Février 2000

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

PROBLEMATIQUE DES ENDOTOXINES EN DIALYSE DANS LE MILIEU MEDICAL

MOTS - CLE

endotoxines / dialyse / hémodialyse / dialysât / ultrafiltration / pyrogène / membrane / test du LAL / lipopolysaccharides

RESUME Dans le milieu médical, l’hémodialyse permet par ultrafiltration sanguine de pallier à une déficience rénale. L’eau utilisée (dialysât) doit être exempt d’endotoxines (lipopolysaccharide) d’origine bactérienne. Les substances pyrogènes, détectées par le test du LAL sont éliminées par différentes méthodes de dépyrogénation.

PROBLEMATIQUE DES ENDOTOXINES EN DIALYSE DANS LE MILIEU MEDICAL

INTRODUCTION La dialyse (ou diffusion) est l'échange de solutés entre deux liquides de composition différente à travers une membrane semi-perméable [1]. L'application médicale de cette technique, l'hémodialyse, est un traitement largement utilisé pour épurer le sang en cas d'insuffisance rénale avancée. L'hémodialyse réalise un échange de solutés et d'eau entre le plasma du malade et une solution de dialyse (dialysât) [2]. Ce dialysât est un mélange d'eau osmosée (épurée et ne contenant plus de sels minéraux) et de solutions concentrées en éléments essentiels. La composition du dialysât est soigneusement ajustée pour permettre l'extraction sélective des composés polluants le courant sanguin et d'en préserver les éléments essentiels. Cette ultrafiltration du plasma résulte d'une différence de pression modérée entre le sang et le dialysât, de l'ordre de grandeur de la pression artérielle, soit 20 kPa (140 mmHg) [3]. L'eau servant à la préparation du dialysât provient du réseau et n'est pas stérile, elle nécessite donc un traitement. Malgré celui-ci des bactéries dîtes Gram - ont la possibilité de se multiplier assez rapidement dans l'eau pure sans aucun nutriment. Elles résistent également aux désinfectants [4]. Certains constituants de la paroi des bactéries Gram -, les endotoxines, peuvent exercer des effets biologiques sur les patients même en l'absence de bactéries. Elles correspondent au composé Lipopolysaccharidique (LPS) [5]. L'élément toxique du LPS est la partie lipidique communément désignée comme le lipide A [6]. Les endotoxines ont un poids moléculaire variable estimé entre 100000 et 900000 daltons (1000 à 2000 daltons pour le lipide A). Elles sont thermostables, elles gardent donc leur propriété après chauffage (exemple : résistance à l'autoclave). Leur pouvoir toxique n'est neutralisé ni par le formol, ni par les antisérums [7]. L'endotoxine est une molécule pyrogène dont les conséquences croissantes en fonction de sa concentration sont : des réactions fébriles, un état de choc, une coagulation sanguine, un état de faiblesse, une diarrhée, une inflammation jusqu’à une hémorragie intestinale, un trouble de la coagulation : fibrinolyse (dégradation enzymatique de la fibrine, constituant protéique principal des caillots sanguins) [6]. Il existe également une hypothèse selon laquelle de petites quantités d'endotoxines, insuffisantes pour produire des réactions fébriles pourraient contribuer au développement de l’amyloïdose, complication bien connue de la dialyse chronique [8]. Les problèmes qui se posent sont de savoir pourquoi les endotoxines sont présentes, comment elles sont détectées et comment elles sont éliminées. COMMENT EXPLIQUER LA PRESENCE DES ENDOTOXINES ? L'eau rentrant dans la composition du dialysât est obtenue à partir d'eau de ville, après passage dans une station de traitement [1]. L'eau de dilution est donc une eau potable de laquelle on élimine des substances potentiellement toxiques pour les malades, à savoir : les inorganiques solubles (dont les métaux lourds), les organiques solubles (dont les chloramines), les bactéries et les pyrogènes [7].

