Protéine p53: sentinelle du génome

rot@ine P53: sentinelle du g nome

MARECHAL*

RESUM(:

P53 est une prot~ine clef du maintien de la stabilit~ g~n~- tique des cellules. D 'une part, il est c lairement ~tabli que le g~ne p53 acquiert f r ~ q u e m m e n t des mutat ions au cours du processus tumoral. D'autre part, l 'inactivation endog~ne ou ~pig~n~tique de P53 predispose les cellules d entrer dans un processus d ' immortal isat ion et/ou de transformation, deux pr~-requis d l'initiation et l'~volution des tumeurs in vivo. Les r~sultats acquis plus r~cemment conf i rment l 'importance de P53 dans les pathologies tumorales et permettent, pour la prerni~re fois, d'~tablir un lien fonct ionnel entre le ph~notype associ~ d l'inactivation de P53 ou d son activit~ oncog~nique in vivo, et les nombreuses don- n~es concernant les activit~s biochirniques et la structure de cette prot~ine.

MOTS-CLES

P53 - oncog~ne - g~ne suppresseur de tumeur - transformation - cycle cellulaire - stabilit~ g~n~tique.

SUMMARY

P53 is a key protein for the preservation o f the cellular genetic stability. First, it is well established that the p53 gene is f requenly muta ted during the tumoral process. Second, endogenic or epigenetic inactivation o f P53 pre- disposes the cell to enter an immortalization and~or trans- format ion process, which are two requisites for tumor initiation and evolution in vivo. More recent data conf irme the importance o f P53 in tumor pathogenesis and allow for the first t ime to func- t ionnaly link the pheno type associated with P53 inactivation or oncogenic activation and the numerous data dealing with biochemical activities and structural in for- mations concerning this protein.

KEY-WORDS

P53 - oncogene - tumor suppressor gene - transformation - cell cycle - genetic stability.

Introduction

La formation des tumeurs ou tumorigen~se r~sulte d'un processus multifactoriel. Les alterations physio- iogiques aboutissant ~ l'~mergence et ~ la dissemina- tion des cellules tumorales recouvrent entre autres un remaniement g~n~tique profond, une dysr~gulation des signaux associ~s aux facteurs de croissance tissu- iaires et un d~tournement des m~canismes d'angioge- n~se. De plus, le processus tumoral est largement facilit~ par la s~lection de m~canismes contribuant au contournement progressif des r~ponses immunitaires cytotoxiques.

U est aujourd'hui ~tabli que la composante g~u~tique constitue un ~l~ment essentiel dans l'initiation et l'~volution de la physiopathologie tumorale. Les alterations g~n~tiques d~tect~es dans les cellules tumorales contribuent ~ activer des g~nes (oncoo g~nes) ayant un effet positif sur ia croissance, la divio

* TIRES A PART : M. le Dr V. MARECHAL H6pital Rothschild Service de microbiologie 33, bd de Picpus 75571 PARIS CEDEX 12

article regu le 26 septembre, accept~ le 30 octobre 1996.

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sion cellulaire ou la survie des cellules ou ~ inactiver des g~nes impliqu~s dans la r~gulation n~gative de la division cellulaire (anti-oncog~nes ou g~nes suppresseurs de tumeurs), dans ia diff~renciation cellulaire et dans l'induction de la mort cellulaire programm~e (apoptose). D'une fa~on tout ~ fait sch~matique, ces ~v~nements surviennent s~quentiellement afin d'assurer l ' immortalisation des cellules (blocage de la diff~renciation et action anti-apoptotique notamment), leur multiplication en d~pit des contraintes physiques impos~es par leur liaison aux cellules environnantes (diminution de l'adh~rence, n~oovascularisation darts le territoire tumoral), et leur migration dans des territoires ~loi- gnus (m~tastase et contournement du syst~me immuo nitaire). Le g~ne cellulaire p53 constitue, au regard des notions ~voqu~es ciodessus, un exemple tout ~ fait remarquable : le g~ne sauvage se comporte comme un g~ne suppresseur de tumeur, alors que certaines mutations, dites mutations activatrices, transforment p53 en oncog~ne. Le g~ne p53 est, parmi les g~nes connus, celui qui est le plus fr~quemment alt~r~ au cours du processus tumoral chez l 'Homme. Alors que le g~ne p53 sauo vage exerce une activit~ n~gative sur la division celluo laire et module positivement la mise en place de m~canismes apoptotiques en r~ponse ~ divers agents g~notoxiques, certains mutants ponctuels sont capables ~ l'oppos~ de conf~rer aux ceUules un avan- tage de croissance tout ~ fait comparable ~ celui observ~ pour d'autres oncog~nes ceUulaires ou viraux. Nous pr~sentons ici certains des r~suitats les plus marquants acquis depuis la d~couverte de la prot~ine P53 et de son activit~ biologique. Notre objectif est donc autant d'illustrer l ' importance des d~couvertes r~alis~es sur le plan fondamental, que de justifier l'attention croissante soulev~e par le g~ne p53 dans le domaine des pathologies tumorales.

