Embed Size (px)
Citation preview
JUSTIFICAREA ALEGERII TEMEI
Deşi drojdiile au fost folosite din vremuri străvechi la prepararea alimentelor
şi băuturilor, utilizarea lor în nutriţia umană sau pentru furajarea animalelor este de
dată mult mai recentă. Deficitul de proteine din timpul primului război mondial a
impulsionat cercetările pentru cultivarea drojdiilor în scopuri furajere.
Microorganismele cele mai frecvent utilizate ca sursă de proteine în nutriţia
omului şi animalelor sunt drojdiile. Datele experimentale atestă că proteina din
drojdii poate înlocui proteinele vegetale şi animale tradiţionale. S-a constatat că
drojdiile sunt capabile să sintetizeze vitaminele hidrosolubile din grupa B, dar şi să le
înmagazineze în celulă în cantităţi la fel de mari sau chiar mai mari decât cele din
ţesuturile animale recunoscute ca surse importante de vitamine.
În condiţiile adâncirii crizei alimentare, fabricarea proteinelor de biosinteză
reprezintă una dintre căile de perspectivă pentru asigurarea necesarului de proteine.
Tehnologia obţinerii proteinelor de biosinteză prezintă următoarele avantaje:
- permite obţinerea de proteine cu valoare biologică ridicată din materii prime
disponibile în cantităţi mari, constituite în mare măsură din subproduse sau
deşeuri şi reziduuri industriale;
- oferă posibilitatea, în raport cu substratul folosit, obţinerii de proteine cu
randament mult mai mare în comparaţie cu cele de origine animală;
- prin utilizarea deşeurilor şi reziduurilor industriale se realizează şi o depoluare a
mediului.
Pentru utilizare in hrana Salmonidelor, drojdia trebuie sa fie producatoare de
astaxantina, compus carotenoidic care intensifica culoarea carnii acestor pesti.
Studiul intreprins a urmarit izolarea unei drojdii producatoare de astaxantina
si investigarea conditiilor de cultivare care sa permita obtinerea compusului
carotenoidic cu randament ridicat, astfel incat biomasa acestei drojdii sa se poata
utilize in alimentatia Salmonidelor.
1
CAPITOLUL I
MICROORGANISME IMPLICATE IN OBTINEREA DROJDIEI
FURAJERE
Microorganismele utilizate in procesul de multiplicare industriala a drojdiilor
trebuie sa indeplineasca o serie de conditii cum ar fi:
- timp de generatie cat mai scurt;
- randament de fabricatie si continut de proteine ridicat;
- vitalitate ridicata, mai ales in cazul multiplicarii continue;
- sensibilitate redusa la infectii, inhibitori si la variatiile calitative ale
mediului;
De obicei, tipurile de drojdii se aleg in functie de natura mediilor de cultura.
Data fiind marea viabilitate si adaptabilitate a drojdiilor la diversele conditii de
mediu, se pot cultiva cu rezultate bune diferite rase, tulpini, specii si chiar genuri de
drojdii sau ciuperci pe lesiile sulfitice reziduale si pe prehidrolizate.
Alte substraturi utilizate cu success la obtinerea drojdiilor furajere sunt
reprezentate de subproduse ale industriei alimentare: melasa, radicele da malt, ape de
inmuiere a porumbului (extract de porumb).
Dintre tulpinile de drojdii folosite in practica pentru formarea de biomasa, se
pot mentiona urmatoarele:
- Torula utilis (Candida utilis) este cea mai folosita la fabricarea drojdiei
furajere. Ea asimileaza diferite glucide (hexoze, pentoze) alcool etilic, alcooli
superiori, aldehide, glicerina si acizi organici.
- Micotorula se dezvlota bine pe medii de cultura care contin cantitati mari de
pentoze.
- Candida tropicalis se multiplica intens pe borhotul rezultat de la fabricarea
alcoolului. Ea asimileaza mult mai bine xiloza in comparatie cu Torula utilis.
De obicei, in linurile de multiplicare a drojdiei se gaseste un amestec de
Torula utilis si Candida tropicalis, chiar si atunci cand initial s-a efectuat numai
2
inocularea cu Torula utilis. Astfel la cultivarea drojdiei Torula utilis prin procedeul
continuu pe borhot de melasa, pot apare in scurt timp si alte drojdii printre care si
Candida mycoderma, a carei proportie poate creste pana la 90%. Aceste contaminari
nu sunt periculoase in masura in care nu conduc la micsorarea randamentului si a
continutului in proteine a produsului finit.
In fabricile de drojdie furajera se folosesc de obicei pentru inoculare
amestecuri de 3-4 tulpini de drojdii (Torula utilis, Candida tropicalis, Candida
lypolitica), proportia dintre ele modificandu-se esential in timpul fabricatiei.
La fabricarea drojdiilor furajere se pot utilize si amestecuri de
microorganisme din diferite genuri: genul Candida, genul Trichosporon, genul
Torulopsis etc.
- Candida tropicalis realizeaza o productivitate mica, desi utilizeaza in
proportie insemnata zaharurile din solutie (75-80%), pe care le consuma specific,
sintetizand cantitati mari de acid glutamic si tirozina. Amestecurile de Candida
tropicalis, Candida arboreea si T. utilis multiplicate in comun, se plaseaza sub
aspectul epuizarii zaharurilor in zona valorilor satisfacatoare (78%), reprezentand in
acelasi timp o compozitie aminoproteica de buna calitate.
- Candida scottii se prezinta, din punct de vedere morfologic, sub forma de
celule oval elipsoidale dispuse sub forma de lant, cate 5-7-12 celule cu inmugurire
multipolara. Coloniile dezvoltate pe agar de bere sunt de culoare alb-crem, cu
suprafata marunt ridata, cu granulatie fina. Aceste drojdii asimileaza bine atat
hexozele cat si pentozele, precum si acizii organici si uronici. Avand un mare
randament in biomasa si continut ridicat de proteine drojdia Candida scottii poate fi
introdusa in fabricatie industriala atat sub forma de cultura pura cat si sub forma de
cultura mixta, in combinatie cu celelate specii de drojdie Candida.
- Trichosporon cutaneum are o viteza de crestere comparativ redusa cu
celelalte tipuri de drojdii, insa asigura o asimilare mai profunda a substantelor
organice, in particular a acizilor organici.
- Candida mycoderma face parte din microflora epifita a fructelor si a unor
legume, in cazuri rare se intalneste in microflora semintelor oleaginoase si cerealiere.
3
Asimileaza glucoza, zaharoza, maltoza, lactoza si poate utiliza etanolul ca unica sursa
hidrocarbonata. Formeaza glucoza, fructoza, zaharoza. Nu formeaza rafinoza. Poate
consuma CH3COOH din mediu simultan cu etanolul si are sulfitorezistenta redusa.
Temperatura propice de inmultire este de: minim 6-16ºC, maxim 24-36ºC, iar cea de
crestere optima este de 18-22ºC. Coloniile pe mediu solidificat prezinta un perimetru
slab-lobat, neregulat cu diameter cuprinse intre 2,5-5,8mm. Suprafata coloniei are un
aspect mat, cutat, de culaoare alb-cenusiu sau alb-crem. In mediu lichid formeaza un
voal alb (pelicula) subtire, la suprafata mediilor slab-alcoolice. In timp voalul se
destrama si se depune in sediment pulverulent.
Rhodotorula glutinis formeaza pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu
diametrul de 1,5-3mm, convexe, cu perimetru circular, cu suprafata lucioasa sau
aspect mucos, de culaore rosu pastelat. Dupa 7 zile, coloniile ajung la diametrul de 5-
10mm dar isi mentin caracterele morfologice. Celulele dezvoltate pe MEA timp de 3
zile au forma elipsoidala si dimensiuni medii de 4-5,5µm reproducerea are loc prin
imugurire pe intreaga suprafata. Unele tulpini pot forma celule alungite.
Se pot dezvolta pe mediul Czapek, cand formeaza celule cu dimensiuni de
2,3-5µm sau 12-16µm si pseudomiceliu. Poate deci folosi azotati ca sursa de azot. Nu
se dezvolta pe MEA cu 0.5% acid acetic. Se dezvolta in domeniul de temperaturi de
la 25ºC la 35ºC in produse cu aw minim de la 0,92. Cresterea este oprita in medii cu
pH 2,2 sau in prezenta de conservanti. Acidul benzoic sau acidul sorbic ii inhiba
cresterea la concentratii mai mici de 100mg/kgsi pH4. Sunt drojdii termorezistente.
Sunt inactivate prin incalzire la 62,5ºC timp de 10 min. Asimileaza glucoza,
galactoza, zaharoza, maltoza, xiloza, celobioza, alcoolul etilic, glicerolul si acizi
organici (lactic, succinic si citric). Rhodotorula glutinis, ca si Rhodotorula rubra, este
larg raspandita pe suprafata fructelor si legumelor proaspat recoltate dar produce rar
alterari ale acestora. Se intalneste in microbiota epifita a frunzelor si tulpinilor, a
boabelor de cereale, a maslinilor. Poate produce alterari ale sucurilor de mere si
capsuni insuficient pasteurizate.