• L'INSTALLATION DE TRAITEMENT DE L’EAU DE DILUTION DES SOLUTIONS CONCENTREES (cf. figure 1)

- Premier étage de traitement : passage de l'eau de ville sur un filtre à sable puis filtration 5 à 10 microns, passage dans les résines des adoucisseurs, filtre à charbon pour déchlorer, filtre anti-colloïde. - Deuxième étage de traitement : passage de l'eau à travers un ou deux osmoseur(s) en série, stockage ou non de l'eau osmosée, départ de la distribution de l'eau dans une boucle avec présence ou non au départ d'une microfiltration à 0.1 micron ou d'une ultrafiltration.

- Troisième étage de traitement : captage de l'eau de la boucle par une vanne et distribution à un générateur par un tuyau allant de la vanne à la machine. L'eau continue de circuler dans la boucle 24 heures sur 24. Celle non réutilisée revient au deuxième étage de traitement, soit dans la cuve d'eau osmosée après filtration, soit en amont du dernier osmoseur [4].

Figure 1 : schéma de la chaîne de fabrication de l'eau pour dilution des concentrés de dialyse et du dialysât [5]

Adoucisseur

Charbon

actif

RO

Patient

A A A A

AA

B1

B2

B3

A : Sites favorables à la prolifération bactérienne

B : Eléments nécessaires pour l’ obtention d ’une eau ultra pure B1 :Osmoseur inverse, B2 :Ultrafiltre; et d ’un dialysât stérile et pyrogène B3 : ultrafiltre

A

Eau deville

PrétraitementOsmose

inverse

Cuve

de stockage

Boucle derecirculation

Tuyaud ’alimentation

Générateur

2ème étage de traitement

1er étage de traitement

3ème étage de traitement

• L’INSTALLATION DE TRAITEMENT

Les sites de prolifération bactérienne

L'installation de traitement ne permet pas toujours d'avoir une eau de qualité microbiologique irréprochable. En effet, elle peut présenter des sites de prolifération bactérienne. Ces bactéries ne sont plus présentes dans le dialysât grâce à l'ultrafiltration. En revanche, les endotoxines ayant pu passer à travers la membrane, se retrouveront dans le dialysât. Les éléments du circuit favorisant la prolifération sont : - Les filtres à cartouche : ils sont constitués de feutre, de coton tissé ou de fibre de verre dans lesquels les micro-organismes s’enchâssent. Ces derniers y trouvent des matières organiques également retenues qui vont leur servir de substrat et de ce fait permettre leur développement. - Les adoucisseurs et les désioniseurs : les germes se logent dans les infractuosités de la résine échangeuse d'ions et s'y multiplient. Ils deviennent alors difficiles à déloger malgré le lavage des résines à contre-courant, lors de leur régénération. - Les filtres à charbon actif : ils constituent un site privilégié pour la croissance des micro-organismes. Leur structure microporeuse offre une très large surface de fixation aux germes. Ils prolifèrent d'autant plus facilement que l'effet bactéricide du chlore est annihilé du fait de sa destruction, catalysée par le charbon.

- La cuve de stockage : son volume est assez important afin d'assurer la poursuite de la séance d'hémodialyse en cas de coupure d'eau ou de défaillance du circuit de traitement. Malgré la recirculation continu de l'eau, les mouvements de fluides y sont réduits et la relative stagnation favorise également le développement des micro-organismes [9]. - Les autres facteurs favorisant la contamination par les endotoxines sont : le tuyau reliant la boucle au générateur de dialyse (matériau souple utilisé, chlorure de polyvinyle, facilite l'adhérence des germes à la paroi) ; le circuit hydraulique du générateur de dialyse qui de par sa complexité favorise la fixation des germes ; le passage des produits bactériens à travers les membranes de dialyse et la contamination du dialysât (la contamination bactérienne fongique et endotoxinique est supérieure dans le dialysât comparée à l'eau, celui-ci est un milieu idéal de croissance bactérienne) [9].

Le dialyseur

Le procédé à contrôler impérativement est la membrane semi-perméable du dialyseur car elle est directement en contact avec le sang du patient. Le passage des endotoxines au travers des membranes de dialyse reste un fait controversé et de nombreuses études sont en cours. Une des hypothèses est que les endotoxines, par hydrolyse et en présence de détergent, peuvent se scinder et donner des molécules plus petites. Leur passage au travers des membranes de haute perméabilité devient alors possible. La seconde hypothèse pour ce phénomène serait liée à la nature de la membrane. En effet, les LPS passeraient à travers les membranes telles que le polysulphane, l'AN 69, le cuprophane et le PAN (polyacrilonicrile). Enfin, le passage des endotoxines pourrait être aussi du à l'intégrité de la membrane (tableau 1) [7].