FIGURE 1 Co-d~tection du complexe AgT/P53

2 3 0 J o u r s

C,~ttul~'~ de rongeur lrarlsfOrnlee$

par le v~rus SV40

Cell~e$ de ro~geu~ ~ransformees

yh"~ [ Extraction de~ p~ot~ime~

53ki

Les experiences r~alis~es d~s 1979 d~montrent qu'un rongeur d~veloppant une tumeur associ~e au virus SV40 produit des anticorps. Ces anticorps permettent d'isoler, & partir de cellules transform~es in vitro par le virus SV40, une pro- t~ine de 53kDa (P53). Les experiences r~alis~es par la suite d~montrent que P53 induit elle-m~me la production d'anticorps chez les animaux porteurs d'une tumeur associ~e au SV40, qu'elle est fr~quemment surexprim~e dans les tumeurs humaines et animales, et qu'elle forme un complexe avec l'antig~ne T dans les cellules transform~es par SV40.

Le g ne p53" de la notion d'oncog ne

celle d'anti-oncog ne...

• D ~ c o u v e r t e de ia prot~ ine P 5 3

Dans le milieu des ann~es 50, lors de la mise en place de stra- tegies de production & grande ~chelle du vaccin polio inactiv~ de Salk, les industries pharmaceutiques d~velopp~rent des techniques de culture du virus essentiellement bas~es sur l'utilisation de lign~es immortalis~es humaines ou de cultures primaires de cellules de rein de singe. Les autorit~s sanitaires de ]'~poque~ craignant ]a presence de virus contaminants dans les lign~es humaines de laboratoire, encourag~rent l'utilisation de cellules de singe.

Afin de v~rifier ]'innocuit~ des preparations vaccinales, celles- ci furent inject~es & des lots de hamster. Les r~sultats obtenus, loin de rassurer les d~tracteurs de la vaccination de masse (par ailleurs largement d~velopp~e & ce moment precis) soulev~- rent une vague d'inqui~tude dans les milieux scientifiques et m~dicaux. Apr~s 230 jours en moyenne, environ 25 % des hamsters d~velopp~rent des tumeurs ; celles-ci ~taient asso- cites & la presence d'un virus (oncog~ne) originaire du singe et present dans les cellules de reins utilis6es, le virus simien 40 (SV40). Paradoxalement (et tr~s heureusement pour les individus vaccines) ce virus se r~plique parfaitement sur cellules de singe mais n'induit de tumeurs ni chez son h6te natu- rel, ni chez l 'Homme.

Les cellules infect~es forment des tumeurs Iorsqu'elles sont inject~es & des souris isog~niques et stimulent la production d'anticorps sp~cifiques dirig~s contre des antig~nes viraux et cellulaires exprim~s par les cellules tumorales. Les prot~ines reconnues par ces anticorps sont appel~es antig~nes de tumeur. Ces anticorps s~riques repr~sentent un outil privil~gi~ pour rechercher et identifier des prot~ines virales et cellulaires potentiellement impliqu~es dans le processus tumoral. Les propri~t~s oncog~niques du virus SV40 sont associ~es ]'expression d'une prot~ine virale connue sous ]e nora d'anti- g~ne grand T (AgT) (67).

La d~couverte de la prot~ine P53 est associ~e aux travaux r~alis~s aux Etats-Unis par le groupe d'A.J. LEVINE, en Grande-Bretagne par D. LANE et L. CRAWFORD, et e n France par P. MAY.

Les anticorps polyclonaux produits par les souris portant une tumeur & SV40 d~tectent ]'antigOne grand T et, de fa9on assez syst~matique, une prot~ine d'un poids mol~culaire appa- rent de 53kDa dans les cellules infect~es (34, 37) (figure 1). Le groupe d'Arnold J. LEVINE a d~montr~ d~s 1979 qu'un tel s~rum est ~galement capable de d~tecter la prot~ine P53 dans des cellules transform~es non-infect~es (41), ce qui d~montre (a) que P53 stimule la production d'anticorps chez ces animaux et (b) que P53 est d'origine cellulaire. P53 est donc initialement d~crite comme un antigone de tumeur d'origine cellulaire.

A la m~me ~poque, plusieurs experiences d~montrent que P53 forme un complexe avec l'antig~ne grand T dans les tumeurs induites par le virus SV40 (37). Enfin, P53 est fr~- quemment surexprim~e dans les lign~es transform~es d'origine humaine ou murine ind~pendamment de l 'agent transfor- mant (5, 65), et cette surexpression est associ~e dans 10 % des cancers du sein chez l 'Homme, & la production d'anticorps polyclonaux s~riques (8). Ces donn~es sugg~raient que P53 ~tait tr~s probablement impliqu~e, directement ou indirectement, dans la transformation tumorale.

