Testovn toxicity prmyslovch chemikli III

(dlouhodob studie subakutn, subchronick a chronick toxicity)Prmyslov toxikologie (C867)

Vznamposkytuj informace o monch incch testovan ltky na organismus po opakovanm dlouhodobm podn.

Subakutn, subchronick a chronick studie

Typy studi OECD metody407 Orln toxicita (28-denn opakovan aplikace)412 Inhalan toxicita (14, 28-denn opakovan aplikace)410 Dermln toxicita (28-denn opakovan aplikace)408 Studie subchronick toxicity orln (90-denn opakovan expozice)411 Studie subchronick toxicity dermln (90-denn opakovan expozice)413 Studie subchronick toxicity inhalan (90-denn opakovan expozice)451 Zkouka karcinogenity452 Zkouka chronick toxicity453 Kombinovan zkouka chronick toxicity a karcinogenity

Obecn podmnky

Pokusn zvata:doporuen druh podle metodiky: potkan, my (kmen, vk, hmotnost)samci i samice; aklimatizace minim. 5 dnpoet: dle metodiky

Podmnky chovu:teplota 22 3 C; relativn vlhkost 30 - 70%osvtlen: 12 hodin svtlo/ 12 hodin tmakrmen a voda ad libitum

Vbr vehikula:dle rozpustnosti ltky voda, olivov olej, metylcelulzastanoven stability a homogenity aplikovan formy

Obecn podmnky

Dvkov hladiny:minimln 3 koncentrace testovan ltky, kontroln skupina (pouze vehikulum)dvky vychzej z vsledk akutnch studi, literatury, pop. z pilotnho experimentu s omezenm potem zvatlimitn test 1000 mg.kg-1satelitn skupiny zjitn reverzibility zmn

Aplikace:orln aluden sondoudermln fixace na cca 10% plochy tlainhalan

Klinick a laboratorn vyeten

Klinick vyeten:kontrola zdravotnho stavu laboratornch zvat a sledovn funknch poruch stav a reakce ke, srsti a sliznicdchn, sekrety, exkrety, pohyb, reakce na podnty

Laboratorn vyten:vyeten moi barva, zkal, zpach, objem, pH, specifick hmotnost, glukza, blkoviny, bilirubin, urobilinogen, krev, leukocyty, ketoltky, dusitanyHematologie - poet leukocyt a jejich diferenciln rozpoet, poet erytrocyt, stedn objem erytrocytu, hemoglobin, hematokrit, poet trombocyt + minimln dva parametry hemokoagulace nap. PT, APTT, fibrinogen..) Biochemie - moovina, glukza, jatern enzymy nap. AST, ALT, ALP, bilirubin, chelesterol, blkoviny, albumin, kreatinin, vpnk, prvky P, Ca, ionty K, Cl, Na, aj.

Patologick vyeten

Patologick vyeten:odhaluje makroskopick zmny na orgnech zvat

Biometrick vyeten:men velikosti orgn(hmotnost orgnu/hmotnost tla) x 100

Histologik vyeten:zjiuje mikroskopick zmny (zmny na bunn rovni) na orgnech a tknch s pouitm mikroskopu.

Testovn toxicity prmyslovch chemikli IV

(reprodukn a vvojov toxicita)Prmyslov toxikologie (C867)

Dvody testovn reprodukn a vvojov toxicity

Thalidomid:v 50. letech 20. st. byl ve 48 sttech pouvn jako lk na nevolnost pro thotn eny. Narodilo se 12 000 postiench dt bez nohou, rukou, u, apod. Zpsoboval pedevm tzv. fokomelii, pi kter se nevyvine stedn st pae, a tak prsty vyrstaj v podstat pmo z ramene

vvojov toxicita

Dvody testovn reprodukn a vvojov toxicity

Agent Orange:sms herbicid, pouita americkou armdou 1962 1972 v jinm Vietnamu s clem zniit rostlinstvo v rozshlch oblastech tak, aby mohly bt snze bombardovny zkladny a zsobovac trasy neptelskch jednotek; vedlejm produktem pi vrob jedn ze sloek Agent Orange byl vysoce jedovat dioxin zpsobuje vznik rakoviny + vrozen vvojov vady (tj. toxick inek pesticid na reprodukci).vvojov toxicita

Reprodukn a vvojov toxicita

Studie reprodukn a vvojov toxicity poskytuj informace o monch toxickch incch testovan ltky na reprodukn schopnosti samce i samice i na vvoj potomstva, tj. na:funkci pohlavnch lz samce i samice prbh estrlnho cyklu samice chovn pi pen, bezosti, porodu a laktaci mortalitu, rst a vvoj potomstva.

