PRAKTIKUM IZ HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA … za organsku hemiju i biohemiju... · HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe 1 PRAKTIKUM IZ HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA izabrane

HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe

1

PRAKTIKUM IZ

HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA

izabrane vježbe

akademska 2016/2017


2

Vježba br. 1

________________________________IZOLACIJA ALKALOIDA

PIPERIN I PIPERINSKA KISELINA IZ BIBERA

1. UVOD

Alkaloidi se obično definišu kao bazni nitrogenovi produkti biljaka koji imaju specifino

dejstvo na organizam ljudi i životinja.

Strukturna karakteristika većine alkaloida je više ili manje složeni heterociklički sistem.

Biološka funkcija alkaloida u biljkama još je gotovo nepoznata, a na životinjske organizme i

ljude već mala količina alkaloida pokazuje izvanredno fiziološko djelovanje. Na primjer

kurare-alkaloidi, kojima se zbog njihove otrovnosti južnoamerički urođenici služe za

premazivanje vršaka strelica. Muskarin je isto tako snažan otrov koji sadrži gljiva muhara

U početku su u terapijama primjenjivane alkaloidne droge, a da njihove komponente nisu bile

poznate. Razvojem savremenih ekstrakcionih i instrumentalnih metoda bilo je moguće

izolovati i odrediti aktivne sastojke mnogih alkaloidnih droga.

U biljkama se alkaloidi nalaze uglavnom u obliku soli s kiselinama, kao što su oskalna,

sirćetna, mliječna, vinska.

Nosioci ljutog okusa bibera su alkaloidi koji sadrže piperidinsku jezgru. Piperin je alkaloid

piperidinskog niza. Glavni je sastojak crnog bibera (Piper nigrum) koji se ubraja u porodicu

Pipereceae.

Alkaloid piperin nalazi se u zrnu crnog i bijelog bibera, i u nekim drugim srodnim biljkama.

U zrnu crnog bibera ima ga 6-9%.

C17H19NO3

O

O

N

O

Informacije za eksperiment:

Reagensi: Etanol, C2H5OH

Metanol CH3OH

10% Kalijumhidroksid, KOH

Hloridna kiselina, HCl

1,3,5-trinitrobenzol

Pribor: Soxletov aparat

Balon

Vodeno hladilo

Vodeno kupatilo


3

Rotavapor

Produkt: Piperin t.t 125-126°C

Piperinska kiselina t.t. 216-217°C

Postupak rada

Ekstrakcija

U Soxletov aparat za ekstrakciju stavi 20 g samljevenog crnog

bibera (Stavi biber u filter papir i umotaj tako da visina bude u

visini bočne cjevčiće kojom se preljeva rastvarč).

Nasuti etanol ili hloroform u balon i zagrijavaj na vodenom

kupatilu toliko dugo dok se ne dobije bezbojan ekstrakt.

Sakupljeni ekstrakt koncentruj na rotavaporu na temperaturi ne

višoj od 60°C.

Ostatak poslije koncentrovanja tretira se sa 20 mL 10%

kalijimhidroksida u etanolu.

Poslije 10 minuta alkoholni rastvor se dekantiranjem odvoji od

taloga i ostavi piperin da iskristališe u obliku žutih kristalića.

Odrediti prinos piperina.

Filtrat ohladiti da bi se formirali kristali piperina, profiltrirati i

isprati kristale sa 2 mL hladne vode. Odrediti prinos piperina.

Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom H2SO4. Otopiti

par kristalića izoliranog spoja u etanolu i dodati par kapi

koncentrovane H2SO4, u prisustvu piperina nastaje intenzivno

crveno obojenje koje nestaje pažljivim dodatkom vode. OPREZ!!!!

Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom HNO3. Otopiti

par kristalića izoliranog spoja u etanolu i dodati malo HNO3, u

prisustvu piperina nastaje zeleno-žuto obojenje koje brzo prelazi u

narandžasto i na karaju u intenzivno crveno. OPREZ!!!!

Piperin sa 1,3,5-trinitrobenzolom (1:1) gradi kompleks u obliku

crvenih iglica.

Hidroliza

piperina

Hidrilizom piperina alkoholnim rastvorom kalijumhidroksida

dobiva se piperinska kiselina i piperidin

U balon od 50 mL, sa povratnim hladilom, stavi se 1 g piperina i 10

mL 10%-tnog alkoholnog rastvora kalijumhidroksida.

Reakciona smjesa se zagrijava 90 min na vodenom kupatilu.

Alkohol se predestilira iz reakcione smjese pod vakuumom na


4

rotavaporu

Ostatak u balonu se ohladi na ledenom kpatilu

Izdvojena kalijumova so piperinske kiseline suspenduje se u malo

vruće vode i zakiseli hloridnom kiselinom

Nastali voluminozni žuti talog odvoji se filtriranjem i ispere s malo

hladne vode

Prekristaliziraj nastali talog iz etanola, nastaju igličasti žuti kristali.

Alkalni rastvor etanola dobiven destilacijom, zakiseli do jako kisele

reakcije i otpari do suha

Kristalizacijom ostatka iz metanola dobiva se piperidinhlorhidrat

t.t. 244°C


5

IZVJEŠTAJ

Ime i prezime: ____________________________________ Grupa:__________

IZVJEŠTAJ

Izračunaj prinos piperina


6

Vježba br. 2

2a IZOLACIJA KOFEINA IZ ČAJA

UVOD

Alkaloidi su prirodni organski spojevi koji sadrže nitrogen, a tako su nazvani zbog njihovog bazičnog

("alkalijama sličnog") karaktera kojem je razlog upravo nitrogen. Danas je poznato više od 12 000

alkaloida, pa pripadaju jednoj od najbrojnijih grupa prirodnih spojeva.

Izrazitog su, ali različitog, fiziološkog djelovanja na organizam čovjeka i životinja. Djeluju već u vrlo

malim količinama. Neki se u malim dozama koriste kao jaki i nezamjenjivi lijekovi, dok su gotovo svi

u većim količinama vrlo jaki otrovi. U biljkama alkaloidi ne dolaze u slobodnom obliku, već su vezani

za neke organske kiseline (na primjer: oksalnu, octenu, mliječnu, vinsku, limunsku i druge) ili u obliku

estera, amida i glikozida. Čisti alkaloidi većinom su bijeli sitnokristalni prašci ili tekućine. Netopivi su

u vodi, ali topivi u anorganskim kiselinama i u organskim otapalima. Njihove su soli čvrste, topive u

vodi, a netopive u organskim otapalima.

Zbog raznolikosti i složenosti alkaloidnih struktura ne postoji sistematizovana klasifikacija ovih

jedinjenja. Prema hemijskoj klasifikaciji alkaloidi se mogu podijeliti u sljedeće grupe:

a) Derivati piridina i piperidina,

b) Derivati tropana

c) Derivati hinolina

d) Derivati izohinolina

e) Derivati indola

f) Derivati imidazola

g) Derivati purina

h) Aciklični alkaloidi

i) Sterodini alkaloidi

Spojevi koji se javljaju u prirodi imaju različite vrste primjene. Jedan od često korištenih je i kofein

Koristi se kao stimulans u nekim lijekovima, a većina nas ga koristi svakodnevno u pićima dobivenim

ekstrakcijom iz kafe ili čaja vrućom vodom. Kofein poticajno djeluje na središnji živčani sistem,

osobito na koru velikog mozga i neka središta u produženoj moždini. Pića koja ga sadrže izazivaju

stanje budnosti, te prolazno i kratkotrajno uklanjaju znakove umora. Kofein umor ne uklanja u cijelosti

već samo privremeno ublažava simptome, a kad djelovanje popusti, osjećaj umora još je intenzivniji.

To obično navodi na uzimanje nove doze kofeina čime zakidamo jedan od osnovnih načina kojim nas

tijelo upozorava da mu je potreban odmor.