• C lonage et ~ tude de l 'act iv i t~ du g~ne p53 Dans les ann~es qui suivirent, plusieurs groupes isol~rent ind~- pendamment le g~ne et I'ADN compl~mentaire (ADNc) p53 partir de lign~es murines (6, 29, 57, 59) ou de cellules humaines (1, 22). En r~introduisant le g~ne p53 dans des cellules saines, c'est-&-dire non transform~es, il devenait possible d'~valuer l'effet de la surexpression de P53 sur la transforma-

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tion cellulaire. Les r&sultats obtenus ont en fait g~n~r~ la plus grande confusion. En effet, alors que certains ADNc s'av~raient capables d'immortaliser des fibroblastes embryonnaires de souris (29, 60) et de transformer les cellules en cooperation avec l'onco- g~ne ras activ~ (16, 17, 58), d'autres experiences sugg~raient

l'inverse que l'introduction de I'ADN compl~mentaire du g~ne p53 dans des fibroblastes embryonnaires n'induisait pas d'augmentation du taux de transformation et inhibait l'inverse la proliferation de cellules transform~es (15, 18). Afin de r~soudre cette apparente contradiction, les cliff,rents groupes impliqu~s mirent en commun leurs r~sultats et com- par~rent base & base la s~quence des clones isol~s. II apparut ainsi que seuls certains mutants du g~ne p53 ~taient capables d'induire la transformation des cellules en cooperation avec l'oncog~ne ras activ~ (15, 19, 25, 26), le g~ne p53 sauvage agissant & l'oppos~ comme un suppresseur de transformation ou anti-oncog~ne (15, 18). L'activit~ anti-proliferative du g~ne p53 a ~t~ v~rifi~e par la suite en r~introduisant le g~ne sauvage dans plusieurs lign~es cellulaires d~rivant de tumeurs humaines ou murines (3, 9, 30, 47). En conclusion, et c'est l& un caract~re ph~notypique majeur de p53, le g~ne sauvage pr~vient la proliferation des cellu|es iorsqu'il est surexprim~. A l'oppos~, la presence de certaines mutations ponctuelles, dites mutations activatrices, est m~me de promouvoir la proliferation et l'immortalisation de cellules fibroblastiques embryonnaires (figure 2). Le g~ne sauvage est donc un g~ne suppresseur de tumeur ou anti- oncog~ne, alors que certains alleles mut~s agissent comme des oncog~nes. Le g~ne p53 pr~sente d'autres caract~res commun~ment ren- contres chez les g~nes suppresseurs de tumeurs ; notamment, l'analyse des tumeurs viro-induites chez la souris (52) et des tumeurs chez l 'Homme (2, 54) indique que le g~ne p53 est fr~quemment alt~r~ au cours du processus tumoral.

leur transformation en cooperation avec l 'oncog~ne ras active. Dans ce contexte la prot~ine mutante impose un ph~- notype immortalis~ ou transform~ et l'on parle commun~- ment d'un mutant oncog~ne dominant. II ne s'agit donc en aucun cas d'une prot~ine mut~e inactive, mais d'une nouvelle forme (oncog~ne) de P53. Les m~canismes de cette dominance sont complexes et prennent deux aspects principaux, d~pendants de la Iocalisation precise de ces mutations : on dis- tingue d'une part les mutants dominants n~gatifs et d'autre part |es mutants dits "gain de fonction". Dans la premiere situation, dite de trans-dominance n~gative, la prot~ine mut~e n'exerce son activit~ immortalisante que Iorsqu'il existe dans la cellule une prot~ine P53 sauvage. Les mutations impliqu~es induisent une modification conformationnelle de P53, sans doute & l'origine de sa plus grande sta-

FIGURE 2 p 5 3 : oncog~ne et anti-oncog~ne

~brobiasles ADf~c p53 sauvage ~ 1 1 ~ . ~ S upple'.~ s~c)t'} de embry~n~a,res ~ . . . . ~ . . ~ / x ~ ~ ,a pro,,feratie# :

de rottge'~r L .......

953 m~te

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P53 et cancer" le rSle des mutations

Le g~ne p53 comprend environ 20 kilobases et est Iocalis~ sur le bras court du chromosome 17 chez | 'Homme. Le g~ne est compos~ de 11 exons, le premier de ces exons n'~tant pas codant. L'analyse extensive des sites mut~s dans les tissus tumoraux indique que la distribution des mutations n'est pas al~atoire et l'on qualifie de points chauds ("hot-spots") les bases les plus fr~quemment mut~es. Ces points chauds de mutation touchent des r~gions de la prot~ine qui sont extr~- mement conserv~es au cours de l'~volution (63). Nous verrons (cf. infra) que ces domaines constituent en fait des r~gions essentielles ~ l'activit~ de la prot~ine P53. Les ~tudes menses sur les ~rythro-leuc~mies murines asso- cites au virus de Friend ont ~t~ les premieres & avancer l'hypoth~se selon laquelle l'inactivation de p53 ~tait une composante essentielle du processus de transformation (52). Cette hypoth~se est notamment corrobor~e par le fait que des cellules embryonnaires fibroblastiques murines perdent fr~quemment les deux all~les de p53 Iors du processus d'immortalisation qui peut survenir in vitro (23). De la m~me fagon, les souris transg~niques qui ne contiennent aucun all~le actif de p53 (souris "knock-out" ou p53-/-) d~veloppent & un &ge pr~coce des tumeurs de nature vari~e (11). En conclusion, ces travaux d~montrent tous que l'inactivation compl~te de P53 est un facteur pr~disposant & l'~mergence des cancers (mutations inactivatrices). Dans les cellules transform~es par le virus de Friend, les mutations ont pour effet (a) soit d'inactiver les deux all~les de p53 (perte de fonction) par d~l~tion, insertion ou r~arrangement, Co) soit de g~n~rer une prot~ine P53 mutante (mutation faux- sens) l'autre all~le n'exprimant alors aucune prot~ine com- plate. Exprim~es dans des fibroblastes embryonnaires de rongeur, ces prot~ines mutantes induisent leur immortalisation, et