4
Fig. 1. Drojdii utilizate ca drojdii furajere
a - Rhodotorula glutinis; b - Trichosporon cutaneum; c - Candida tropicalis
5
CAPITOLUL II
MATERIALE SI METODE UTILIZATE IN EXPERIMENTARILE
DE OBTINERE A DROJDIEI FURAJERE
2.1. MATERIALE
2.1.1. Microorganisme utilizate in scopul produceri de drojdii furajere
pentru salmonide
Phaffia rhodozyma tulpina izolata de pe mere.
6
2.1.2. Medii de cultura
Compozitia mediilor de cultura si scopul in care acestea au fost folosite in
experimentari sunt prezentate in tabelul 1.
Tabel 1. Medii de cultura utilizate in cadrul experimentelor de laborator
Denumire mediu Cod Compozitie pH Utilizari
Must de malt cu agar/ Extract de
malt cu agar
MMA/ MEA
Extract de malt 30g, agar 20g, apa pana la
1000ml5.5
Izolarea drojdiilor, descrierea caracterelor morfologice obtinere
inocul.
Mediu de cultura cu melasa si
adaos de ureeMMu
Melasa-40%(NH4)2HPO4-0,02%(NH4)2SO4-0,01%
MgSO4·7H2O-0,005%H2O- ~60%
Uree
5,5-6Mediu de cultura de
utilizat pentru cultivarea drojdiilor
7
Mediu de cultura cu melasa si
adaos de extract de porumb
MMp
Melasa-40%(NH4)2HPO4-0,02%(NH4)2SO4-0,01%
MgSO4·7H2O-0,005%H2O- ~60%
Extract de porumb
5,5-6Mediu de cultura de
utilizat pentru cultivarea drojdiilor
Mediu de cultura cu melasa si
adaos de extract de drojdie
MMd
Melasa-40%(NH4)2HPO4-0,02%(NH4)2SO4-0,01%
MgSO4·7H2O-0,005%H2O- ~60%
Extract drojdie
5,5-6Mediu de cultura de
utilizat pentru cultivarea drojdiilor
Mediu de cultura cu melasa
MM
Melasa-40%(NH4)2HPO4-0,02%(NH4)2SO4-0,01%
MgSO4·7H2O-0,005%H2O- ~60%
5,5-6Mediu de cultura de
utilizat pentru cultivarea drojdiilor
2.1.3. Substante utilizate ca adaos la mediile de cultura
Ureea este prima substanţă de tip organic obţinută artificial, în laborator, din
substanţe anorganice (cianatul de amoniu - NH4NCO), creatorul ei fiind Friedrich
Wöhler, în 1828. Acesta :
se prezinta sub forma de
granule albe sau slab colorate;
prezinta in compozitia sa azot
(raportat la substanta uscata)
min 46%
este solubil in apa
Ureea este utilizata ca ingrasamant de
suprafata si ca adaos la mediile de
cultura, fiind o excelenta sursa de azot
pentru microorganisme.
8
Extractul de porumb prezinta aminoacizi ce au rol de biostimulatori si
vitamine, dintre care biotina este prezenta in cantitati apreciabile(150 – 200 mg/100g
produs)
Extractul de porumb este folosit la fabricarea drojdiei de panificaţie cu un consum de 60 kg/t melasă, poate creşte productivitatea cu 4÷6%, în schimb prezintă inconvenientul că este un produs deficitar şi este folosit preponderent în industria antibioticelor. Se constată de asemenea că proteinele din extract pot lega biotina într-o formă inaccesibilă pentru celula de drojdie.
Extractele de drojdie sunt folosite în principal ca potenţiatori de arome sau
chiar arome. Alte autolizate de drojdie pot masca gustul amar sau acru, pot mări
gradul de aromă şi pot servi ca agenţi de colorare sau antioxidanţi.
2.2. METODE UTILIZATE IN EXPERIMENTARI
9
2.2.1. Metode de izolare
Metodele prin raspandire sunt larg raspandite deoarece sunt usor de executat,
avand ca principiul raspandirea celulelor aflate in populatii eterogene in medii
naturale, prin diluare in medii lichide sau raspandire pe suprafata mediilor sterile
solidificate.
Metoda Koch se bazeaza pe raspandirea microorganismelor recoltate din
medii naturale intr-un mediu nutritiv si fixarea distantata a celulelor in urma
solidificarii mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate intre ele.
Metoda este folosita in special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de
raspandire este mustul de malt cu gelatina, repartizat cate 20 cm³ in 3 eprubete,
fluidificat si mentinut la 35-40ºC. Din proba aleasa pentru izolare se recolteaza
celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecuta succesiv in cele 3 eprubete. Dupa
inoculare si uniformizare, continutul fiecarei eprubete se repartizeaza in cate o placa
Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care raman fixate in gel vor forma prin
multiplicare colonii izolate.
In functie de densitatea celulelor
recoltate initial, in placa a 2-a sau a 3-a
pot exista colonii izolate, iar dupa
studiul caracterelor microscopice ale
coloniilor reprezentative se face
repicarea in ebrubete cu slant agar,
obtinandu-se culturi pure.
Fig. 3.
10
Metoda in strii se aplica in cazul contaminarii cu microorganisme straine a
culturilor pure in timpul conservarii acestora. Este similara cu metoda scarificata, in
schimb drept mediu de raspandire se foloseste mediul inclinat din 2-3 eprubete, in care se
realizeaza transferul succesiv de celule, prin trasarea de striuri la suprafata mediului
2.2.2 Metode de numararea celulelor
Stabilirea numarului de celule de drojdii dintr-un produs sau cultura pura se
realizeaza prin diferite tehnici :
-numararea directa a celulelor de drojdii;
-numararea indirecta (metoda culturala-Koch);
Celulele de drojdii si sporii de mucegai se pot numara, prin examen microscopic
direct, cu ajutorul citometrelor ( camerelor de numarat ).
Un citometru este o lama de sticla groasa, prevazuta cu 3 platforme separate intre ele
prin rigole in sticla. Platforma centrala este denivelata fata de celelalte doua cu o inaltime
de 0,1- 0,2 mm (inscrisa pe fiecare camera ). Pe platforma centrala este gravata o retea de
linii perpendiculare, care delimiteaza o anumita suprafata divizata de catre linii
perpendiculare in microcelule de forma patratica (patratele elementare ).
Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Türk, Bürker, Rosenthal,
construite pe acelasi principiu. Diferentierea dintre tipurile de citometre consta in
marimea variabila a suprafetei unui patratel elementar.
Citometrul Thoma are suprafata de 1mm² divizata de catre linii in 400 de
patratele elementare cu latura de 1/20 mm ( suprafata unui patratel elementar = 1/400
mm³ ). Pentru numarare se plaseaza o picatura din suspensia de celule de analizat pe
platforma centrala, in dreptul suprafetei delimitate. Peste suspensie se plaseaza o lamela
care se sprijina pe cele doua platforme laterale si astfel intre lamela si citometru se
creeaza o pelicula de lichid cu inaltime egala cu denivelarea platformei centrale ( 0,1
mm ). Astfel, volumul de lichid plasat pe fiecare patratel elementar este .
Preparatul obtinut se studiaza la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, cand in
campul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 patratele elementare, din care se
numara celulele a caror suprafata se afla mai mult de jumatate in interiorul careului de
4x4 patratele elementare. Se fac numarari de celule din mai multe
campuri microscopice ( ) si se calculeaza numarul mediu de celule pe un
patratel elementar ( ).
Numarul de celule prezente intr-un cm³ de suspensie de analizat se determina cu
formula:
N= n · 4 ·
In care: n- numarul mediu de celule pe un patratel elementar;
k- coefficient de dilutie;
Fig. 4. Profilul si reteaua citometrului Thoma
2.2.3. Metode de selectionare a drojdiei producatoare de pigmenti
carotenoidici
Metodele de selectie a microorganismelor in general , in cazul nostru al drojdiilor
urmeaza niste etape prestabilite:
A. Izolarea care presupune parcurgerea mai multor etape:
1.Recoltarea probelor biologice presupune recoltarea unor mostre in cantitati
mici din care sa se izoleze drojdiile cautate.
Probele biologice pot consta in resturi alimentare, resturi vegetale, medii specifice (apa
de mare, saramura, nisip, plante acvatice, fructe, etc).
La stabilirea sursei de izolare se au in vedere urmatoarele criterii:
a)o asociere intre microorganism si substrat (amidon-tarate, faina, paine,
suprafata fructelor etc);
b)densitatea microorganismului in mediul din care se face izolarea;
c)variatia densitatii celulelor in functie de conditiile de mediu (pentru a crea acest
fenomen numarul de tulpini izolate in aceasta etapa trebuie sa fie de ordinul sutelor si de
obicei mai mult de 500).
Pentru a facilita izolarea de tulpini variate se aplica metode selective de izolare.
Aceste metode se bazeaza pe prop biologice si de termorezistenta a sporilor. Tulpinile
izolate nu au identitate si poarta denum de izolat. Fiecare tulpina izolata se pastreaza in 2
exemplare si pentru a evita degenerarea acestora se pastreaza in stare liofilizata.
