ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

5. DESCRIERE PROCEDURA – ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

5.1 Principiul metodei

Metoda fotometrica:

Electroforeza este o metodă de analiză şi separare bazată, în principal pe criterii de sarcină electrică şi masă moleculară. Migrarea diferenţială a particulelor încărcate electric se face sub acţiunea unui câmp electric continuu.Electroforeza proteinelor pe gel de agaroză este tehnica cea mai uşoară şi mai puţin costisitoare, implicând o cantitate limitată de materiale, un timp de lucru scurt şi o reproductibilitate foarte bună. Separarea electroforetică a proteinelor serice prezintă un interes major în testele clinice, datorită importantelor informaţii pe care le oferă acestea în diverse afecţiuni, precum şi asupra modalităţilor de tratare a acestora.

Metoda curentă pentru separarea proteinelor serice utilizată în laboratoarele de biochimie medicală este electroforeza. Se utilizează suporturi solide şi pH alcalin, la care toate componentele proteice sunt încărcate negativ şi migrează spre polul pozitiv. Pe electroforegramă, după colorare, proteinele apar sub formă de benzi cărora li se măsoară densitatea optică, fiecare bandă având un maxim de absorbţie. Prin electroforeză, în condiţiile amintite mai sus, se obţin cinci fracţiuni: albumina serică, a1, a2, b, g - globuline.

Electroforeza reprezinta miscarea unei particule incarcate electric aflate sub imfluenta unui camp electric.Aceasta miscare este data de forta Lorentz,care poate fi descrisa ,ca proprietate electrica fundamentala a unui corp studiat si a conditiilor electrice ambientale,de catre ecuatia: unde F este forta Lorentz,q este sarcina electrica cu care este incarcat corpul , E este campul electric.Miscarea electroforezica rezultata este contracarata de fortele de frecare,prin urmare rata miscarilor este constanta intr-un camp electric omogen constant:unde v este velocitatea si f este coeficientul de frecare:Mobilitatea electroforetica este definita ca fiind:Mobilitatea depinde atat de proprietatile particulei ,cat si de proprietatile solutiei.Pentru concentratii ridicate de ioni,o expresie aproximativa pentru mobilitatea electroforetica este data de ecuatia lui Smoluchowski:unde ε este constanat dielectica a lichidului, ε0 este permitivitatea spatiului liber, η este vascozitatea lichidului si ζ este potentialui zeta al particulei.

5.2 Reactivi: solutii gata preparate:

1 . Placuta cu gel agaroza in tampon Tris-Barbital cu conservant si stabilizatorPlacutele sunt gata pentru utilizare.Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

2 . Bureti imbibati cu tampon; contin bureti imbibati in Tris-Barbital cu conservant si stabilizator.

Buretii sunt gata pentru utilizare.Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

3 . Colorant Acid Blue,concentrat; contine Acid Blue in solutie de acid acetic.Pentru utilizare se dilueaza 1 mL concentrat la 1L apa distilata. Se agita 10

min. Pana se dizolva complet. Solutia este pentru 10 placute. Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

4 . Solutie spalare pentru aplicator; surfactant,solutie apoasa cu conservant.Solutia este gata de utilizare.Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

5 . Placa probe de unica folosinta; este din plastic;prezinta alveole pentru pipetatrea produsului de analizat.

Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

6 . Hirtie de filtru pentru absorbtia exesului de tampon de pe placute.Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

Kitul se pastreaza la 2 -8 0C pana la data expirariiCei doi rectivi se sunt integrati intr-o caseta care este stabila la bordul aparatului la o temperatura de 10 – 15 0C timp de 8 saptamani.

Manipularea reactivilor se face cu atentie si numai de catre responsabilii de analiza.Containerele goale se vor arunca in recipiente speciale.

5.3 Analiza

Pentru determinarea factorului reumatoid se utilizeaza analizorul automat Cobas Integra 400 Plus furnizat de Roche Systems corespunzator ILA-02

Produsul biologic de analizat: ser Serul de analizat se obtine in urma centrifugarii eprubetei cu produsul biologic conform PO –01Se face selectare de teste si programe conform ILA - 02

Se pipeteaza,aproximativ 500 L ser , cu o pipeta automata,in cupele (micro sau standard) situate pe discul de probe, sau se pune vacutainerul centrifugat. Se actioneaza butonul START din ecranul Start pentru a incepe analiza.Dupa terminarea analizei rezultatele sunt afisate si tiparite.