Le g~ne p53, lorsqu'il est sauvage, pr~vient la proliferation de cellules fibroblastiques embryonnaires de rongeur. Certaines mutations, dites activatrices, convertissent le g~ne p53 sauvage en oncogene. Ces mutants sont alors capables d'immortaliser des fibroblastes embryonnaires de rongeur, ou de les transformer en cooperation avec l'onco- g~ne ras active.

FIGURE 3 Effet des mutations touchant les alleles du g~ne p 5 3

JZ

v @ O o o

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T

T

Sans mutation (A), le g~ne p53 code pour une prot~ine formant un complexe t~tram~rique et manifestant une action anti-proliferative. Les mutations peuvent inactiver les deux all~les de p53 (B), et la proliferation r~sulte d'une perte totale de fonction. Les mutations dites trans-dominantes n~gatives (C) g~n~rent une prot~ine de conformation alt~r~e capable de s'associer & la prot~ine sauvage et de l'inactiver. Les mutations gains de fonction (D) g~n~rent une prot&ine P53 pr~sentant des activit~s nouvelles et stimulant la proliferation cellulaire.

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FIGURE 4 P53 et physiologie cellulaire

N'om~re de d~v~s~o~5 St;~de ~e d~/[erencL'~tfo#

Slade de d v i~on S~at~ me~abo]~que

Eta~ du ma~ede~ geneI~que

Fac~eu[~ de c~oi~sanc~ Facte~r~ de dif ferenciat i~n

Contac[s 4nte[ce~lu~aites

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D ; f f # [ e n c i ~ t i 0 e !

c e ~ l a i r e .i

D i v i s f o n cel i (~ la i f~

Le destin d'une cellule est d6termin~ par la r&sultante de facteurs exog&nes (facteurs de croissance ou de diff&renciation notamment) et endog~nes (stade de division, 6tat de I'ADN cellulaire, etc.). P53 joue un r61e pr6pond~rant dans le contr61e du cycle cellulaire, la diff6renciation cellulaire, le maintien de la stabilit6 g6n&tique et l'entr6e des cellules en apoptose en r&ponse & certains agents g&notoxiques.

FIGURE 5 R61es probables de P53 dans le contr61e du cycle cellulaire

A ~:3clears de cro~ssance

Pacteur~ de d i f ferent ia t ion ConI~ct~ i~ terc~t~ai res

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Notable de div is ions * ~ S~ade de d~fferenciat~o~ C¥~:tm~;,s A a-t 8

$~ade de dJvi~}on cdc2 Stalut ~e~aboiJq~e

E~t dtl mater~ei ge~e~ique

P53

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P o i n t s de v e r i f i c a t 0~

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~t~ dnseq~e (~xenucleas~ 3'- "5]

Acbvat i0n des sys~ernes de ~epa raUon

A cti ~ . ; I i ~ de WM.Cq~t

. . . . . . .......... JZI AC~n'~tio~ de Bs~

e~ re~r~ssi~t~ d~ i~¢~

Le cycle cellulaire est contr616 & chacune de ces phases (GO, G1, S, G2, M) (figure 5A). L'activit~ de P53 s'exerce essentiellement durant la phase G1. P53 est capable de reconnaitre sur I'ADN certaines modifications (structures partiellement simple brin, bases extra-num~raires...) induites par les agents g6notoxiques (figure 5B). Cette reconnaissance active la fixation de P53 (sous forme t6tram6rique) sur ses g&nes cibles, dont le g~ne Waf-Cipl. Celui-ci code pour un inhibiteur des kinases d@endantes des cyclines (cdk2) requises pour la transition G1/S. P53 activerait ~galement les syst&mes de r&paration de I'ADN et poss~de elle-m@me une activit~ exonucDasique 3'->5'. Le cycle cellulaire reprendrait apr&s que P53 a activ6 le g~ne Mdm2 dont le produit inactive en retour P53. Lorsque les 16sions sont trop importantes, P53 activerait l'entr6e des cellules en apoptose (induction du g&ne Bax et r~pression du g&ne Bcl-2).

