J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 68 (1992), 205-208 0 1992 Verlag Paul Parey, Hamburg und Berlin

Eingang dcs Ms. 21. 5. 1992

ISSN 0931-2439

Aus dem Institut fur Ernahrungsphysiologie der Technischen Universitat Munchen in Freising- Weibenstepban

Pt-Retention in verschiedenen Organen von Ratten nach alimentarer Applikation von Pt-11-Phytochelatin-Komplex

Von M. KIRCHGESSNER, R. BADER und ANNA M. REICHLMAYR-LAIS

Einleitung

Zur Risikoabschatzung des mit Autoabgasen emittierten Platins, das durch Abriebprozesse in Autoabgaskatalysatoren freigesetzt wird, wurden Modellversuche mit wachsenden Rat- ten zur Ableitung von Dosis-Wirkungsbeziehungen fur unterschiedliche Platinverbindun- gen (Pt", PtCI,, PtCIJ durchgefuhrt (BADER et al. 1991, REICHLMAYR-LAIS et al. 1992). Da jedoch nicht nur direkt ausgeschiedenes Platin von Tier und Mensch aufgenommen wird, sondern auch von Pflanzen aufgenommenes Platin in die Nahrungskette gelangt, wurde in einer weiteren Untersuchung mit Ratten ein Pt-11-Phytochelatin-Komplex, der aus Pt-kon- taminiertem Pflanzenmaterial isoliert wurde, alimentar appliziert. Als wesentlicher Ver- suchsparameter diente die Pt-Retention in ausgewahlten Geweben und Organen.

Material und Methoden

Der Pt-11-Phytochelatin-Komplex wurde von Herrn Prof. Dr. M. H. ZENK, Institut fur Phar- mazeutische Biologie der Technischen Universitat Miinchen, zur Verfugung gestellt, wofur ihm sehr herzlich gedankt sei. Dabei handelt es sich um einen weitgehend wasserunlos- lichen Komplex, der aus Pt-kontaminierten Pflanzen isoliert wurde. Der Pt-Komplex wies einen relativen Platingehalt von 17% auf. Allgemein wird die Bildung von Phytochelatinen in Pflanzen durch viele Metall-Anionen und -Kationen induziert und durfte der Detoxifi- kation von Metallen dienen (GRILL et al. 1987).

63 mannliche Ratten (Sprague Dawley, Stamm Mus Rattus) rnit einer anfanglichen Lebendmasse von 36 f 1,5 g wurden in eine Kontrollgruppe (ohne Pt-Applikation) und in 6 Pt-Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Pt-Zulagen bei den Behandlungsgruppen betru- gen 0,Ol; 0,05; 0,lO; 0,50; 1,0 und 10 mg Pt2+/kg Diat. Fur die alimentare Applikation wurde Pt einer synthetischen Diat rnit folgender Zusammensetzung zugelegt: 20% Casein, 31,6% Maisstarke, 32% Saccharose, 3 % Cellulose, 6 % Palmkernfett, 1 O/o Sonnenblumen- 01, 4,2% Mineralstoffmischung, 2 % Vitaminmischung und 0,2010 DL-Methionin. Die Zusammensetzung der Mineralstoff- und der Vitaminmischung ist ausfuhrlich bei BADER et al. (1991) beschrieben. Die Diat wurde ad libitum 4 Wochen angeboten.

Am 29. Versuchstag wurden die Tiere nach 12stundiger Nuchterung unter Ethernarkose dekapitiert, entblutet und seziert. Die entnommenen Organe und Gewebe wurden sofort mit flussigem Stickstoff schockgefroren und bis zur analytischen Aufarbeitung tiefgefro- ren. Fur die Pt-Bestimmung wurden die Gewebe und Organe mit einem Ultra Turrax (T25, Fa. Janke und Kunkel, Staufen i. Br.) homogenisiert und getrocknet. Vom getrockneten Material wurden mehrere Proben offen oxidierend in Anlehnung an eine Methode von ALT et al. (1988) aufgeschlossen. Danach erfolgte nach vorausgehender Reduktion mit

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206 M . KircbgeJner, R. Badcr und Anna M. Rcicblmayr-Lais

Zinnchlorid zu PtZ+ eine Komplexierung des Platins rnit 1,5-DiphenyIthiocarbazon. Nach Einengen der organischen Phase wurde der Ruckstand rnit Isobutylmethylketon auf- genornmen. AnschlieBend wurde Platin durch Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt. Die Nachweisgrenze lag fiir die rneisten Organe bei 0,03 pg/g Trockenmasse, fur Plasma lag sie bei O,O1 pg/ml.

