PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF AN ACIDIC PROTEASE FROM THE VISCERA OF BOLTI FISH (Tilapia nilotica)A.E. El-Beltagy, T.A. El-Adawy *, E.H. Rahma, A.A. El-Bedawey

PENDAHULUANProtease merupakan kelompok yang paling penting dari industri enzimProtease dapat diekstraksi dari organisme hidupPengolahan Perikanan menghasilkan limbah cair maupun padat yang tidak sedikit.Protease dapat digunakan sebagai bahan pengolahan limbah Dalam kurun waktu beberapa tahun terakhir, aplikasi tambahan protease dalam industri makanan berkembang cukup pesat

Selain untuk industri enzim, protease dapat diaplikasikan dalam industri makanan.Protease berasal dari tanaman, hewan dan mikroba sedangkan protease yang berasal dari laut dan sumber air lainnya, belum dimanfaatkan secara maksimal.Sebagai contoh, hanya sekitar 15%dari udang yang menjadi menjadi produk udang kaleng.. Sudah banyak produk olahan limbah perikannan,namun pada umumnya bernilai tidak terlalu tinggi.Ikan memiliki sifat berdarah dingin, sehingga dalam kebiasaan(pola-red) makan mereka berubah ubah sehingga diharapkan enzim pencernaan mereka juga bervariasi.Beberapa contohnya melalui penghapusan selektif kulit, hidrolisis membran dan jaringan pendukung dan pemulihan pigmen untuk ekstrak rasa.Penelitian ini dilakukan sebagai usaha untuk pemanfaatan ikan sebagai sumber enzim dan juga untuk pengurangan masalah pembuangan limbah.

*

BAHANBahanSampel ikanIkan Bolti (Tilapia nilotica) dibersihkan dari jeroan sesegera mungkin, kemudian disimpan dalam kantong tertutup plastik pada suhu 20oC hingga nantinya digunakan untuk ekstraksi enzim

*

BAHANReagenAlbumin serum sapiAsam trikloroasetatGliserol,b-mercaptoethanolTris (hydroxymethylaminomethane)Coomassie brilliant blue R-250AkrilamidaBisacrylamideTetramethylethylenediamineNatrium sulfat dodesilAmonium persulfatEthylenediaminetetraacetic

METODE Persiapan Asam Protease KasarPemurnian Enzim

Pengendapan Amonium SulfatDialisisFiltrasi GelPenentuan Homogenitas EnzimPenentuan Berat Molekul

1. Persiapan Asam Protease KasarJeroan di thawing dengan suhu 40C di dalam kulkasPowder disimpan dalam botol gelas coklat suhu -200CHomogenasi dengan aseton dingin 8 volume 30 sekonHomogenat di saring dan material aseton tak terlarut dicuci sebentar dengan aseton dingin lalu dicuci dengan eter. Lalu dikeringkan pada suhu ruangan (25+20C) semalam

LanjutanBubuk kering aseton diekstrak dengan air hasil sulingan (1:20, w/v) selama 1 jam menggunakan mesin pengocoksupernatan dibiasakan untuk pH 2,5 dengan cara penambahan 0,1 M HCL lalu ditahan selama 30 menitSupernatan didiaslisis terhadap air sulingan pada suhu 40C semalamdibiasakan kembali dalam pH 5 dengan ditambahkan 0,1 M NaOH setelah penghilangan asam yang mengendap

2. Pemurnian EnzimA. Pengendapan Amonium SulfatKonsentrasi larutan dibuat menjadi 40% lalu disentrifuge 10,000 rpm selama 10 menit dan endapan yang diperoleh dihilangkanLarutan enzim konsentrasinya dibuat menjadi 60% jenuh dan endapan enzim ditahan, sisanya dihilangkan atau dibuang

Hasil ekstark didialisis, terlarut dalam 0,02 M buffer asetat pada pH 5. dsimpan dalam gelas botol coklat dengan suhu -200C untuk pemurnian lebih lanjut.

