PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS

Baltymų išskyrimas iš ląstelių kultūrų ir audinių

Ląstelių Subfrakcionavimas

Ląstelių kultivavimas

Ląstelių išskyrimas iš audinių

Baltymų išskyrimas iš audinių ir ląstelių kultūrų

Baltymų išskyrimui naudojami detergentai

Eukariotų ląstelės sandara

• Plazminė membrana ląstelės morfologija, judėjimas, kontaktai su aplinka ir ląstelėmis, medžiagų judėjimas per membraną ir kt.

• Branduolys: chromatinas, ląstelės programos ir valdymo centrasBranduolėliai, nukleoplazma

• Citoplazma koloidinis įvairių molekulių tirpalas

• Organelės:• Mitochondrijos energijos transformacija; karbamido, hemo, steroidinių

hormonų sintezė• Endoplazminis tinklas lipidų ir baltymų sintezė, detoksikacijos reakcijos,

(vidinė branduolio membrana) organoidų fiksacija• Goldžio kompleksas endoplazminiame tinkle pagamintų medžiagų

rūšiavimas ir modifikavimas, paskirstymas ląstelėje• Lizosomos baltymų proteolizė• Peroksisomos medžiagų oksidacija dalyvaujant peroksidui• Pernašos pūslelės (vezikulos) medžiagų pernešimas tarp membraninių ląstelės

struktūrų• Citoskeleto tinklas: ląstelės formos ir judėjimo palaikymas,

Aktino, trapinės gijos organoidų transportasmikrovamzdeliai

• Ribosomos baltymų sintezė

Baltymų kiekis organoiduose

Iš 1 mlj (106) ląstelių – 100 -200 µg baltymų:

tirpūs citoplazmos baltymai - 50%branduolio baltymai - 15%membranų baltymai - 30%

Pavyzdžio pasirinkimas

Visas organizmo lizatas ~100,000Audinio lizatas ~50,000

Ląstelių lizatas (pvz. eritrocitai) ~20,000

Subląstelinis frakcionavimasmitochondrija ~1000branduolys

Išgrynintas baltymų kompleksas 2-50

Baltymų skaičius

Ląstelių tipai

Ląstelių morfoligijų skirtumai.a) BHK-21 ląstelės (baby hamster kidney fibroblasts);

b) FHI (Fetal human intestine) į fibroblastus panašios ląstelės;

c) astrocitai;

d) plato fazė BHK-21 ląstelių;

e) jaučio aortos endotelio ląstelės;

f) 3T3 ląstelės, pelės fibroblastai.

Ląstelių ardymo būdai

Osmotinė lizėLizė šaldymu-šildymuDetergentinė lizėFermentinė lizėArdymas ultragarsu (sonikavimas)Ardymas French presuTrynimasMechaninis homogenizavimasHomogenizavimas rutuliukais

Homogenizacijos trūkumai

– galimas baltymų degradavimas dėl peršilimo,– homogenizavimas nepakankamas,– branduoliai užteršti nesuirusiomis ląstelėmis,– branduoliai užteršti endoplazminio tinklo likučiais

ir organoidais,– nėra bendrų homogenizavimo sąlygų,– citozolis užterštas suirusių branduolių

nukleoplazma.

Detergentai, jų savybės

• Detergentai – amfipatinės (amphipathic) molekulės, turinčios nepoliarinę dalį, kuri turi alifatinių ar aromatinių savybių ir poliarinę dalį;

• Detergentai skirstomi į:– Joninius (turintys krūvį – anijoniniai arba katijoniniai),– Nejoninius (be krūvio),– Zviterjoniniai (turintys tiek teigiamai, tiek neigiamai įkrautas grupes; bendra

krūvio suma - nulinė).

Detergentų Struktūra

Schematinė detergento struktūra (kairėje);

CHAPS struktūra (dešinėje).

Hidrofobinė “uodega”

Hidrofilinė “galvutė”

Detergentų Micelės

Esant didelėms detergentų koncentracijoms, detergentų monomerai agreguoja ir sudaro struktūras – miceles. Micelės yra termodinamiškai stabilus koloidinis detergentų monomerų agregatas.

Ideali detergento micelės struktūra

Kai kurių detergentų savybės• Natrio dodecilsulfatas (SDS)

Anijoninis detergentas. • Triton X-100

Nejoninis detergentas. • Triton X-114

Nejoninis detergentas. • NP-40

Nejoninis detergentas. • CHAPS

Nedenatūruojantis zviterjoninis detergentas. • SB3-10, ASB 14 arba ASB 16

Zviterjoniniai detergentai.

Redukuojantys agentai

• Ditiotreitolis (DTT) ir ditioeritrolis (DTE)

• TBP (Fosfinai)

• TCE (Tris[2-karboksietil]fosfinas)

Detergentų Parinkimas

Disulfidinių tiltelių suardymas• 2-merkaptoetanolis (700 mM, jonizuoja)• Ditiotreitolis (50 mM)• Fosfinai (2 mM, stiprus reduktorius)

Nekovalentinių jungčių suardymasJoniniai detergentai, pvz. SDS,Chaotropiniai ir nejoniniai detergentai, pvz. Urea/Thiourea,

CHAPS

Baltymų išskyrimas

• Viduląstelinių baltymų išskyrimui reikalinga:– ląstelių išskyrimas (pvz., iš audinių);- ląstelių lizavimas;- ląstelių nuosėdų pašalinimas;- DNR, RNR, lipidų pašalinimas.

• Išorinių ląstelių baltymų išskyrimui reikalinga:– Ląstelių išskyrimas.

Baltymų išskyrimo metodai

• Bendras ląstelių lizatas• Citoplazmos ir branduolio baltymai• Tirpūs ir netirpūs ląstelių baltymai• Plazminės membranos baltymai• Mitochondrijų baltymai• Citoskeleto baltymai• Ir kt.