Proteinele

Proteinele sunt substanțe organice macromoleculare formate din lanțuri simple sau complexe de aminoacizi; ele sunt prezente în celulele tuturor organismelor vii în proporție de peste 50% din greutatea uscată. Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, în care secvența acestora este codificată de către o genă. Fiecare proteină are secvența ei unică de aminoacizi.

Compoziția proteinelor Sute de proteine diferite au fost izolate în forma lor pură, cristalină. Toate

conțin carbon, hidrogen, azot și oxigen; foarte multe conțin sulf. Unele proteine conțin în plus și alte elemente, în special: fosfor, fier, zinc și cupru. Masa moleculară a proteinelor este foarte mare, dar, prin hidroliză acidă, toate se transformă în compuși organici simpli, cu masă moleculară mică, numiți α-aminoacizi. Aceste molecule – ”cărămizi de construcție” – conțin cel puțin o grupare carboxil și o grupare α-amino, dar diferă între ele prin structura radicalilor (R) sau a lanțurilor laterale. În mod obișnuit în proteine se găsesc 20 de α-aminoacizi diferiți.

Formula structurală generală a α-aminoacizilor prezenți în proteine;

radicalul R este diferit pentru diferiți aminoacizi.

Radicalii celor mai importanți aminoacizi sunt prezentați mai jos:

În moleculele proteice, resturile de aminoacizi sunt legate covalent formând lanțuri foarte lungi, neramificate. Ei sunt uniți într-un aranjament cap-coadă prin legături de amidă substituită, numite legături peptidice, care se formează prin eliminarea elementelor componente ale unei molecule de apă dintre gruparea carboxil a unui aminoacid și gruparea α-amino a aminoacidului următor. Aceste macromolecule, numite polipeptide, pot conține mai mult de 100 de resturi de aminoacizi în moleculă.

Unele proteine conțin numai un lanț polipeptidic, altele conțin două sau mai multe. Lanțurile polipeptidice ale proteinelor nu sunt polimeri întâmplători, de lungimi nedefinite; fiecare lanț polipeptidic are masa moleculară, compoziția chimică, ordinea secvențială a aminoacizilor componenți și structura tridimensională bine definită.

Proteinele îndeplinesc în celulele vii diferite roluri: plastic sau structural,

reprezentând constituenții principali ai citoplasmei și infrastructurilor celulare, a umorilor și fluidelor organismelor vii; catalitic, mediază accelerând selectiv reacțiile biochimice specifice vieții în calitate de enzime; energetic furnizând energia necesară menținerii funcțiilor normale în cazuri limită pentru celulă sau pentru organism (inaniție, subalimentație, procese inflamatorii și patologice), de transport, hormonal, imunologic ș.a. Proteinele constituie, de asemenea, instrumentul molecular al expresiei informației genetice conținute în acidul deoxiribonucleic din cromozomi.

Fiecare moleculă proteică nativă prezintă o formă tridimensională caracteristică, funcție de dispoziția spațială a catenei (sau catenelor) polipeptidice din care este formată. Dispoziția catenelor polipeptidice în spațiu poartă denumirea de conformație. Datorită faptului că proteinele sunt biopolimeri macromoleculari, alcătuiți din catene polipeptidice de dimensiuni mari și extrem de diferite ca structură internă, așezarea lor spațială poate fi extrem de variată, de aceea s-a hotărât introducerea unei terminologii specifice pentru definirea nivelelor de organizare a moleculelor proteice. Între aceste nivele de organizare nu se poate face o delimitare netă ele reprezentând mai degrabă etape ale perfecționării neîntrerupte ale mijloacelor fizico-chimice de investigație a structurii proteinelor.

Structura primară a proteinelor Se referă la numărul și succesiunea resturilor de aminoacizi într-o

proteină, deci la organizarea catenei polipeptidice, dacă proteina este alcătuită din mai multe catene polipeptidice. Resturile de aminoacizi sunt unite între ele în cadrul structurii primare prin legături peptidice formate între gruparea funcțională carboxil a unui aminoacid și gruparea funcțională amino din poziția α a unui alt aminoacid:

Studiul peptidelor sintetice cu ajutorul metodei difracției de raze X prin

cristale pure, a permis precizarea distanțelor interatomice într-o catenă polipeptidică, unghiurilor dintre atomii componenți ai unei secvențe aparținând unei catele polipeptidice extinse și forma ideală a acesteia (Pauling și Corey, 1954). Determinările efectuate pe numeroase preparate cristaline de peptide sintetice au demonstrat existența unei perioade de identitate de 7,27Å pentru fiecare două resturi de aminoacizi și distanțe interatomice normale între C' – C” (1,53 Å) și C'” – N (1,47 Å).

Datorită unghiurilor de valență dintre atomi și așezării coplanare a atomilor interesați în legătura peptidică catena polipeptidică proiectată într-un plan are forma de zig-zag, iar catenele laterale ale resturilor aminoacizilor constituenți sunt dispuse alternant deasupra și dedesubtul planurilor formate de legătura polipeptidică.

Proteinele formate din mai multe catene polipeptidice se numesc proteine oligomere, iar catenele care le alcătuiesc protomeri. Legăturile dintre protomeri într-o proteină oligomeră sunt legături covalente, dar nu de natură peptidică, formate între două resturi de aminoacizi ce aparțin la două catene polipeptidice diferite (legături intercatenare).

Sanger (1955) reușește pentru prima dată să stabilească structura primară a unei proteine-hormon – insulina.

Insulina este alcătuită din două catene polipeptidice: catena A, care conține 21 resturi de aminoacizi și prezintă o punte disulfurică intracatenară formată de resturile de cisteină în poziția 6 – 11 și catena B care este alcătuită din 30 resturi de aminoacizi. Cele două catene sunt legate între ele prin două punți disulfurice formate de resturile de cisteină din pozițiile A7 – B7 și A20 – B19 (Ryle, Sanger, Smith, Kitai,1955).

