314 Bericht: Spezielle analytische Methoden.

G o s s y p o l a u s B a u m w o l l s a m e n m e h l m i t X t h e r haben J . O. H a l v e r s o n und F. I:[. S m i t h 1) eingehend studiert. I)abei konnten sie feststellen, dab isoliertes Gossypol in wasserfreiem oder gew6hnlichem J~thyl~ther leicht 16slich ist; dagegen kann aus trockenem Mehl mittels _~thers wenig oder gar kein Gossypol gewonnen werden. Dabei spielt es keine t~olle, ob das Mehl mit oder ohne t t i tze getrocknet wurde. Es hat sich nun gezeigt, dab der Wassergehalt des Mehles auf die LSslichkeit des Gossypols in ~ ther einen groBen EinfluB hat. An Hand von Versuchen haben die Verfasser festgestellt, dab die grSBten Ausbeuten bei einem Mehl yon etwa 20~o Feuchtigkeit erhalten werden und wenn dem Ex- traktions/~ther etwas Wasser zugegeben wird (5 c c m Wasser auf 350 c c m

J~ther). Mehle, die auf diese Art extrahiert wurden, ergaben 2--10real h6here Werte als Mehle, die im lufttrockenen Zustand der Extrakt ion unterworfen wurden. Ein: bestimmter Unterschied zwischen gebundenem und £therl6slichem Gossypol scheint demnach nicht zu bestehen, sondern nur durch den EinfluB des Wassers vorgetiiuscht zu sein.

F. N e u m i i l l e r . 4. A u f P h y s i o l o g i e u n d P a t h o l o g i e b e z t i g l i c h e M e t h o d e n .

Yon

I. Abelin. W. Fisehbaeh. Quantitative Bestimmung der Citronens~iure in biologischem l)Iaterial. Als ein bedeutsames Produkt des intermedi£ren Stoffwechsels wurde

neuerdings die Citronensi~ure erkannt. Zu ihrer Bestimmung in biologisehem Material stand bislang nur eine einzige Methode zur Verfiigung, n~Lmlich das Dehydraseverfahren yon T. T h u n b e r g 2 ) . Diesem Autor ist es gelungen, im Pflanzenreich spezifische Enzyme aufzufinden, welche die Citronens/iure dehydrieren. Der Verlanf der Reaktion wird an der Ent- fgrbung yon Methylenblau verfolgt. G. W. P u e h e r , C a r o l i n e C. S h e r m a n und H. B. V i c k e r y ~) schlagen nun eine rein chemische Methode der Citronens~urebestimmung vor.

P r i n z i p de r M e t h o d e . Die Citronens~ure wird mit Hilfe von Permanganat und Brom in Pentabromaceton umgewandelt. Das Penta- bromaceton wird mit Petrolgther ausgeschiittelt und mit w~Briger Natriumsulfidl6sung behandelt. Die entstandene F~rbung wird im Stufenphotometer gemessen. Durch Pyridinzusatz wird die Farbe stabilisiert. Gen/migkeit der Methode -4- 5~o.

E r f o r d e r l i c h e R e a g e n z i e n . t. 50%ige Schwefelsi~ure. 2. Citronen- s~nrestamml5sung in n -Sehwefels~ure. I c c m ~ 10 m g wasserfreie Citronens~ure. 3. Bromwasser, ges~ttigte LSsung. 4. m-Kaliumbromid- 16sung: t~,9g Bromkalium werden in 100ccm destflliertem Wasser auf- gel6st. 5. 1,5 n-Kaliumpermanganatl6sung: 47,4 g Kal iumpermanganat werden in i l Wasser aufgel6st. 6. Natriumsulfid, 4~/oig: 4 g krystalli- siertes Natr iumsulf id werden in 100 c c m Wasser aufgel5st. Die LSsung muB alle 2- -3 Tage frisch hergestellt und vor dem Gebrauch zentri-

l) Ind. Eng. Chem. Analytical Edition 5, 320 (1933). __ 2) Biochem. Ztschrft. 296, 409 (1929); vergl, diese Ztschrft. 95, 86 (1933). - - a) Journ. of Biol. Chem. 113, 235 (t936).