2.Controlul puritatii culturii care se realizeaza prin examen macroscopic si
microscopic si se studiaza caracterele culturale prin cultivare pe medii specifice cu agar
rezultand colonii la care se urmaresc caracterele macroscopice:
- pigmentatia,
- aspectul,
- diametrul coloniei
si caracterele microscopice:
- forma
- dimensiunea celulelor,
- prezenta sporilor,
- unele particularitati privind reproducerea, etc
In urma acestui studiu fiecare tulpina este asociata unei specii si unui gen. Lucrul acesta
poate sa ofere date privind puritatea izolatelor si stabilitatea genetica.
B. Selectia propriu-zisa (screening-ul) urmareste identificarea tulpinilor
active, care corespund cerintelor noastre. Prin selectie se elimina din competitie tulpinile
inactive si slab active si se evidentiaza tulpinile inalt active. Selectia se realiz in 2 etape:
1.Preselectia (selectia calitativa) se aplica tuturor tulpinilor izolate si urmareste
eliminarea tulpinilor inactive. De obicei se aplica cultivarea in placi Petri pe medii de
cultura cu agar iar drept criterii de selectie se utilizeaza urmatoarele:
-dezvoltarea coloniala exprimata prin diametrul coloniei, acesta se exprima in mm
sau viteza de dezvoltare coloniala care se masoara in mm/h;
-consumul de substrat se exprima semicantitativ printr-un raport consum/ colonie;
.2.Selectia cantitativa se aplica tulpinilor selectionate in etapa anterioara iar drept
criteriu de selectie este randam de biosinteza.
Daca este vorba de un compus extracelular randamentul se masoara in g/dm3
mediu de cultura.
Daca ne referim la o enzima – UA/dm3 mediu de cultura.
Daca ne referim la compusi mintracelulari unitatea de masura este g/g s.u.
biomasa. Si cantitatea de enzime intracelulare se masoara deasemeni in UA/g s.u
biomasa.
In aceasta etapa cultivarea se realizeaza pe mediu lichid in culturi pe agitator sau
in bioreactoare de mica capacit aceasta insemnand de la 1-3 litri. In urma selectiei se
mentin in competitie 1-5 tulpini inalt active.
In urma selectiei tulpinii de drojdie, am observat urmatoarele:
- pigmentatia: rosu-portocaliu(specifica pigmentilor carotenoidici);
- aspectul coloniilor este rugos si mat;
- diametrul coloniei variaza intre 2 si 4 mm;
- forma coloniei este ovoidala;
- dimensiunea celulelor variaza inte 4 si 4,8 μm;
- nu prezinta spori.
2.2.4. Tehnici de executare si studiul caracterelor microscopice
Pentru a studia caracterele microscopice ale coloniilor reprezentative s-a folosit
un preparat in stare proaspata (preparate umede, preparat intre lama si lamela). In general
preparatele proaspete sunt folosite pentru cercetarea miscroorganismelor in stare vie.
Cercetarea celulei microbiene in stare vie permite studierea formei ei reale.
Executarea unui preparat umed s-a facut tinand cont de urmatoarele etape:
- pregatirea lamei si lamelei- lama curate si degresata se sterilizeaza trecand
ambele suprafete prin flacara becului de gaz. Lamela se sterge cu hartie de filtru;
- realizarea suspensiei de celule pe lama- se depune o picatura de apa sterila pe
lama de sticla sterilizata, in zona centrala. Pentru recoltarea microorganismelor aflate in
mediul lichid, in vederea realizari suspensiei, se foloseste ansa sau pipeta sterile.
- realizarea preparatului intre lama si lamela- dupa obtinerea suspensiei de
celule, lamela curata se sprijina si se deplaseaza pe lama la un unghi de 45º, pana cand
devine tangenta la picatura, apoi es lasa sa cada peste aceasta. Lichidul in exces se
absoarbe pe marginile lamelei cu hartie de filtru.
Un preparat bun nu trebuie sa prezinte bule de aer, acestea putand determina
aglomerari de celule si ingreuna studiul preparatului microscopic. Toate manipularile se
realizeaza in conditii aseptice.Preparatele umede se mai numesc si preparate temporare,
deoarece, prin folosirea apei sau a serului fiziologic steril ca lichid de relizare a
suspensiei de celule, studiul trebuie efectuat imediat pentru ca se produce destul de rapid
uscarea preparatului.
2.2.5. Aparatura utilizata in experimentari
Principalele aparate de laborator folosite pentru determinarea diversilor parametrii
sunt prezentate in tabelul 2.
Tabel 2. Aparatura utilizata in experimentele de laborator
Tipul aparatului Scopul utilizarii
Microscop Karl Zeiss JenaDimensionarea, numararea si fotografierea
microorganismelor.
Balanta analitica
Balanta precizie 0.001g. Denver
Balanta precizie 0.1g
Determinari gravimetrice
Spectrofotometru Determinari spectrofotometrice
pH-metru Determinari de pH ale mediilor de cultura
Termostat Cultivarea microorganismelor
Centrifuga Separari de biomasa
Etuva Determinari de umiditate si uscare
2.2.6. Medii de cultura comerciale
Sunt gata preparate si se prezinta sub forma de granule, pudra, tablete, in
ambalaje ermetic inchise. Pentru obtinerea mediilor de cultura uzuale se face dizolvarea
conform indicatiilor de pe eticheta, repartizarea in vase si sterilizarea. Mediile comerciale
pot fii livrate si sub forma de medii solidificate si sterilizate in ambalaje de sticla si care
necesita doar incalzirea pentru a fi fluidificate, urmate de repartizarea in vasele de
cultivare si inocularea cu microorganismele de cultivat .
Folosirea in laborator a mediilor deshidratate prezinta o serie de avantaje si anume:
-ocupa un volum redus;
-sunt usor conservabile;
-pot fi usor rehidratate cand este necesar.
In lipsa mediilor gata preparate, reteta poate fi folosita in laborator pentru
obtinerea mediilor respective. Mediile de cultura se pot folosi:
sub forma lichida - in acest caz se face imediat repartizarea si sterilizarea
sub forma solida
Bulionul de carne – este un mediu general pentru cultivarea bacteriilor si
actinomicetelor. Se prepara din carne de vita degresata. Se cantaresc 500g carne tocata si
se adauga 1000cm³ apa de retea. Se pastreaza amestecul timp de 24 de ore la rece apoi se
face fierberea timp de 30 de minute. Dupa filtrare in strat de vata se completeaza volumul
la 1000cm³ si se adauga suplimentar 1-10g peptona si 5g NaCl. Se ajusteaza pH-ul la
7,00. Se foloseste sub forma lichida sau ca mediu dens, prin adaugare de agenti de
solidificare. Sterilizarea se face timp de 20 min la 121ºC. In locul bulionului de carne se
poate folosi extract de carne in concentratie de 3g la 1000cm ³ apa.
Mustul de malt - este un mediu general pentru cultivarea drojdiilor si
mucegaiurilor. Se obtine din faina de malt si apa de retea in proportie de 1:4. Se cantaresc
50g faina de malt si se introduc intr-un vas tarat si se amesteca cu 200 cm³ apa cu
temperature de 47 ºC, astfel incat temperatura amestecului sa fie de 45ºC. Se mentine
aceasta temperatura timp de 30 min ,in conditii de agitare a probei. In acest interval de
timp, denumit interval de proteoliza, sub actiunea enzimelor proteolitice din malt are loc
hidroliza protidelor cu formarea de compusi solubili (peptone, peptide, aminoacizi). Se
ridica progresiv temperature, cu 1ºC /pe min, pana la 70 º C, se adauga 100cm³ cu aceasi
temperatura si se mentine la aceasta temperatura timp de 10-30 min, interval in care sub
actiunea enzimelor amilolitice (α-amilaza si β- amilaza) are loc zaharificarea amidonului
pana la compusi care nu mai dau coloratie cu solutia de Lugol. Dupa zaharificare se face
racirea si se adauga apa pana la greutatea finala de 450g. Extractul se obtine dupa
filtrarea plamezii prin strat de vata sau hartie de filtru cutata. In filtrate se determina
concentratia cu un aerometru Balling sau gradul refractometric. Pentru obtinera mustului
cu o anumita concentratie se face diluarea corespunzatoare cu apa de retea. Pentru
cultivarea mucegaiurlor se recomanda must cu 3-4 º Bllg, pentru drojdii cu 6-8 º Bllg,
pentru bacterii lactice 8-12º Bllg. Sterlizarea mustului se face la 0,5atm, timp de 20-30
min.
Mediile cu care se mai poate lucra in laborator sunt:
Mediul Andreev
-H3PO4(1-10%)= 1,9ml;
-CH3COOH (1-10%)= 8,0ml;
-KCl = 0,15g;
-MgSO4·7 H2O= 0,075g;
-Ca(HSO4)2 (se poate inlocui cu
NH4H2PO4) = 0,0125g
-NH4OH (20%) = 1,0ml;
-NaOH(0,1N) = 2 ml ;
-glucoza = 30 g;
-autolizat de drojdie = 5 ml ;
-apa potabila = 1000 ml ;
Mediul Rieder
-glucoza =30 g;
-(NH4)2SO4 =3 g;
-MgSO4·7H2O =0,7 g;
-NaCl =0,5 g
-Ca(NO3)2 =0,4 g;
-KH2PO4 =1 g;
-autolizat de drojdie =10ml;
-apa potabila =1000ml ;
2.2.7. Medii industriale pentru obtinerea drojdiei furajere
Producerea industrială de drojdie furajeră se realizează în mare subproduse sau deşeuri
şi reziduuri industriale ca:
- deşeuri celulozice: hidrolizate de sulf, paie de grâu, coceni de porumb, măsură
din coji de floarea-soarelui, rumeguş de lemn, leşii bisulfitice;
- ape reziduale din industria alimentară;
- zer (deşeu de la fabricarea brânzeturilor care conţine ca sursă de carbon lactoza);
- melasă şi borhot de melasă de la fabricarea alcoolului;
- petrol lampant;
- motorină;
- ceară de parafină care conţine hidrocarburi saturate aciclice;
- metan;
- alcool metilic;
- alcool etilic.