5.4 Calcule si interpretarea rezultatelor

IFA, IFB = constante ale instrumentului ;

Valorile normale : 0 – 5 mg/L

5.5 Echipamente

Analizor automat de biochimie HITACHI 912 ,cu numar de inventar 2251063/157616, aflat in dotarea laboratorului din 2005 si care este descris in ILA 01Sau Cobas Integra 400 Plus,cu numar de inventar TR2478,aflat in dotarea laboratorului din 2007 si descris in ILA-02.

5.6 Esantionare

Probele biologice sunt recoltate de catre asistentii din clinici,la patul bolnavului sau de catre asistentii din ambulatoarele de specialitate sau triaj. Recoltarea se face in monovette,sistem inchis cu vacuum .In cadrul laboratorului exista o camera pentru primirea probelor unde acestea sunt receptionate.Probele necorespunzatoare se ignora.Dupa receptionare ,identificare unica si centrifugare probele sunt transportate in laborator pentru inregistrarea electronica si prelucrare.Laboratorul de biochimie nu pastreaza contraprobe.

5.7 Raportarea rezultatelor

Raportarea rezultatelor se face pe buletinul de analiza intocmit de executant conform PG – 18, validat de responsabilul de analiza si aprobat de seful de laborator.

5.8 Controlul calitatii

In Laboratorul de Biochimie se foloseste un control de calitate interlaboratoare si un control extern prin care rezultatele obtinute in laboratorul nostru sunt comparate cu rezultatele altor laboratoare,inscrise in acest program, care folosesc aceleasi aparate si aceleasi metode de lucru.

In zilele in care se lucreaza electroforeze se executa controlul de calitate apoi se pun in lucru probele.

5.9 Estimarea incertitudinii de masurare

Raportarea incertitudinii de masurare a fost realizata dupa urmatorul model de calcul:

Rezultatele au fost prelucrate astfel: reproductibilitatea - au fost prelucrate rezultatele obtinute in luna mai 2008 pe

urmatoarele seruri de control PRECINORM U LOT 178985 EXP 02.2010 PRECIPATH U LOT177995 EXP 08.2009 PRECINORM L LOT 178148 EXP 06.2010 PRECIPATH HDL/LDH LOT 178149 EXP 06.2009 PRECINORM CK-MB LOT 177901 EXP 12.2008 PRECIPATH CK-MB LOT 179735 EXP 05.2009 PRECINORM PROTEINE LOT 179631 EXP 08.2009 PRECIPATH PROTEINE LOT 179632 EXP 08.2009 RF CONTROL SET LOT 600321 EXP 03.2009m=media aritmetica = ∑ xi/n ;unde xi =valoarea ptr nivel normal sau patologic a

controlului obtinut; n= numarul total de valori luat in calcul

CV(%)=coeficientul de variatie=(SD/m) x100 ;unde SD=abaterea standard=s(x) m=media aritmetica

s(x)= √∑(xi-m)2/n-1; s(x) = up unde up= incertitudine standard

D=deplasarea sau biasul = m- tinta unde: m=media aritmetica; tinta reprezinta valoarea tinta ptr nivel l normal sau patologic a controlului mai sus mentionat

uD=incertitudine standard=D/√3

urmin =valoarea min a intervalului ptr nivel normal- SD( mentionat de producator in prospectul insotitor

control nivel normal)urmax= valoarea max a intervalului ptr nivel normal- SD( mentionat de producator in

prospectul insotitor control nivel patologic)

ur= incertitudinea standard datorata materialului de referinta=(urmax-urmin)/ √12

Uf = incertitudinea extinsa datorata calibratorului folosit ptr calibrarea parametrilor pe cele doua

analizoare(COBAS INTEGRA PLUS; HITACHI 912);valorile au fost puse la dispozitia

laboratorului da catre firma ROCHE DIAGNOSTICS GmbHuf=incertitudine standard =Uf/2 unde (2 reprezinta constanta k)

Uet= incertitudinea de etalonare de pe certificatul obtinut de la INM in urma etalonarii celor doua analizoare

ptr 3 parametrii respectiv- UREE;CREATININA;GLUCOZAuet= incertitudine standard de etalonare= Uet/2 unde (2 reprezinta constanta k)

uc=incertitudinea compusa=√up2+uD2+ur2+uf2+uet2

U=incertitudinea extinsa =ucx2 unde (2 reprezinta constanta k)

Raportarea incertitudinei extinse s-a realizat in doua variante:in valoare absoluta si in valoare relativa de tipul R=x±U(k=2)unde :x=m( media aritmetica) ; U=incertitudinea extinsa