bilit& et donc de son accumulation dans la cellule (20). La pro- t6ine mutante peut encore s'associer sous forme multim6rique avec la prot6ine P53 sauvage mais le complexe ainsi form6 serait globalement inactif. L'explication principale de la trans- dominance n&gative r&side donc dans l'inactivation de la pro- t&ine sauvage par la prot6ine mutante. Ce m6canisme n'est 6videmment efficace que si la mutation n 'a pas affect6 les domaines requis pour l'oligom6risation de P53, et si la pro- t6ine mutante a perdu la plus grande partie de son activit& D'un point de vue mol&culaire, la trans-dominance n6gative constitue une voie d'inactivation tout & fait remarquable ; les 6tudes structurales r6alis6es par Joe MILNER montrent e n effet que l'association de la prot~ine sauvage avec la prot&ine m u t a n t e induit u n e modification conformationnelle de la pro- t6ine sauvage, qui adopte alors la conformation inactive de la prot6ine mutante (49). Qu'il s'agisse de mutations inactivatrices ou transdominantes, le r6sultat net est identique et conduit, soit directement soit indirectement, & l'inactivation des prot~ines exprim6es & partir des deux all&les de p53. Selon ce mod&le, l'introduction d'un mutant transdominant dans des cellules n e c o n t e n a n t p lus a u c u n g~ne p53 actif n e doit donc pas alt~rer leur multiplication ni accro~tre leur pouvoir oncog~ne. Dans la seconde situation, la dominance de l'all~le mut6 s'exerce soit en pr6sence, soit e n a b s e n c e de la prot6ine sauvage. On d6signe ces mutants sous le nom de mutants "gain de fonction". En 1993, l'~quipe de A.J. LEVINE d6couvrit e n effet que certains mutants sp&cifiques de p53 6taient capables d'accro~tre le pouvoir tumorig~ne de lign6es cellulaires n e c o n t e n a n t a u c u n g~ne p53 sauvage (10). Cette experience d6montre que des mutations (tr~s sp6cifiques) de p53 p e u v e n t g~n~rer des prot~ines a y a n t d ' u n e part perdu leur pouvoir anti-oncog&ne, mais ayant d'autre part acquis des propri6t6s oncog~niques nouvelles. Les hypotheses formul~es actuelle- ment consid~rent que ces mutants seraient capables d'activer l'expression d'un ensemble de g~nes cellulaires non encore identifies pour la plupart (7, 40). Les effets cons6cutifs aux mutations touchant un seul ou les deux all~les de p53 sont r6sum6s (figure 3).

Activit s biologiques de P53

II est difficile aujourd'hui d'envisager un aspect de la physiologie cellulaire qui n'implique pas, directement ou indirectement, P53. P53 est en effet ce qu'il convient d'appeler "un gardien du g~nome" (36). Elle assure un contr61e actif sur le d~roulement du cycle cellulaire, mais plus g6n~ralement, constitue un point d'orientation d~cisif. Son activit~ porte autant sur la surveillance des l&sions g~n&tiques et sur l'activation des m~canismes de r~paration, que sur l'orientation des cellules vers certaines voies de diff~renciation ou encore sur l'entr~e des cellules en apoptose (figure 4). L'activit~ n~gative de la prot~ine P53 sur la progression du cycle cellulaire a &t~ d~montr&e notamment par l'&tude d'un mutant conditionnel de la prot~ine P53 murine ; une lign~e fibroblastique de rat, obtenue par co-transfection de l'onco- g~ne ras activ~ et d'un mutant thermosensible de P53 (Val 135) a ~t~ ~tudi~e & 32 °C, temperature & laquelle P53 est e n conformation active, et ~ 39 °C, temperature & laquelle P53 adopte une conformation mut~e. A 39 °C, les cellules acquit- rent un ph~notype transform~ et la prot~ine P53 est Iocalis~e dans l 'espace cytoplasmique. En revanche, le passage des cellules de 39 °C & 32 °C induit une relocalisation nucl~aire de la prot~ine et un blocage de la division cellulaire en phase G1 tardive (46, 48). Ces travaux et d'autres ~tablissent formellement que P53 est capable de bloquer la progression du cycle cellulaire en phase G1 (une phase pr~c~dant la r@lication de I'ADN cellulaire) apr~s exposition aux rayonnements UV ou ionisants et & certaines mol~cules g&notoxiques. Plusieurs ~l~ments sugg&rent que l'activit~ n&gative exerc&e par la prot~ine P53 sur la progression du cycle cellulaire est