Materia primă utilizată în instalaţiile industriale este selectată în funcţie de o serie
de factori, dintre care cei mai importanţi sunt disponibilitatea, costul şi capacitatea de
asimilare.În aceste materii prime utilizate ca medii de cultură pentru drojdii se găsesc, în
anumite cantităţi, o serie de glucide cum sunt: glucoza, xiloza, maltoza, zaharoza,
manoza, galactoza, arabinoza, pe care drojdiile le pot folosi ca sursă de carbon şi energie.
În majoritatea ţărilor producătoare de proteine de biosinteză se folosesc leşiile
bisulfitice rezultate de Ia fabricarea hârtiei şi celulozei (S.U.A., Franţa, Germania). În
fosta U.R.S.S., se folosesc leşiile bisulfitice şi borhotul de la fabricarea alcoolului, iar în
Bulgaria, în afara leşiilor bisulfitice rezultate din hidroliza lemnului, se folosesc şi cele
obţinute din hidroliza cocenilor de porumb şi cojilor de floarea-soarelui.
La noi în ţară, multe secţii şi fabrici de drojdie furajeră ca de pildă Piteşti,
Comăneşti, Blaj, Suceava, Drobeta Turnu-Severin folosesc apele reziduale de la
fabricarea plăcilor fibrolemnoase, iar Zărneşti - Braşov, Letea - Bacău, Piatra-Neamţ
folosesc leşiile bisulfitice de la fabricarea celulozei. În paralel cu valorificarea şi
diversificarea reziduurilor industriale, în ultimii ani s-au întreprins cercetări pentru
biosinteza proteinelor pornind de la fracţiuni de hidrocarburi petroliere.
2.2.8. Componente ale mediului de cultura utilizat in laborator
Melasa
Prin melasă se înţelege ultimul reziduu care rămâne de la fabricarea zahărului, în
urma cristalizării repetate a zaharozei şi din care nu se mai poate obţine economic zahăr
prin cristalizare. În timpul primului război mondial, ca urmare a faptului că cerealele nu
mai erau în cantităţi suficiente, la fabricarea drojdiei plămezile amidonoase zaharificate
au fost înlocuite cu melasă, care avea un preţ mai convenabil şi era mai uşor de depozitat
decât cerealele. În prezent, în S.U.A., Europa, Australia ca şi la noi în ţară, melasa este
principala materie primă folosită la fabricarea drojdiei de panificaţie şi în condiţii
dirijate, 4 g melasă (aproximativ 2 g zaharoză) pot contribui la obţinerea unui gram de
drojdie de panificaţie
Caracteristici fizico-chimice
Din punct de vedere fizic, melasa se prezintă ca un lichid vâscos, având o culoare
brună-neagră, cu miros plăcut de cafea proaspăt prăjită şi un gust dulce-amărui. Reacţia
melasei este, de regulă, uşor alcalină.
Compoziţia chimică a melasei variază în funcţie de materia primă folosită la
fabricarea zahărului (sfeclă sau trestie de zahăr) şi de procesul tehnologic aplicat în
fabricile de zahăr (tabelul 3).
Tabelul 3. Compoziţia chimică a melasei din sfeclă şi trestie de zahăr
CompusulProvenienţa melasei
Sfeclă de zahăr Trestie de zahăr
Apă, % 20-25 15-20
Substanţă uscată, % 75-80 80-85
Zahăr total, % 44-52 50-55
Zahăr invertit, % 0,1-0,5 20-23
Rafinoză, % 0,6-1,8 -
Azot total, % 1,2-2,4 0,3-0,6
Substanţe minerale, % 7,6-12,3 10-12
PH 6,0-8,6 <7
Melasa din sfeclă de zahăr are avantajul că favorizează obţinerea unui produs de
culoare mai deschisă, în schimb conţine betaină ce nu este asimilată de către drojdie şi
astfel prin deversarea apelor reziduale creşte consumul biochimic de oxigen. De
asemenea poate fi deficitară în biotină, vitamină necesară creşterii drojdiilor.
Tabelul 4. Compoziţia chimică şi indicii de calitate ai melasei din sfeclă de zahăr
Indicatorul de calitate Minim Maxim
Optim
pentru
fabricarea
drojdiei
Standard
România
Substanţă uscată, % 71,0 85,0 74,0 min. 75,0
Zahăr (polarimetric), % 40,0 54,0 46,0÷50,0 min. 45,0
Zahăr invertit, % 9,1 10,0 max. 1,0 max. 1,0
Rafinoză, % - 2,5 max. 1,0 -
Azot total, % 0,5 2,1 min. 1,4 min. 1,4
Azot aminic, % 0,1 0,5 min. 0,3 min. 0,4
Cenuşă (fără Ca), % 5,0 12,0 max. 7,0 max. 12
Potasiu (K2O),% 2,0 5,0 min.3,5 -
Calciu (CaO), % 0,1 1,5 max. 1,0 -
Biotină, mg/t 30 125 200 -
SO2(anhidridă sulfurică),% 0,01 0,07 max. 0,05 max. 0,08
Acizi volatili, % 0,5 1,8 max. 1,2 max. 1,2
Culoare, ml iod 0,1 n la
100ml melasă 2%0,4 10,0 max. 2,0 -
Ph 4,9 8,5 6,5÷8,5 min. 7,0
Melasa din trestie de zahăr este bogată în biotină, în schimb biomasa de drojdie
obţinută are o culoare mai închisă, încât sunt necesare operaţii suplimentare de spălare.
Pentru a asigura un mediu optim de creştere, se pot folosi melase cupajate în care se
adaugă fosfaţi, surse de azot, factori de creştere; totuşi, la noi în ţară se preferă utilizarea
melasei din sfeclă de zahăr la fabricarea drojdiei de panificaţie, melasa din trestie de
zahăr fiind folosită la fabricarea alcoolului. Compoziţia chimică a melasei obţinută la
fabricarea zahărului din sfeclă de zahăr este prezentată în tabelul 4
Concentraţia în substanţă uscată a melasei se exprimă în practică în grade Balling
(Bllg) sau Brix (Bx), care reprezintă procente masice de substanţă uscată dizolvată.
Glucidele din melasa de sfeclă de zahăr sunt reprezentate în cea mai mare parte
din zaharoză, alături de care se mai găsesc cantităţi mici de rafinoză şi zahăr invertit. Un
procent mai ridicat de 1% denotă contaminarea melasei cu microorganisme care produc
invertirea zaharozei.
Nezahărul melasei cuprinde atât substanţe organice (substanţe azotoase şi
neazotoase) cât şi săruri minerale.
Substanţele cu azot sunt reprezentate în special prin produse de descompunere a
proteinelor şi în mai mică măsură prin proteine macromoleculare. Dintre acestea în
cantitatea cea mai mare se găseşte betaina, care poate să ajungă până la circa 5% faţă de
melasă. Dintre aminoacizi în cantitatea cea mai mare se află acidul glutamic.
Cantitatea de substanţe azotoase, exprimate sub formă de azot total variază între
1,2 şi 2,4%, din care azotul asimilabil reprezintă 0,4÷0,6%, cantitate care este insuficientă
pentru nutriţia drojdiei. Din această cauză, atât la fabricarea alcoolului cât şi a drojdiei
este absolut necesară adăugarea de săruri de azot sub formă de sulfat de amoniu, fosfat de
amoniu, apă amoniacală, uree, ş.a.
Substanţele fara azot cuprind:
pectine,
hemiceluloze şi produsele lor de hidroliză (arabinoză şi galactoză)
săruri ale acizilor organici.
Dintre vitamine s-au găsit în melasa din sfeclă de zahăr, tiamina, piridoxina şi
acidul pantotenic. Conţinutul melasei în vitamine prezintă o mare importanţă la fabricarea
alcoolului şi mai ales a drojdiei.
Sărurile minerale se află în proporţie de 6÷8% faţă de melasă şi sunt reprezentate
de săruri de K, Na, Ca şi Mg ale acizilor carbonic, sulfuric, fosforic, ş.a. Conţinutul în
fosfor al melasei este foarte scăzut, de aceea în procesul de fabricaţie se procedează la
corectarea conţinutului în fosfor al melasei prin adaos de superfosfat sau fosfat de
amoniu. Melasa conţine cantităţi suficiente de Ca, în timp ce conţinutul ei în magneziu
este scăzut, în special atunci când se tratează zemurile pentru purificare cu schimbători de
ioni. Deficitul de magneziu al melasei se corectează prin adaos de sulfat de magneziu.
