Quantifizierung von Cytomegalievirus(CMV)-DNA in Darmbiopsien mittels PCR zur Diagnostik der gastrointestinalenCMV-Erkrankung

Dr. med. Tina Ganzenmüller

Institut für Virologie

HumanesHumanes CytomegalievirusCytomegalievirus (CMV)(CMV)

• behülltes DNA-Virus (Herpesviridae)

• Hohe Durchseuchung (bis 100%)

• Latenz als persistierende Infektion in verschiedenen Zelltypen (Epithel, Endothel,Monozyten/Makrophagen etc.)

• Übertragung:– über die Plazenta– Schmierinfektion – Transfusion/Transplantation

CMVCMV--ErkrankungErkrankung ((CMV diseaseCMV disease))

• CMV bedeutender Erreger v.a. beim Immunkompromittierten

• schwere Komplikationen in nahezu allen Organsystemen möglich

• Häufiger Manifestationsort ist u. a. der Gastrointestinal(GI)-Trakt

GastrointestinaleGastrointestinale CMV ErkrankungCMV Erkrankung

– erosiver/ ulzerativer Prozess

– kann an jeder Stelle auftreten

– CMV-Enterokolitis am häufigsten beobachtet(1)

(1) Goodgame et al

RisikopatientenRisikopatienten

• Allogen Stammzelltransplantierte (zweithäufigste CMV Endorganmanifestation)

• Organtransplantierte

• HIV/AIDS-Patienten

• Patienten mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung

• Patienten mit Immundefekten, Malignomen oder älterePatienten etc.

(2) Schulenburg et al; (3) Baroco et al; (4) van Burik et al.

Diagnose der Diagnose der gastrointestinalengastrointestinalen CMVCMV--ErkrankungErkrankung

• Klinische Symptome,• makroskopische Endoskopie-Befunde,

• und Nachweis von CMV in Biopsien mittels Histologie (morphologische Untersuchung, Immunohistochemie etc.)

CMV-Enterokolitis-Fälle bleiben z.T. undiagnostiziert/Abgrenzung zu ähnlichen Krankheitsbildern (z.B. GvHD) schwierig

qualitative PCR nicht für CMV-Nachweis im Gewebe empfohlen, da positiver Vorhersagewert gering

Quantifizierung von CMV-DNA mittels PCR in Darmbiopsien käme als zusätzliches Diagnostikum für

in Frage.

Bislang kaum Daten zur Interpretation und diagnostischem Nutzen dieser Methode.

Ziel dieser StudieZiel dieser Studie

Retrospektive StudieRetrospektive Studie

163 Biopsien aus dem unteren GI-Trakt, die zum Ausschluss einerCMV-Enterokolitis zur CMV-PCR eingesendet wurden.

• Bestimmung der CMV Kopienzahl in den Biopsien pro Zelle:Real-time PCRs auf CMV und das CRP-Gen (um die Zellzahl zubestimmen und zu normalisieren

Berechnung von ”CMV Kopien/Zelle”

• Retrospektive Analyse von:a)Histopathologischem Befund

Morphologische Untersuchung/immunhistochemische Färbunga)klinischer Diagnoseb)CMV-Antigenämie (pp65-Antigen-Assay)

PatientenPatienten

22 (13.5)Other diagnosisc23 (14.1)Inflammatory Bowel Disease (IBD)13 (8.0)HIV Infection41 (25.2)Solid organ transplanation (SOT)b

64 (39.3)Stem cell transplantation (SCT)

Underlying disease

101 (62.0)Sex, male46 (1-80)Age in yearsa

Number of patientsn= 163 (%)Characteristic

a Median (range)b 15 kidney, 20 liver-, 6 other transplantations c Others included: immunodefects, non-transplant malignancies or rheumatic disorders

PrPräävalenzvalenz von CMVvon CMV--DNA in den DarmbiopsienDNA in den Darmbiopsien

PositivPositiv53/163 53/163 (32.5%)(32.5%)

NegativNegativ110/163 110/163 (67.5%)(67.5%)

Nachweis von CMV-DNA, n

(%)

Nur 12/53 der CMV-PCR positivenProben hatten ein histopathologischpositive Ergebnis

niedrigerniedriger positiverpositiver VorhersageVorhersage--wertwert derder qualitativenqualitativen PCR!!PCR!!

Keine der CMV-PCR negativenProben hatte ein positives histopathologisches Ergebnis

hoherhoher negativernegativerVorhersagewertVorhersagewert

Quantifizierung der CMVQuantifizierung der CMV--Last in DarmbiopsieLast in Darmbiopsie

Mediane CMV Last =8×10-2 (1×10-4 – 1.4×102) copies/cell

weite Spanne der weite Spanne der intestinalenintestinalenCMVCMV--lastlast (> 6 (> 6 LogstufenLogstufen))

Signifikant* hSignifikant* hööhere CMVhere CMV--Last in Last in histopathologischhistopathologischpositiven Darmbiopsienpositiven Darmbiopsien

quantitativequantitative PCRPCR sollte sollte benutzt werdenbenutzt werden

MMööglichkeit einen glichkeit einen cutcut--offoff zu zu definierendefinieren

* p <0.001

Definition eines Schwellenwerts fDefinition eines Schwellenwerts füür die r die intestinaleintestinale CMVCMV--Last mit der Histologie als gold Last mit der Histologie als gold standardstandard ((cutcut--offoffhistohisto))

- Werte oberhalb des Cut-offs sagen eine histopathologisch bestätigte CMV-Enterokolitis besser voraus als die qualitiative PCR

- Aber: CMV häufiger mittels PCR detektiert als histologisch bestätigt (n=12/53)

HistopathologieHistopathologie als idealer/empfindlicher Goldals idealer/empfindlicher Gold--Standard?Standard?