În urma cercetărilor s-a ajuns la concluzia că structura primară a

proteinelor este importantă pentru asigurarea unor proprietăți biologice. Structura secundară a proteinelor reprezintă al doilea nivel de

organizare al acestora. Se referă la aranjarea spațială a moleculei proteice pe o singură axă. Acest lucru este posibil datorită legăturilor de hidrogen formate între resturile carboxil și amino aparținând legăturilor peptidice.

Cea mai mare contribuție la elucidarea structurii secundare a proteinelor au avut-o Pauling și Corey care au elaborat modelele teoretice: modelul

helicoidal sau spiralat denumit α-helix, rezultat prin spiralarea catenei polipeptidice în jurul unui cilindru imaginar.

În funcție de direcția de spiralare teoretic α-helix-ul poate să apară sub

două forme: α-helix-ul de dreapta, care are sensul unui șurub cu pasul spre dreapta și α-helix-ul de stânga, care are sensul unui șurub cu pasul spre stânga. În ambele forme radicalii R ai aminoacizilor sunt proiectați spre exteriorul elicei.

Helixul de tip α are forma unei scări în spirală. Înălțimea fiecărei trepte este de 1,5Å, iar o spiră conține 3,6 resturi de aminoacizi, ceea ce face ca distanța dintre spire să fie 5,44Å.

Această structură este menținută în spațiu datorită legăturilor de hidrogen

intracatenare în care sunt implicate toate legăturile peptidice. Legăturile de hidrogen sunt paralele cu axul elicei și se realizează între gruparea carboxil a unui aminoacid și gruparea amino a celui de-al patrulea aminoacid. Aminoacizii care intră în alcătuirea α-helix-ul aparțin seriei L.

Catenele polipeptidice nu pot exista toate sub formă de α-helix, deoarece structura acestuia este determinată și de natura și succesiunea radicalilor resturilor de aminoacizi. Resturile de prolină, hidroxiprolină și glicocol prezente în structura primară a proteinelor tind să confere catenelor (catenei) polipeptidice o altă conformație decât cea de α-helix, denumită β-conformație sau modelul straturilor pliate în care catenele sunt relativ extinse.

Structura β sau modelul straturilor pliate se bazează pe formarea legăturilor de hidrogen intercatenare și poate apărea în două variante: modelul

paralel al straturilor pliate (cazul β-keratinei) și modelul antiparalel (în cazul fibroinei din mătase).

În modelul paralel (a, c) toate lanțurile polipeptidice sunt așezate paralel, cu grupările R orientate în același sens, în timp ce în straturile antiparalele (b, d) catenele polipeptidice sunt așezate față în față.

Spre deosebire de α-helix, în structura de tip β, legăturile de hidrogen sunt

aproape perpendiculare pe axa lanțului polipeptidic. În afara tipurilor principale de structură secundară – α-helixul și structura cu straturi pliate – există și un al treilea tip denumit modelul structural al colagenului, proteină mult răspândită în țesuturile conjunctive, tendoane, ligamente, cartilagii, piele, oase etc. Studiile de difracție a razelor X indică un model structural diferit de cel α-helicoidal și de cel stratificat. Proporția mare a resturilor de prolină și hidroxiprolină (până la ¼ din moleculă) face imposibilă structura α-helicoidală și β-stratificată, datorită faptului că cei doi aminoacizi inserați în structură nu pot participa la formarea legăturilor de hidrogen.

Studiile de difracție a razelor X, pe cristale de colagen, au arătat că acesta este alcătuit din trei catene polipeptidice, răsucite una în jurul celeilalte și toate trei în jurul unei axe proprii, dând naștere unui triplu helix (vezi figura).

Fiecare catenă polipeptidică a colagenului are o masă moleculară de 95000 daltoni și este alcătuită din aproximativ 1000 resturi de aminoacizi.

Structura terțiară a proteinelor Acest nivel de organizare structurală reprezintă rezultatul interacțiunilor

dintre resturile aminoacizilor din catenele polipeptidice (R), interacțiuni care apar deja și în cazul lanțurilor polipeptidice mai lungi care au o structură secundară proprie. Pauling a sugerat că fiecare elice poate fi la rândul ei înfășurată sub forma unei supraelici (superhelix) ce posedă o spiră mare pentru fiecare 35 de spire a elicei α. șase astfelde suprahelixuri sunt împletite în jurul unui al șaptelea spre a forma o arhitectură moleculară complexă asemănătoare unei funii formate din șapte fire torsionate.

Proteinele cu o structură terțiară bine studiată și cunoscută în prezent sunt hemoglobina, mioglobina, ribonucleaza, chimotripsinogenul, carboxipeptidaza A.

Menținerea structurii terțiare se realizează prin forțele de atracție care se nasc între radicalii catenelor polipeptidice ce pot ajunge în poziții favorabile formării unor legături.

- legături de hidrogen care se pot forma între gruparea fenolică a tirozinei și un rest carboxilic, aparținând acidului glutamic sau acidului aspartic, între restul imidazolic al histidinei și gruparea – OH a serinei etc. (nu însă între – CO– și – NH ale legăturilor peptidice, deoarece acestea aparțin structurii secundare). - legături ionice între resturile –COOH ale aminoacizilor dicarboxilici și resturile –NH2 ale acizilor diaminomonocarboxilici. Aceste legături se realizează când distanța dintre atomi e cuprinsă între 2 și 3,1Å. Studii ale difracției razelor X au demonstrat că doar o parte relativ mică dintre legăturile ionice posibile se realizează în realitate, datorită faptului că majoritatea lor intră în interacțiune cu solventul. Se poate spune că proteinele au în soluții o conformație în care un număr maxim de grupări polare sunt expuse la suprafața arhitecturii moleculare,

deci interacționează ușor cu solventul, iar resturile aminoacizilor cu grupări nepolare sunt dispuse în interiorul acesteia. - legături apolare prin forțe van der Waals formate între resturile de hidrocarburi ale catenelor laterale (alanină, fenilalanină, leucină etc.). La aceste legături, care s-au dovedit de o deosebită însemnătate pentru menținerea structurii terțiare, participă atomi care se află la distanțe variind între 3,1 și 4,1Å.

Aceste tipuri de legături (fig. ) implicate în structura terțiară a moleculelor

proteice sunt mult mai labile decât legăturile chimice obișnuite (tabelul ...)