D ioxid de sulf ce provine din procesul tehnologic de obţinere a zahărului, fiind
folosit pentru decolorarea zemurilor de difuziune, cât şi nitriţi formaţi prin reducere din
nitraţi. Prezenţa SO2 şi nitriţilor este nedorită deoarece inhibă activitatea drojdiilor. Din
acest motiv conţinutul melaselor în SO2 nu trebuie să depăşească 0,008% (Hopulele, T.,
1980).Un loc aparte în compoziţia melasei îl ocupă coloizii de natură proteică, pectică,
melanoidinică, care împiedică funcţionarea normală a celulei de drojdie şi produc o
spumă abundentă, nedorită, în linurile de fermentare. Din această cauză este necesară
limpezirea melasei.
Melasa mai conţine substanţe colorante, care se compun din melanoidine,
melanine, caramel, cât şi suspensii formate prin coagularea coloizilor şi precipitarea unor
săruri anorganice şi organice.
Compoziţia şi calitatea melasei diferă de la fabrică la fabrică şi chiar în cadrul
aceleaşi campanii, în raport cu:
- calitatea sfeclei de zahăr;
- natura solului pe care a fost cultivată sfecla de zahăr;
- cantitatea şi calitatea îngrăşămintelor aplicate solului;
- factorii meteorologici şi climatici;
- procesul tehnologic de extracţie a zahărului;
- condiţiile de depozitare a melasei.
Compoziţia chimică medie a melasei, în principalele microelemente este
prezentată în tabelul 5
Tabelul 5. Compoziţia chimică medie a melasei din sfeclă de zahăr (%)
Carbon 33
Azot 1,5÷2
Fosfor 0,03
Potasiu 6
Magneziu 0,025
Calciu 0,3
Vitaminele din melasă sunt reprezentate, în principal, din biotină, acid pantotenic
şi inozitol (tabelul 6)
Tabelul 6. Conţinutul în vitamine al melasei (mg/t
melasă)
Vitamine
Melasă din: Cantitatea necesară pentru
un randament optim de
fabricaţie drojdiesfeclă de zahăr trestie de zahăr
B7
(Biotină)40 ÷ 130 2700 ÷ 3200 250
B5
(Acid
pantotenic)
5 *10Comb i n÷ 11*10Com
b i n 5*10Comb i n ÷ 6*10Com
b i n 44000
B9
(Inozitol)570*10Com
b i n÷ 800*10Comb i n 600*10Com
b i n 1000000
Calitatea melasei, ca materie primă este deosebit de importantă la multiplicarea
drojdiei de panificaţie. Industrial, se preferă numai utilizarea melasei din sfeclă de zahăr,
care este mai puţin contaminată comparativ cu melasa din trestie de zahăr.
În afară de substanţele valoroase, melasa poate să conţină şi substanţe cu efect
inhibitor asupra activităţii fiziologice a drojdiilor, formate în procesul de obţinere a
melasei. Dintre acestea fac parte :
- imidodisulfonatul de potasiu, care în cantităţi mai mari de 5%, inhibă activitatea
drojdiilor. Rezultă din nitriţi şi sulfiţi care ajung în melasă prin activitatea unor
bacterii;
- nitriţii prezenţi în melasă în concentraţie mai mare de 0,02%, inhibă multiplicarea
drojdiilor;
- acidul acetic, acidul butiric, în concentraţii mai mari de 0,1÷1%, inhibă
multiplicarea drojdiilor (Dan, V., 1999).
Dintre aceste substanţe cea mai mare influenţă o exercită nitriţii rezultaţi în urma
reducerii nitraţilor din melasă, sub acţiunea bacteriilor denitrificatoare. Acestea pot folosi
nitraţii ca acceptori de hidrogen, în locul oxigenului, în procesul de respiraţie. Astfel, se
produce reducerea nitraţilor până la azot sau amoniac.
Bacteriile denitrificatoare conţin enzime induse, ca nitrat-reductaza şi
nitritreductaza, care realizează denitrificarea. La prezenţa în mediu a nitratului şi
oxigenului molecular, denitrificatorii produc respiraţia oxigenată a nitriţilor şi doar la
deficit de O2, ele trec la denitrificare.
Acţiunea dăunătoare a nitriţilor constă în modificarea morfologiei celulelor,
întârzierea respiraţiei, inhibarea înmulţirii şi activităţii fermentative a celulelor de drojdie.
Cea mai mare sensibilitate a fost semnalată în faza logaritmică de multiplicare a
drojdiilor. La un conţinut în mediu de numai 0,0005% este inhibată înmugurirea normală
a drojdiilor. Conţinutul în nitriţi de 0,0004% reduce înmulţirea drojdiilor de cultură cu
50%, iar în cantitate de 0,02%, inhibă aproape în totalitate creşterea şi înmulţirea
celulelor, iar o parte din drojdii mor, în primul rând mugurii.
Dacă concentraţia nitriţilor în mediu se micşorează de la 0,0037 la 0,001 % în
cursul înmulţirii drojdiilor, randamentul drojdiei se îmbunătăţeşte cu 8÷10%, iar de la
concentraţii de 0,009 la 0,002% cu 17÷21% (Notkima, 1975).
Melasa are o încărcare microbiană ridicată şi se consideră o melasă bună aceea
care conţine până la 2·103 celule/g; cea de calitate inferioară are peste 3·104 celule/g.
În mod curent, decadal, se efectuează analiza fizico-chimică şi microbiologică la
melasa existentă în stoc şi care urmează a fi utilizată în producţie. Analizele
microbiologice constau în :
- determinarea numărului total de bacterii aerobe, mezofile, mediu bulion de carne
gelozat, termostatare 48 ore (350), în UFC/g melasă;
- determinarea numărului de drojdii şi mucegaiuri, mediu must de malţ agar cu pH =
3,5 ajustat la repartizare, termostatare 3 zile la 250C, în UFC/g melasă;
- test calitativ de evidenţiere a bacteriilor din genul Leuconostoc, specia Leuconostoc
mesenteroides prin cultivare din diluţii decimale în mediu îmbogăţit cu 15% zahăr;
- determinarea numărului de drojdii (osmofile) în mediu cu must de malţ şi 10% zahăr,
termostatare 3 zile la 250C, în UFC/g melasă;
- examen microscopic al coloniilor caracteristice în scopul identificării.
Substanţe nutritive şi factori de creştere
Atât la fabricarea alcoolului cât şi a drojdiilor este necesară adăugarea de
substanţe nutritive care conţin azot, fosfor, magneziu, ş.a., cât şi factori de creştere pentru
a compensa deficitul substratului în aceste substanţe necesare în cantităţi bine
determinate pentru nutriţia drojdiei.
Sulfatul de amoniu-(NH4)2SO4 se utilizează ca sursă de azot asimilabil. Este o
pulbere alb-gălbuie, cristalină, solubilă în apă, care se prepară industrial prin tratarea
acidului sulfuric cu amoniac gazos. Conţinutul de azot variază între 20÷21%.
Fosfatul diamoniacal tehnic (îngrăşământul complex), se utilizează ca sursă de
fosfor şi azot asimilabil în procesul de multilplicare a drojdiei. Este un amestec de mono
şi diamonofosfaţi, (NH4)H2PO4 şi (NH4)2HPO4, cu un conţinut foarte ridicat de fosfor
(54% P2O5) şi de azot (21% N2). Este solubil în apă (42 g/100 ml la 250C, 47,5 g/100 ml
la 500C şi 51,5 g/100 ml la 700C). Este insolubil în alcool etilic. Soluţia apoasă 1% are
pH-ul = 4,7, iar soluţia saturată are pH-ul = 3,1. Produsul trebuie să conţină minimum 95
% substanţă pură, max. 3 mg As/kg, max. 10 mg Pb/kg şi max. 20 mg/kg alte metale
grele.
Sulfatul de magneziu (MgSO4 · 7H2O) se utilizează ca sursă de magneziu la
multiplicarea drojdiei. Produsul pulbere trebuie să conţină 16,3% MgO şi să nu conţină
arsen mai mult de 0,0005%.
Amoniacul (NH3) se comercializează sub formă de soluţie de amoniac de sinteză
dizolvat în apă, cu o concentraţie minimă de 25%. Se utilizează ca sursă de azot şi pentru
corectarea pH-ului. Amoniacul se adaugă, de regulă, sub formă de apă amoniacală
obţinută prin diluarea amoniacului cu apă în raport de 1:5.
Superfosfatul de calciu se obţine prin tratarea făinii de oase cu acid sulfuric şi este
un amestec format din 3 moli de fosfat monocalcic şi 7 moli sulfat de calciu. Este o sursă
de fosfor ce conţine 16÷18% P2O5. Conţinutul în arsen trebuie să fie de maximum
0,006%.
Ureea este o sare solubilă în apă ce conţine circa 46% azot din s.u., utilizându-se
sub formă de soluţie prin diluare cu apă în cantitate de 10÷12 litri la 1 kg de substanţă.
Acidul ortofosforic (H3PO4) se utilizează ca sursă de fosfor şi pentru reglarea pH-
ului plămezilor. În industria drojdiei de panificaţie se utilizează H3PO4 tehnic, care să
conţină minimum 73% H3PO4 şi maximum 0,0001% As.