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affili~e ~ l'activation des m~canismes qui assurent le maintien de l'int~grit6 g~n6tique de la cellule. Apr~s traitement des cellules aux rayonnements ionisants ou ultraviolets, le niveau intracellulaire de P53 augmente, vraisemblablement par le jeu d'une stabilisation post-traduction- nelle (21, 31, 45) ; l'accumulation nucl~aire de P53 coincide dans ces syst~mes avec l'arr~t des cellules en phase G1 ou leur entr6e en apoptose (31, 35). A l 'opposG les cellules n'exprimant pas P53, exprimant un mutant de P53 ou une prot~ine P53 sauvage inactiv6e par voie 6pig&n~tique (interaction avec certaines oncoprot~ines virales) ne s'arr~tent plus en phase G1 apr~s irradiation (35) ou exposition ~ l'actinomy- cine D (33). P53 est activ~e fonctionnellement Iorsque le g~nome est vic- time de certaines 16sions. Elle induit alors un arr@t de la division cellulaire probablement n~cessaire & la mise en place des m~canismes de r~paration de I'ADN, ou oriente les cellules vers la voie de l 'apoptose si l'extension de ces 16sions est trop importante (figures 5A et 5B). L'importance de P53 dans le maintien de la stabilit6 g4n6tique de la celMe est soulign~e par au moins deux s6ries d'observa- t i o n s :

-1 . les cellules primaires en culture ne pr6sentent pas, en g~n6ral, d'amplification g~nique, & l 'oppos6 des cellules immortalis6es ou transform6es (66, 68). Les m6canismes mol~culaires de cette instabilit~ sont encore real connus; cependant, l'inactivation des deux alleles du g~ne p53, fr~- quemment observ~e durant le processus d'immortalisation in vitro est associ6e ~ une augmentation de la capacit6 d'amplification g~nique de ces cellules (42, 71). R~ciproquement, la r~introduction du g6ne p53 sauvage dans ces cellules r~duit significativement le taux d'amplification g6nique (71) ; - 2. d'autre part, l'inactivation de P53 par la prot~ine E6 des papillomavirus de type 16 est fr~quemment associ~e & un accroissement du taux de mutation dans les cellules (24).

Modes d'action de P53

P53 agit essentiellement comme un facteur de transcription. Elle se fixe sous la forme d'un t~tram~re au niveau d'une s~quence d'ADN sp6cifique pr6sente sur plusieurs g6nes cellulaires (figure 6). Elle active ainsi sp~cifiquement l'expression du g4ne cellulaire Waf-Cipl (13, 14), qui code un inhibiteur des cdk kinases n~cessaires ~ la progression du cycle cellulaire. Ce m~canisme rend compte pour une part importante du contr61e n6gatif exerc6 par P53 sur la progression du cycle cellulaire. P53 active 6galement l'expression du g~ne cellulaire Gadd 45 qui est impliqu6 dans la r6gulation du cycle cellulaire et dans les m~canismes de r~paration de I'ADN (32). Elle active enfin l'expression du g~ne Mdm2, qui code pour une prot~ine capable de s'associer en retour avec la prot4ine P53 et de l'inactiver (51, 55, 56). L'activation du g6ne Mdm2 par P53 constitue donc une boucle de r6tro r~gulation, probablement requise & la reprise du cycle cellulaire apr6s r~paration des 16sions survenues dans I'ADN cel|ulaire (4, 69). Les diff6rents domaines de la prot~ine P53 requis pour sa fonction transactivatrice comprennent un domaine N-terminal dit transactivateur, car il interagit avec les 416ments du complexe de transcription (dont la prot~ine TBP). Le domaine central assure la reconnaissance sp~cifique de I'ADN et est la cible majeure des mutations dans les cancers humains. Le domaine C-terminal assure l'oligom4risation de P53 et comporte ~galement une activit~ de fixation asp~cifique & I'ADN (figure 7). Plusieurs travaux r~cents ont permis d'avancer un module d'activation de P53 en r6ponse aux l~sions g~n6r6es dans I'ADN cellulaire. On pense que P53 comporte une activit6 de fixation peu sp6cifique & I'ADN, conf6r6e par l'extr~mit~ car- b0xy-terminale de la prot4ine. Cette r~gion constitue la t~te chercheuse de P53. Lorsque la prot6ine rencontre une l~sion,

FIGURE 6 ModUle de t~tram~risation de P53

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P53 : F ' o " • "

La formation d'un t~tram~re, d'apr~s SAKAMOTO et coll. (61), s'effectue par l'association de structures en h61ice alpha antiparall~ies (AA 319-360). Le domaine basique, qui manifeste une affinit6 asp6cifique pour I'ADN, entrerait en contact avec la face externe du domaine de fixation & I'ADN et bloquerait donc la fixation de P53 ~ I'ADN. Les modifications touchant le domaine carboxy-terminal basique induirait un changement conformationnel de la prot~ine, d6mas- quant ainsi le site de fixation & I'ADN pr4sent dans le domaine central. Cette modification structurale est sch6matis6e par une modification de la forme du domaine central.