Diversitatea tipurilor de legături chimice întâlnite în structurile terțiare ale

biopolimerilor, precum și valorile energiilor legăturilor explică marea labilitate a proteinelor în prezența diverșilor factori externi sau celulari (pH, temperatură, presiune, reactivi chimici etc. ). Dezorganizarea acestei structuri terțiare atât de complexe și de variate aduce cu sine pierderea proprietăților biologice ale proteinelor. Adesea se pot produce doar mici modificări în conformația ce determină structura terțiară prin legarea într-un mod oarecare, de exemplu, prin adsorbție, a unui compus chimic cu masa moleculară mică. Această mică

modificare a conformației poartă numele de efect alosteric și joacă un rol deosebit în activitatea enzimelor.

În ceea ce privește forma moleculelor proteice, care este condiționată îndeosebi de structura secundară și terțiară, se cunosc ca tipuri extreme proteine fibrilare și proteine globulare , alături de numeroase proteine care au o structură intermediară.

Proteinele fibrilare au o structură filiformă alcătuită din catene liniare; majoritatea îndeplinesc în organism mai ales rol de susținere și rezistență mecanică. Reprezentanții tipici ai acestei categorii de proteine sunt miozina, keratina din păr, fibroina din mătase etc. (poze cu. pe ppt....)

Proteinele globulare nu au formă sferică, ci forma unor cilindri elipsoidali a căror lungime depășește de 2-6 ori diametrul lor și în care catenele macromoleculare sunt strânse sub formă de ghem. Se găsesc în general în lichidele din organism (albumine, globuline).

Forma moleculelor proteice se datorează nu numai factorilor care aparțin de însăși structura moleculelor, ci și factorilor de mediu. Replierea, bobinarea, desfacerea catenelor depinde de pH și salinitatea mediului, de prezența unor compuși, de presiune, de temperatură etc., ceea ce explică variabilitatea funcțională a proteinelor în raport cu mediul de reacție, precum și faptul că unele proteine fibrilare pot adopta formă globulară odată cu schimbarea caracteristicilor mediului.

Structura terțiară a mioglobinei, cromoproteidă alcătuită dintr-un hem (partea prostetică) și globină (partea proteică) a fost elucidată de Kendrew, care a arătat că această moleculă care are o formă globulară și o masă moleculară de 16700 daltoni, constă dintr-o singură catenă polipeptidică alcătuită din 153 resturi de aminoacizi și o grupare feroporfirinică.

Molecula mioglobinei este compactă și în interiorul ei se află un spațiu în

care se găsesc numai patru molecule de apă, iar grupările R ale resturilor de

aminoacizi sunt orientate către exteriorul moleculei în timp ce grupările R apolare sau hidrofobe sunt îndreptate spre interiorul moleculei.

Structura cuaternară a proteinelor Reprezintă nivelul de organizare cel mai înalt al proteinelor și este

rezultatul interacțiunii dintre catenele polipeptidice independente care au structuri primare, secundare și terțiare bine definite. Structura cuaternară se referă la modul cum se unesc subunitățile proteice. Acest tip de structură este frecventă pentru proteinele globulare a căror masă moleculară este mai mare de 50000 și deci sunt proteine oligomere.

Structura cuaternară a proteinelor reprezintă asocierea ordonată a subunităţilor globulare pentru a forma un agregat funcţional. Aceasta implică două tipuri de ansambluri proteice:

Primul tip, în care subunităţile sunt, din punct de vedere structural, foarte diferite, iar organizarea lor spaţială depinde de natura specifică a interacţiilor dintre subunităţile diferite. În general, aceste ansambluri prezintă forme geometrice foarte neregulate.

Al doilea tip, în care agregatele moleculare sunt alcătuite din copii multiple ale unuia sau mai multor tipuri de subunităţi diferite. Datorită recurenţei interacţiilor structurale specifice dintre subunităţi, asemenea agregate formează, în general, aranjamente regulate din punct de vedere geometric.

Proteinele alcătuite din subunităţi identice se numesc oligomere, iar subunităţile respective se numesc protomeri. Un protomer poate fi constituit dintr-un singur lanţ polipeptidic sau din mai multe lanţuri diferite. Astfel, hemoglobina, care este alcătuită din două catene polipeptidice de α-globină şi două de β-globină (α2β2), poate fi considerată un dimer alcătuit din doi protomeri αβ.

Legăturile care se stabilesc între subunităţile dintre ambele tipuri de ansambluri proteice sunt: hidrofobe, de hidrogen şi uneori sub formă de punţi disulfurice.

Având în vedere că proteinele sunt compuşi fundamental asimetrici (pentru că sunt alcătuite numai din L-aminoacizi), este evident că cel mai simplu model de structură cuaternară este formarea agregatelor liniare

DE REVAZUT ȘI DE COMPLETAT MATERIALUL:

STRUCTURA CUATERNARĂ A PROTEINELOR !!!!

ENZIME Evoluția spectaculoasă pe care a cunoscut-o enzimologia în ultimele

decenii este strâns legată de progresele remarcabile înregistrate în studiul organizării structurale a proteinelor. Acestea au contribuit decisiv la înțelegerea mecanismelor intime de acțiune a enzimelor.

Manifestările acțiunii enzimelor (fermentația, respirația celulară, digestia) erau cunoscute de foarte mult timp, dar explicația mecanismului acestor procese complexe, rolul și locul enzimelor în transformările substanțelor celulare au fost mult timp necunoscute, multe mecanisme și procese biochimice rămânând neclare și astăzi.

Enzimele sunt biocatalizatori organici, coloidali, specifici aparținând prin natura lor chimică proteinelor. Enzimele sunt compuse dintr-o parte proteică și o grupă prostetică asociată. Grupa prostetică legată cu diferite grade de stabilitate de gruparea proteică poartă denumirea de coenzimă sau cofactor (cofactorii sunt modificați odată cu reacția chimică pe care o suferă substratul). Partea proteică primește numele de apoenzimă, iar ansamblul apoenzimă-coenzimă se numește holoenzimă reprezentând forma catalitic activă.(figura).