Fragment d'endotoxines Membranes intactes Franchissement (2 à 20 kilodaltons) Stimulation des cytokines pour 50 pg/mg

Endotoxines Membranes réutilisées ou/et endommagées

Franchissement

Endotoxines Membranes intactes Stimulation des cytokines Passage par rétrofiltration

Tableau 1 : Nature du franchissement en fonction des endotoxines et du type de la membrane

En France, le dialyseur est une source d'infection moins importante car sa réutilisation est interdite, contrairement à l'Angleterre et aux États-Unis par exemple.

• LE PROBLEME DE LA RETROFILTRATION Plusieurs phénomènes physico-chimique sont utilisés en Hémodialyse, l'HDF (hémodiafiltration) combine les phénomènes de diffusion (transfert passif de solutés au travers de la membrane sans passage de solvant) et de convection (ou ultrafiltration, transfert simultané à travers de la membrane, du solvant et d'une fraction de son contenu en soluté grâce à une pression hydrostatique) [10]. La HDF induit des pertes liquidiennes du fait de la convection, qui sont compensées par la réinjection d'un dialysât (rétrofiltration). Celui-ci est de composition et de conductivité proche de celle du plasma et doit être exempt d'endotoxines donc stérile [11]. COMMENT DETECTER LES ENDOTOXINES ? La qualité des eaux pour dilution des concentrés de dialyse et pour préparation injectable est fixée par la Xème édition de la Pharmacopée Européenne de janvier 1993. L'eau doit contenir moins de 100 CFU/ml (Coliform Faecal Unit) et un taux d'endotoxine inférieur ou égal à 0,25 UE/ml (Unité Internationale d'Endotoxine) [4]. C'est pourquoi il est nécessaire de faire une recherche et un dosage systématique de ces dernières. A l'heure actuelle pour les endotoxines après le test du lapin pour

pyrogène, la méthode du LAL (Lysat d'Amoebocyte de Limule) semble le test le plus fiable et le plus reproductible [7].

• LE TEST DU LAL

L'addition d'une solution contenant des endotoxines à une solution de lysat provoque une turbidité, une précipitation ou une gélification du mélange. En effet, les cellules de l'hémolymphe d'un crabe, le Limulus polyphémus ont la particularité de se gélifier en présence de quantité même très faible d'endotoxines [11]. Seule la gélification est utilisée comme point d'équivalence dans l'essai de la pharmacopée. Il existe des méthodes quantitatives, fondées sur la mesure du degré de turbidité ou de concentration d'un colorant libéré par la lyse d'un peptide chromogène (qui produit de la couleur). Elles peuvent être adaptées au contrôle de qualité après validation.