Primarni izvor kofeina je zrno kafe koje sadrži oko 2-3% kofeina. Sadržaj kofeina u napitku varira od

40 do 120 mg, u zavisnosti od načina pripreme. Kafa takođe sadrži tragove srodnog alkaloida

teofilina, ali ne i teobromina. Čaj je drugi važan izvor kofeina i mada sadrži više kofeina nego kafa,

uobičajeni čajni napitak sadrži mnogo manje kofeina. Za razliku od kafe, čaj sadrži male količine

teobromina i nešto viši nivo teofilina.


7

KOFEIN TEOBROMIN TEOFILIN

Listovi biljke čajevac, Camellia sinensis, od kojih se spravlja čaj, vrući aromatični napitak blago

gorkog i oporog mirisa, sastoje se primarno od celuloze kao osnovnog gradivnog materijala svih

biljnih ćelija. Na sreću, celuloza nije topiva u vodi, pa korištenjem ekstrakcije vrućom vodom, mnogo

topiviji kofein može se razdvojiti. Takođe u vodi su topivi i složeni spojevi, tanini. Ovo su obojeni

fenolski spojevi velikih molekulskih masa(500-3000) koji imaju kiseli karakter. Ako se neka bazna so

kao što je natrijum karbonat doda vodenoj otopini, tanini će reagovati i formirati soli. Ove soli su ne

topive u organskom otapalu, kao što su hloroform ili dihlormetan, ali su topivi u vodi. Kako je kofein

slabije topiv u vodi (2g/100g hladne vode), a mnogo je topiviji u organskom otapalu (14g/100g

dihlormetana), kofein možemo ekstrahovati iz bazne otopine čaja dihlormetanom, a natrijumove soli

tanina ostaju u vodenoj otopini. Otparavanjem dihlormetana ostaje sirovi kofein, koji se može

prečistiti sublimacijom.

EKSPERIMENTALNI RAD

ZADATAK VJEŽBE

- Izvršiti izolaciju kofeina

- Naučiti tehnike ekstrakcije

- Izvršiti prečišćavanje izoliranog produkta

HEMIKALIJE I REAGENSI

- Čaj ili filter vrećice čaja

- Natrijum karbonat, Na2CO3

- Dihlormetan, CH2Cl2

- Toluen C6H5CH3

- Heptan C7H16

- Bezvodni natrijumsulfat, Na2SO4

- Destilovana voda

OPREMA I PRIBOR

- Čaše od 100, 250, 600 mL

- Erlenmajerova tikvica od 50, 125 mL

- Menzura od 10, 100 mL

- Lijevak za odvajanje od 500 mL

- Büchnerov lijevak

- Vakuum boca

- Rešo

MJERE OPREZA

- Ne udišite pare organskih rastvarača

- Oprez pri radu sa vrućim priborom


8

SAVJETI

- Ekstrakcije dihlormetanom i prekristalizaciju radite u digestoru

PRODUKT

- Kofein, bijeli igličasti kristali t. t. 230°C

IZVOĐENJE VJEŽBE

I Postupak

Izolacija

U čašu od 600 mL naspi oko 200 mL vode i dodaj 15 g natrijum karbonata.

Zagrijavaj na rešou uz mješanje dok se karbonat ne rastvori.

Izvagaj oko 15 g čaja

Dodaj čaj u čašu sa vodom i zagrij do ključanja

Smanji grijanje i pusti da lagano ključa poklopljeno satnim staklom oko 30

min

Prekini zagrijavanje i pusti da se rastvor ohladi (hlađenje možeš ubrzati

stavljanjem čaše pod mlaz hladne vode).

Profiltriraj dobivenu smjesu preko Büchnerovog lijevka

Pokvasi ostali čvrsti ostatak sa 10 mL destilovane vode i profiltriraj uz

pritiskanje malom erlenmajericom kako bi dobili maksimalnu količinu

tečnosti.

Ostavite čašu u ledeno kupatilo da se ohladi ispod sobne temperature

Ekstrakcija

Prebaci filtrat u lijevak za odvajanje od 500 mL

Dodaj 30 mL dihlormetana

Promućkaj sadržaj nekoliko puta i ostavi da se razdvoje slojevi. (Nemojte

mućkati previše intenzivno kako bi izbjegli stvaranje pjene)

Ispusti dihlormetanski dio u čistu čašu od 250 mL pazeći da se slojevi što

preciznije odvoje ne ispuštajući vodu iz gornjeg sloja.

Ponovi ekstrakciju na isti način još 3 puta sa po 15 mL dihlormetanu

Sušenje Dodaj 15-20 g anhidrovanog natrijumsulfata u čašu sa dihlormetanskim

slojem kako bi izvršili sušenje

Uz povremeno miješanje ostavi da stoji 10 min (ako je rastvor mutan

prebaci ga u novu čašu i dodaj novu porciju natrijumsulfata).

Otparavanje

orgasnkog

radtvarača

Sastavi aparaturu za destilaciju, koristeći vodeno kupatilo kao sredstvo za

zagrijavanje, a destilat sakupite u tikvicu koja je uronjena u ledeno kupatilo.

Predestiliraj dihlormetan uz lagano zagrijavanje kako bi izbjegli stavranje

pjene.

Kada je rastvarač otpario kofein bi trebao da kristalizira.

U ovoj fazi kofein je oko 90% čist, žućkastih kristala.

Prekristalizacija Naspi po 5 mL toluena i heptana u balon u kome se nalazi kofein

Zagrijte dok se kristali kofeina ne otope (možda će biti potrebno po još 2

mL svakog rastvarača kako bi se rastvorili nastali kristali).

Prekinite zagrijavanje kada se otope kristali kofeina

Prebacite sadržaj balona u čašu od 50 mL i pustite da dođe do

rekristalizacije pri halđenju na ledenom kupatilu

Ovako nastali kristali kofeina su bijele boje i obično 96-98% čisti

Nastali produkt profiltriraj kroz Buchnerov lijevak

Izvagajte nastali produkt i izračunajte prinos


9

Shema izolacije kofeina

II Postupak

U čaši ugrijati 100 mLvode i u ključalu vodu staviti tri vrećice indijskog čaja. Vrećice držati u vodi 5

minuta. Kofein je dobro topiv u vreloj vodi pa će preći u vodeni sloj. Izvaditi vrećice iz čaše i istisnuti

iz njih tečnost koju su upile.

Iz dobivene otopine se kofein ekstrahira u lijevku za odvajanje uz dihlormetan ili hloroform, tri puta sa

po 15 mL rastvarača. Kofein prelazi u organski sloj.

Nakon ekstrakcije organski sloj isprati dva puta sa po 20 mL hladnog 6M rastvora NaOH i jednom sa

20 mL hladne vode. Nakon toga organski sloj osušiti s anhidrovanim Na2SO4. Nakon sušenja

dekantirati rastvor u suhu i izvaganu kristalizirku i upariti do suha. Nakon otparavanja rastvarača

ostaju bijeli talog kofeina.

2b IZOLACIJA TEOBROMINA IZ KAKAO PRAHA

Kakao prah

zagrijavanje

Ekstrakcija

CH2Cl2

ČAJ Nerastvorljivi

ostatak

KOFEIN u CH2Cl2

Soli tanina u

vodi

KOFEIN

Otparavanje

CH2Cl2

UZORAK

ČAJA

Na2CO3 u vrućoj vodi

Teobromin


10

POSTUPAK I

U balon ogruglog dna (500 mL) pripremi se smjesa kakao praha (20g) i metanola (20 mL), a zatim

se doda rastvor MgO (6 g u 40 ml vode). Zagrijavati na vodenom kupatilu 30-45 minuta uz

mješanje (do stvaranja mrvičaste polu čvrste forme). Ohladiti smjesu i dodati dihlormetan ili

hloroform (150 mL) i zagrijavati pod refluksom 30 minuta. Smjesu ponovo ohladiti, filtrirati preko

Bihnerovog lijevka, filtrat osušiti sa Na2SO4 i potom prebaciti u balon okruglog dna (250 mL).