Enzimele cunoscute până în prezent sunt substanțe de natură proteică și

îndeplinesc rol de catalizator al transformărilor biochimice din celula vie. Fiind biocatalizatori, enzimele prezintă toate proprietățile generale ale catalizatorilor chimici:

- măresc viteza reacțiilor chimice posibile din punct de vedere termodinamic prin scăderea energiei de activare și instalarea mai rapidă a stării de echilibru;

- activitatea catalitică este manifestată în concentrații mici, mediul de reacție conținând concentrații relativ mari de substrat;

- la sfârșitul transformării catalizatorii chimici se regăsesc în mediu din punct de vedere cantitativ și calitativ, într-o stare chimică neschimbată, putând participa la un nou act catalitic.

Structura enzimelor Din punct de vedere structural, enzimele pot fi clasificate în două mai

grupe: enzime monocomponente și enzime bicomponente. Enzimele monocomponente sunt holoproteine, ceea ce înseamnă că

moleculele acestora sunt formate din una sau mai multe catene polipeptidice. Enzimele bicomponente sunt heteroproteine (proteine complexe sau

proteine conjugate) și conțin, în afară de componenta polipeptidică și o componentă de altă natură, neproteică numită cofactor enzimatic. Componenta proteică a enzimelor bicomponente poartă numele de apoenzimă. Pentru enzimele bicomponente, cofactorul enzimatic este implicat direct în realizarea actului catalitic, în timp ce apoenzima este răspunzătoare în primul rând de specificitatea de acțiune.

Clasificarea enzimelor Enzimele cunoscute până în prezent se clasifică în șase clase principale,

enzimele cuprinsă într-o clasă catalizând același tip de reacție: 1. Oxidoreductazele – enzime ce catalizează reacțiile de oxidoreducere

ce au loc în organismele vii. Acestea catalizează reacții de tipul:

în care electronii sunt donați unui al doilea substrat, ca în cazul particular

al reacției catalizate de alcool:NAD oxidoreductază:

2. Transferazele – enzime ce catalizează reacții de transfer ale unor grupe

de atomi de la un substrat la altul, fără ca aceste grupări să existe libere în timpul procesului.

Transferazele catalizează reacții de tipul

în care un radical R este scindat din structura unui substrat, fixându-se în

structura celui de-al doilea substrat. Astfel, enzima L-aspartat: 2-oxoglutarat aminotransferaza cu denumirea veche glutamat oxaloacetat transaminaza (GOT) catalizează reacția:

în care are loc o reacție de transfer a unei grupări de azot și anume a unei

grupări amino. 3. Hidrolazele – enzime ce catalizează scindarea diferitelor legături

covalente din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă. Hidrolazele catalizează reacții de tipul:

care sunt reversibile, echilibrul lor fiind deplasat în sensul hidrolizei. Ca exemplu, enzima lipaza, cu denumirea sistemică glicerol:ester

hidrolaza, catalizează reacția:

4. Liazele – enzime ce catalizează reacții în care are loc ruperea

legăturilor dintre doi atomi (C – C, C – heteroatom) fără participarea apei. De exemplu enzima izocitrat glioxilat liaza catalizează reacția:

în care după scindarea legăturii C – C are loc o rearanjare care conduce la

oxidarea alcoolului secundar la aldehidă. 5. Izomerazele – enzime care catalizează diferite reacții de izomerizare a

substratelor ( adică reacții în care au loc rearanjări intramoleculare):

De exemplu, enzima alanin-racemaza catalizează reacția fiind înalt

specifică pentru L- și D-alanină:

6. Ligazele sau sintetazele – enzime ce catalizează formarea unor noi

legături chimice, în majoritatea cazurilor utilizându-se energia stocată în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP.

În acest fel se pot constitui noi legături C – O, C – S, C – N, C – C. De exemplu, enzima piruvat carboxilaza, cu denumirea sistemică piruvat: CO2ligaza (ADP) catalizează reacția reversibilă:

Centrul activ al enzimelor Cu unele excepții, masa moleculară a enzimelor este mult superioară

maselor moleculare ale substratelor. Activitatea catalitică este realizată de o regiune mică din enzimă, geometric discretă, numită centrul activ sau situs catalitic (activ).

Structura centrului activ este diferită de la o enzimă la alta și depinde în mare măsură de structura macromoleculei enzimatice în ansamblu. Astfel, la enzimele monocomponente a căror moleculă este formată exclusiv din catene polipeptidice, centrul activ este alcătuit din resturi de aminoacizi localizate în zone extrem de diferite ale catenei (catenelor) polipeptidice dar care în urma spiralizării și plierii acestora pentru formarea structurilor de nivel superior devin vecine, fiind grupare pe o arie cu diametrul de cel mult 30Å.

În cazul enzimelor bicomponente, cofactorul enzimatic face parte integrantă din structura centrului activ fie singur, fie de cele mai multe ori, împreună cu unele resturi de aminoacizi din structura apoenzimei.

Geometria centrului activ trebuie să fie complementară cu cea a substratului natural a cărui transformare o catalizează, să-i permită "pătrunderea" în cavitate și stabilirea legăturilor în vederea formării complexului enzimă – substrat.

Energetica și mecanismele interacțiunii enzimă-substrat Teorii asupra acțiunii enzimatice

1. Prima dintre acestea este teoria lacăt – cheie, formulată de către Herman Emil Fischer în 1894. În conformitate cu aceasta, între enzimă și substrat trebuie să existe o stereocomplementaritate cât mai bună, astfel încât interacțiunea dintre cele două specii să fie maximă. Acest tip de interacțiune implică o enzimă pereche pentru fiecare substrat, structurile celor două componente fiind rigide.

2. Teoria lacăt – cheie a fost înlocuită cu teoria ajustării induse, elaborată de Koshland în 1958, o teorie mult mai cuprinzătoare și totodată plauzibilă. În conformitate cu aceasta, atât enzima cât și substratul își adaptează reciproc conformația, prin modificarea unghiurilor și a lungimilor legăturilor, astfel încât între substrat și enzimă să existe o potrivire cât mai bună, prin complementaritatea sterică și electrostatică a punctelor de atașare. Această ajustare se petrece dar nu poate fi perfectă deoarece, prin stabilizarea maximă a complexului enzimă – substrat ar aduce energia acestuia la o valoare minimă, incompatibilă cu transformările ulterioare – o condiție pentru eficiența reacției catalitice.

