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Proteine Klassifizierung - Charakterisierung - Raumstruktur

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ProteineKlassifizierung - Charakterisierung -

Raumstruktur

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GliederungEinleitungKlassifizierung- Einteilungen- Aufbau- EigenschaftenCharakterisierung- Isolierung- Bestimmung Molekülmasse und isoelektrischer Punkt- Bestimmung Aminosäurezusammensetzung und

AminosäuresequenzRaumstruktur- Primärstruktur- Sekundärstruktur- Tertiärstruktur- Quartärstruktur

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EinleitungCa. 30 000 – 50 000 verschiedene Proteine im menschlichen Genom codiertwichtige StrukturelementeKatalyse und Regulation chemischer Reaktionen als EnzymeAufbau und Funktion von GewebenSignalerkennung, Signalverarbeitung und SignalübermittlungAbwehr StofftransportMotalitätNervenleitung

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KlassifizierungEinteilung nach Zusammensetzung:einfache und zusammengesetzte Protein

einfache nur aus Aminosäuren

zusammengesetzte mit Nichtproteinanteil:Bezeichnung nach Nichtproteinanteil: -Nucleoproteine (Nucleinsäuren)-Glycoproteine (Saccharide)-Chromoproteine (chromophore Gruppen)-Lipoproteine (Lipide)-Metalloproteine (Metalle)

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Einteilung nach Form:globuläre und fibrilläre Protein

globuläre Proteine: kompakt gebaut, kugelförmig, gut wasserlöslich, Funktionsproteine(Enzyme, Plasmaproteine, Hämoglobin, Myoglobin, Hormone)

fibrilläre Proteine: faserförmig, in Wasser und verd. Salzlösungen unlöslich, Strukturproteine(Kollagen, Elastin, Keratine, Fibrinogen, Myosin, Titin, Nebulin)

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Einteilung nach Familien:Zusammenfassung von funktionell unterschiedlichen Proteinen zu Familien und Großfamilien aufgrund von Gemeinsamkeiten oder Ähnlichkeiten ihrer Aminosäuresequenzen, d.h. Vergleich der Faltungstopologie

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Einteilung nach Größe:

kurzkettige Peptide und langkettige Proteine:

kurzkettige: bis zu 100 Aminosäurenlangkettige: mehr als 100 ASOligopeptide: bis zu 10 ASPolypeptide: mehr als 10 AS

Benennung nach Anzahl der Aminosäurereste: (griech. Zahlen)

Dipeptid: aus 2 ASTripeptid: aus 3 ASDekapeptid: aus 10 AS

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Aufbau:

- lineare, unverzweigte, kettenförmige Makromoleküle aus den 21 proteinogenen AS

- jeweils spezifische Sequenz: strukturelle und funktionelle Vielfalt(Kombination der 21 proteinogenen AS,

z.B. Protein mit 100 AS=21100 versch. AS-Sequenzen)- Verknüpfung durch Peptidbindungen (Säureamidbindungen)- Entstehung einer Peptidbindung: Wasserabspaltung zwischen der Carboxlgruppe der einen undder Aminogruppe der nächsten AS,freie ά-Aminogruppen und ά-Carboxylgruppen gehen verloren und liegen nur an den Enden in freier Form vor,

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- Sequenzfolge: N-Cά-C-N-Cά-C C aus CarboxylgruppeN aus AminogruppeCά aus AS,

Verknüpfung AS-Seitenketten→ Rückgrat (Hauptkette)

- Rückgrat bei allen Peptiden und Proteinen identisch- Individualität durch AS-Seitenketten-Zusammensetzung und Reihenfolge: spezifische Sequenz (genetisch festgelegt)

- Schreibweise und Darstellung der AS-Sequenz:N-terminale (aminoterminale) AS links (Beginn)C-terminale (carboxyterminale) AS rechts (Ende)AS durch Drei-Buchstaben-Code angegeben,(z.B. Bradykinin:

+H3N-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-COO-)

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Eigenschaften:

biologische Aktivität der Proteine abhängig von Protonierung und Deprotonierung der dissoziablen Gruppen in den Seitenketten(pH-Wert abhängig)besondere Bedeutung:- Aminogruppe des Lysin- Guanidinogruppe des Arginins- Carboxylgruppe des Aspartats und des Glutamats- Imidazolgruppe des Histidins- Hydroxylgruppen des Serins, Threonins und des Tyrosins- Sulfhydrylgruppe des Cysteins