4. Auf Physiologie und Pathologie beziigliche. 315

fugiert oder filtriert werden. 7. 1%rrosulfat16sung: 20 g krystallisiertes Ferrosulfat werden unter Zusatz yon i c c m konz. Schwefelsi~ure in Wasser gelSst und die LSsung auf i00 c c m aufgefiillt. 8. Petrolather (Siedepunkt 35--50o). Das Produkt muI] vor dem Gebraueh auf etwaigen Gehalt an Citronens~ure untersucht werden. 9. Pyridin (Siedepunkt i i2--117°), friseh destilliert, i0. 50~oiges Pyridin : Gleiehe Volumina yon redestilliertem Pyridin und Wasser. i i. Wasserstoffsuperoxyd, 3~oige LSsung (zur Entf£rbung). 12. Trichloressigsaure, 10%ige L5sung.

A u s f i i h r u n g de r B e s t i m m u n g . Von tier zu untersuchenden LSsung wird eine bekannte Menge (die nicht mehr als i,0 m g Citronen- s~ure enthalten darf) in einen ~50 c c m - G l a s b e c h e r gegeben und mit Wasser auf 75 c c m aufgefiillt. Dann werden hinzugeffigt: 3 ccm des Reagenses i und einige QuarzkSrnehen; da.s Ganze wird etwa l0 rain lang gekocht. Nach dem Abkfihlen auf Zimmertemperatur setzt man 3 c c m des l~eagenses 3 hinzu und lgBt i0 min stehen. Das Gemiseh wird nun in ein 50 c c m - Z e n t r i f u g e n g l a s iibergeffihrt und zentrifugiert. Die w£Brige Schieht wird in einen birnfSrmigen 1 2 5 c c m - S e h e i d e t r i c h t e r

abgegossen, worauf 2 c c m vom Reagens 4 und i0 c c m Reagens 5 zu- gesetzt werden. Das Ganze wird 10 min stehen gelassen, wonach durch Zu- satz der erforderlichen Menge vom Reagens 7 die LSsung entfarbt wird.

E x t r a k t i o n des P e n t a b r o m a e e t o n s . Die Mischung wird mit 25 c c m Reagens 8 ausgeschfittelt, die wi~Brige Schicht abgegossen, der Petrol~ther mit 5 - - i 0 c c m Wasser einmal ausgewaschen und die Wasch- fltissigkeit zur wal3rigen Schicht hinzugefiigt. Man bringt den Petrol- ~ther in einen zweiten Scheidetrichter und die waBrige LSsung wieder in den ersten Seheidetrichter zurtick. Hier wird die Extrakt ion mit einer neuen Por t ion Petrol~ther wiederholt. Die beiden Petrol£therauszfige werden vereinigt und darauf 4real mit je 5 c c m Wasser gewasehen.

P h o t o m e t r i s c h e B e s t i m m u n g des P e n t a b r o m a c e t o n s . Der so vorbehandelte Petroli~ther wird hintereinander zuerst mit 3, dann mit 2 und znletzt mit i c c m des 1%eagenses 6 ausgeschfittelt, die Waschflfissig- keiten quant i ta t iv in einen l0 c c m - M e l ] k o l b e n gegeben, mit 3,5 c c m

Pyridin versetzt und mit Reagens l0 bis zur Marke aufgefiillt. Unter Vorschaltung des Liehtfilters S 43 wird innerhalb der n~ehsten 30 rain der Extinktionskoeffizient der LSsung in P u l f r i c h s Photometer be- stimmt. Als Kontrolle dient Wasser. Zum Vergleieh dient eine Eiehungs- kurve yon LSsungen, welche zwischen 0,] und 1,0 m g Citronens~Lure enthalten.

U n t e r s u e h u n g y o n b i o l o g i s c h e m M a t e r i a l a u f C i t r o n e n - s/~ure.

a) t i a r n . Vom mensehlichen Harn gen/igen 0 ,2-- i ,0 com.

b) B l u t . Zur Analyse werden etwa l0 c c m Blut verwendet. Das- selbe muff zuerst enteiweifit werden, i Tell Vollblut oder Plasma wird mit 9 Teflen einer 10%igen Triehloressigs£uretSsung vermisch t , um- gerfihrt, l0 min stehen gelassen, dann filtriert oder zentrifugiert. Es darf nur frisch entnommenes Blut verwendet werden, da sonst die Citronensaure sehr rasch zersetzt wird.