Clorura de potasiu (KCl) se foloseşte pentru corectarea plămezilor de melasă în
potasiu. Trebuie să conţină minimum 57÷60% KCl pură.
Factorii de creştere.
Pentru multiplicare, drojdiile sunt dependente de prezenţa în mediul de culturã a
unor substanţe numite factori de creştere.
Biotina intervine în multe din reacţiile metabolismului glucidelor şi azotului şi în
biosinteza proteicã (în carboxilarea acidului piruvic, în sinteza acizilor nucleici, în
formarea bazelor purinice şi pirimidinice) şi în sinteza acizilor graşi.
Celula de drojdie nu este capabilã sã sintetizeze biotina, dar prezenţa ei în mediu este
necondiţionat legatã de o producţie rentabilã. Cerinţa drojdiei în biotinã scade parţial la
prezenţa în mediu a aminoacizilor dicarboxilici (acid aspartic şi acid glutamic).
Eficacitatea aminoacizilor se măreşte în condiţii de aerare intensã. De exemplu, dacã
la aerarea slabã a mediului, care conţine aminoacizi dicarboxilici, la 100 g drojdie sunt
necesare 200 μg biotinã, atunci în condiţii de aerare intensã sunt suficiente 50 μg. În
melasã biotina se găseşte în cantitate de aproximativ 80 μg/kg. Acizii graşi, saturaţi si
nesaturaţi cu lanţ de 16 si 18 atomi de C şi esterii lor etilici adăugaţi împreunã cu acidul
aspartic sunt capabili sã înlocuiască biotina în creşterea drojdiilor de panificaţie în
condiţii aerobe.
Acidul pantotenic influenţează metabolismul drojdiilor atât în condiţii aerobe cât
şi anaerobe. El participã în transferul grupării acyl, ca un component al coenzimei A, în
metabolismul glucidelor şi al acizilor graşi. Vitamina B3 este unul din cei mai importanţi
stimulatori ai creşterii şi activităţii fermentative a drojdiilor. Ea se găseşte în melasã în
cantităţi suficiente (50 ppm).
Inozitolul stimulează creşterea drojdiilor, deficitul în inositol producând o slăbire
a metabolismului glucozei atât în condiţii aerobe cât şi anaerobe. Inositolul, în special
ataşat de lipide, acţionează ca un component structural. Activitatea fosfofructokinazei
este afectatã de deficitul în inositol (Ghosh si Bhattacharyya, 1967).
Tiamina catalizează decarboxilarea acizilor α-cetonici, ca acidul piruvic, acidul
α-cetoglutaric, are un rol fundamental în metabolismul aerob al glucidelor. Derivatul
tiaminei, tiamino-pirofosfatul este cofactor pentru multe enzime, care catalizează
procesele de decarboxilare: piruvatdecarboxilaza, piruvat-dehidrogenaza. Celula de
drojdie este capabilã sã sintetizeze tiamina în prezenţa ATP şi ionilor de magneziu, totuşi
adaosul de tiaminã în mediu stimulează suplimentar creşterea culturii. Tiamina este
termostabilã rezistând la sterilizarea mediului.
Piridoxina participã la decarboxilarea, dezaminarea şi transaminarea
aminoacizilor absorbiţi, iar acidul paraaminobenzoic la fixarea polipeptidelor.
Riboflavina este sintetizată de către toate drojdiile. Derivaţii riboflavinei, cum ar
fi flavinadenindinucleotidul (FAD), flavinmono-nucleotidul(FMN) şi alţii, sunt cofactorii
multor oxidoreductaze şi joacă un rol important în reacţiile de oxidoreducere. Riboflavina
este termostabilă. Atunci când celulele de drojdie de panificaţie sunt transferate din
condiţii anaerobe de cultură în condiţii aerobe, în timpul propagării industriale, conţinutul
de riboflavină creşte, iar creşterea este maximă în faza de creştere semiaerobă.
Produse biostimulatoare:
Extractul de porumb - obţinut prin concentrarea apelor de înmuiere ale
porumbului şi obţinerea de amidon poate fi o sursă de microelemente şi vitamine din
grupul B. Compoziţia sa este prezentată în tabelul 7
În extract se află aminoacizi cu rol de biostimulatori şi vitamine, dintre care
biotina este prezentă în cantităţi apreciabile (150÷200 mg/100 g).
Tabelul 7. Compozitia chimica a extractului de porumb
Apa 30÷60%
Azot total 2,7÷4,5% s.u.
Azot amoniacal 1÷2 % s.u.
Acid lactic 5÷11,5% s.u.
Cenuşă 8÷10% (Ca, P, Cu, Fe, Mg, S, Zn, Co)
Biotină 150÷200 mg/100g
Extractul de porumb folosit la fabricarea drojdiei de panificaţie cu un consum de
60 kg/t melasă, poate creşte productivitatea cu 4÷6%, în schimb prezintă inconvenientul
că este un produs deficitar şi este folosit preponderent în industria antibioticelor. Se
constată de asemenea că proteinele din extract pot lega biotina într-o formă inaccesibilă
pentru celula de drojdie.
Extractul apos din radicele de malţ
Prin obţinerea de extracte 1:10 şi păstrare 2 ore la 500C şi filtrare, filtratul poate conţine
1,9% glucide/s.u. şi 2,3% azot solubil/s.u. Prin concentrare la 50% substanţă uscată se
poate conserva. Radicelele de malţ conţin vitamine din grupul B, vitamina E,
provitaminele A şi D, biotină şi aminoacizi cu rol biostimulativ. Compoziţia chimică
medie a radicelelor de malţ este prezentată în tabelul 8.
Tabelul 8.Compoziţia chimică medie a radicelelor de malţ
Componente g%
proteine 25
lipide 2
substanţe extractive neazotoase 42
celuloză 14
umiditate 10
Germeni de cereale (grâu şi porumb). Germenii de cereale sunt subproduse rezultate din
procesul de măcinare, în proporţie de până la 10% din greutatea cerealelor supuse
prelucrării.
Germenii de cereale conţin pe lângă lipide, protide, numeroase substanţe care
îndeplinesc rolul de factori de creştere pentru drojdii (vitamine şi aminoacizi), şi conţin
în cenuşă, microelemente cu rol de activatori ai enzimelor celulare participante la
metabolismul fermentativ/oxidativ al drojdiei-tabelul 9.
Germenii de grâu sunt utilizaţi şi ca sursă de vitamină E. Valorificarea principală
a germenilor de porumb o constituie extragerea uleiului care are un conţinut ridicat de
acid linoleic şi, prin aceasta, proprietăţi dietetice.
Tabelul 9. Compoziţia germenilor de cereale (grâu şi porumb) în substanţe cu rol
favorizant în activizarea drojdiei Saccharomyces cerevisiae
Vitamine (μg/g) Germeni de grâu Germeni de porumb
Niacina (PP) 71,5÷73,5 1,08
Acid pantotenic (B)17,9 ÷25,7 1,08
Acid folic 2,65÷ 2,59 4,0
Tiamina (B1) 22,97÷24,02 1,2
Riboflavina (B2) 5,76÷6,25 1,2
Piridoxina (B6) 9,31÷10,82 36,8
Tocoferol (E) 5,9÷20,1 12÷16
Germenii de porumb se caracterizează şi prin conţinut deosebit de valoros în substanţe
minerale, cu rol de biostimulatori –tabelele 10-11
Tabelul 10.
Aminoacizi g / 100g extract
Arginina 0,38 0,51Lizina 0,34 0,36
Metionina 0,08 0,1Valina 0,27 0,33
Histidina 0,15 0,19Izoleucina 0,28 0,26Leucina 0,42 0,44Treonina 0,4 0,28Cisteina 0,09 0,08
Fenilalanina 0,19 0,31Triptofan 0,06 0,08Tirozina 0,24 0,35
Tabel 11.
Substanţe minerale Concentraţie
Ca 0,014 ÷ 0,018%
P 2,33 ÷ 2,34%
K 2,34 ÷ 2,36%
Na 0,092%
Mg 0,1÷1,23%
Zn 201 ppm
Fe 203 ppm
Mn 54 ppm
Cu 15,5 ppm
Acidul sulfuri se utilizează pentru corectarea Ph-ului mediilor de cultură. Are o
concentraţie de circa 96÷98% substanţă pură. Se foloseşte acid sulfuric obţinut prin
procedeul de contact care conţine o cantitate redusă de arsen de max. 10 mg/kg. Întrucât
la diluarea acidului sulfuric se dezvoltă o cantitate mare de căldură este interzis să se
toarne apă în acid, ci în mod treptat acid în apă, sub agitare.
Substanţele antispumante
La fabricarea alcoolului şi în special a drojdiei de panificaţie şi furajere se
formează cantităţi mari de spumă datorită coloizilor din melasă care se dispun la
suprafaţa bulelor de aer care barbotează în mediu, stabilizând spuma formată. Cu cât
melasa este mai bogată în substanţe coloidale şi deci insuficient limpezită cu atât
cantitatea de spumă formată este mai mare.
Substanţele antispumante se utilizează pentru împiedicarea formării spumei sau
pentru distrugerea spumei deja formate. Ca antispumanţi se utilizează acidul oleic, uleiul
siliconic, octadecanolul, polipropilenglicolul, hidrocarburi parafinice, ş.a.