Speciln reprodukn studie odhaluj schopnost chemickch ltek vykazovat biologickou aktivitu shodnou nebo protikladnou spirozenmi hormony endokrinn disruptory (xenoestrogeny a xenoandrogeny).

Fyziologie rozmnoovn potkan

pohlavn dosplost samic: 5 8 tdn pohlavn dosplost samc: 6 8 tdn zaazen do chovu: 9 12 tdn (dle metodiky: kmen Wistar od 12 tdn) estrln cyklus samic: 4 5 denn vlastn estrus (je): 7 20 hodin ovulace: za 2 3 hodiny po zatku estru gravidita: 21 23 dn poet mlat ve vrhu: 9 13 (nkdy i 20) poet vrh za rok: 7 - 9 odstav mlat: ve vku 21 dn

Typy studi

Neexistuje studie nevyadujc pouit zvat

Reprodukn/vvojov toxicita screening test OECD 421vtinou 1. krok v testovn reprodukn toxicity - studie s menm potem zvat, krat dobou expozicenegativn vsledek nutno pokraovat v dalch studich

Studie prenatln vvojov toxicity (teratogenita) - OECD 414Jednogeneran studie reprodukn toxicity - OECD 415Dvougeneran studie reprodukn toxicity - OECD 416

Typy studi

Kombinace studi dlouhodob a reprodukn toxicity28-denn studie + Reprodukn Screening - OECD 42290-denn studie + Jednogeneran studie - OECD 408 + 415

Studie odhalujc endokrinn disruptory Uterotrofick screeningov test - OECD 440 Hershberger screeningov test - OECD 441

Obecn podmnky reproduknch studiPln studiePokusn zvatadoporuen druh dle metodiky: potkan (kmen, vk, hmotnost)pohlavn dospl samice, nullipary, pohlavn dospl samciaklimatizace minim. 5 dn; poet dle metodiky

Podmnky chovuteplota: 22 3C; relativn vlhkost: 30 70%;osvtlen: 12 hodin svtlo/12 hodin tmakrmen a voda: ad libitum

Vbr vehikulapednostn voda (olivov olej, metylcelulza...)stanoven stability a homogenity ltky ve vehikulu

Obecn podmnky reproduknch studiDvkov hladinyminimln 3 rovn dvek a kontrola (vehikulum) vychzej z vsledk akutnch a dlouhodobch studi toxicity, literatury a ppadn vsledk pilotnho testu s omezenm potem zvatlimitn test 1000 mg.kg-1Aplikaceorln (sondou do aludku), denn, ve stejnou dobuobjem 1 ml/100g iv hmotnosti (vodn roztoky a 2 ml/100 g iv hmotnosti)

Vyetenkontrola zdravotnho stavu: denn (ped aplikac)klinick vyeten: minimln 1x denn (po aplikaci)tlesn hmotnost a spoteba krmiva (intervaly dle metodiky) patologick vyeten

Prbh reproduknch studiGeneraceparentln generace tj. rodiovsk generace (P)fililn generace tj. potomstvo (F1, F2...)Aplikace testovan ltky reprodukn toxicitapo uritou dobu ped penm (screening 2 tdny, jednogeneran 10 tdn), po dobu pen, po dobu bezosti a uritou dobu laktace (screening do 4. dne, jednogeneran do 21. dne)Aplikace testovan ltky teratogenitainek prenatln expozice na bez samici a na vyvjejc se organismus v dloze aplikace ltky pouze po uritou dobu bezosti od 5. (tj. od implantace vajka v dloze) do 19. dne bezostiUren nultho dne bezosti dle zjitn spermi ve vaginlnm vplachu - nsledujc den po zahjen pen a pot denn a do zjitn spermi

Vyeten mlat po narozenKlinick vyeten mlatpoet a pohlav mlat iv narozenchpedasn narozen a vrazn men mlataviditeln anomlie abnormln chovn mlat Vzhled a vvoj mlat po narozenNovorozen mlata potkana kmene Wistar jsou hol, masov rov, maj slepen on vka, zarostl zvukovody, nemaj proezan zuby a v asi 5 7g. Na ichov a dotykov podnty reaguj hlasov (jemn pskn), kroutivmi pohyby trupu a pdlovnm konetin. Pokud jsou dobe nakrmen, na bie vkrajin aludku prosvt pes tenkou bin stnu aludek naplnn mlkem

Vyeten mlat po narozenPoporodn vvoj mldte dleit etapy

2. 3. den: odklopen unch boltc, rstsrsti4. den: otevrn zevnch zvukovod, 9 12 g8. 10. den: proezvn hornch ezk, srst na hbet10. 17. den: otevrn o12. 14. den: pijmn pevn potravy, 25 35 g18. den: prvn stoliky21. den: druh stoliky, 35 50 g

Vyeten spermiSuspenze spermi jedno nadvarle + 0,9% roztok NaCl

Motilita spermi Suspenze spermi se kpne na vyht podlon sklko (cca 35 C), vyeten se provd pod mikroskopem s pedehtm posuvnm stolkem. Porovnv se rychlost pohybu spermi u kontrolnch a aplikovanch zvat.