Rastvor se koncentrira na rotavaporu do volumena 10 mL, a potom dekantirati u čistu

kristalizirku, doda se dietileter (30 mL) i ostavi da kristalizira. Izračunati prinos.

POSTUPAK II

U erlenmajericu (250 mL) odvagati 10g kakao praha, dodati 75 mL vode i promješati. Pomoću

magnetne mješalice sadržaj u erlenmajerici mješati, zagrijavati i održavati na temperaturi 900C u

toku od 90 minuta. Sadržaj u erlenmajerice se ohladi na sobnu temperaturu, prebaci u posude za

centrifugiranje i centrifugira se 20 minuta na 3000 obrtaja u minuti. Supernant se odvoji

flitriranjem od taloga, a potom se sadržaj koncentrira upravanjem na vodenom kupatilu.

PRPIREMNA VJEŽBANJA

IZVJEŠTAJ


1. Zašto je važno dobro ohladiti vodeni ekstrakt čaja prije dodatka dihlormetana za ekstrakciju?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

1. Izračunaj prinos dobivenog produkta u odnosu na početnu masu materijala!


11

2. Kojim metodama je moguće izvršti prečišćavanje kofeina?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________


12

Vježba br. 3

IZOLACIJA I EKSTRAKCIJA ESENCIJALNIH ULJA

1 UVOD

Prirodni produkti su podjeljeni u dvije velike grupe spojeva. Metaboliti koji su uobičajeni za veliki

broj organizama, poznati kao primarni metaboliti, npr. amino kiseline. Općenito oni imaju dobro

definisan ulogu u biohemijskom sistemu. Druga velika grupa prirodnih produkata poznata je pod

imenom sekundarni metaboliti među koje spadaju i esencijalna ulja.

Esencijalna ulja su volatilne tečnosti konzistencije ulja. Izolacija iz biljnog materijala vrši se različitim

metodama. Ulja imaju karakterističan miris biljke iz koje su izolirane.

Prije izolacije biljni materijal iz kojeg se dobiva esencijalno ulje se mora osušiti i usitniti. Izolacija

esencijalnog ulja iz biljnog materijala se može vršiti slijedećim metodama:

a) hidrodestilacija;

b) destilacija vodenom parom;

c) eskstrakcija rastvaračima;

d) anfleriranje;

e) maceracija;

f) presovanje.

Hidrodestilacija je metoda koja se najčešće koristi za izoliranje esencijalnih ulja. Ovaj metod se

bazira na činjenici da su navedene supstance veoma slabo rastvorljive u vodi. Procedura se sastoji u

destilaciji vode iz vodenog rastvora koji sadrži organske spojeve pri čemu para nosi sa sobom i

organske spojeve. Para se može stvarati u sistemu i van njega. U sistemu se para stvara intenzivnim

ključanjem vode pomiješane sa materijalom koji sadrži spojve koje je potrebno izolirati, uz povremeno

dodavanje vode kako bi se nivo vode održavao konstantnim.

Biljni materijal se kuha u vodi. Pare koje nastaju kondenzuju se u hladilu i sadrže smjesu vode i

esencijalnog ulja. Iz destilata se ulje i voda odvajaju ekstrakcionim postupcima. Prilikom destilacije

dolazi do hidrolize pojedinih komponenata ulja što je uzrokovano visokom temperaturom.

Esencijalna ulja razlikuju se od masnih ulja po njihovoj isparljivosti i činjenici da nisu saponibilni

(saponifikacija je proces nastanka sapuna iz masti i baze), daju specifičan miris cvijetu, listu i drvetu

ili su izvedeni iz komponenata biljaka enzimatskom reakcijom. Esencijalna ulja često su zapaljiva,

rastvorljiva u alkoholu i eteru i samo slabo rastvorljivi u vodi. Mogu sadržavati, ugljikovodike,

alkohole, fenole, etere, aldehide, ketone, kiseline i estere.

Začini su često kompleksne smjese različitog sastava. Mirisne komponente su najčešće povezane sa

esterima, a kakakteristični okus i aroma mnogih začina rezultat je prisustva aromatskih aldehida i

ketona. Primjeri takvih aldehida su vanilin (štapići vanilija), cimetaldehid (cimet), eugenol (klinčići),

karvon (kim)

OH

O

H

O CH3 O

H

OH

O CH3

CH2

CH3CH2

CH3

O

Vanilin Cimetaldehid Eugenol Karvon


13

Od davnina, posebno kada nije bilo frižidera, začini su se dodavali da maskiraju nepoželjne mirise.

Antiseptici i antioksidansi prisutni u začinima bili su efikasni u produženju roka trajanja hrane.

U ovom eksperimentu, vršićete izolaciju esencijalog ulja iz klinčića. Klinčići su pupoljci jednog

zimzelenog drveta iz istočne Indije. Esencijalno ulje se uglavnom sastoji od eugenola. Koristi se u

parfimeriji, za sintezu vanilina, kao anelgetik i antiseptik.

Cimetaldehid je glavni sastojak esencijalnog ulja koji se može izolirati iz suhih dijelova biljke

Cinnamomum, porjeklom iz istočne Indije i jugoistočne Azije. Cimetaldehid je i sintetiziran za

komercijalne svrhe, koristi se kao vještački začin. Cimetaldehid je među nekoliko aldehida za koji se u

IUPAC sistemu zadržalo uobičajeno ime.

Karvon je keton, pronađen u ulju kima, Carum carvi, i mirođije. Nema komercijalnu primjenu. Kim

je dvogodišnja biljka iz familije peršuna, koja se uzgaja zbog sjemenki koje imaju intenzivan,

privlačan miris. Sjemenke kima se koriste kao začin za peciva i služe da poboljšaju probavu.


14

EKSPERIMENTALNI RAD

ZADATAK VJEŽBE

- Izolirati esencijalno ulje iz klinčića*1

- Izvršiti ekstrakciju esencijalnog ulja iz destilata

- Odrediti prinos

HEMIKALIJE I REAGENSI

- 5% kalijum hidroksid, KOH

- 5% hloridna kiselina, HCl

- Dihlormetan, CH2Cl2

- Destilovana voda, H2O

- Bezvodni natrijum sulfat, Na2SO4

- Zasićeni rastvor natrijum hlorida, NaCl

PRIBOR I OPREMA

- Aparatura za destilaciju

- Erlenmeyerove tikvice 250 mL, 125 mL

- Menzura 100 mL

- Lijevak za odvajanje, 150 mL, 250 mL

- Vodeno kupatilo

- Univerzalni pH papir

MJERE OPREZA

- Nemoj udisati pare organskih otapala

- Budi oprezan pri radu sa kiselinama i bazama, u slučaju posipanja isperi kožu velikim

količinama vode

- Ekstrakciju dihlormetanom izvodi u digestoru

SAVJETI

- Nemoj bacati nijednu otopinu koja bi mogla sadržavati željeni produkt. Ostavite ih u propisno

označenim posudama do kraja eksperimenta. Uobičajena greška je korištenje pogrešne otopine

za nastavak eksperimenta tokom ekstrakcije. Ako nisi siguran prati upute u Shemi

- Prinos primarno određuju destilacija i ekstrakcija dihlormetanom. Uspješnost destilacije

određuje količina predestiliranog organskog materijala vodom, dok je uspješnost ekstrakcije

određena količinom materijala koji se iz vodenog dijela prenese u organski.

- Formiranje emulzije može predstavljati ozbiljan problem tokom ekstrakcije, usporava cijeli

postupak i uzrokuje gubitak produkta.

- Pri drugoj destilaciji ili jednostavnom otparavanju otapala, produkt će ostati na dnu u malim

količinama, može ga biti tako malo da je gotovo nevidljiv, ali će vaganje potvrditi njegovo

postojanje.