3. Pentru explicarea accelerării reacției enzimatice față de reacția

necatalizată, s-a emis teoria desolvatării și a solvatării-substituției. Teoria,

elaborată inițial de Dewar în 1986, arată că între reacția enzimatică și o reacție în fază gazoasă există asemănări.

Intrând în situsul catalitic, substratul elimină toate moleculele de apă. În acest mod interacțiunea dintre enzimă și substrat se petrece ca și interacțiunea între doi reactanți aflați în fază gazoasă, fără intervenția perturbatoare a moleculelor de "solvent". Această teorie explică de ce uneori moleculele mai mici reacționează mai lent decât cele mari pe argumentul dezlocuirii unei cantități mai mici de apă.

4. Poate cea mai importantă caracteristică a enzimelor este stereoselectivitatea. Pentru a explica aceasta a fost dezvoltată de către A. G. Ogston teoria celor trei puncte de atașare (1948). Această teorie explică stereoselectivitatea unui proces enzimatic, putând fi aplicată și pentru chemocataliza stereoselectivă. În conformitate cu enunțul, deoarece stereoselectivitatea unui proces este o proprietate spațială, substratul supus transformării trebuie fixat în cel puțin trei puncte de enzima cu ale cărei grupări active va interacționa.

Această fixare, care precede și determină acțiunea operatorului chimic din

situsul catalitic, se face prin intermediul unor legături chimice și/sau fizice, care nu se pot stabili decât prin ajustarea complementară a pnctelor de interacțiune (A - A'; B – B' și C – C', figura). După cum se vede în figură, complementaritatea (ajustarea) apare doar în cazul I. Enantiomerul pereche nu se poate adapta la topologia situsului catalitic din enzimă (cazurile II, III și IV).

Interacțiunea enzimă – substrat: aspecte energetice Enzima interacționează cu substratul, formându-se inițial un complex enzimă – substrat ES (figura de mai jos) parțial stabilizat. În complex are loc, în urma contactului dintre substrat și resturile de aminoacizi din situsul catalitic al enzimei (operatorul chimic), transformarea substratului în produs legat de enzimă (EP). În această transformare, esențială pentru substrat, acesta trece în

formă legată de enzimă prin starea intermediară de complex activat ES#, de energie maximă. Diferența dintre entalpia liberă a acestei stări și entalpia liberă a complexului enzimă – substrat va da entalpia liberă de activare a reacției enzimatice, ΔGe

#. Comparativ cu valoarea entalpiei libere de activare în procesul de transformare necatalitică a aceluiași substrat ΔGe

# inegalitatea este evidentă:

Punerea în evidență a interacțiunii dintre enzimă și substrat, comparativ cu a interacțiunii dintre enzimă și starea de tranziție a substratului (complexul activat), se poate face prin intermediul următoarei scheme de reacție:

Etapele de formare a produsului, atât în reacția necatalitică cât și în cea enzimatică, sunt cele mai lente și de aceea, determinante de viteză. În acord cu teoria complexului activat atât pentru reacția necatalizată, cât și pentru reacția catalizată, vitezele de formare a produsului sunt egale cu produsul dintre concentrația stării de tranziție (T și respectiv ET) și frecvența γ de oscilație a legăturii ce se va rupe. Acestă frecvență se va determina din egalitatea celor două forme de exprimare a energiei acestei legături:

Prin urmare:

Exprimând constantele de echilibru ale reacției de formare, respectiv de descompunere a complecșilor activați pentru reacțiile necatalitice, respectiv catalitice:

Concentrațiile complexelor activate pot fi exprimate prin entalpiile libere de activare (echivalentele energiilor de activare):

Eliminând din ecuațiile (2) concentrațiile complexelor activate, vitezele

reacțiilor necatalizate, respectiv catalizate vor avea forma:

Ecuațiile (5) atestă dependența inversă dintre vitezele de reacție și entalpiile libere de activare, respectiv dependența directă dintre vitezele de reacție și temperatură. Admițând că reacțiile globale de formare a produsului P atât în reacția necatalizată, cât și în reacția enzimatică sunt de ordinul I, adică:

Prin identificare din expresiile (5), constantele de viteză vor fi:

Revenind la constantele de echilibru de activare, constantele de viteză vor

avea forma:

Raportul constantelor de viteză (ke/kn), în condițiile în care atât procesul catalitic cât și cel necatalitic se desfășoară la aceeași temperatură, va fi egal cu raportul constantelor de echilibru ale formării stărilor de tranziție corespunzătoare:

Înlocuind în relația (9) expresiile celor două constante de echilibru și ținând seama că KS și KT reprezintă constantele de disociere ale complexului enzimă-substrat (ES) și ale complexului activat (ES#) adică:

de aici rezultă:

Constanta de viteză a reacției enzimatice poate fi cu până la 16 ordine de mărime mai mare decât a reacției necatalizate. Acest raport, care exprimă factorul de amplificare al vitezei de reacție de către enzimă, se regăsește în raportul constantelor de disociere ale complexului enzimă-substrat și ale complexului activat, ceea ce duce la concluzia stabilizării mult mai puternice a stării de tranziție decât a substratului. De altfel, așa după cum reiese din diagrama energetică a evoluției reacției enzimatice, stabilizarea prea puternică a substratului ar duce la mărirea barierei energetice a reacției, cu consecința scăderii vitezei de transformare a substratului în produs. Teoria ajustării induse, după cum s-a văzut, implică stabilizarea cât mai bună a stării de tranziție. Ori, această stabilizare implică o distanță optimă între grupele–atomii complementari steric și electric. Atingerea distanțelor optime se face pe seama modificării lungimii legăturilor, pe seama modificării unghiurilor de valență și a celor de torsiune, în scopul minimizării entalpiei libere a complexului activat, adică a complexului dintre enzimă și starea de tranziție.

Funcția catalitică a enzimei se manifestă prin asistarea transformării substratului în produs, într-o reacție mai rapidă decât cea necatalizată, ca rezultat al scăderii energiei de activare.