Phases préliminaires La vitesse de la réaction dépend de la concentration en endotoxine, du pH (6,5 - 7,5) et de la température (37°C +/- 1°C). La réaction nécessite aussi la présence de cations bivalents, d'un système enzymatique favorisant la coagulation et de protéines coagulables dans le lysat. Le produit satisfait à l'essai seulement si sa teneur en endotoxines bactériennes est inférieure à la limite spécifiée. Avant de procéder à l'essai des endotoxines sur la préparation à examiner, plusieurs étapes sont nécessaires : - étalonnage des endotoxines : la mise au point du test de recherche des endotoxines a nécessité l'établissement de produits de référence de manière à ce que les utilisateurs puissent évaluer leurs étalons de travail. L'étalon d'endotoxine PBR (préparation d'endotoxine de référence) est titré par rapport à l'étalon international d'endotoxine de l'O.M.S. (Organisation Mondiale de la Santé). Son activité est exprimée par unité internationale d'endotoxines par millilitres. L'unité internationale d'endotoxine est définie comme l'activité spécifique d'une masse donnée de l'étalon international ; - vérification de la sensibilité du lysat : la sensibilité est définie comme étant la concentration minimale d'endotoxine qui donne un gel solide dans les conditions de l'essai. Cette sensibilité est testé en présence et en absence du produit à examiner. Il ne doit pas exister de différences significatives entre les deux valeurs obtenues. Elle est exprimée en unité d'endotoxine par millilitres. Il est nécessaire de démontrer que l'échantillon n'est ni inhibiteur, ni activateur (facteurs d’interférence). Le phénomène d'inhibition se traduit par une diminution apparente de la sensibilité du lysat, l'activation quant à elle va se traduire par une augmentation apparente de celle-ci. L'hypothèse nulle (absence de facteur d'interférence) est acceptée lorsque la sensibilité du lysat, en présence du produit, n'est pas inférieure à 0,5 fois ni supérieure à 2 fois la sensibilité du lysat seul. Pour pallier à ces interférences, le moyen le plus courant est la dilution. Lorsque la dilution dépasse un certain seuil appelé "seuil maximale valide" (MVD), il est possible d'employer d'autres procédés tels que filtration, dialyse ou addition de substances déplaçant les endotoxines adsorbées. Les procédés employés pour éliminer ces facteurs d'interférence ne doivent entraîner ni augmentation ni diminution de la teneur en endotoxines du produit à examiner. Le LAL - RM (LAL Reactive Material), interférence positive, est une molécule non pyrogène qui peut faire réagir le test LAL de la même façon qu'une endotoxine. Le LAL - RM est une substance qui se retrouve dans les extraits de dialyseurs; on pense qu'il s'agirait d'une substance provenant d'un phénomène intrinsèque sur les membranes de dialyse. Les protéines plasmatiques, interférence négative, pourraient se lier aux fragments d'endotoxines, formant alors un complexe incapable d'activer le LAL [12] [13].

Interprétation des résultats En fonction de la présence d'un gel ou non, deux résultats peuvent être envisagés pour l'échantillon : - si l'essai a été réalisé en utilisant comme dilution la MVD, l'absence de gel indique que la concentration du produit en endotoxines est inférieure à la valeur limite, au contraire la présence de gel indique que la concentration d'endotoxine autorisée dans le produit est dépassée : c'est le test limite; - si l'essai est réalisé avec des dilutions inférieures à la MVD, on peut connaître la concentration en endotoxines du produit en multipliant la sensibilité du lysat par le facteur de dilution du dernier tube donnant une réaction positive ; nous pourrons dire que l'échantillon contient x Ul/ml : c'est un résultat semi-quantitatif [13].

Méthodes quantitatives en point final Le test consiste à ajouter un certain volume de LAL à une quantité identique d'échantillon ou de dilution d'endotoxine de référence dans un tube. La méthode turbidimétrique en point final est rarement utilisée car les auteurs n'ont pas les éléments nécessaires pour aborder cette technique. Il existe d'autres techniques telles que les méthodes quantitatives cinétiques, la turbidimétrie et la méthode chromogénique qui nécessitent cependant d'être validées pour être reconnues [13]. COMMENT ELIMINER LES ENDOTOXINES ? Si les techniques d’obtention de produits stériles sont actuellement au point (autoclave, filtration stérilisante sur membrane, stérilisation par rayonnement…), elles restent inefficaces sur les substances pyrogènes. Il existe à l’heure actuelle, deux approches pour éliminer les molécules pyrogènes telles que les endotoxines : l’inactivation ou l’élimination.

• LA DEPYROGENATION PAR INACTIVATION On entend par “ dépyrogénation par inactivation ”, l’élimination du pouvoir pyrogène (effets biologiques) provoqué par le LPS. Cette méthode sera principalement utilisée pour dépyrogéner le petit matériel. On pourra alors, dépyrogéner les embouts de pipettes, les tubes de prélèvement, les tuyaux de trempage, mais aussi les circuits, les cuves et les hémodialyseurs. La composition chimique des endotoxines fait qu’elles ne peuvent pas subsister longtemps dans un acide ou dans une base forte. Ainsi on pourra procéder à une hydrolyse acide (acide chlorhydrique à 0.05N pendant 30 mn à 100°C ou acide acétique glacial à 1% pendant 2 à 3 heures à 100°C) ou à une hydrolyse basique (saponification des acides gras de la molécule pyrogène grâce à la soude). On utilise également des anhydrides acétiques, succiniques ou phtaliques pour provoquer une réaction d’alkylation. Welch a mis en évidence l’élimination des pyrogènes de la pénicilline en utilisant une température supérieure à 250°C pendant 30 mn (méthode de la chaleur sèche). L’action de l’oxyde d’éthylène et du rayonnement gamma est aussi communément utilisée pour stériliser le matériel pharmaceutique. Enfin, Hort et Penfold ont mis en évidence que le peroxyde d’hydrogène (H2O2 : eau oxygénée) inactive les endotoxines à faible concentration et sous température peu élevée. L’eau oxygénée est facilement éliminée, mais altère de nombreux produits par oxydation.