FIGURE 7 Cartographie simplifi~e

des principaux domaines fonctionnels de P53

AcHvi l6 eXOltl)el6asiql~e 3'->5 ~

]i f i t 1\ K

Trt~)~s.aciiva~io~l FixaliOl:t sp6e i f ique i~ i 'ADN IIII ~ IIIII I III

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Fixat io~ 5 TBP

F i x a t i o n it R P A Fixatio~l h ] t P A

5 |d in-2 .t~ ~ iv i~ ,,VrPa~e et al":,ealh~g

Les chiffres romains d~signent les domaines fortement conserv4s au cours de l'~volution. Les domaines requis pour l'activation de la transcription sont repr6- sent~s (rose). Les domaines potentiellement importants pour les fonctions de r6paration de I'ADN (jaune) et pour la r~pression de la transcription (vert) sont ~galement indiqu6s.

essentiellement des structures localement simple brin ou des r~gions contenant des bases extra num6raires sur un seul brin, des modifications conformationnelles d~masquent le domaine central de fixation ~ I'ADN. P53 peut alors stimuler l'expression de ses g~nes cibles et induire un arr~t transitoire du cycle cellulaire, cet arr@t permettant la mise en place des m6ca- nismes de r6paration (27, 28, 39). L'activation du g~ne Mdm2, qui est vraisemblablement secondaire & celle des g~nes Waf-Cipl et Gadd45, permettrait d'inactiver P53 et d'assurer une reprise du cycle cellulaire en phase S Iorsque les r6parations sont effectu6es. Le r61e de P53 dans les processus de r4paration de I'ADN pourrait, selon des rapports r6cents, ~tre encore plus direct. On sait en effet que P53 interagit avec le complexe de r6plica- tion A (RPA), un 616ment essentiel de la machinerie de r6pli- cation et de r6paration de I'ADN (12). Par ailleurs, l'~quipe de Frank GROSSE a d4montr~ que P53 poss~de une activit~ exonucl~ase 3 ' ->5 ' qui pourrait @tre associ6e & la correction des erreurs sur I'ADN (53).

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LEXIQUE

Amplification g~nique Alt~ration g~n~tique fr~quemment observ~e dans les cellules transform~es par laquelle un g~ne, souvent complet, est dupliqu~ en plusieurs copies dans le g~nome cellulaire. II s'agit donc d'un signe d'instabilit~ du g~nome cellulaire. Cette alteration conduit la surexpression du g~ne dupliqu~ et peut concerner des onco- g~nes cellulaires ou des g~nes de r~sistance aux mol~cules cytotoxiques. CDK ou prot~ines kinases d~pendant des cyclines (Angl. Cyclines Dependent kinases) Prot~ines-kinases (enzymes phosphorylant des prot~ines) dont l'activit~ est modul~e par des cyclines; les cyclines sont des pro- t~ines dont la concentration augmente et diminue p~riodique- ment au cours du cycle cellulaire et qui d~terminent par ce biais la progression du cycle. Exonucl~ase Enzyme d~gradant ]es acides nucl~iques & partir de leurs extr~mi- t~s, par opposition aux endonucl~ases qui induisent des coupures

l'int~rieur des acides nucl~iques. Immortalisation Processus spontan~ ou induit (par des agents mutag~nes ou des virus oncog~nes) selon lequel une cellule acquiert la propri~t~ de se diviser de fagon illimit~e. Mutat ion faux-sens Mutation induisant la substitution d'un acide amin~ donn~ par un acide amin~ different. Post-traductionnel(le) Qualifie toute modification touchant le produit d'un g~ne apr~s synth~se des ARNm en prot~ines. RPA Complexe de r~plication A. Complexe prot~ique compos~ de trois prot~ines (70K, 34K et 13K) tr~s conserv~es au cours de l'~volution. C'est le premier facteur cellulaire recrut~ iors de l'initiation de la r~plication de I'ADN. II se fixe & I'ADN simple brin au niveau de l'origine de r~plication, facilite le d~senroulement de I'ADN et l'initiation de la r~plication. P53, en se fixant & RPA, pourrait bloquer sa fixation & I'ADN et donc la r~plication du g~nome cellulaire. Le complexe RPA pourrait ~galement jouer un r61e important dans la r~paration de I'ADN et en particulier dans les m~canismes d'excision/r~paration. Dominance Type d'interaction entre deux g~nes all~les, dont Fun est qualifi~ de dominant et l'autre de r~cessif. La cellule h~t~rozygote pr~- sente un ph~notype d~fini par l'all~le dominant. On parle de trans-dominance n~gative Iorsque l'all~le mut~ (dominant) de p53 abolit la fonction normale (activit~ antiprolif~rative) de l'all~le sauvage (r~cessif). Transfection/co-transfection Technique de biologie mol~culaire permettant d'introduire et d'exprimer un g~ne recombinant dans une cellule ex vivo. La co- transfection d~signe l'introduction simultan~e de deux ou de plusieurs g~nes dans une m~me cellule. Transformation Acquisition, par une cellule, de propri~t~s g~n~tiquement stables lui conf~rant des caract~ristiques rencontr~es chez les cellules tumorales. (Perte de l'inhibition de contact et/ou moindre d~pen- dance aux facteurs de croissance par exemple).

Le r61e jou~ par P53 dans l 'orientation des cellules vers les voies d 'apoptose pourrait correspondre & une voie physiologique "normale ' , l 'apoptose prenant part activement ~ l'~la- boration de plusieurs compart iments cellulaires. Elle pourrait ~galement correspondre & la "solution de la derni~re chance" Iorsqu'il est n~cessaire de pr~venir la proliferation de cellules dont les alterations g~n~tiques n 'ont pu ~tre corrig~es.