Enzima este o substanță proteică care are toate însușirile unui catalizator clasic, excelând față de acesta, de regulă, prin activitate, selectivitate și prin capacitatea de a lucra în condiții apropiate de cele ambientale activității umane. Formarea produsului din substrat într-o reacție enzimatică presupune trei etape:

1. Atașarea non-covalentă a substratului (substratelor) prin intermediul resturilor auxiliare A de aminoacizi din structura proteică a enzimei. În acest mod se va forma complexul enzimă–substrat (ES). De regulă, entalpia liberă (conținutul de energie) al acestui complex este mai redusă decât în cazul amestecului substrat–enzimă, datorită unei anume stabilizări a substratului de către enzimă. Această stabilizare este însă limitată, în caz contrar diferența dintre conținutul de energie al complexului activat (ET#) și al complexului enzimă–substrat (ES) ar fi prea mare, ceea ce ar reduce viteza reacției asistate (Irimie, 1998).

2. Interacțiunea substratului legat cu resturile aminoacizilor de contact (C), proces în urma căruia are loc reorganizarea sistemului de legături din substrat(uri), cu formarea de produs. Acest proces trebuie să depășească bariera dată de energia de activare a reacției enzimatice. Asistența enzimei în această fază constă în furnizarea grupelor active, potrivite ca tip, distanță și orientare, care asistă ruperea și reformarea legăturilor din substrat sau între substraturi.

3. Produsul (produșii) formați disociați de pe enzimă. Situsul catalitic este format din aminoacizii de contact și din aminoacizii

auxiliari. Dispuânerea în spațiu a acestor aminoacizi nu coincide cu dispunerea lor în secvența din catenă. Structura situsului catalitic a multor enzime a fost descifrată prin difracție de raze X. Pe lângă aminoacizii de contact și cei auxiliari, o enzimă mai conține aminoacizi conformaționali, care prin interacțiuni intracatenare reciproce, asigură stabilitatea edificiului proteic și integritatea situsului catalitic. Pe lângă aceste trei categorii de aminoacizi, mai există și aminoacizi neutri, care nu au aparent vreo influență asupra structurii enzimei sau a performanțelor catalitice ale acesteia. În realitate, acești aminoacizi participă, prin interacțiuni cu solventul, la stabilitatea structurii terțiare și eventual cuaternare a enzimei.

Biocatalizatori naturali și modificați Majoritatea reacțiilor din natură sau din laboratorul chimic presupun

asistența unei substanțe care are rolul de a reduce entalpia liberă de activare a reacției, facilitând astfel accesul în unitatea de timp a unui număr mare de molecule de substrat la nivelul energetic astfel coborât, mărind în consecință viteza reacției (bio)chimice.

Această substanță este catalizatorul chimic, sau, dacă este produs de materia vie, vorbim de biocatalizator. Elementul fundamental al celor două tipuri de catalizatori este că ambii accelerează viteza reacțiilor. Pe lângă aceasta atât catalizatorii, cât și biocatalizatorii au o serie de caracteristici comune.

Caracteristici generale ale catalizatorilor

o Un catalizator este o substanță care mărește viteza reacției chimice o Catalizatorul acționează asupra unei substanțe numită substrat o Deși catalizatorul participă direct la procesul de transformare

chimică a substratului, el se regăsește nemodificat după terminarea procesului. Acest proces poate implica o fază de regenerare enzimatică

o În cazul proceselor controlate de echilibru, un catalizator mărește viteza cu care se atinge echilibrul, nemodificând constanta de echilibru sau variația standard a entalpiei libere

o În prezența unui catalizator, un proces favorabil termodinamic este transformat într-unul și mai favorabil (mai rapid)

o Un proces termodinamic nefavorabil nu poate fi făcut favorabil în prezența vreunui catalizator.

Spre deosebire de catalizatorii chimici (chemocatalizatorii), biocatalizatorii sunt produși sau provin din materia vie. Majoritatea catalizatorilor biologici au o natură proteică, fiind cunoscuți sub numele de enzime (excepția o constituie ribozimele, molecule de ARN cu funcție catalitică, implicată în autoexcizia unor fragmente ribonucleice).

Abzimele (antibody enzyme) sau anticorpii catalitici sunt biocatalizatori artificiali sintetizați de organismul animal ca răspuns la un antigen sintetic, creat după asemănarea unei stări de tranziție. Ei vor cataliza o reacție care va decurge printr-o stare de tranziție al cărei analog a fost sintetizat. Tot construcții artificiale, cu funcție biocatalitică, derivând de la natura proteică, sunt reprezentate de sinzime (synthetic enzyme). Acestea pot îndeplini funcții catalitice similare enzimelor, atașând saturativ substratul și stabilizând stările de tranziție.

Enzimele au nevoie uneori de asistența unor substanțe neproteice, cofactorii, care sunt modificați odată cu reacția chimică pe care o suferă substratul. De aceea, cofactorii necesită sisteme de regenerare. Enzimele care funcționează cu cofactori sunt mai dificil de folosit în stare purificată, tocmai datorită necesității regenerării cofactorilor. De regulă, aceste enzime se utilizează incluse în celule.

Biocatalizatorii se pot sistematiza după mai multe criterii. Biocatalizatori naturali După constituenții însoțitori: - Enzime pure - Complexe enzimatice - Organite celulare - Celule întregi (non viabile sau viabile, în creștere sau în repaus) După gradul de purificare: - Enzime purificate - Preparate brute După origine:

- Microbiene - Vegetale - Animale După solubilitate: - Libere - Imobilizate Biocatalizatori artificiali Procesați chimic: - Situs modificat chimic - Imobilizare covalentă, ionică Procesați biochimic: - Mutageneză dirijată - Evoluție direcționată - Abzime - Sinzime Din punct de vedere practic, biocatalizatorii sunt utilizați în sintezele

organice fine, în procesele fermentative sau în bioconversii, datorită avantajelor care în ultimă instanță se traduc în costuri mai reduse și într-o dezvoltare economică durabilă.