• LA DEPYROGENATION PAR ELIMINATION L’élimination des endotoxines peut être réalisée par diverses méthodes fondées sur leurs propriétés physiques telles que la taille, la masse moléculaire, la charge ou bien les propriétés d’absorption.

En fonction de la taille

Les formes d'endotoxines apparaissant comme les plus nombreuses dans l'eau sont sans doute celles de haut poids moléculaire (pyrogènes liés au micro-organisme), arrêtées par des filtres de 0.22 µm. Si on se base sur le poids moléculaire des pyrogènes seuls, on utilise alors l'ultrafiltration, l'osmose inverse ou la distillation. Le problème de l’ultrafiltration est que les membranes se colmatent très vite et peuvent ainsi s’altérer, n’assurant plus une eau de qualité. On pourra alors, classiquement utiliser le “ Test de point de bulle ” pour définir l’intégrité de la membrane. C’est un test qualitatif qui permet de calculer le diamètre du plus gros pore cylindrique présent dans la membrane. Quant à la distillation, c’est la méthode la plus connue et la plus ancienne.

En fonction de la charge

La molécule de LPS est chargée négativement. Elle devrait par conséquent pouvoir être éliminée par chromatographie d’échange d’ions (méthode par attraction électrostatique). En réalité la méthode est relativement inefficace à cause de la masse moléculaire importante des LPS et de leur charge peu élevée.

En fonction des propriétés moléculaires Les polymères hydrophobes comme le polyéthylène, le polypropylène ont une affinité pour les endotoxines par des interactions hydrophobes. Les méthodes de dépyrogénation sont nombreuses mais malheureusement elles restent non concrétisable la plupart du temps au niveau des chaînes de traitement de l’eau pour dialyse [7]. CONCLUSION La pharmacopée, le laboratoire de microbiologie et le service de dialyse, par un partenariat efficace, permettent de garantir la qualité des liquides de dialyse et doivent agir au niveau des fabricants de générateurs pour obtenir une conception plus adaptée au respect de la qualité et du contrôle de l’eau et du dialysât.

GLOSSAIRE

amyloïdose : affection caractérisée par le dépôt dans de nombreux organes de substance extra cellulaire, solide, translucide, résistante aux enzymes anhydride : composé chimique provenant de la déshydratation totale d’un acide autoclave : récipient à parois épaisses et à fermeture hermétique pour réaliser sous pression la stérilisation à la vapeur chromatographie : méthode de séparation des constituants d’un mélange, fondée sur leur adsorption sélective par des solides pulvérulents ou sur leur partage entre deux solvants colloïde : nom donné à toute substance qui est de la nature de la colle de gélatine et ne peut être dialysée Dalton : unité de masse moléculaire égale à celle d’un atome d’hydrogène soit 1.66 x 10-24 gramme distillation : Opération consistant à vaporiser partiellement un liquide et à condenser les vapeurs formées pour les séparer lipopolysaccharide (LPS) : les endotoxines répondent à une définition précise, ce sont les LPS de la paroi des bactéries Gram négatif lysat : produit de la digestion ou de la dissolution des cellules ou des bactéries par les lésines plasma : liquide clair où baignent les globules du sang et de la lymphe pyrogène : qui provoque de la fièvre saponification : transformation des matières grasses en savon, à la suite de leur décomposition par une base en sel d’acide gras et en glycérine substrat : substance sur laquelle réagit une enzyme en facilitant sa transformation chimique

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