Zahl und Volumen der Erythrozyten sowie der Hamatohit wurden mit Hilfe eines Coulter Counters (Fa. Coulter Electronics GrnbH, Krefeld) ermittelt. Mit einem zusatz- lichen Harnoglobinometer des gleichen Herstellers wurde nach der Cyanmetharnoglobin- Methode der Hamoglobingehalt des Blutes bestimrnt.

Die Daten wurden varianzanalytisch ausgewertet und als Gruppenrnittelwerte zusam- men mit den Standardabweichungen der Einzelwerte angegeben. Die Gruppenmittelwerte wurden mit Hilfe des Student-Newrnan-Keuls-Test hinsichtlich signifikanter Unterschiede getestet. Signifikante Unterschiede bei den Gruppenmittelwerten sind mit unterschied- lichen hochgestellten Buchstaben gekennzeichnet.

Ergebnisse

Zuwachs und Futterverbrauch von mannlichen Ratten, die 4 Wochen lang alimentar Pt-11- Phytochelatin erhielten, sind in Tabelle 1 aufgefuhrt. Wie daraus ersichtlich ist, veranderte die Pt-Zulage zur Diat in keiner Dosierung den Zuwachs und die Futteraufnahme der Ver- suchstiere. Auch Zahl und Volurnen der Erythrozyten, Harnatokrit und Harnoglobin- Gehalt des Blutes blieben durch die Applikation von Pt-11-Phytochelatin unbeeinflugt, wie pus Tabelle 2 hervorgeht.

Tabelle I . Zuwachs und Futtcrvcrbrauch von Rattcn wihrend cincr 4wochigcn aliment5rcn Applibtion von Pt-11-Phytochelatin

(Table 1. Life mass gain and food consumption of rats resulting from an application of Pt-11-phytochelatin during 4 weeks)

' Pt-Zulage 0 0,010 0,050 0,100 0,500 1 10 (mg/kd

Zuwachs 175,6 174,3 175,2 174,7 168,5 171,O 173,9 (9) f10 ,O f 8 , 9 f17 ,6 f13,O f 9 , 7 f 8 , 8 f 1 1 , S

Durchschn. 375,7 375,9 374,1 354,O 3573 368,3 376,s Futter- f 2 0 , l f 16,O f36,O f 2 0 , 9 f 17,O f 19,2 f 2 8 , 8 verbrauch (9)

Tabelle 3 zeigt die Pt-Konzentrationen in ausgewahlten Organen und Geweben nach 4wochiger alirnentarer Zufuhr von Pt-(11)-Phytochelatin. Platin konnte in diesen Proben erst ab einer Pt-Zulage von 1 mg/kg Diat bei einigen Organen nachgewiesen werden. Bei geringeren Pt-Zulagen zur Diat lagen die Platin-Gehalte in den Geweben und Organen unter der Nachweisgrenze, die je nach Organ 0,Ol bis 0,05 pg/g Trockenmasse betrugen. Eine Erhohung der Pt-Zulage von 1 mglkg auf 10 mg/kg Diat fiihrte zu einer hoheren Pt-Reten- tion der Organe bzw. Gewebe. Die hochste Pt-Retention konnte in den Nieren gefunden werden.