316 Bericht: Spezielle analytische l~¢[ethoden.

c) F a e c e s wcrden mit Wasser vermischt und mit 8chwefelsgure bis zum Umschlag yon Kongorot anges/iuert. Ein abgemessener Tell dieser Mischung wird mit dem gleichen Volumen 10% iger Trichlor- essigsgure versetzt. Zur Analyse gelangt 1/5~/10 der Tageskotmenge.

d) T i e r i s c h e s Gewebe . Organ- oder lV[uskelgewebe wird mit Sand und mehreren Anteilen ~0% iger Trichloressigsgure im 1ViSrser verrieben. Ein a]iquoter Tell des Fi]trats, entsprechend etwa i0 g des ursprfinglichen Gewebes, dicnt zur Ana]yse.

e) P i l a n z l i c h e s Gewebe . Es ge]ingt zwar manchmal, die Citronen- sgure direkt in wgl~rigen Pflanzenextrakten zu bcstimmen, aber etwa vorhandene stSrende iNebenstoffe machen die Bestimmung unsicher. Deshalb ist die Herstellung eines gtherischen Auszuges empfehlenswert. Derselbe enthglt die organischen Sguren, darunter auch die Citronen- sgurel). Ferner sol]re bei Pflanzenmaterial die Entfgrbung der Analysen- flfissigkeit nicht mit Ferrosulfat (s. oben), sondern mit Wasserstoff- superoxyd vorgenommen werden. I. Abe l i n .

Quantitative Bestimmung des Bleies in tierischem ]laterial. a) Q u a n t i t a t i v e B l e i b e s t i m m u n g im B l u t e nach It. K r a f t -

S t r S m , K. W f i l f e r t und 0. Sydnes2) . Reagenzien. l) Konz. Schwefel- sgure, bleifrei. 2) Kaliumnitrat, analysenrein. 3) 5%ige Ammoncitrat- 15sung (Ammoncitrat, analysenrein). 4) 5%ige CyankaliumlSsung (Cyankalium, analysenrein). 5) Natriumhydrosulfit, gepulvert p .a . 6) Ammoniak, konz. p. a. 7) Ammoniak, verdiinnt (i:200). 8) Dithizon- lSsung, 6 mg in i00 ccm Tetrachlorkohlenstoff, aufbewahrt unter wgl~riger NatriumhydrosulfitlSsung. 9) I)estilliertes Wasser. i0) Stickstofi (Bombe). Das kgufliehe Dithizon mul~ nach H e l l m u t F i s c h e r und G r e t e L e o p o l d i 3) in folgender Weise gereinigt werden: 6 mg kgufliches Dithizon werden in 100 ccm Tetrachlorkohlenstoff gelSst; sodann wird die LSsung in einen Scheidetrichter fibergefiihrt. Zu der LSsung werden etwa 40 ccm verdfinntes Ammoniak zugesetzt; das Ganze wird 5 rain krgftig geschfittelt. Das Dithizon geht in die ammoniakalische LSsung fiber, die gelbbraun wird, wghrend die etwa vorhandenen Verunreinigungen, wie Metall- dithizonate, oxydiertes Dithizon und andere im Tetraehlorkohlenstoff zurfickbleiben. Die wgl~rige Schicht wird mit ~ Tropfen konz. Salpeter- s/iure (Laekmusprobe) neutralisiert oder schwaeh anges/iuert und nochmals mit 100 ccm Tetraehlorkohlenstoff geschiittelt. Das nun reine Dithizon geht in den Tetrachlorkohlenstoff fiber (der sich tier griin fgrbt) und ist nun vollkommen bleifrei. Die LSsung wird unter einer dfinnen Schicht Wasser, dem einige KSrnchen Natriumhydrosulfit zugesetzt sind, aufbewahrt.

Das zum LSsen der lgeagenzien und Ausspfilen der Glgser ver- wendete Wasser mul3 in einer Glasapparatur destilliert werden. Metalle jeder Art, besonders Metallkfihler, sind zu vermeiden.

1) Vergl. hierzu G. \V. P u c h e r , It. B. V icke ry , A. J. W a k e m a n , Ind. Eng. Chem. Analytical Edition 6, :140, 288 (t934). __ 2) Biochem. Ztschrft. 290, 382 (:1937). - - 8) Vergl. diese Ztsehrft. 96, 130 (:1934).