Morfologie spermiNa podlon sklko se zhotov ntr suspenze spermi a na vzduchu se nech zaschnout, po obarven se vyet pod mikroskopem stanovuje se procentuln zastoupen abnormlnch spermi

Patologick vyeten reprodukn toxicitamakroskopick revize orgn dutiny hrudn a binhmotnost varlat, nadvarlat, prostaty, dlohy, vajenk, hypofzypoet implantac na dlozepoet lutch tlsek na vajencchodbr pohlavnch orgn khistologickmu vyeten: varlata, nadvarlata, semenn vky, koagulan lza, prostata, dloha, vajenky, vejcovody (fixace: 4% formaldehyd, modifikovan Davidsonova tekutina)histologick vyeten pohlavn orgny a hypofza + detailn vyeten spermiogeneze ve varlatech (pedevm u screeningu krat doba aplikace ped penm)

Patologick vyeten teratogenitaVyeten ploduzjitn pohlav a hmotnosti jednotlivch plod vyeten zevnch odchylek plod a zmn kostry a mkkch tkn dkladn pitva u poloviny plod z kadho vrhufixace (96% etanol) druh poloviny plod z kadho vrhu pro dal zpracovn a barven kmikroskopickmu vyeten skeletu

Vyhodnocen vsledkPrimrn daje se zaznamenvaj do tabulek a numerick vsledky se zpracuj vhodnou statistickou metodou.

Ukazatele toxicity samc a samicpoet zvat na zatku studie, poet bezch zvat, poet potrat a pedasnch vrh, mortalita, doba nstupu abnormlnch klinickch pznak, hmotnost zvat a spoteba krmiva, hmotnosti pohlavnch orgn, nlezy zpitvy, histologick vyeten, NOAEL pro samce a samice, vpoet index reprodukceUkazatele vvojov toxicity podle dvky poet lutch tlsek, poet implantac, poet ivch mlat i plod, poet resorpc, pomr pohlav, tlesn hmotnosti mlat i plod, vvoj mlat po narozen, zevn zmny mkkch tkn a kostry, preimplantan ztrty: implantace/lut tlska, postimplantan ztrty: resorbovan plody/implantace a postnatln ztrty (ztrty mlat po narozen) , NOAEL pro vvoj.

Endokrinn disruptoryexogenn ltky nebo smsi ltek, kter mohou alterovat funkci endokrinnho systmu a nsledn pokozovat zdrav jedince, jeho potomstva i dalch generac, chemick ltky s (anti)estrogennm, (anti)androgennm i (anti)thyroidnm inkem - iroce pouvan chemiklie expozice lovka a celho ivotnho prosted tmto ltkm vysok pokles potu spermi, nrst rakoviny mln lzy a pochvy u lovkaPkladyftalty (zmkovadla v PVC)endosulfan (insekticid)bisphenol A (fungicid, plastov obaly potravin, dtsk umlohmotn lahve) atrazin (iroce pouvan herbicid v zemdlstv)dioxiny (vznik pi spalovn odpadu s chlrem)

Endokrinn disruptoryUterotrofick screeningov test

pouit pro testovn estrogenovho agonismu xenoestrogen, (mn bn je pouit pro testovn estrogenovho antagonismu)Princip: aplikace testovan ltky pohlavn nedosplm nebo kastrovanm samicm statisticky signifikantn zven hmotnosti dlohy zvisl na dvce ve srovnn skontroln skupinou = dkaz estrogennho agonismu(rst dlon tkn je pod vlivem estrogen, pokud nen kdispozici endogenn zdroj estrogen, krstu dlon tkn me dochzet vlivemestrogen exogennch)

Endokrinn disruptoryHershberger screeningov test

pouit pro testovn androgenovho agonismu xenoandrogen i androgennho antagonismuPrincip: aplikace testovan ltky kastrovanm samcm statisticky signifikantn zven hmotnosti pdatnch pohlavnch orgn zvisl na dvce ve srovnn skontroln skupinou = dkaz androgennho agonismu (nap.: prostata, semenn vky)(rst nkterch tkn u samc je pod vlivem androgen, pokud nen kdispozici endogenn zdroj androgen, krstu tchto tkn me dochzet vlivem androgen exogennch)