- Ovaj eksperiment zahtijeva dobro planiranje i koordinaciju različitih poslova unutar grupe

kako bi se eksperiment mogao završiti na vrijeme. Počnite sa destilacijom što prije, to je dio

vježbe koji najduže traje, a ostale poslove podijelite unutar grupe.

PRODUKT

- Esencijalno ulje klinčića je žuta volatilna tečnost, t. k. 243°C

1 Ista procedura može se koristiti i za izolaciju esencijalnog ulja iz cimeta i kima


15

- Eugenol je bezbojna tečnost, t. k. 253°C, slabo topiv u vodi.

- Karvon je bezbojna tečnost t. k.245°C.

- Cimetaldehid je žuta volatilna tečnost, t.k. 245°C

IZVOĐENJE VJEŽBE

a) Izolacija eugenola

Destilacija Sastavi aparaturu za hidrodestilaciju, zagrijavanje vrši na električnom

grijaču, a koristi vodeno hladilo.

Izvagaj 14-16 g klinčića, smrvi ih u avanu kako bi voda lakše prodrla u

njih. (20-25 g kima, 15-20 g štapića cimeta)

Stavi biljni uzorak u tikvicu za destilaciju i preko njega naspi oko 2/3

vode

Priključi vodu na hladilo i uključi grijač kako bi smjesa lagano

proključala da se ne stvara pjena. Kada ključanje otpočne, pojačaj

grijanje.

Prikupljaj destilat u Erlenmeyerovu tikvicu dok god vidiš emulziju koja

izlazi iz hladila (destilacija obično traje 45-60 min). Trebalo bi da

prikupiš najmanje 150-200 mL destilata.

Izbaci ostatke biljnog materijala iz balona dok je još vruć ili ga napuni

do vrha vodom, snažno izmješaj i prebaci u veću čašu, otopinu iz čaše

dekantiraj u odvod, a čvrsti ostatak baci u kantu za smeće.

Ekstrakcija

Prebaci destilat u lijevak za odvajanje od 250 mL i dodaj oko 25 mL

dihlormetana.

Protresi lijevak nekoliko puta, (previše intenzivno miješanje može

prouzrokovati stvaranje emulzije; ako se emulzija stvori pokušaj izvršiti

isoljavanje). Okrećući lijevak za odvajanje naopako, kroz ventil možeš

ispusti gasove koji nastaju pri ekstrakciji.

Ostavi lijevak da stoji na prstenu dok se slojevi ne razdvoje.

U Erlenmeyerovu tikvicu od 125 mL, ispusti donji organski sloj i ponovi

ekstrakciju još dva puta na isti način sa po 20 mL dihlormetana.

(Sljedeći dio vrijedi samo za ekstrakciju eugenola iz esencijalnog ulja)

Prebaci dihlormetanski dio u drugi lijevak za odvajanje i dodaj 30 mL

5% otopine KOH. Otopina u lijevku je topla jer se pri reakciji oslobađa

toplota.

Sačuvaj vodenu otopinu u Erlenmeyerici od 125 mL i vrati

dihlormetanski dio u lijevak za odvajanje.

Ekstrahuj dihlormetanski dio još dva puta sa po 25 mL 5% otopinom

KOH i spoji vodene slojeve.


16

Prebaci vodeni sloj ponovo u lijevak za odvajanje i još ga jednom isperi

novom porcijom dihlormetana.

Prebaci vodeni rastvor u čašu od 250 mL i polako zakiseli do pH 1

koristeći 5% rastvor HCl-a. Kiselinu dodaj u kapima i uz miješanje. pH

vrijednost kontroliši univerzalnim pH papirom; biće potrebno 20-50 mL

kiseline. Primjetićeš da se razvija toplota i da otopina postaje zamućena

kad pH postane kisela.

Prebaci zakiseljenu otopinu ponovo u lijevak za odvajanje i dodaj 20 mL

dihlormetana.

Sačuvaj dihlormetanski dio i ponovi ekstrakciju još dva puta sa po 25 mL

dihlormetana. Pazi pri razdvajanju da u organskom sloju ne bude vode.

Koristi isti lijevak za odvajanje da opereš sakupljeni organski dio sa 15

mL destilovane vode.

Nakon pranja vodom operi organski dio sa poluzasićenom otopinom

NaCl (napravi ga miješanjem 8 mL zasićene otopine NaCl sa 7 mL

destilovane vode).

Prebaci dihlormetanski dio u čistu i suhu Erlenmeyericu, dodaj 15 g

bezvodnog natrijum sulfata, Na2SO4, da osušiš organsku otopinu (ako

otopina ostaje mutna dodaj još bezvodnog natrijum sulfata).

Otparavanje

organskog

otapala

Izvagaj balon okruglog dna od 150 mL koji će biti korišten za destilaciju,

a ne za prikupljanje destilata.

Dekantiraj osušeni organski sloj iz Erlenmeyerice u izvagani balon i

sastavi aparaturu za destilaciju, koristeći vodeno kupatilo kao sredstvo za

zagrijavanje.

Predestiliraj dihlormetanski dio. Zagrijavanje vrši lagano, kako bi izbjegli

stvaranje pjene, sve dok otapalo izlazi iz hladila.

Kad je otapalo otparilo, izvagaj balon i iz razlike masa izračunaj masu

dobivenog produkta.

b) Izolacija ulja cimeta

Sastavi aparaturu za destilaciju vodenom parom, zagrijavanje vrši na

električnom grijaču, a koristi vodeno hladilo.

Izvagaj 20-25 g štapića cimeta, smrvi ih u avanu kako bi voda lakše

prodrla u njih. (20-25 g kima).

Stavi biljni uzorak u tikvicu za destilaciju i preko njega naspi oko 100-

150 mL destilovane vode.

Priključi vodu na hladilo i uključi grijač kako bi smjesa lagano

proključala da se ne stvara pjena. Kada ključanje otpočne, pojačaj


17

grijanje. Sakupiti 150-200 mL destilata.

Prebaci destilat u lijevak za odvajanje i dodaj oko 25 hloroforma.

Protresi lijevak nekoliko puta, (previše intenzivno miješanje može

prouzrokovati stvaranje emulzije; ako se emulzija stvori pokušaj izvršiti

isoljavanje). Okrećući lijevak za odvajanje naopako, kroz ventil možeš

ispusti gasove koji nastaju pri ekstrakciji.

Ostavi lijevak da stoji na prstenu dok se slojevi ne razdvoje.

U Erlenmeyerovu tikvicu od 125 mL, ispusti donji organski sloj i ponovi

ekstrakciju još dva puta na isti način sa po 20 mL hloroforma

Sakupljeni ekstrakt osusiti sa anhidrovanim magnesiz sulfatom, višak

rastvaraca upariti na rotavaporu do volumena 10 mL.

Nakon uparavanja ostatak prebaciti u izvaganu kristalizirku.

Kad je otapalo otparilo, izvagaj kristalizirku i iz razlike masa izračunaj

masu dobivenog produkta.


18

PRIPREMNA VJEŽBANJA

1. Navedi metode kojima možeš izolirati esencijalna ulja iz biljnog materijala!

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________ 2. Na koji način se vrši sušenje organskog ekstrakta?

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

______________________________________________________

IZVJEŠTAJ


1. Izračunaj prinos esencijalnog ulja u odnosu na početnu masu biljnog

materijala!

2. Izračunaj prinos eugenola u odnosu na masu dobivenog esencijalnog ulja

i u odnosu na početnu masu biljnog materijala!


19

1. Šta može uticati na prinos eugenola?