Abilitățile greu de egalat ale biocatalizatorilor în raport cu chemocatalizatorii constau în activitatea, selectivitatea și condițiile de lucru compatibile cu viața.

Activitatea biocatalizatorilor (numărul de molecule de substrat transformate în unitatea de timp de o moleculă de biocatalizator) este de multe ori superioară. Este suficient să urmărim descompunerea apei oxigenate fără catalizator (reacție imperceptibilă), în prezența unor chemocatalizatori consacrați precum dioxidul de mangan, permanganatul de potasiu sau argintul (reacție perceptibilă dar lentă), în comparație cu descompunerea intensă a apei oxigenate atunci când aceasta vine în contact cu sânge proaspăt la dezinfecția unei răni. Descompunerea abundentă a apei oxigenate se datorează catalazei, prezente în sânge.

Selectivitatea este net superioară chemocatalizatorilor. În plus, biocatalizatorii pot rezolva situații de reacții sensibile, care din cauza condițiilor necesare nu s-ar putea petrece, sau ar fi extrem de dificil de condus.

De exemplu, obținerea hidroximetilencetonelor din acetații corespunzători este extrem de dificilă din cauza tautomerizărilor, a formării de hemiacetali sau de dimeri ciclici ori alte procese de izomerizare sau disproporționare ce pot avea

loc în mediul bazic necesar. Prin utilizarea lipazelor sensibilitatea hidroxialcoolului este menajată.

Biocatalizatorii au fost utilizați în procese fermentative domestice din

vremuri imemorabile, fără a se conștientiza individualitatea și valoarea lor catalitică. Mărturie stau procedurile pentru fezandarea cărnii, pentru obținerea produselor de panificație, a produselor lactate fermentate,a băuturilor alcoolice precum berea și vinul etc.

Biocatalizatorii au început să fie folosiți în industrie relativ târziu, prima mențiune făcând referire la deschiderea în 1874 la Copenhaga, Danemarca, de către Christian Hansen, a unei fabrici specializate în fabricarea renetului standardizat. Renetul este un amestec de enzime ce provine din stomacul vițeilor sugari și este folosit pentru producerea brânzeturilor.

Ulterior, producția de amilaze și proteaze, apoi de lipaze și celulaze s-a dezvoltat în legătură cu industria detergenților, folosind progresele obținute în industria fermentativă destinate obținerii antibioticelor, solvenților, vitaminelor, băuturilor alcoolice, a produselor lactate fermentate etc.

Pătrunderea biocatalizatorilor în general și a enzimelor în particular în sinteza organică a fost întârziată atât de prejudecăți privind enzimele cât și de unele dezavantaje reale, ambele însă fiind la ora actuală surmontabile prin tehnicile de inginerie genetică ce pot adapta structura enzimelor la proprietățile catalitice necesare unei aplicații particulare, prin tehnicile de inginerie a mediului de reacție și prin posibilitățile de modulare a structurii substratului prin atașare de grupări auxiliare care să faciliteze acțiunea enzimelor (biocatalizatorilor). Toate aceste intervenții au ca rezultat o ajustare fină (fine tuning) a procesului de biotransformare, astfel încât eficiența acestuia să tindă spre maximul teoretic.

Dintre prejudecățile care afectează enzimele, creând rezerve în adoptarea soluțiilor biocatalitice, putem aminti:

1. Sensibilitatea enzimelor. Această caracteristică se referă la plaja valorilor parametrilor de mediu în care enzima este stabilă. Se au în vedere temperatura, presiunea, forțele de forfecare, tăria ionică etc. În cazul enzimelor, poate cu excepția presiunii, ceilalți parametri au o plajă extrem de îngustă a valorilor suportabile de către enzimă, sau biocatalizator. Dacă însă ținem seama

de activitatea maximă a biocatalizatorilor care se atinge în interiorul acestor plaje și în plus că aceste intervale de valori sunt perfect compatibile cu toate funcțiile vitale, această prejudecată se transformă într-un argument favorabil enzimelor. Totuși, în context poate fi relevat un dezavantaj minor, legat de necesitatea utilizării unei instrumentații de monitorizare și control performante, cu sensibilitate acordată domeniului îngust de valori. În plus, sensibilitatea biocatalizatorilor poate fi redusă prin imobilizarea acestora.

2. Prețul prohibitiv. Biocatalizatorii au o valoare care reflectă prețul obținerii din surse nu întotdeauna comune. Gradul de purificare reprezintă o variabilă corelată direct cu prețul biocatalizatorului. Nu întotdeauna este însă necesar un grad mare de purificare, putând fi realizat un compromis între timpul de reacție, numărul de treceri ale soluției de substrat care pot crește, cu influențe directe asupra costurilor de producție și cu gradul de purificare care poate avea valori mai reduse, ceea ce duce la scăderea costurilor generale. Decizia, evident, ține de datele concrete ale problemei.

3. Enzimele prezintă activitate și selectivitate maxime față de substraturile naturale. Este firesc, atâta timp cât enzimele actuale reprezintă expresia evoluției structurii, implicit a funcției exercitată față de substraturile naturale. Capacitatea de transformare a substraturilor nenaturale este un avantaj, atâta timp cât este exercitată mai eficient și mai selectiv în comparație cu alți chemocatalizatori. În plus, prin tehnici de inginerie proteică, a mediului și a substratului, atât activitatea cât și selectivitatea biocatalizatorilor față de substraturile naturale poate crește.

4. Enzimele pot funcționa numai în mediul lor natural, care este apos. Investigațiile recente au demonstrat posibilitatea ca enzimele să funcționeze și în medii de solvenți organici polari sau nepolari (apolari), astfel încât să poată fi realizat un control fin al echilibrului unor reacții reversibile și în condițiile utilizării unor substraturi sau formării unor produși puțin solubili în apă.

Dintre dezavantajele clare ale unor enzime amintim: 1. Sunt enzime care necesită cofactori. Ori, regenerarea cofactorilor în

afara celulei, în sisteme de sinteză de scară pilot sau industrială poate deveni prohibitivă pentru întreg sistemul de biotransformare, atât din punct de vedere tehnic, cât și economic.

