FACULTAD DE QUÍMICADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

CURSO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA(CLAVE 1807)

Licenciatura de QFB

Prof. Laura Carmona Salazar

Semestre: 13-II

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

• Los enzimas como catalizadores biológicos

• Determinación de la actividad enzimática

• Los enzimas como marcadores de lesión tisulartisular

• Enzimas séricas de importancia en el diagnóstico clínico

ESTRUCTURA Y NATURALEZA DE LOS ENZIMAS

EL ARREGLO DE UNA PROTEÍNA PARTICULAR ES ELRESULTADO DESU SECUENCIA ÚNICA Y ESPECÍFICA DE AMINOÁCIDOSY ES INDISPENSABLE PARA SU FUNCIONALIDAD

Ha y Loh, 2012Chemistry 18 (26):7984

LAACTIVIDAD CATALÍTICA DEPENDEDE LA INTEGRIDAD DE SU CONFORMACIÓNPROTEICA NATIVA

ADEMÁS PUEDEN REQUERIR DE OTROS COMPONENTESQUÍMICOS ADICIONALESQUÍMICOS ADICIONALES

VITAMINA COENZIMA REACCIÓN EN LA QUE ESTÁ INVOLUCRADA

Tiamina (vitamina B1) Tiamina pirofosfato Activación y transferencia de aldehídos

Riboflavina (vitamina B2) Flavin mononucleótido o FMN; flavin adenin dinucleótido o FAD+,

Oxidación-reducción

Niacina Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+; Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP+

Oxidación-reducción

COENZIMAS FUNDAMENTALES PARA LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DE VARIOS ENZIMAS

fosfato o NADP+

Ácido pantoténico Coenzima A Activación y transferencia de grupos acilo

Piridoxina Fosfato de piridoxal Reacciones que involucran la activación de aminoácidos

Biotina Biotina Activación y transferencia de CO2

Ácido lipoico Lipoamida Activación del grupo acilo:oxidación-reducción

Ácido fólico Tetrahidrofolato Activación y transferencia de grupos funcionales de un sólo carbono

Vitamina B12 Adenosil cobalamina; metil cobalamina

Isomerizaciones y transferencia de grupos metilo

CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMAS ACORDE A LA REACCIÓN QUE CATALIZAN

1) Oxidoreductasas.- Reacciones redox que involucran transferencia de electrones

2) Transferasas.- Reacciones de transferencia de grupos funcionales

3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis

4) Liasas.- Crean dobles enlaces

5) Isomerasas.- Reacciones de isomerización

6) Ligasas.- Formación de puentes con rompimiento de ATP

LOS ENZIMAS CATALIZAN REACCIONES DE MANERAEFICAZ Y ALTAMENTE ESPECÍFICA

INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO

COMPLEJA ESTRUCTURACIÓN PROTEICA

ESPECIFICIDAD

INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO

¿QUÉ HACEN LOS ENZIMAS?

Energía libre

Estado de transición S

LOS ENZIMAS FACILITAN LA FORMACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN

(Proporcionando una superficie complementaria a su estereoquímica, polaridad

o carga)

Coordenada de reacción(cambios químicos)

Energía libre

Estadobasal

Estadobasal

Energíalibre

S P

REACCIÓN QUÍMICA

EL EQUILIBRIO DEPENDE DEL ∆G

Y LA VELOCIDAD DE LA ENERGÍA LIBREDE ACTIVACIÓN

EN UNA REACCIÓN CATALIZADA POR UN ENZIMA, ÉSTA MODIFICA LA VELOCIDAD

CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga deestudiar el mecanismo de una reacción catalizadaenzimáticamente.

OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción y

evaluar como se ve modificada ésta en

respuesta a cambios en los parámetros

experimentales

VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido oproducto formado por la enzima por unidad de tiempo

Por tanto sus unidades soncantidad de compuesto sobre unidad de tiempo:

moles µmoles

nmolesgramos

miligramosµgramos

hora

minuto

segundo

E + S ES E + PS P

ESTADOPRE-ESTACIONARIO

REACCIÓN

VELOCIDADDELAREACCIÓN

Concentración del sustrato

¿QUÉ ES ACTIVIDAD Y CANTIDAD DE UN ENZIMA?

• ACTIVIDAD: Cantidad transformada por unidad de tiempo

(moles/s)

• ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Actividad • ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Actividad enzimática por cantidad de enzima

(moles/s/mg de proteína)

• CANTIDAD: Se refiere a la concentración del enzima (mg, mg/mL, actividad enzimática/mL)

¿CÓMO SE DETERMINA LA CANTIDAD DE ENZIMA EN UNA

MUESTRA?

METODOLOGÍA UTILIZADA PARA LA DETERMINACIÓN DE ENZIMAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

�MÉTODOS INMUNOLÓGICOS.- Que determinan la cantidad de enzima

�MÉTODOS �MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS.- Que establecen la actividad catalítica de las enzimas

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La velocidad de una reacción se puede expresar

como cantidad de sustrato consumido

o como cantidad de producto formado

Lo cual puede monitorearse espectrofotométricamente a través de determinarLo cual puede monitorearse espectrofotométricamente a través de determinarlos cambios en la absorción óptica de la solución que contiene lossustratos y el enzima

1 UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICACantidad de enzima que puede transformar 1 µmol de sustrato por minuto

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN UNA MUESTRA BIOLÓGICA

PROCEDIMIENTO´PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

1.

2.3.

4.

¿CÓMO CONVIERTO LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

OBTENIDA EN UI?

Para obtener el valor definitivo de actividad

enzimática aplicamos la siguiente fórmula:

Donde:

· εεεε = coeficiente de extinción molar· b = es el espesor de la cubeta· VF = es el volumen total de reacción· VI = es el volumen de muestra en el ensayo

Los parámetros:

son constantes por tanto podemos la fórmula anterior

queda como:

UI/L=?A/min · cte

� No utilizar muestras congeladas y descongeladasvarias veces.

• Separar lo antes posible el coágulo del suero• Evitar trabajar con muestras hemolizadas

CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

• El transporte de las muestras debe realizarse en frío sincongelar, salvo que se vaya a prolongar mucho tiempo.

• Evitar estasis venosa durante la extracción• Evitar el envejecimiento de las muestras

Variables que afectan al análisis clínico. EDTA y hemólisis

EDTA:

Su efecto anticoagulante se basa en su capacidad para quelar iones

divalentes como calcio o magnesio. No es posible determinar la

actividad de enzimas que requieran estos iones.

CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

MUESTRAS HEMOLÍTICAS:

La ruptura de los eritrocitos hace que su contenido pase al plasma.

Las muestras presentan una coloración roja intensa muy característica

debida a la presencia de hemoglobina.

La hemólisis puede ser causada por una patología o, en la

mayor parte de los casos, un procesamiento

indebido de la muestra.

CARACTERÍSTICAS DE LOS ENZIMAS UTILIZADOS COMO MARCADORES EN LA CLÍNICA

LOS ENZIMAS SE UTILIZAN COMO MARCADORES DE LESIÓN TISULAR

SIGNIFICADO CLÍNICO DEL PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE ALGUNOS ENZIMASISOENZIMÁTICO DE ALGUNOS ENZIMAS

DETERMINACIÓN DEL PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE LACTATO DESHIDROGENASA (LDH)

DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LAS ISOFORMAS DE LDH

PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE LDH EN DIFERENTES PATOLOGÍAS

¿QUÉ PUEDE PROMOVER CAMBIOS EN LAS CONCENTRACIONES DE LOS

ENZIMAS?