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

1. Objasni šta se dešava sa eugenolom u svakom koraku ekstrakcije!

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

Eugenol u

klinčićima

Destilacija

Ekstrakcija sa CH2Cl2

Ekstrakcija sa KOH

Eugenol u baznom

ekstraktu

Ekstrahuj sa CH2Cl2

Isperi sa CH2Cl2

Zakiseli sa HCl

Eugenol u

CH2Cl2

ekstraktu

Isperi sa H2O

Isperi sa NaCl

Osuši sa Na2SO4

Otpari CH2Cl2

Eugenol

Eugenol u destilatu

Eugenol u CH2Cl2

ekstraktu


20

Vježba br. 4

IZOLACIJA LIKOPENA IZ PARADAJZA

1 UVOD

Karotenoidi su organska jedinjenja koja se svrstavaju u terpenoide; po formuli su tetra-

terpenoidi, zbog obojenosti pigmenti, a po fizičkim osobinama su lipidi. Osnovni biohemijski

značaj karotenoida je u tome što učestvuju uz hlorofile i fikobilinske pigmente u fotosintezi.

Karotenoidi u toku fotosinteze štite ćeliju od fotodinamičke destrukcije koju katalizuje

hlorofil, i apsorbuju i prenose svjetlosnu energiju do hlorofila A.

Dejstvo svjetlosti i molekulskog kiseonika može biti letalno za ćeliju. Pokazalo se da

karotenoidi inhibiraju fotodinamičku akciju svjetlosti i kiseonika na hlorofil.

Centralni dio molekule sastavljen je od dugog konjugovanog niza, najčešće osam izoprenskih

jedinica CH2=CHC(CH3)=CH2, vezanih tako da dvije CH3 grupe najbliže centru zauzimaju

položaj 1,6, a ostale su u položaju 1,5. Na krajevima ovog niza nalaze se bilo dva otvorena

niza, bilo dva prstena ili je na jednom kraju otvoren niz, a na drugom prsten.

Posljedica ovakve strukture je velika reaktivnost karotenoida, podložnost autoksidaciji,

intezivna boja, kao i karaktersitični apsorpcioni spektri.

Karotenoidi koji su ugljovodonici nazvani su karotenima, a oksidovani derivati karotena

ksantofilima.

Svi karotenoidi su rastvorni u mastima, većina je rastvorna u organskim rastvaračima

(karoteni), dok su neki rastvorni u alkoholu i alkalijama (ksantofili). Karotenoidi koji su

vezani za bjelančevine i ugljikohidrate-oblik u kojem se najčešće nalaze u prirodi-jesu

jedinjenja rastvorna u vodi.

Nekoliko pigmenata obično dolazi zajedno i to u malim količinama. U višim biljkama

najčešće se i u najvećim količinama nalaze β-karoten, lutein, kao i violaksantin i neoksantin,

koji su najvažniji ksantofili u višim biljkama. U nekim biljkama je prisutan i α-karoten, mada

u mnogo manjim količinama.

Likopen je polien sa 11 dvostrukih veza (C40H56, aciklički tetraterpen). Svrstava se u grupu

karotenoida i strukturni je izomer karotena, ali ne pokazuje vitaminske aktivnosti. Nalazi se u

plodovima voća i povrća (jabuka, paradajz) da daje plodovima crvenu boju. Apsorpcioni

maksimum je na 504 nm.

Po strukturi su vrlo slični i njihovo čišćenje pomoću uobičajenih metoda kristalizacije je bilo

vrlo teško. Nagli razvoj na području hemije karotenoida započeo je primjenom


21

hromatografske apsorpcije na aluminijevom oksidu, magnezijevom oksidu ili kalcijevom

karbonatu. Upravo pri odvajanju karotenoida ova se tehnika ubrzano razvijala.

likopen

-karoten

ksantofil

2. EKSPERIMENTALNI DIO

Izolacija

Postupak 1

Odvagati 20 grama paradajz pirea u erlenmajericu (150-200 mL) i dodati 20 mL acetona.

Smjesu mješati 15-20 minuta na magetnoj mješalici i nakon toga je profiltrirati. Filtrat

odbaciti, a talog prenjeti u novu erlenmajericu, dodati dihlormetan (25 mL) i sadržaj mješati 5

minuta. Sadržaj dekantirati preko Bihnerovog lijevka, ostavljajući glavninu taloga u

erlenmajerici. Ponoviti ekstrakciju sa novom količinom dihlormetana (10 mL). Sadržaj

profiltrirati u istu bocu, a potom ga osušiti sa Na2SO4 i filtrirati u čistu izvaganu posudu. Na

vodenom kupatilu otpariti višak rastvarača i izračunati prinos. Nakon toga snimiti spektar

dobijenog likopena otopljenog dihlormetanu.

Postupak 2

Odvagati 10 g paradjaz pirea u balon okruglog dna (250 mL) i dodati 15 mL metanola i 35

mL dihlormetana. Smjesu zagrijavati 10 minuta pod refluksom. Nakon hlađenja, smjesu

profiltrirati, prebaciti u lijevak za odvajanje i oprati zasićenom otopinom NaCl (100 mL). Ako

dođe do stvaranja pjenastog sloja na dnu lijevka, ispustiti nastali sloj u posebnu posudu, a

zatim organski sloj u čistu čašu. Organski sloj ponovo isprati sa 100 mL zasićene otopine

NaCl. Osušiti organski sloj, prebaciti u izvaganu kristalizirku da višak rastvarača otpari.

Izračunati prinos i snimiti spektar dobijenog likopena otopljenog dihlormetanu.


22

Priprema

1. Šta su karotenoidi?

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

2. Kakva je uloga karotenoida u biljakama?

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

3. Kakva je razlika u strukturi između likopena, -karotena i ksantofila?

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

4. IZVJEŠTAJ

masa uzorka ___________

masa kristalizirke ___________ masa kristalizirke likopena _____________

masa likopena _______________ prinos _________________


23

Vježba br. 5

__ SINTEZA 7-HIDROKSI-4-METILKUMARINA

UVOD

Kumarini spadaju u heterociklične spojeve koji u svojoj skeletnoj strukturi sadrže atome oksigena kao

heteroatome. Kao prirodni produkti nađeni su u mnogim biljkama. Samo ime kumarin potiče od

karipske riječi „coumarou“ za biljku tonkovac (Dipteryx odorata Willd.) iz koje je kumarin (Slika 1)

prvi put izoliran 1820. godine. Do danas je izolirano preko 2000 kumarinskih struktura iz različitih

biljnih vrsta.

O O

Slika 1. Struktura kumarina.

Značajne koncentracije kumarinskih struktura se mogu naći u voću. Najviše u marelicama, višnjama,

jagodama, te začinskim biljkama kao što je cimet i lavanda.

Proizvodnja kumarina počela je 1868. godine kada su se prvi put počeli koristiti u industriji parfema i

pojačivača okusa. Njihova današnja upotreba se najviše zasniva na njihovim antikoagulacijskim

svojstvima, te kao otrov za pacove, upravo zbog tog svojstva. Zagrijavanjem kumarina nastaju

dikumaroli koji su jaki antikoagulanti. Kumarini također imaju snažan uticaj na biosintezu vitamina K.

Pored ovih svojstava, kumarini posjeduju i antibakterijska i antigljivična svojstva.

Neke od bitnijih kumarinskih struktura nađenih u biljnom svijetu su (Slika 2):

a) umbeliferon (1) – kumarin prisutan u aromatičnim biljkama familije Umbelliferae sa

izrazitim antigljivičnim svojstvima;

b) eskulin (2) – glikozidni kumarin iz ploda kestena sa vaskularnim terapeutskim

svojstvima;

c) skopoletin (3) – kumarin iz bljke noni koji regulira krvni pritisak, ima značajna

antibakterijska svojstva, te regulira hormon serotonin, te smanjuje depresiju i

anksioznost;

d) bergapten (4) – kumarin iz citrusnog voća bergamota koji spada u grupu furokumarina

(psoralena) koristi se kao aktivna komponenta krema i losiona za sunčanje.