2. Enzimele sunt susceptibile la fenomene de inhibiție. Inhibiția enzimatică este un fenomen cunoscut. Dacă în organismul viu inhibiția are rol de reglare atât pentru reacția catalizată de enzima supusă inhibiției, cât și pentru rețeaua de reacții metabolice în care este inclusă respectiva enzimă, în

biotransformarea enzimatică, făcută în scop sintetic, inhibiția este o frână de care trebuie să se țină seama, pentru că are implicații nefavorabile în economia procesului.

3. Unele enzime, dată fiind natura lor proteică, pot fi surse de alergii. Efectele acestora pot fi controlate prin selecția personalului și prin utilizarea echipamentului de protecție corespunzător.

Metode și tehnici utilizate în enzimologie Fiind proteine, enzimele prezintă toate proprietățile fizico-chimice și

structurale ale acestora. Fiind biocatalizatori, respectă toate legile catalizei chimice, iar faptul că acționează în organismele vii determină o serie de caracteristici specifice.

Un studiu complet și corect al enzimelor presupune, în primul rând, izolarea lor din surse biologice și purificarea până la un grad de puritate cât mai înalt. Metodele utilizate la izolarea și purificarea enzimelor sunt comune cu cele utilizate în studiul proteinelor în general. În cazul enzimelor trebuie evitată nu numai denaturarea ci și inactivarea lor. Este cunoscut faptul că stabilitatea maximă a enzimelor se întâlnește in vivo, adică în mediul lor natural. Cu cât gradul lor de puritate crește, cu atât stabilitatea enzimelor scade, fapt ce impune unele precauțiuni suplimentare pe parcursul procedurilor de separare și purificare. Principalii factori ce inactivează enzimele în timpul acestor proceduri sunt temperatura și pH-ul mediului. În afara temperaturilor ridicate și a valorilor extreme de pH, enzimele sunt puternic afectate și de modificările bruște ale acestor factori. De aceea toate operațiunile se execută la rece (0 + 4ºC) iar separarea fazei insolubile se face utilizând centrifuga cu răcire.

Modificarea pH-ului într-un interval mic al valorilor acestui parametru determină o modificare mai mult sau mai puțin accentuată a activității enzimelor, iar valorile extreme ( de regulă în afara intervalului de pH 5 – 9) produc chiar denaturarea acestora. De aceea, ajustarea pH-ului se face la pH-metru și nu cu ajutorul hârtiei indicatoare. Acest lucru se face sub agitare continuă, utilizând soluții acide sau alcaline diluate care se adaugă cu picătura pentru a evita o modificare prea puternică a pH-ului în zona de contact din jurul picăturii.

Surse de enzime Din punct de vedere al localizării lor, enzimele se clasifică în două grupe

principale:

a) enzime solubilizate în diferite lichide biologice (sânge, urină, lichid cerebrospinal, lichid interstițial, salivă, citoplasmă, mediu de cultură pentru microorganisme)

b) enzime fixate pe diferite structuri tisulare și subcelulare. În acest din urmă caz, multe enzime sunt puternic legate de diferite componente ale membranelor biologice, făcând parte din structura lor. Alegerea sursei optime pentru izolarea și purificarea unei enzime date se face în funcție de mai multe criterii. În primul rând se alege materialul biologic cel mai bogat în enzima respectivă. Cum într-un țesut localizarea unor enzime este diferită, iar în fiecare celulă enzimele sunt localizate preponderent sau exclusiv în anumite organite celulare, prima operațiune a tehnicilor de izolare o constituie omogenizarea țesutului și separarea formațiunilor subcelulare respective prin centrifugare diferențiată.

În cazul enzimelor solubilizate în lichide biologice, extracția enzimelor se face direct din acestea. Pentru enzimele fixate pe structuri celulare, se efectuează mai întâi omogenizarea țesutului, izolarea structurilor subcelulare și solubilizarea enzimelor.

a) Omogenizarea țesuturilor se face fie prin mojarare pe nisip de cuarț sau sticlă pisată, fie cu ajutorul omogenizatoarelor speciale. Pentru aceasta, se sacrifică animalul fără a-l stresa. Se recoltează imediat organul sau țesutul interesat și se introduce într-o capsulă rece, aflată pe gheață. Dacă omogenizarea și operațiunile ulterioare nu se execută imediat, se recomandă congelarea țesutului pentru a împiedica inactivarea enzimelor.

Se mărunțește apoi țesutul cu un bisturiu sau un foarfece rece. Fragmentele astfel obținute se mojarează pe nisip de cuarț, sticlă pisată. Se recomandă ca această operațiune să se execute la rece și în camere frigorifice speciale.

Atât omogenizarea cât și mojararea se face în prezența unui lichid de extracție – soluție salină izotonică, soluție izotonică de zaharoză, diferite soluții tampon, apa bidistilată. O altă modalitate de obținere a extractelor acelulare o constituie congelarea – decongelarea repetată, metodă des folosită în special pentru levuri. Dezintegrarea peretelui celular se mai poate efectua prin tratare cu ultrasunete, tratament enzimatic (lizozim, proteaze, lipază), tratament chimic (deoxicolat de sodiu, uree, guanidină) și alte metode.

b) Izolarea structurilor subcelulare. După omogenizarea țesutului, omogenazele obținute sunt supuse centrifugării diferențiate în vederea separării structurilor subcelulare. Centrifugarea se face la rece, după ce instalația

frigorifică a centrifugei cu răcire a fost cuplată în prealabil pentru răcirea rotorului și eprubetelor. În funcție de scopul urmărit, se folosesc diferite viteze de rotație și intervale de timp diferite.

c) Solubilizarea enzimelor. Enzimele fixate pe structurile subcelulare nu

pot fi extrase decât după îndepărtarea lor din aceste structuri. În acest scop, fracțiunea subcelulară ce ne interesează este supusă dezintegrării prin diferite metode. Poate fi utilizat tratamentul sonic, tratamentul enzimatic, chimic etc. Printr-o modalitate sau alta, membrana biologică respectivă este dezintegrată, iar enzimele se solubilizează în mediul de extracție. Îndepărtând prin centrifugare la rece resturile membranare se obțin, în final, supernatante ce conțin enzimele în formă solubilă.