LOS ENZIMAS PUEDEN SER INDICADORES DE UNA LESIÓN CELULAR Y TISULAR

IMPORTANCIA DEL ESTUDIO ENZIMÁTICO

- Alanina aminotransferasa (ALT)

- Aspartato aminotransferasa (AST)

- Creatina kinasa (CK)

- Fosfatasa alcalina (AP, ALP, SAP)

ENZIMAS UTILIZADOS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO

- Fosfatasa alcalina (AP, ALP, SAP)

- g-glutamil transpeptidasa (GGT)

- Amilasas

-Lipasas

DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LAS TRANSAMINASAS

Función: cataliza la transferencia de alanina al ácido a-cetoglutárato, formando piruvato y ácido glutámico)

Localización: citoplasma

ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT)

También llamada GPT (Transaminasa glutámico-pirúvica)

•Valores normales: < 50 U/ml•Valores normales: < 50 U/ml•Aumento importante: Shock, hepatitis•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis,ictericia,

ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST)También conocida como GOT (Transaminasa glutámico-oxalacético)

-Función: cataliza la transferencia del grupo a-amino del ácidoaspártico al ácido a-cetoglutárico, formando oxaloacetato yglutámico)

Localización: citoplasma y mitocondria

•Valores normales: < 40U/ml•Valores normales: < 40U/ml•Aumento importante: Infarto del miocardio, hepatitis, traumatismos•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemólisis

DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA CREATINA CINASA

CREATINA CINASA (CK Ó CPK)

Función: importante para la contracción muscular. Transfiere elfosfato de la fosfocreatina al ADP, formando ATP

Localización: citoplasma y mitocondria de miocitos

Isoenzimas:CK-1: isoenzima BB, cerebroCK-2: isoenzima MB, músculo cardíaco y esqueléticoCK-3: isoenzima MM, músculo esquelético y cardíacoCK-3: isoenzima MM, músculo esquelético y cardíacoCK-Mt: membranas mitocondriales. Músculo cardíaco

•Valores normales: < 160U/ml en varonesy <130U/ml en mujeres•Aumento importante: Infarto demiocardio CK-MB•Aumento moderado: miopatías, distrofiamuscular, accidente cerebro-vascular

DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA FOSFATASA ALCALINA

FOSFATASA ALCALINA (AP, ALP, SAP)

Función: metaloenzima que cataliza la hidrólisis dediferentes ésteres de fosfato. Requiere pH alcalino ycofactores (iones zinc y magnesio)

Localización: asociada a membrana

• Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en niños endesarrollo

• Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia devías biliares, cirrosis, hepatomas• Aumento moderado: neoplasias óseas osteogénicas, osteomalacia,enf. Paget, hiperparatiroidismo

G-GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT)

Función: Cataliza la transferencia de grupos glutamilC-terminales de unos péptidos a otros o aaminoácidos. Es importante en el metabolismo delglutatión, la absorción de aminoácidos y en la anti-oxidación

Localización: membrana y citoplasma (5%)

•Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres•Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasishepáticas, enf. alcohólica•Aumento moderado: infecciones que afectan al hígado(citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)

AMILASAS (αααα-AMILASA)

Función: hidroliza carbohidratos complejos para formarmaltosa y glucosa

Localización: Se produce en páncreas, hígado e intestinodelgado. Se filtra y reabsorbe a través del riñón

• Valores normales: <50U/ml•Aumento importante: pancreatitis aguda y crónica,cáncer de páncreas.•Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas,procesos parapancreáticos (gastritis, úlcera duodenal,peritonitis, obstrucción intestinal.

LIPASAS

Función: hidroliza triglicéridos

Localización: Se sintetiza en el páncreas y en la mucosa

gástrica. Se elimina a través del riñón

Causas del incremento de lipasa:PancreatitisGastrointestinalesRenales

DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA FOSFATASA ÁCIDA

DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA LACTATO DESHIDROGENASA

Las enzimas son indispensables en DIAGNÓSTICO CLÍNICO porque la alteración

de la actividad enzimática puede estar asociada a un estado patológicoasociada a un estado patológico