O OOH

O

O

HHOH

H

H

OH OH

H

OH

O OOH O O

OH

O

CH31 2 3

O O

OCH3

O

4 Slika 2. Neke kumarinske strukture.

Biosinteza kumarina u biljkama kreće od cimetne kiseline koja se ciklizacijom prevodi u

kumarinsku strukturu. U laboratoriji se najčešće koriste mnoge sintetičke metode, a među

njima Perkinova, Knoevenagelova i Pechmannova reakcija.

1 TEORIJSKE OSNOVE EKSPERIMENTA


24

U ovoj vježbi sinteza 7-hidroksi-4-metilkumarina će se izvršiti prema jednoj od najpoznatijih

sintetičkih metoda za dobivanje kumarina – Pechmannova reakcija. Hans von Pechmann je 1883.

godine sintetizirao kumarinsku strukturu kondenzirajući fenolski derivat sa β-ketonskim esterom.

Kondenzacija ove dvije molekule se uspješno provodi u prisustvu jake kiseline koja ima ulogu

katalizatora, pri čemu nastaje novi prsten u molekuli.

Cijeli tok kondenzacije zavisi od vrste fenolskog spoja, od estera, i od kiselog kondenzacionog

katalizatora.

Generalno, fenolski spojevi koji imaju aktivatorske grupe u meta- i para-položaju (CH3, OH, OCH3,

NH2) vrlo lako podliježu Pechmannovoj kondenzaciji. Ako je supstituent u orto-položaju, onda je već

zauzeta pozicija kondenziranja estera sa fenolom u novi prsten.

Slično, β-ketonski esteri koji imaju jednostavne alkilne grupe u α-položaju također lako podliježu

kondenzaciji.

U ovoj vrsti kondenzacije katalizator ima veliki uticaj na tok reakcije. Najčešće korišteni katalizatori

su koncentrovana sulfatna kiselina i polifosforna kiselina. Generalno, postoje dvije vrste mogućih

produkata Pechmannove kondenzacije: kumarin i hromen (Slika 3).

OH

+CH3

O CH3

O OO

CH3

O

O

O

CH3 Slika 3. Produkti Pechmannove kondenzacije

Koji će od ova dva produkta nastati, zavisi od upotrebljenog katalizatora. Uopšteno, važe slijedeća

pravila:

a) U prisustvu koncentrovane sulfatne kiseline nastaje kumarin. Jedino u slučaju kada se kao

fenolski derivat koristi β-naftol nastaje smjesa kumarina i hromena.

b) Fenoli koji u prisustvu koncentrovane sulfatne kiseline daju kumarinske strukture, u prisustvu

polifosforne kiseline također daju iste strukture.

U upotrebi su još neki katalizatori, pretežno Lewisove kiseline: aluminijum (III)-hlorid, cink (II)-

hlorid, indij (III)-hlorid, samarijum (III)-nitrat, bizmut (III)-nitrat, te kationske smole.


25

EKSPERIMENTALNI RAD

2 ZADATAK VJEŽBE

- Uradi pripremu za vježbu i ispiši je u svoj laboratorijski dnevnik

- Pripremi čisto i laboratorijsko posuđe za sintezu.

- Izvrši sintezu 7-hidroksi-4-metilkumarina prema navedenim uputama.

- Prekristaliziraj sirove produkte.

- Odredi masu prektristaliziranog produkta.

- Odredi tačku topljenja prektristaliziranog produkta.

- Upiši rezultate u svoj laboratorijski dnevnik.

3 HEMIKALIJE I REAGENSI

- koncentrovana sulfatna kiselina

- rezorcinol

- etilacetoacetat

- 5% otopina natrijum-hidroksida

- etanol

- destilovana voda

- aktivni ugalj

4 PRIBOR I OPREMA

- Erlenmajerova tikvica od 250 mL

- čaše od 50 mL, 100 mL i 400 mL

- lijevak za dokapavanje

- stakleni štapić

- pipeta, 20 mL

- Bucherov lijevak

- lijevak

5 MJERE OPREZA

- Natrijum hidroksid je nagrizajuća supstanca i u slučaju kontakta sa kožom treba ga isprati

velikim količinama vode.

- Koncentrovana sulfatna kiselina je takođet veoma nagrizajuća supstance. U kontaktu sa

kožom nagriženi dio isprati velikim količinama vode.


26

6 IZVOĐENJE VJEŽBE

6.1 Sinteza 7-hidroksi-4-metilkumarina

U Erlenmajerovu tikvicu od 250 mL pažljivo nasuti 10 mL

koncentrovane sulfatne kiseline.

Tikvicu sa kiselinom prenijeti u ledeno kupatilo i pričvrstiti je za

laboratorijski stalak.

Iznad tikvice postaviti lijevak za dokapavanje.

U čaši od 50 mL otopiti 1 g rezorcinola u 3-5 mL etilacetoacetata i

smjesu pomoću uliti u lijevak za dokapavanje.

Pažljivo dokapavati smjesu rezorcinola i etilacetoacetata u

Erlenmayerovu tikvicu sa sulfatnom kiselinom (u porcijama od 1-2

mL). Pri tome paziti da temperatura reakcione smjese ne pređe 10°C.

Nakon svakog dodavanja smjese rezorcinola i etilacetoacetata,

Erlenmayerovu tikvicu energično promiješati.

Kad je sva smjesa prenesena u tikvicu, tikvicu ostaviti na sobnoj

temperaturi 15-20 minuta.

Pripremiti 200 g smjese leda i vode u čaši od 400 mL.

Preliti reakcionu smjesu u smjesu leda i vode uz veliki oprez, i snažno

promiješati. U prisustvu vode nastaju žuti kristali 7-hidroksi-4-

metilkumarina.

Sirovi produkt profiltrirati na Büchnerovom lijevku i isprati ga sa 50

mL hladne destilovane vode.

Sirovi 7-hidroksi-4-metilkumarin otopiti u čaši sa 50 mL 5% vodene

otopine natrijum-hidroksida.

Nastalu otopinu profiltrirati i filtrat zakiseliti do neutralne reakcije.

Tokom neutralizacije smjesu snažno miješati. Zakiseljavanjem

otopine ponovo dolazi do taloženja 7-hidroksi-4-metilkumarina.

Prečišćeni produkt ponovo profilrirati na Buchnerovom lijevku i talog

isprati s 50 mL hladne destilovane vode.

Sirovi 7-hidroksi-4-metilkumarin prekristalizirati iz 95% etanola

koristeći aktivni ugalj.

Osušti prekristalizirani kumarin, izvagati svoj produkat na papirnoj

lađici i odrediti tačku topljenja.

Rezultate upiši u svoj dnevnik.

Na papirnoj lađici upiši svoje ime, podatke i naziv spoja kojeg si

sintetizirao, te predaj asistentu.


27

7 PRIPREMNA VJEŽBANJA

1. Objasni pojam reakcija kondenzacije!

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

2. Napiši reakciju sinteze 7-hidroksi-4-metilkumarina!

3. Objasni ulogu sulfatne kiseline u sintezi 7-hidroksi-4-metilkumarina!

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

________________________________________________________

____________________________________________________

4. Napiši sve moguće izomere rezorcinola i imenuj ih po IUPAC nomenklaturi?


28

8 IZVJEŠTAJ

Ime i prezime: _______________________________________ Grupa:___________

Datum: ___________________ Asistent: ___________________________________

masa rezorcinola: ____________ g

količina rezorcinola: ____________ mol

teorijski prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina

masa sintetiziranog 7-hidroksi-4-metilkumarina:

____________ g

____________ g

prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina: ___________ %

tačka topljenja 7-hidroksi-4-metilkumarina (interval topljenja) ______°C (_______°C)

PITANJA:

Koliki je prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina ako si za sintezu uzeo/la 3 g rezorcinola, a

dobio/la si 4 g 7-hidroksi-4-metilkumarina?