Diskussion

In vorausgehenden Experimenten wurde mannlichen Ratten Platin in Form von Pt", PtCI,, PtCl, alimentar appliziert (BADER et al. 1991, REICHLMAYR-LAIS et al. 1992) und Dosis-Wir-

Pt-Retention in Organen von Rattcn 207

Tabclle 2. Zahl und Volumen dcr Erythrozytcn, Hamatokrit und HamoglobinGchalt dcs Blutes

von Rattcn nach 4wochiger Applikation von

(Table 2. Count and volume of erythrocytes,

TabeNe 3. PtGehaltc in vcrscbicdcnen Organen bzw. Gewcbcn nach 4wochigcr alimcntircr

Applikation von Pt-11-Phytatchclatin

(Table 3. Pt content in different tissues resulting Pt-11-Phytochelatin (pg/g Trockcnmassc)

hematocrit and hemoglobin content of blood from rats applicated with Pt-11-phytochelatin during

4 weeks)

Kontrolle 7,11 69 49,O 14,6 f 0 , 4 4 f 2 f 3,4 f 0 , 5

0,010 6,90 69 47,4 14,3 fO,29 f 2 f 2,O *0,5

0,050 6,87 69 47,l 14,O f 0 , 5 2 f 1 f 3,4 f 0 , 6

0,100 7.02 69 48,7 14,3 f 0 . 6 2 5 2 f 4 . 9 f 0 , 6

0,500 7,08 69 49.0 14,3 f 0 , 3 3 f 2 f 2,3 f0.8

1 7,02 69 48,O 14,2 f 0 , 3 1 f 1 f 1,4 f 0 , 4

10 7,11 70 49,3 14,3 f 0 , 2 5 f 1 f 0 , 5 f 0 , 5

from an alimentary application of Pt-11-phytochelatin during 4 weeks)

Pt-Konz. in dcr Diet (mglkg) Gewebc 0 1 ,o 10

Nieren

Leber

Milz

Femora

Muskel

Gehirn

Hoden

Herz

Fett

Plasma'

Restkorper

I; 0,03"

I; 0,03'

I; 0,05'

I; 0.03'

I; 0,03'

I; 0,03'

2 0,03'

s 0,03'

2 0,03'

-

-

-

-

-

-

-

-

-

5 0.01' -

$0,03' -

' Angabe (pg/ml)

0, l lb f 0,04

f 0,03

* 0,03

0,04b

0,06b

I; 0,03ab

I; 0,03'

I; 0,03'

0,06b f 0,03

I; 0,03'

- < 0.03'

-

-

-

-

-

< 0,01a -

I; 0,03a -

0,l lb f 0,02

0,05b

0,08b

0,05b

O,OSb

0,07b

0,09b

0,04b

f 0.03

f 0,02

f 0,03

f 0,Ol

f 0.02

f 0,04

f 0,02

I; 0.03' -

I; 0.01' -

0,07b f 0,03

kungsbeziehungen vor allem anhand von Pt-Retentionen in ausgewahlten Organen und Geweben abgeleitet. Dabei konnte festgestellt werden, daB die Pt-Retention von der Art der Platin-Verbindung, von der Pt-Dosis und von Organen und Geweben abhangig war. Die geringste Pt-Retention konnte bei Einsatz von Pt" gefunden werden, wahrend die Pt-Reten- tion infolge des Einsatzes von Pt-Chloriden hoher war. Die hochste Pt-Retention in den Geweben und Organen konnte bei Einsatz von PtCl, gefunden werden.

Der vorliegende Versuch zeigt nun, daB die Pt-Retention in den Organen und Geweben infolge der Applikation von Pt-11-Phytochelatin relativ gering ist. Sie ist vergleichbar mit den Effekten infolge der Applikation von Pt" (BADER et al. 1988) und damit weitaus gerin- ger als die Pt-Retention infolge einer Zulage von PtCI, oder PtC1, (REICHLMAYR-LAIS et a]. 1992). Damit ist die Verwertbarkeit des Pt-11-Phytochelatins aus Pflanzen fur den tierischen Organismus vergleichbar mit der des elementaren Platins. Das toxikologische Risiko des mit Autoabgasen ausgeschiedenen Platins diirfte demnach dann relativ gering sein, wenn das Platin zunachst von Pflanzen metabolisiert wird und dann anschliegend in die Nah- rungskette gelangt. Allerdings liegen uber die Mobilisierung des Platins durch die Pflanzen und deren BeeinfluBbarkeit noch sehr wenige Kenntnisse vor.