Isoelektrischer Punkt: - errechnet aus pH-Werten - Protein besitzt dort Zwitterionform und wandert nicht im

elektrischen Feld

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CharakterisierungIsolierung von Proteinen- Reinigung aus Gewebsextrakten oder Körperflüssigkeiten- Kombination verschiedener chromatographischer Verfahren(Ausnutzung der biologischen Aktivität der Proteine)

- Vorgehensweise:1. Homogenisierung des Gewebes2. Extraktion der Proteinfraktion3. Entfernung der zellulären Bestandteile durch Zentrifugation4. Ionenaustauschchromatographie (Fraktionierung + Volumen↓)5. Gelchromatographie (Trennung nach Molekülgröße +

Verdünnung)6. Affinitätschromatographie oder

Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie (Hochreinigung)- Umkehr-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)(Hochreinigung von Proteinen die nur in geringen Mengen vorkommen z.B.: Hormone, da Verfahren sehr empfindlich)

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Bestimmung der Molekülmasse

- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

spezielle Form der Elektrophorese mit hoher AuflösungTräger: hochvernetztes PolyacrylamidgelDetergens: Natriumdodecylsulfat (Entfaltung des Proteins)Mercaptoethanol (Spaltung der Disulfidbrücken)negativ geladene Proteine wandern zur Anodekleine Moleküle wandern schneller durch PorenFärbung: Coosmassie-Blau oder Silberfärbung (empfindlicher)

→Proteine sichtbarBestimmung: Vergleich mit Proteinen bekannter MolekülmasseWestern-Blotting-Technik: Abklatsch der Proteine vom Gel auf

Nitrocellulosepapier oder Nylonfolien und Zugabe eines Antikörpers→Identifizierung (HIV-Diagnostik)

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- analytische Ultrazentrifugation

Bestimmung der Molekülmasse hochmolekularer Proteine und Proteinkomplexen

Sedimentation des Proteins entsprechend des Gewichtes und der Gestalt (Svedberg-Koeffizienten zwischen 1 und 200)

Trennung nach Dichte: Dichtegradientenzentrifugation

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Bestimmung Molekülmasse und isoelektrischer Punkt

- zweidimensionale Gelelektrophorese

Bestimmung des isoelektrischen Punktes (1.Dimension) undder Molekularmasse (2.Dimension)

Kombination von isoelektrischer Fokussierung (IEF: Trennung nach ph-Gradienten entspricht IP)und Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

→ Charaktrerisierung

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Bestimmung Aminosäurezusammensetzung - Säurehydrolyse der Peptidbindungen:Zerlegung in Aminosäuren

Bestimmung Aminosäuresequenz- Edmann-Abbau:Abtrennung und Analyse der Aminosäuren vom N-terminalen Endeaus in einzelnen SchrittenNW von bis zu 40 AS in einem Ansatzbei größeren Proteinen vorherige Zerlegung nötig:○ Spaltung mit Bromcyan (CNBr)○ Spaltung mit Trypsin○ Spaltung mit Chymotrypsin

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- MassenspektrometrieBestimmung Molekülmasse und Aminosäureteilsequenzenschnelle und empfindlich Methodenur sehr geringe Mengen benötigt

- direkte Sequenzierung durch Analyse der dem Proteinzugehörigen cDNA

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RaumstrukturPrimärstruktur► lineare Sequenz der durch Peptidbindungen verknüpften AS

enthält alle Informationen über Raumstruktur

Konformation: freie Drehbarkeit um die Achse einer Einfachbindung(verdeckte Form: energiereich, unstabilgestafelte Form: energiearm, stabil)

Rückgrat: Einfachbindungen, aber Drehbarkeit sehr eingeschränktwegen Mesomerie

→ Peptidbindung: Charakter einer partiellen Doppelbindung(Atome starr in einer Ebene, trans-Stellung) → Zahl möglicher Konformationen beschränkt

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Sekundärstruktur

► lokale räumliche Struktur der Hauptkette (Rückgrat)alle Strukturen, die sich durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der CO- und NH-Gruppen ergeben:α-Helix, β-Faltblatt, Schleifen, Kollagen-Helix