CARA PERTAMACARA KEDUA

B. DialisisEnzim diproduksi dari tahapan sebelumnya yaitu dialisis terhadap buffer/penyangga yang sama Buffer tersebut 0,02 M asetat dengan pH 5 selama 24 jam suhu 40C Buffer mengalami dua kali perubahan.

C. Filtrasi GelEnzim dialyzed dipecah pada sebuah Shepandex 6-100 kolom 1x50 cm.Kolom tersebut diequilibrasi dan dielute dengan 0,02 M asetat pH 5Elution dibawa keluar pada angka aliran 20 ml/jam dan 3 ml pecahannya dikumpulkan secara manualAbsorban 280 nm dan aktivitas enzim dipertimbangakan dalam semua pecahan menggunakan spektrofotometer Pecahan aktif dikumpulkan dan disimpan pada suhu -200C untuk analisis lebih jauh

D. Penentuan Homogenitas EnzimElektroforesis gel poliakrilamida digunakan untuk memantau homogenitas enzimEnzim mentah dan telah dimurnikan yang dicampur dengan 0,01 M buffer sodium fosfat pada pH 7,8 dan didialisis semalam pada suhu 4 oC terhadap buffer yang samaElektroforesis dilakukan pada 0,01 M sodium fosfat pH 7,8 pada arus konstan dari 3 ma / tabung selama 3 jam. Gel dinodai dengan 0,5 % amido Hitam di 7,5% asam asetat selama 30 menit. Destaining dilakukan pada 7,5% asam asetat untuk menghapus pewarna bebas.

E. Penentuan Berat MolekulDodesil elektroforesis gel poliakrilamida sulfat dilakukan untuk menentukan berat molekul enzim murni dengan menggunakan metode KemenyEkstrak enzim murni dicampur dengan air suling yang mengandung 0,062 M Tris, 4% sodium dodesil sulfat, 10% gliserol, 1,5% -mercaptoethanol dan 0,002% bromophenol biru (pH 6.8)Gel poliakrilamida (monomer yang berkonsentrasi 8,33%) dalam tabung gel vertikal yang mengandung 0,15% SDS dan 0,375 M Tris telah disiapkanProses dari buffer yang mengandung 3.03 g Tris, 14.42 g glisin dan 1 g SDS per liter100 l sampel yang diterapkan pada permukaan gel dan difraksinasi selama 3 jam pada 300 V di bawah pendinginGel bernoda semalam di 25 mg Coomassie Brilliant Blue-R 250 asam trikloroasetat, air suling, metanol dan asam asetat (5,8: 72: 18: 6, w / v / v / v), kemudian destained dalam air suling; metanol dan asam asetat (134: 58: 10, v / v / v). Standard kalibrasi protein, yaitu fosforilase b (92.500), albumin serum sapi (66.200), ovalbumin (45.000), karbonat anhidrase (31.000), kuntize tripsin inhibitor kedelai (21.000), digunakan sebagai penanda berat molekul. Pergerakan relatif dihitung dan diplot terhadap logaritma berat molekul untuk menghitung berat molekul protein

METODEUji Aktivitas ProteasePenentuan aktivitas asam protease seperti yang dijelaskan Anson dan Mirsky (1932), menggunakan 2 % hemoglobin pada pH 2 dan 30 oC. Unit pepsin dihitung dari kemiringan awal pada A 280 nm di waktu produk TCA larut, sebagai jumlah enzim yang menghasilkan pada A 280 nm peningkatan dari 0,0042 per menit per ml campuran reaksi

Kadar ProteinKadar protein dapat ditentukan dengan metode Lowry, Resebrough, Far dan Randell (1951) menggunakan serum albumin sapi sebagai standar.