208 M. Kircbg&ner, R. Bader nnd Anna M . Rrichlmayr-Lair

Zusammen fassung 63 mannliche Sprague Dawley-Ratten mit einer anfanglichen Lebendmasse von 36 f 1,s g wur- den in 6 Pt-Behandlungsgruppen und in eine Kontrollgruppe eingeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt eine synthetische Basisdiat, der fur die Pt-Behandlungsgruppen ein Pt-II-Phytochelatin- Komplex in steigenden Dosen zugelegt wurde. Die Zulagen betrugen 0,Ol; 0,05; 0,lO; 0,SO; 1 und 10 mg Pe'Ikg Diat. Die Diat wurde ad libitum angeboten. Zur Ableitung einer Dosis-Wir- kungsbeziehung des Pt-11-Phytochelatins wurde die Pt-Retention in verschiedenen Organen und Geweben gemessen. Bis zu einer Zulage von 1 mg Pt2+/kg Diat lagen die Pt-Gehalte unter der Nachweisgrenze des Platins, die zwischen 0,Ol und 0,05 pg/g Trockenmasse je nach Organ lag. Erst ab einer Zulage von 1 mg Pt?'/kg Diat konnten Pt-Konzentrationen in einigen Organen nachgewiesen werden, die iiber der Nachweisgrenze lagen. Eine Erhohung der Pt-Applikation auf 10 mg Pe+/kg Diat fuhrte auch zu hoheren Organgehalten. Insgesamt kann die Verwertung des Platins in Form von Pt-11-Phytochelatin fur den tierischen Organismus als relativ gering ein- geschatzt werden.

Summary Pt retention in different tissues of rats resulting j?om alimentag application of Pt-II&tochehtin

63 male Sprague Dawley rats with a starting life mass of 36 f 1.5 g were distributed between 6 Pt treatment groups and a control group. The control group was fed with a synthetic basic diet which was substituted with Pt in form of Pt-11-phytochelatin with increasing dosis for the Pt treatment groups. Pt was added in dosis of 0.01; 0.05; 0.10; 0.50; 1 and 10 mg Pt2+/kg diet. The diet was offered ad libitum. For the derivation of dose response relationships of Pt-II-phpoche- latin Pt retentions in different tissues were determined. Below a supplementation of 1 mg P?+l kg diet the tissue retention was smaller than the detection limit, which was between 0.01 and 0.05 pg/g dry matter dependent on tissues. Pt concentrations higher than the detection limit could be determined starting with 1 mg Pe'/kg diet. An elevation of the Pt supplementation to 10 mg P P / k g diet induced higher Pt retentions. Altogether, it can be conduced that the availa- bility of Pt in form of Pt-11-phytochelatin is relativ low.

Danksagung Vorliegende Untersuchungen wurden mit Mitteln des Bundesministeriums fur Forschung und Technologie aus dem Forschungsverbund ,Edelmetallemissionen" (Forderkennzeichen 07 VPT 04) gefordert.

Literatur

ALT, F.; JERONO, U.; MESSERSCHMIDT, J.; TOLG, G., 1988: Microchim. Acta 111, 299. BADER, R.; REICHLMAYR-LAIS, ANNA M.; KIRCHGESSNER, M., 1988: J. Anim. Physiol. a. Anim.

GRILL, E.; WINNACHER, E. L.; ZENK, M. H., 1987: Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 439. REICHLMAYR-LAIS, ANNA M.; KIRCHGESSNER, M.; BADER, R., 1992: J. Trace Elem. a. Electrol.

Nutr. 66, 256.

Health a. Disease, in press.

Anschrrfr der Autoren: M. KIRCHGESSNER, R. BADER und ANNA M. REICHLMAYR-LAIS, Institut fur Ernahrungsphysiologie der TU Miinchen, W-8050 Freising-Weihen- stephan, FR of Germany