Les donn~es biochimiques concernant l'activit~ de P53 dans l 'apoptose sont encore assez parcellaires. La vole apoptotique est induite en particulier Iorsque la prot~ine E2F, un facteur de transcription favorisant l 'entr~e des cellules en phase S, est exprim~e en presence de P53 (70). L 'apoptose, dans cette situation, est l 'expression physiologique du conflit r~sultant de la presence concomitante d'un ordre d'arr~t de division (associ~ & l 'expression de P53), et d 'un ordre de progression du cycle cellulaire (associ~ & la prot~ine E2F).

Un second module sugg~re que P53 module de fagon oppo- s~e l 'expression de deux prot~ines cellulaires impliqu~es dans

le contr61e de l 'entr~e des cellules en apoptose : P53 r~prime- rait l 'expression du g~ne Bcl-2 (dont l'activit~ anti-apoptotique est clairement ~tablie), et activerait l 'expression du g~ne Bax, un inducteur de l 'apoptose (50, 62). II est tout & fait raison- nable d ' imaginer que ces deux modalit~s d 'action coexistent. La validit~ de ces modules reste soumise & l'identification des facteurs cellulaires qui d~terminent le choix entre arr~t du cycle cellulaire ou entree des cellules en apoptose.

Conclusion

L' identi f icat ion r~cente de plusieurs activit~s biochimiques essentielles de P53, comme sa capacit~ & activer ou r~primer l 'expression de g~nes cellulaires ou viraux, ses mult iples interactions avec des prot~ines cellulaires (dont certaines sont au coeur des m~canismes de r~plication et de r~paration de I 'ADN), son activit~ intrins~que exonucl~asique, autorise aujourd'hui & ~tablir un lien rationnel entre les muta- t ions du g~ne p53 observ~es darts ies cancers et la transformation cellulaire. De nombreux aspects de l'activit~ de P53 darts les cellules "normales" non transform~es et non soumises la pression d'agents g~notoxiques, restent encore dans l 'ombre. L 'obtent ion de souris p53-/- a d~montr~ que P53 n'est pas strictement requise lots du d~ve- loppement embryonnaire (11), puisque les souris sont viables jusqu'& l'~ge adulte. Elles d~veloppent n~an- moins des tumeurs diverses avec une fr~quence sensi- blement plus ~lev~e que les souris p53+/+. On peut rapprocher cette observation de celles r~alis~es chez les patients atteints du syndrome de Li-Fraumeni. Ce syndrome est en effet caract~ris~ par la survenue pr~- coce de cancers (sarcomes, cancers du sein avant la m~nopause, tumeurs c~r~brales, leuc~mies, carci- homes ad~nocorticaux) chez des individus pr~sentant un lien de parent~ ~troit. Cette predisposit ion au cancer est en fait corr~l~e ~ la transmission d 'un allele mut~ (mutation faux-sens) du g~ne p53, et le processus tumoral est enclench~ lorsque l'all~le sauvage res- tant subit & son tour une mutation (44, 64). Les m~canismes de r~gulation du g~ne p53 jouent sans doute un rSle considerable, mais restent somme toute peu ~tudi~s. Cette tendance tradui t le fait que l 'activit~ de P53 serait essentiellement modul~e par des ph~nom~nes post-traductionnels, c'est-&-dire des modif ications biochimiques de la prot~ine (phospho- rylat ion notamment) ayant des effets sur sa conformation et /ou sur ses interactions avec d'autres prot~ines cellulaires. Si l ' image qui se d~gage progressivement est bien celle d'une prot~ine "sent inei le" de la cellule, il faut garder & l 'espri t que P53 peut se transformer sous l 'effet de mutations, en un v~ritable cheval de Troie. Cette activit~ oncog~ne se manifeste soit en abolissant (par trans-dominance n~gative) l 'activit~ anti-prol i ferative de ia prot~ine sauvage, soit grace l 'acquisit ion de propri~t~s oncog~niques nouvelles dont la nature reste encore myst~rieuse. Ces mutants "gain de fonct ion" pourraient activer l 'expression d 'un r~pertoire g~nique nouveau qu' i l reste ~ identifier. L ' importance des ~tudes menses sur le g~ne p53 et son rSle actif darts le contr61e du processus apopto- t ique est ~galement justif i~e par la mise en ~vidence d'une nouveile vole de r~sistance des cellules tumorales aux radiations ionisantes (38) ou aux traitements chimiotoxiques (43) associ~e ~ l ' inactivation de P53. Cet aspect nouveau, s'i l est ~tay~ par des ~tudes ~pid~miologiques rigoureuses visant ~ corr~ler le statut du g~ne p53 darts les tumeurs au succ~s des traitements anticanc~reux, pourraient au moins par- t iel lement or ienter le clinicien sur le choix des th~ra- peutiques & mettre en place.

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36 Revue franqaise des laboratoires, d#cembre 1996, N ° 289

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Protéine p53: sentinelle du génome