OVJERA VJEŽBE


29

Vježba br 6

HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (TLC)

TLC je jednostavna, brza i jeftina procedura koja hemičaru daje odgovor koliko se komponenti

nalazi u smjesi. Ona se koristi za identifikaciju komponente upoređujući njenu Rf vrijednost sa Rf

vrijednošću poznate komponente (obje se nalaze na istoj ploči).

Kod TLC-a stacionarna faza (adsorbens) je u tankom sloju nanešena na staklenu ploču određenih

dimenzija, najčešće 20 x 20 cm (10 x 10 cm). Kao adsorbensi koriste se silika gel, aluminij-oksid,

celulozni prah i poliamid. Može biti impregniran i cink-sulfid (fluerescirajuća supstanca) zbog

detekcije pod UV-svjetlom.

Izbor adsorbensa se vrši na osnovu njegove aktivnosti koja je određena njegovom selektivnošću

(jačina aktivnih centara), kapacitetom (gustoća rasporeda aktivnih centara na površini adsorbensa),

veličinom čestica i aktivitetom (sadržaj vode).

Veze kojima se organska komponenta veže na adsorbens zavise od jačine slijedećih tipova

interakcije: ion-dipol, dipol-dipol, vodikove veze, dipol inducirani dipol, i Van der Walsove sile. Kod

silika gela dominantne interakcije između adsorbensa i materijala koji treba biti razdvojen su dipol-

dipol tipa. Polarnije molekule djeluju poprilično jako sa polarnim Si-O vezama ovog adsorbensa i

nastojat će da se adsorbuju na fine čestice adsorbensa, dok slabije polarna molekule nisu tako jako

vezane. Slabije polarne molekule zbog toga nastoje da prođu kroz adsorbens brže od polarnih.

Različite komponente u uzorku putuju različitim brzinama zbog razlika u rastvorljivosti u

rastvaraču i razlikama u privlačnosti sa stacionarnom fazom. Rezultati ovise od upotrebljenog

rastvarača.

Vizualizacija tačaka se može napraviti tako što ploču prskamo sa odgovarajućim detekcionim

reagensima. Za svaku klasu organskih spojeva postoje karakteristični detekcioni reagensi koji sa

komponentema uzorka daju karakteristična obojenja ili pojavu fluorescencije.

Uzorak rastvoren u odgovarajućem rastvaraču se nanosi u vidu mrlje na jednu stranu ploče, na

udaljenosti 1 cm od ivice. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji kapilarnim

silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom komponente uzorka, koje se kreću do određene

udaljenosti na ploči. Zbog različitog afiniteta komponente se zaustavljaju na različitim mjestima na

ploči, što omogućava njihovu identifikaciju

Za svaku komponentu karakteristična je njena Rf vrijednost koja se dobije iz omjera dužine

pređenog puta komponente i dužine pređenog puta mobilne faze. Rf vrijednost nije fizikalna konstanta

i ona zavisi od:

a) vrste mobilne faze i stepena zasićenosti atmosfere mobilnom fazom u kadi za razvijanje;

b) aktiviranja i uslova čuvanja ploča za hromatografiju;

c) veličine čestica adsorbensa;

d) debljine sloja adsorbensa.

Da bi se mogao identificirati određeni spoj potrebno je imati standard određene čistoće. Spoj je

identificiran TLC-om ako je nakon detekcije određenim detekcionim reagensom isto obojen kao

njegov standard i ako ima istu Rf vrijednost kao i standard pod istim uslovima.


30

Hromatografija na tankom sloju ima široku primjenu u analizi organskih spojeva. Njome se vrše

preliminarna ispitivanja, separacija, identifikacija i određivanje čistoće različitih spojeva.

2.1 Alkaloidi

Većina biljnih alkaloida su tercijarni amini; drugi sadrže primarni, sekundarni ili kvanterni nitrogen.

Slika 1-4. Bazičnost alkaloida varira u zavisnosti kojem tipu od ova četiri pripada. Veličina uzorka

alkaloida koja će se aplicirati na TLC ploču mora biti izračunata prema srednjoj vrijednosti sadržaja

alkaloida specifičnog ekstrakkta. Ekstrakcija se vrši na slijedeći način: usitnjena droga 1 g dobro se

izmiješa sa 1 ml 10% rastvorom amonijaka ili 10% rastvoromm Na2CO3 i onda se ekstrahira sa 5 ml

metanola 10 minuta pod povratnim hladilom. Filtrat se koncentrira prema sadržaju ukupnih alkaloida

specifične droge, tako da 100 μl sadrži 50 – 100 μg ukupnih alkaloida. Većina istraživača koristi

silika gel 60 F254, ali aluminij oksid je također pogodan. Mnoge mobilne faze sadrže hloroform, čija

se moć eluacije može smanjiti dodatkom cikloheksana ili povećati dodatkom acetona, etanola ili

metanola. Mobilna faza je obično bazna dodatkom amonijaka ili dietilamina do manje polarnih

rastvarača, ali dietilamin nije tako lako ukloniti prije prskanja. Najčešći eluenti su hloroform-metanol

(90:10) ili hloroform-dietilamin (90:10). Također se može koristiti i mješavina koja je pogodna za

većinu alkaloida toluen-etil acetat-dietilamin (70:20:10).

Detakcija alkaloida je moguća pod UV svjetlom 254 nm i 365 nm kao i sa dva reagensa. Dragendorff i

jodoplatinat.

2.4 Esencijalna ulja

Esencijalna ulja su mirisne komponente koje se nalaze u različitim djelovima biljke zbog toga što

isparavaju kada se izlože zraku na sobnoj temperaturi zovu se i volatilna ulja, eterična ulja ili

esencijalna ulja. Najčešće se sastoje od (a) terpena npr. alkohola (borneol, geraniol, linalol, mentol),

aldenihda (anisaldehid, citral), ketona (tujon), estera (bornil acetat, linalil acetat) ili (b) fenil

propanskih derivata (eugenol, safrol) itd. Rastvorljiva su u etanolu i toluenu i najčešće se dobivaju

hidrodestilacijom biljnog materijala. Za pripremanje ekstrakta, mikro-destilacija je metod koji se

koristi da bi se izvuklo i sačuvalo esencijalno ulje. Esencijalno ulje se ekstrahuje toluenom, ili

ksilenom i sadrži uzorak koji će biti analiziran metodom TLC, ali tkođer možemo ga izolovati i sa

heksanom, eterom ili acetonom.

Najčesće stacionarna faza koja se koristi je silika gel, a mobilne faze koje se koriste su : benzen,

toluen, hloroform. Zbog svoje toksičnosti benzen se ne preporučuje kao rastvarač za TLC. Mobila faza

toluen-etil acetat (97:3) je pogodan za sva važna esencijalna ulja.različiti rastvarači mogu se primjeniti

u posebnim slučajevima npr. toluen (Pimpinella anisum), hloroform (Melissa officinalis), metilen

hlorid (Pimpinella, Juniperus, lavandula, Rosmarinus i Salvia), toluen-etil acetat (Eucaliptus,

Mentha), hloroform-toluen (75 : 25) za Thyms vulgaris i Chamomilla recutica.

Detekcija pod UV svjetlom na 254 nm za komponente koje sadrže najmanje dvije konjugirane

dvostruke veze i gase tamne zone naspram zelenoj fluorescirajućoj pozadini. Ovo je slučaj kad su u

pitanju derivati fenil-propana (anetol, šafrol, eugenol itzd). Reagensi koji se koristi za prskanje su:

anisaldehid-sulfat koji daje plavo, zeleno, crveno i smeđe obojenje i fosfomolibdenska kiselina koja

daje plave mrlje na žutoj pozadini. Reagens koji se najčešće koristi je vanilin-sulfat koji daje širok

dijapazon boja.


31

EKSPERIMENTALNI RAD

1 ZADATAK VJEŽBE

- Pripremi ploče za tankoslojnu hromatografiju.

- Izvrši separaciju komponenti esencijalnog ulja tankoslojnom hromatografijom.