Substanţele antispumante folosite trebuie să fie inofensive pentru drojdie sau chiar
asimilabile, să nu producă murdărirea utilajelor şi conductelor tehnologice şi să nu
influenţeze negativ asupra aspectului exterior, gustului şi mirosului drojdiei de
panificaţie.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante
Atât la fabricarea alcoolului cât şi a drojdiei sunt folosite o serie de substanţe cu
acţiune antiseptică sau dezinfectantă.
Substanţele antiseptice se folosesc pentru combaterea microorganismelor de
contaminare în cursul fermentaţiei plămezilor, în doze bine stabilite, la care să nu fie
influenţată negativ activitatea fermentativă a drojdiei.Dintre antisepticii mai des utilizaţi
sunt acidul sulfuric, formalina şi pentaclorfenolatul de sodiu.
Prin adăugare de acid sulfuric în plămezile de drojdie se creează o aciditate
ridicată care inhibă dezvoltarea bacteriilor de contaminare, în timp ce activitatea drojdiei
este puţin influenţată. Prin tratarea laptelui de drojdie cu acid sulfuric până la un pH
scăzut de 2,0÷2,4 se realizează, de asemenea, o purificare a drojdiei în vederea
însămânţării.
Formalina se foloseşte ca antiseptic în special la fermentarea plămezilor din
cereale şi cartofi, fiind utilizată în doze de 0,015÷0,02% faţă de plămadă si deasemeni se
foloseşte ca dezinfectant în soluţii cu concentraţia de 3÷5% aldehidă formică şi chiar
până la 10% pentru dezinfectarea conductelor şi utilajelor tehnologice. Fiind o substanţă
volatilă, se sporeşte eficienţa ei prin introducere de abur în urma tratamentului cu
formalină.
Pentaclorfenolatul de sodiu se utilizează ca antiseptic la fermentarea plămezilor
de melasă în cantităţi de 60÷90 g/tona de melasă, sub forma unei soluţii alcoolice cu
concentraţia de 12÷17% substanţă pură. Prin adaos de pentaclorfenolat de sodiu se pot
fermenta plămezile din melasă fără sterilizare termică. Nu se recomandă folosirea acestui
antiseptic atunci când din borhotul obţinut de la fabricarea alcoolului din melasă urmează
să se producă drojdie furajeră, deoarece antisepticul se acumulează în drojdie şi este
dăunător pentru animale şi păsări.
Substanţele dezinfectante cele mai des utilizate pentru combaterea microflorei de
contaminare la fabricarea alcoolului şi a drojdiei sunt: formalina, clorura de var, laptele
de var, soda caustică şi soda calcinată.
Clorura de var se foloseşte sub formă de suspensie în apă cu concentraţia de 1-
3%, cu care se stropeşte suprafeţele utilajelor şi încăperilor tehnologice. Celelalte
substanţe se folosesc în concentraţii asemănătoare de 1,5÷5%.
CAPITOLUL III
IZOLAREA SI CARACTERIZAREA DROJDIEI
Phaffia rhodozyma
3.1. Izolarea drojdiei Phaffia rhodozyma
O drojdie cu caracteristici similare Phaffiei rhodozyma a fost izolata din
microbiota epifita a marului, utilizand metoda de izolare Koch. Aceasta metoda se
bazeaza pe formarea de colonii,in urma raspandirii microorganismelor recoltate din medii
naturale pe suprafata unor medii nutritive solidificate
3.1.1. Caracterizarea unei drojdii producatoare de pigment carotenoidic
Determinarea caracterelor drojdiei s-a realizat pe MEA la o temperatura de 25°C/timp de
3 zile. Studiul microscopic s-a reazat cu obiective uscate, cu grosimea de x10 sau x40.
Fig.5. Phaffia rhodozyma
Phaffia rhodozyma formeaza colonii cu
perimetru circular iar celulele dezvoltate
au forma ovoidala si dimensiuni medii
de 4-5µm.
- pigmentatia: rosu-portocaliu(specifica
pigmentilor carotenoidici);
- aspectul coloniilor este rugos si mat;
- diametrul coloniei variaza intre 2 si 4
mm;
- forma coloniei este ovoidala;
- dimensiunea celulelor variaza inte 4 si
4,8 μm
3.2.2. Multipicarea drojdiei Phaffia rhodozyma
Pentru a obtine mai mult mediu de lucru s-a facut multiplicarea in 10 eprubete pe mediu
MMA. Mediul de lucru astfel obtinut sa intodus la termostatare timp de 3 zie la temperaura de
25ºC.
Fig.6. Multiplicarea drojdiei Phaffia rhodozyma
Drojdia izolata dintr-o colonie rosie rezultata din microbiota epifita a merelor a format
pe MEA, dupa 3 zile de cultivare, colonii cu diametrul de 1,5-3mm, cu perimetrul circular, cu
suprafata striata rosu caramiziu. Celulele dezvoltatepe MEA timp de trei zile au forma ovoidala
si dimensiuni medii de 4-5μm, reproducerea avand loc prin imugurire pe intreaga suprafata.
Caracteristicile drojdiei sunt in concordonanta cu descrierea drojdiei Phaffia rhodozyma,
drojdie izolata de catre Herman Paff in anul 1960 si cunoscuta pentru abilitatea sa de a produce o
mare cantitate de astaxanthina.
35
Nr.Crt.
DrojdieCaractere morfologice
Macroscopice Microscopice
1Phaffia rhodozyma
Drojdie izolata in laboratorColonie cu Ø 2-2,5Perimetrul circular
Dim.celulei – 4,8μmForma ovoidala
2Phaffia rhodozymaTulpina industriala
Colonie cu Ø 1,5-5Perimetrul circular
Dim.celulei 4-5 μmForma ovoidala
In mod normal, pentru identificarea unei drojdii sunt necesare teste biochimice prin care se pune
in evidenta capacitatea ei de a asimila si / sau fermenta anumite glucide, precum si preferintele
acestora pentru anumite surse de azot.
In lipsa posibilitatii de a investiga caracterele biochimice si fizice ale drojdiei izolate, se poate
concluziona doar ca drojdiile izolate de pe mere ar putea fi din genul Phaffia.
36
CAPITOLUL IV
PRODUCEREA DE BIOMASA DE Phaffia rhodozyma
4.1. Producerea de biomasa
In vederea obtinerii de biomasa de Phaffia rhodozyma, acesteia trebuie sa i se asigure un
mediu de cultura cu un amestec de substante care asigura toate componentele necesare pentru
procesele energetice ale celulei, si anume surse de carbon, azot, substante minerale, factori de
crestere, la o concentratie a substantelor dizolvate corespunzatoare presiunii osmotice celulare, cu
valori de pH si rH optime cresterii si multiplicarii microorganismelor de cultivat.
Cultivarea in laborator s-a realizat pe un mediu pe baza de melasa a carei compozitie si
pH sunt prezentate in tabelul 1, acesta fiind tinut pe agitator timp de 48h la o temperature de
25°C .
4.2. Medii de laborator
Se obtin prin dozarea si dizolvarea succesiva sau suspendarea in apa a unor ingrediente de
natura organica / anorganica, conform retetelor de obtinere.Gratie utilizarii metodelor matematice
de planificare a experientelor a fost elaborat un mediu de cultura, prin intermediul caruia este
posibila majorarea productivitatii in biomasa drojdiei Phaffia rhodozyma.
. Dupa sterilizarea mediului de cultura a avut loc inocularea acestuia. Inocularea s-a
realizat cu ajutorul unui inocul ce contine o concentratie de 1,2· 10Comb i ncel/cm Com
b i n. Dozarea acestuia s-
a facut astef incat mediu sa sa contina un numar de 3,6·10Comb i ncel/cm Com
b i n
Dupa inoculare paharele Erlenmayer s-au pus pe agitator timp de 24h. Urmatoarea
operatie dupa agitare a fost colectarea lichidului de la suprafata mediului de cultura care a fost
supus unei citiri cu refgractometrul, acest indice ajuta la determinarea cantitati de glucoza al
lichidului cultural. In paralel cu probele de analizat s-a citit indicele de refractie si la lichidul
prelevat de la mediul de cultura neinoculat.
Rezultatele sunt afisate in tabelul 12 de mai jos:
37
Nr.crt. Lichidul supus citirii Indicele de refractie
1 Proba martor- mediu de cultura neinoculat 3.8
2 Proba 1 1.1
3 Proba 2 1
Dupa cultivare, centrifugare si uscare biomasa a fost separata intr-un vas steril, in conditii
aseptice, fiind mai apoi pastrata la frigider, pana in momentul extractiei, in vederea dezvoltarii
cantitatii de astaxantina.
Extractia de astaxantina s-a realizat amestecand 13 ml suspensie de drojdie cu 6 bile mici,
de metal, dupa care s-a introdus in moara cu bile in vederea distrugerii peretilor celulari ai
drojdiei. Extragerea metabolitului s-a realizat prin precipitare, folosidu-se ca agent de precipitare
acetona. Procesut a trecut prin trei etape repetitive pana la colectarea finala, dupa care s-a efectuat
o centrifugare la 3000 rot/min /10 min a lichidului final.