METODE ENZIM KINETIKpH optimum stabilitas pHSuhu optimalThermostabilityDeterminasi dari Km dan VmaxInhibitor dan aktivator

pH OptimumSubstrat hemoglobin dalam berbaga larutan buffer (0,2 M HCl-KCl penyangga pH 2.0,0.2 M buffer sitrat fosfat pH 3-7 dan 0,2 M 3-HCl buffer pH 7-11)Stabilitas pHPerlakuan sebelum inkubasi enzim dalam larutan buffer selama 30 menit pada suhu kamar (25 1C)

Suhu OptimalInterval suhu (10-80oC)ThermostabilitasEnzim diinkubasi di berbagai suhu (50, 60, 70 dan 80oC) selama 30, 60, 90 dan 120. Suhu (50, 60, 70 dan 80oC) selama 30, 60, 90 dan 120

Determinasi dari Km dan VmaxKonsentrasi (2,5, 5, 7,5 dan 10 mg / ml)Inhibitor dan AktivatorKonsentrasi berbeda pada CaCl2 dan NaCl (10, 20, 30, 40 dan 50 mM).

HASIL DAN PEMBAHASANPEMURNIAN ENZIM

STABILITAS pH

Asam protease sebenarnya dapat melakukan aktivitasnya pada kisaran pH 2-5Aktivitasnya menurun sejalan dengan kenaikan pHAktivitas terendahnya pada pH 11Ketidakstabilan asam protease pada kondisi basa karena enzim ini awalnya berda di pencernaan yang kondisinya cenderung asam.

SUHU OPTIMALrelative activity meningkat sejalan dengan peningkatan suhu mulai dari 10 sampai 35oC dan kemudian mengalami penurunan, namun pada suhu 70 oC tidak terdeteksi adanya aktivitas enzim.

THERMOSTABILITAS

THERMOSTABILITASrelative activity asam protease dapat bertahan lebih dari 50% setelah pemanasan 50oC dan 60oC selama 30 menit, sedangkan pada pemanasan 120 menit dapat kehilangan aktivitasnya 40,4% pada 50oC dan 74,9% pada 60oC. enzim kehilangan aktivitasnya saat dipanaskan pada 70oC selama 30 menit. Enzim proteolitik dari ikan Bolti memiliki sifat termal yang unik, yaitu lebih rentan terhadap inaktivasi panas daripada hewan yang hidup pada suhu yang lebih tinggi.

PENENTUAN Km DAN VmaxKm dan Vmax dari enzim asam ditentukan menggunakan hemoglobin sebagai substrat pada konsentrasi (2,5, 5, 7,5 dan 10 mg/ml) (metode Lineweaver-Burke)

Hasil Km dan VmaxKm dan Vmax nilai protease asam sebesar 0,77 mM dan 2.22 mM/menit Efisiensi katalis (Vmax / Km) adalah 2.88. Hasil ini lebih tinggi dari yang dilaporkan oleh Ibrahim (1994) bahwa Km dan Vmax adalah 0.180 dan 0.044 untuk minyak mentah protease asam Bolti.Namun, lebih rendah dari yang diperoleh Arunchalam dan Haard (1985), bahwa Km dan Vmax cod Polar protease lambung adalah 1,33 dan 31,00

Selain untuk industri enzim, protease dapat diaplikasikan dalam industri makanan.Protease berasal dari tanaman, hewan dan mikroba sedangkan protease yang berasal dari laut dan sumber air lainnya, belum dimanfaatkan secara maksimal.Sebagai contoh, hanya sekitar 15%dari udang yang menjadi menjadi produk udang kaleng.. Sudah banyak produk olahan limbah perikannan,namun pada umumnya bernilai tidak terlalu tinggi.Ikan memiliki sifat berdarah dingin, sehingga dalam kebiasaan(pola-red) makan mereka berubah ubah sehingga diharapkan enzim pencernaan mereka juga bervariasi.Beberapa contohnya melalui penghapusan selektif kulit, hidrolisis membran dan jaringan pendukung dan pemulihan pigmen untuk ekstrak rasa.Penelitian ini dilakukan sebagai usaha untuk pemanfaatan ikan sebagai sumber enzim dan juga untuk pengurangan masalah pembuangan limbah.

*

*