- Rezultate analize upiši u svoj laboratorijski dnevnik.

2 HEMIKALIJE I REAGENSI

- dihlormetan

- iod/škrob reagens za detekciju*

- vanilin/sulfatna kiselina reagens za detekciju*

- silika gel (GF-245)

- anhidrovani natrijum sulfat

- etilacetat

- toluen

3 PRIBOR I OPREMA

- Erlenmayerova tikvica, 250 mL

- čaša od 100 mL, 2 komada

- staklene kapilare

- ploče za tankoslojnu thomatografiju

- kada za tankoslojnu hromatografiju

- sprejalica za tankoslojnu hromatografiju

- UV-lampa

- eksikator

4 IZVOĐENJE VJEŽBE

Preliminarna ispitivanja heterogenosti uzorka ulja, rade se tankoslojnom hromatografijom.

Kao rastvarač koristi se sistem toluen – etilacetat (97:3)

Priprema reagenasa

Anisaldehid – sulfatna

kiselina

0,5 ml anisaldehida, 10 ml glacijalne sirćetne kiseline, 85 ml

metanola i 5 ml koncentrovane sulfatne kiseline, se pomiješa

navedenim redom i priprema neposredno pred upotrebu

Vanilin – sulfatna kiselina

C8H803/H2SO4 a) 1 % etanolni rastvor vanilina – rastvor I

b) 10 % etanolni rastvor sulfatne kiseline – rastvor II

Jod / škrob (pare joda /

1 % rastvor škroba)

2 g topivog škroba pomiješa se sa 5 ml vode i ulije u 45 ml

ključale vode, smjesa se zagrijava 2 min i spremna je za

upotrebu nakon hlađenja

Fosfomolibdenska

kiselina

P20524MoO3xH2O

20 % etanolni rastvor fosfomolibdenske kiseline


32

Tankoslojna hromatografija

Pripremi dvije hromatografske ploče. Na svaku nanesi pripremljene

uzorke

Odredi startnu liniju na hromatografskoj ploči, oko 1,5-2,0 cm od

ruba ploče.

Na startnu liniju nanesi uzorke esencijalnog ulja, tako da je najmanji

razmak među mrljama 2 cm.

Na hromatografske ploče nanesi i uzorak standarda kojeg ćeš dobiti

od asistenta.

Kao mobilnu fazu pripremiti otopinu toluen – etilacetat u volumnom

omjeru 97:3.

Pažljivo prenesi hromatografske ploče u kadu u kojoj se nalazi

mobilna faza.

Startna linija mrlja uzoraka mora biti iznad površine mobilne faze.

Kada mobilna faza pređe određeni put na hromatografskoj ploči,

ploče pažljivo izvadi iz kade, označi front i ostavi ploče da se osuše.

Detekcija komponenata esencijalnog ulja

DETEKCIJA POD UV LAMPOM 365 nm i 254 nm

Suhu Ploču stavi pod UV lampu i uoči da li je neke od komponata

moguće detektovati na ovaj način

DETEKCIJA REAGENSOM IOD/ŠKROB*

Suhu hromatografsku ploču prenesi u eksikator u kojoj se nalaze

kristali ioda. Uočit ćeš ljubičaste pare ioda koji sublimira u

eksikatoru.

Kada na hromatogramu uočiš žuto-smeđe mrlje ioda koji se adirao na

komponente esencijalnog ulja, ploče pažljivo izvadi iz eksikatora.

Da bi se fiksirale detektirane žute mrlje, razvijene hromatograme

sprejaj otopinom škroba koju ćeš dobiti od laboranta.

Detektovane žute mrlje postat će modro-plave.

* Reagens iod/škrob je univerzalni detekcioni reagens na sve organske spojeve.

DETEKCIJA REAGENSOM ANISALDEHID – SULFATNA KISELINA

Ploča se prska sa 10 ml reagensa, zagrijava na 100 - 105°C, 5-10 min,

dok mrlje ne postignu maksimum intenziteta boje. Detekcija se vrši

na dnevnoj svjetlosti ili/i pod UV 365 nm. Reagens je specifičan za


33

različite prirodne materijale, posebno derivate terpena, ali i za fenole,

šećere i steroide, koji daju različito obojene produkte (ljubičasto,

plavo, crveno, žuto ili zeleno) zavisno o vrsti jedinjenja.

DETEKCIJA REAGENSOM VANILIN – SULFATNA KISELINA

Ploča se prvo prska rastvorom I, a zatim odmah rastvorom II.

Zagrijavaj u sušnici na 110°C, 5-10 min. Reagens je specifičan za

komponente esencijalnog ulja, npr. terpenoide i fenilpropanoide.

Nastaju mrlje sličnih boja kao kod detekcije s anisaldehidom.

Hromatografsku ploču stavi pod UV svjetlost. Uočit ćeš

fluorescenciju različitih boja.

* Reagens vanilin/sulfatna kiselina je univerzalni detekcioni reagens na komponente

esencijalnih ulja.

DETEKCIJA REAGENSOM FOSFOMOLIBDENSKA KISELINA

Ploča se prska sa 10 ml rastvora, nakon čega se zagrijava na 100

- 110°C, 5 min nastaju plave mrlje na žutoj pozadini.

Univerzalni reagens za reducirajuća jedinjenja uključujući

terpene.

Identifikacija komponenata esencijalnog ulja

Prebroj komponente svakog uzorka na oba razvijena hromatograma.

Odredi Rf vrijednosti standarda koje si dobio od asistenta i odredi da

li imaš iste komponente u svom uzorku.

Upiši rezultate u svoj laboratorijski dnevnik.


34

Rezultati vježbe

Uzorci___________________________________________________________________

Standardi _______________________________________________________________

Mobilna faza _____________________________________________________________

Stacionarna faza __________________________________________________________

Upiši Rf vrijednosti i odgovarajuću boju detektovane komponente u prvu kolonu, a u drugu

kolonu upiši podatke za korišteni standard

Uzorak Standard

Rf vrijednost Boja Rf vrijednost Boja

OVJERA VJEŽBE


35

Vježba br 7

IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA PRIRODNIH PRODUKATA

Naziv spoja

CAS broj

Molekulska masa

Molekulska

formula

Strukturna formula

Prirodni izvori

Maksimović et al, 2007

Načini izolacije

Navesti literaturni izvor

Identifikacija


Separacija


Kvantitativno

određivanje


Literatura:

Napomena :

Na web stranici predmeta nalazi se isti ovaj formular u word-formatu koji možete koristiti

pri pripremi ove vježbe.

Ovjera


36

UPUTE

Zadatak je predstaviti način izolacije i identifikacije određenog prirodnog produkta,

pregledom dostupne literature.

Navesti ;

Ime, molekulska i strukturna formula, CAS broj, molekulska masa

prirodne izvore za zadati spoj (npr; biljnog porjelka, specificirati vrstu –e u kojima se

može naći i u kojim količinama)

specifičnosti ( nije obavezno ali ukoliko ima neku specifičnost npr. vezanu za

upotrebu, uticaj na živi organizam......)

način izolacije (npr; destilacije, ekstrakcije.......)

način separacije (npr; hromatografije, ekstrakcije........)

način identifikacije (npr; spektroskopske metode, IR, NMR....)

kvantitativno određivanje (navesti instrumentalnu tehniku)

spisak literature (za svaki od navedenih koraka navesti literaturu predstavljenu

spiskom po harvardskom načinu pisanja literature) npr;

Maksimovic, M., Vidic, D., Milos, M., Solic, M. E., Abadzic, S., Siljak-Yakovlev, S. (2007)

Effect of the environmental conditions on essential oil profile in two Dinaric Salvia species: S.

brachyodon Vandas and S. officinalis L., Biochemical Systematics and Ecology, 35, 473-

478.

Documents

PRAKTIKUM IZ HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA … za organsku hemiju i biohemiju... · HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vježbe 1 PRAKTIKUM IZ HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA izabrane