PPV: Positiver Vorhersagewert; NPV: Negativer Vorhersagewert; Cut-offhisto: Schwellenwert angepasst an die histologischen Ergebnisse

1.00.520.931.0Cut-offhisto: 0.141.00.230.731.0qualitative PCR

NPVPPVSpezifitätSensitivitätCut-off (CMV-copies/cell)

Klinische Kriterien zur Einteilung des Patientenkollektivs Klinische Kriterien zur Einteilung des Patientenkollektivs in in CMVCMV--EnterokolitisEnterokolitis--FFäällelle und Fund Fäälle anderer lle anderer ÄÄtiologie*tiologie*

„CMV-Enterokolitis“ :- Verdächtiger Endoskopie-Befund- Besserung durch antivirale

Behandlung

Kontollgruppe: „Non CMV-Äthiologie“ der Kolitis:-akute Episoden einer CED oder GvHD-Bakterielle Infekte etc.

-Alle Biopsien der Kontrollgruppe histopathologisch negativ -12/26 der klinisch definierten CMV-Enterokolitis-Fällen waren histopathologisch positiv

Mittels klinischer Kriterien konnten 14 zusätzliche Fälle definiert werden, die histologisch negativ waren

n=26/163 n=82/163

Bei 47 Patienten war die Äthiologie nicht eindeutig klärbar („unclear“) bzw. es waren keine klinischen Daten verfügbar (n=8)

Signifikant Signifikant hhööherehere intestinaleintestinale CMVCMV--Last Last beibei PatientenPatienten mitmitklinischklinisch definierterdefinierter CMVCMV--EnterokolitisEnterokolitis

CMV-Enterokolitis

Klinisch definierte Gruppen

Definition Definition „„klinischerklinischer““ Schwellenwert fSchwellenwert füür die r die intestinaleintestinaleCMVCMV--Last (Last (cutcut--offclinoffclin) im klinisch klassifizierten Kollektiv) im klinisch klassifizierten Kollektiv

Der histologische Der histologische CCutut--offoffhistohisto ist hochspezifisch, aber es kist hochspezifisch, aber es köönnen nnen klinisch relevante Fklinisch relevante Fäälle lle üübersehen werden.bersehen werden.

Der Der klinscheklinsche CutCut--offoffclinclin zeigt eine akzeptable Sensitivitzeigt eine akzeptable Sensitivitäät und t und SpezifitSpezifitäätt

0.911.01.00.69Cut-offhisto: 0.140.990.780.910.96Cut-offclin: 0.010.990.680.850.96qualitative PCR

NPV PPV SpezifitätSensitivitätCut-off(CMV-copies/cell)

PPV: Positiver Vorhersagewert; NPV: Negativer Vorhersagewert; Cut-offclin: :Schwellenwert angepasst an die klinischen Kriterien

Die HDie Häälfte der Patienten mit klinisch definierter lfte der Patienten mit klinisch definierter CMVCMV--EnterokolitisEnterokolitis zeigen keine zeigen keine CMVCMV--AntigenAntigenäämiemie**

68.2% der Patienten mit klinisch definierter CMV-Enterokolitiszeigten keine (11/22) oder nur eine low-level (4/22) CMV-Antigenämie.

Lokale CMV Lokale CMV ReplikationReplikation??AntigenAntigenäämietestungmietestung alleine alleine

nicgtnicgt ausreichend fausreichend füür die r die Diagnose! Diagnose! (7,8)(7,8)

*CMV-Antigenämie = positiver CMV pp65 Test innerhalb 10 Tage vor/nachBiopsie; Daten von 108 Patienten. <10 positive/400 000 Zellen = low-level Antigenämie≥10 positive/400 000 Zellen = high-level Antigenämie

(7)Mori et a.; (8)Ruell et al.

<

ZusammenfassungZusammenfassung

• Die PCR-Technik ist eine schnelle und objektive Methode (Turnover im Labor ca. 1-2 Werktage)

• Mittels PCR-Quantifizierung von CMV-DNA in Darmbiopsien können Schwellenwerte definiert werden, mit deren Hilfe die CMV-ID genauer vorhergesagt werden kann als mit qualitativer PCR:

– Histologisch adaptierter cut-offhisto liefert vergleichbare Ergebnisse wie die Histopathologie, allerdings können klinisch relevante Fälle übersehen werden.Geeignet zur Bestätigung

– Klinisch adaptierter cut-offclin hat eine verbesserte Sensitivität obwohl die Spezifität leicht erniedrigt ist Geeignet zum Screening

Vorteile aus der CMVVorteile aus der CMV--Quantifizierung in DarmbiopsienQuantifizierung in Darmbiopsien

Unterstützung der Diagnosefindung bei histopathologischunklaren Fällen; Adäquate Therapie (Immunsuppression vs. antivirale Therapie)

Vermeidung von Übertherapie, die bei qualitativ positiven aber klinisch irrelevanten Fälle entstehen könnte.

Weitere prospektive Studien müssen klären, ob die Anwendung dieser Schwellenwerte die Diagnose und Behandlung der CMV-Enterokolitis in der klinischen Praxis verbessern können.

Danke fDanke füür Ihre Aufmerksamkeitr Ihre Aufmerksamkeit