Charakterisierung durch Größe der Winkel und H-Brückenmusterα-Helix: stabilste Helixstruktur

α-Keratin (Haare, Wolle), fibrilläre und globuläre Proteine rechtsgewundene Helix,Seitenketten der α-C-Atome ragen aus Zentrum heraus Stabilisierung durch Wasserstoffbrückenbindungen (zwischen H-Atom am Stickstoff und dem O-Atom der Carbonylgruppe der vierten darauffolgenden AS, d.h. H-Brücke fast parallel zur achse der α-Helix)

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β-Faltblatt: parallel oder antiparellel(parallel: die zwei Peptidketten der Faltblattstruktur

haben dieselbe Richtungantiparallel: entgegengesetzte richtung der Peptidketten)β-Keratin (Seide), fibrilläre und globuläre Proteine,N-H- und C=O-Gruppe einer AS fast auf einer Ebene, nur H-Brücken zwischen verschiedenen β-Strängenrechtsgängig verdrillt,

β-Schleifen: verbinden Sekundärstrukturelemente in kompaktgefalteten Proteinen (enge Schleifen, schnelleRichtungsänderung)

Kollagen-Helix: wichtigstes fibrilläres Protein des Bindegewbes, gestreckter, linksgängig, keine intramolekularen H-Brücken > nur wenn sich rechtsgängige Triplehelix bildet> hohe Zugfestigkeit

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Tertiärstruktur

► dreidimensionale Struktur des gesamten Proteins einschließlich der Konformationen, die sich durch die Aminosäureseitenketten ergeben

Ausbildung und Stabilisierung durch:

elektrostatische (ionische) Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen, intramolekulare Wasserstoffbrücken,hydrophobe Wechselwirkungen undDisulfidbrücken

Jede Strukturveränderung der umgebenden wässrigen Lösung kann eine Störung der Proteinkonformation verursachen

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räumliche Anordnung häufig extrem kompliziert: vereinfachte Darstellung: - α-Helices = Spiralen

- β-Faltblätter = Pfeil (Richtung:N→C)- übrige Teile = normale Linien

Kombinationen von Sekundärstrukturelementen: Supersekundärstrukturen oder Motive (häufig:Helix-Schleife-Helix)

Strukturvergleich von verwandten Proteinen:Faltungstopologie (Abfolge der Sekundärstrukturelemente in der

Primärstruktur und räumliche Anordnung)4 Hauptklassen:- α-Proteine: ausschließlich α-Helices- β-Proteine: Ausschließlich antiparallele β-Faltblätter- α/β-Proteine: parallele oder gemischte β-Faltblätter, verbunden mit

α-Helices- α+β-proteine: α-Helices und β-Faltblätter deutlich voneinander getrennt

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Quartärstruktur

► wechselseitige räumliche Anordnung mehrerer Untereinheiten zu einer Funktionseinheit (bei multimeren Proteinen)

oft funktionelle Eigenschaften erst als Polymere

Funktion und Kooperativität durch Wechselwirkungen zwischenUntereinheiten bzw. Bindung von Substraten und dadurch entstehende Konformationsänderungen

→ Regulationsmechanismen

Voraussetzung für Zusammenlagerung:bestimmte komplementäre Bereiche auf der Oberfläche derProteine, wodurch sie sich erkennen und zusammenlagern

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Zusammenlagerung:Anzahl der Untereinheiten von wenigen bis einige TausendZusammenhalt durch schwache, nichtkovalente Bindungen:

- hydrophobe Wechselwirkungen- Wasserstoffbrückenbindungen- elektrostatische Wechselwirkungen→ Vorteil: Verlagerung der Untereinheiten ohne hohen

Energieaufwand (Flexibilität)

Stabilisierung durch Vernetzung der Untereinheiten über kovalenteBindungen:

- Disulfidbrücken (hohe Stabilität z.B. Kollagen)

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Beispiel: Myoglobin und Hämoglobin

Myoglobin: Proteinmonomer mit 153 ASHämoglobin: Proteintetramer mit 574 AS (2α- und 2β-Ketten)

Sauerstoff wird an Häm (prosthetische Gruppe) gebunden

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