Pentru determinarea randamentului de biosinteza s-a efectuat o citire la spectrofotometru.
Carotenoizi totali (mg/g drojdie) = 10 ml eter petrol · A474 · 100 / 21 · 38,03 s.u.biomasa
Carotenoizi totali (mg/g drojdie) = 0,194 mg / m drojdie
4.3. Astaxanthina
Principalul carotenoid produs de Phaffia rhodozyma este astaxanthina.
Astaxanthina este pigmentul rosu care da speciilor de salmonide (somon, lostrita, pastrav),
crevetilor si pasarilor Flamingo culoarea lor roz-rosie. Acest compus mareste pigmentarea
animalelor de acvacultura si este cel mai scum ingredient din hrana acestor animale.
Fig.9. Pigmentarea salmonidelor
Din punct de vedere chimic are o structura asemanatoare cu β- carotenul (din morcovi) si
vitamina A.
38
Astaxanthina este consumata de multe organisme acvatice inclusiv crustacee, printer care
si crevetele care secreta pigmentul in exoschelete si care ii da culaorea rosie. Crustaceele sunt la
randul lor consumate de catre pesti (pastrav, somon) sau pasari (flamingo, pasari rosii). Acestea
depoziteaza pigmentul la randul lor in piele si tesutul gras. Acesta este motivul pentru care
somonul si celelalte animale au culoarea rosie. Astaxanthina nu-si pierde din intensitate si de
aceea animalele raman cu coloratie roz-rosie. Prin includerea astaxanthinei in dieta pestilor,
functionand si ca un puternic antioxidant, este responsabila si pentru cresterea duratei de viata,
pentru imbunatatirea ratei de crestere si supravietuire a puietului, a imunitatii si rezistentei la stres
si foarte important a fecunditatii.
In prezent, pentru om, astaxanthina este utilizata ca un supliment alimentar. Cercetarile
arata ca datorita activitatii astaxanthinei ca puternic antioxidant ar putea fi benefic si in anumite
boli cardiovasculare si neurodegenerative. Cercetarile sustin ca imbunatateste sistemul imunitar
prin cresterea numarului de celule care produc anticorpi.
39
CAPITOLUL V
Imbunatatirea compozitiei mediului de cultura in vederea produceri de astaxanthina
5.1. Imbunatatirea compozitiei mediului de cultura
In vederea obtinerii unei cantitatati mai mare de produs de biosinteza, am adaugat o serie
de factori de crestere pentru a imbunatati conditiile optime in care drojdia produce cea mai mare
cantitate de astaxantina. Astfel am adaugat mediului de cultura, repartizat in mod egal in 6
eprubete, diverse adaosuri de:
Extract de drojdie
Extract de porumb si
Uree .
Amestecul din fiecare eprubeta a fost repartizat in cate o placa Petri si s-a procedat la
inocularea punctiforma in 5 locuri distincte a fiecareia cu drojdia Phaffia rhodozyma, placile fiind
termostatate timp de 3 zile la o temperatura de 25ºC.
Rezultatele cultivarii sunt cel mai bine reprezentate de figura 8
a ) b )
40
c ) d )
e ) f )
Fig.8. Variatia intensitatii pigmetului la Phaffia rhodozyma, in urma cultivarii pe MM cu
adaos de diversi factori de crestere
a - 0,1 ml. uree; b - 0,2 ml. uree;
c - 0,1 ml. extract de drojdie; d - 0,2 ml.. extract de drojdie;
e - 0,1 ml.. extract porumb; f - 0,2 ml. extract porumb
Dupa cum se observa si in imagini culoarea drojdiei Phaffia rhodozyma difera in functie
de factorii de crestere folositi. Pe mediul cu uree culoarea este mult mai intensa.
41
CAPITOLUL VI
Obtinerea unui bun producator de pigmenti carotenoidici prin mutageneza
Cercetarile efectuate vizeaza reglarea proceselor de biosinteza la cultivarea drojdiilor
pigmentate si sporirea continutului cantitativ de pigmenti carotenoidici.
6.1.Carotenoidele
Reprezinta unul din cele mai numeroase si raspandite grupuri de pigmenti naturali. In
functie de natura carotenoidului, in prezent, ei se obtin prin sinteza chimica, sinteza microbiana
sau sunt extrasi din materie vegetala. Aproximativ 10% din carotenoizi sunt precursori ai
vitaminei A. In multe tari pigmentii carotenoidici sunt utilizati ca supliment alimentar dar isi
gasesc utilizarea si in cosmetologie si acvacultura.
Cererea de pigmenti carotenoizi, care este in permanenta crestere, impune necesitatea
maririi numarului de surse potentiale de obtinere a lor.
6.2. Imbunatatirea biosintezei de pigment prin mutageneza
Pentru obtinerea unui bun producator de pigmenti carotenoidici s-a folosit ca agent
mutagen inhibitor al sintezei de steroli sau carotenoizi- clotrimazolul.
In acest scop s-au folosit trei eprubete cu continut de mediu initial si 2 % agar peste care
s-a adaugat clotrimazol dupa cum urmeaza:
in prima eprubeta 0,32 mg
1g……………………10 mg clotrimazol
0,032 g……………….x mg clotrimazol
x = 0,32 mg clotrimazol
42
0,32 mg ………………….9 ml clotrimazol
y mg ……………………100 ml clotrimazol
y = 3,555 mg clotrimazol
in cea de a doua eprubeta 0,67 mg
1g……………………10 mg clotrimazol
0,067 g……………….x mg clotrimazol
x = 0,67 mg clotrimazol
0,67 mg ………………….9 ml clotrimazol
y mg ……………………100 ml clotrimazol
y = 7,444 mg clotrimazol
in a treia eprubeta 1,02 mg
1 g……………………10 mg clotrimazol
0,102 g……………….x mg clotrimazol
x = 1,02 mg clotrimazol
43
1,02 mg ………………….9 ml clotrimazol
y mg ……………………100 ml clotrimazol
y = 11,333 mg clotrimazol
Continutul fiecarei eprubete se repartizeaza uniform in cate o placa Petri, iar dupa
solidificarea mediului se trece la inteparea acestora cu drojdie Phaffia rhodozyma. Cele trei placi
Petri sunt intoduse la termostatare timp de 3 zile la o temperatura de 25ºC.
Fig. 10. Inocularea placilor, cu continut de clotrimazol, cu drojdie Phaffia
Dupa termostatare s-a facut o observare vizuala, dupa cum reiese din urmatorul tabel:
44
Tabel nr.13.Nr.crt.
Clotrimazol(g)
Numar replicate Procentaj supravietuire
1 0,032 5 80%2 0,067 5 80%3 0,102 5 100%
Din prima placa s-au prelevat celule de drojdie si s-a facut inocularea in doua eprubete cu
continut de MMA, in mod similar sa procedat si cu celelalte doua placi. Eprubetele astfel obtinute
au fost supuse operatiei de termostatare timp de trei zile la o temperatura de 25ºC.
Fig. 11. Inocularea eprubetelor continand MMA cu drojdia de pe mediul cu clotrimazol
Pentru continuarea experimentului s-au pregatit trei placi Petri ce contin mediu cu 2 %
agar si diferite cantitati de uree : in prima placa 0,1 ml uree (2 picaturi), in a doua placa 0,4 ml
uree (4 picaturi), iar cea de-a treia este folosita ca placa martor (fara uree). Din cele 6 eprubete,
scoase de la termostatare, s-a prelevat celule de drojdie si s-au inoculat in mediile pregatite, in
prealabil, in cele 3 placi.
45
Fig. 12. Inocularea placilor cu continut de uree
Printr-o simpla observare vizuala se poate vedea o mai buna dezvoltare si o culoare mult
mai intensa a coloniilor de drojdie in placa cu continutul cel mai ridicat de uree. Clotrimazolul,
in concentratiile testate, nu a fost un bun agent mutagen iar in cercetarile viitoare se va incerca
imbunatatirea celulelor de drojdie, in vederea producerii de astaxantina, cu concentratii mai mari
de clotrimazol.
46
CONCLUZII
1. S-a realizat izolarea unei drojdii de culoare rosie in vederea producerii de astaxantina.
2. Pe baza caracterelor morfologice de natura macroscopica si microscopica drojdia a fost
identificata ca facand parte din genul Phaffia ssp. Rhodozyma
3. Drojdia izolata de pe mere si cultivata mai apoi pe mediu cu melasa a avut ca produs de
biosinteza astaxantina. In urma biosintezei s-a obtinut o cantitate de pigmenti
carotenoidici egala cu 0,194 mg / m drojdie.
4. In laborator s-au efectuat testari privind imbunatatirea mediului de cultura in vederea
obtinerii unui randament ridicat de astaxantina. Mediul cu continutul cel mai mare de uree
as-a dovetit a fi favorabil in vederea producerii unei cantitati mai mari de astaxantina fata
de celelalte medii utilizate anterior.
5. S-a incercat obtinerea unui mutant de drojdii, folosind ca agent mutagen Clotrimazolul in
concentratii de :
0,032 mg;
0,067 mg;
0,102 mg
In urma experimentelor incercate s-a observat ca agentul mutagen reprezentat de clotrimazol
nu este un agent eficace deoarece nu s-au obtinut rezultatele dorite.
47
