Z. Krebsforsch. 76, 320--324 (1971) �9 by Springer-Verlag 1971

Quantitative Versuche an Ratten fiber die carcinogene Wirksamkeit von Tabakrauchkondensaten

D. SCHMAHL Institut fiir experimentelle Toxikologie und Chemotherapie

(Direktor: Prof. Dr. reed. D. Schm~hl) am Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg

Eingegangen am 19. August 1971

Quant i ta t ive Invest igat ions of Carcinogenic Effects of Tobacco Smoke Conden- sates in Ra t s

Summary. Tobacco smoke condensates have been injected subcutaneously in different concentrations (50, 25, 12,5 and 6.25 rag/0.15 ml) with equal treatment-endurance (64 weeks), as well as in equal concentrations (50 rag/0.15 ml) but with different treatment-endurances (64, 32, 18 and 8 weeks) in to 640 rats once weekly. The total doses of 3200, 1600, 800 and 400 mg injected within a particular series proved comparable. With an increase of the total dose from 1600 to 3200 rag, no increase in yield of local sarcomas, however, could be found. The strength of the carcinogenic effect of tobacco smoke condensates with lower total doses proved to be dependent on the amount of the total doses; probably also on the duration of treatment.

Zusamme~]assung. Tabakrauchkondensate wurden in unterschiedlichen Konzentrationen (50, 25, 12,5 und 6,25 rag/0,15 ml) bei gleichen Behandlungszeiten (64 Wochen) sowie bei glei- cher Konzentration (50 rag/0,15 ml) aber verschiedenen Behandlungszeiten (64, 32, 16 und 8 Wochen) an 640 Ratten wSchentlich einmal sc. injiziert. Die injizierten Gesamtdosen waren in den einzelnen Behandlungsserien untereinander vergleichbar, sie betrugen 3200, 1600, 800 und 400 mg pro Tier. Bei Steigerung der Gesamtdosis yon 1600 auf 3 200 mg war keine erh6hte Ausbeute an lokalen Sarkomen zu verzeichnen. Die St~rke der carcinogenen Wirkung der Tabakrauchkondensate hing nur bei niedrigeren Gesamtdosen deutlich yon der HShe derselben, wahrscheinlich abet auch yon der L~nge der Behandlungszeit ab.

Dosis-Wirkungs- und Dosis-Zeit-Beziehungen bei der Carcinogenese durch Tabakrauehkondensate (TRK) wurden bisher vorwiegend an der M~usehaut stu- diert (Day, 1967 ; Wynde r u. Hoffmann, 1967 ; Dontenwill u. Mitarb., 1970). Dabei ha t te sieh ergeben, dab eine dosisabh~ngige lineare Regression vorherrscht . U m zu priifen, ob ~hnliche Verh~ltnisse auch fiir andere Tierarten und andere Gewebe als die H a u t anzunehmen sind, haben wir an der Subcutis der Ra t t e quant i ta t ive Ver- suche zur Sarkomerzeugung mit T R K durehgefiihrt. Dieses Modell ersehien uns fiir solehe Studien besonders geeignet, da die Rat tensubeut is empfindlicher auf die carcinogene Wirkung yon T R K reagiert als die M~usehaut (Sehm~hl, 1967). Bei den hier mitzuteilenden Versuchen wurden sowohl die Einzel- und Gesamtdosen des applizierten T R K sowie die Behandlungszeiten variiert, n m zu erkennen, welche EinfluBgrSBen die eancerogene Wirkung der T R K bestimmen.

Methodik

Die Versuche umfaBten 640 m~nnliche Ra t t en des Stammes B R 46, die bei Versuchsbeginn 100 Tage alt waren und mit Altromin| und Wasser

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ad. lib. ern~hrt wurden. ])as verwendete T R K 1 (Blend B) ist hinsichtlich der wichtigsten physiko-chemischen Daten bereits besehrieben worden (Schm~hl, 1968). Es wurde in einem Tri-N-caprylin-•thanol-Gemisch an die Rat ten w5chent- lich einmal sc. immer an die gleiche Stelle knapp lateral der Wirbels~ule in ihrem dorsalen Antefl injiziert, bis die gewiinschten Gesamtdosen und Behandlungszeiten erreieht waren (Tab. 1).

Der Versuch gliederte sich in 3 Untergruppen. In der ersten wurde bei Konstanz der Einzeldosis (50 mg TRK]Woehe) die applizierte Gesamtdosis und damit aueh die Behandlungszeit variiert. Die letztere lag zwischen 64 und 8 Wochen, die Ge- samtdosen verteflten sieh entspreehend auf 3200-400 mg TRK/Tier. Das T R K war hier zu gleichen Teilen in Tri-N-eaprylin und 70 %igem J~thanol gelSst ; seine Konzentration betrug demgem~B 33 %, das wSchentliehe Injektionsvolumen 0,15 ml. In der zweiten Untergruppe lieBen wit die Behandlungszeit mit 64 Woehen konstant, variierten aber die Einzeldosen yon 50 mg his 6,25 mg TRK/Woehe, um wiederum auf die gleichen Gesamtdosen wie in der ersten Untergruppe zu kommen (Tab. 1). Um das wSehentliche Injektionsvolumen (0,15 ml) gegeniiber der ersten Gruppe gleich zu halten, wurde bei geringeren TRK-Konzentrat ionen der ent- sprechende fehlende Anteil der T R K durch Wasser ersetzt. Die beiden ersten Untergruppen shad also in sich beziiglich der verabreiehten Gesamtdosen und der Injektionsvolumina streng vergleiehbar. Die dritte Untergruppe umfaBte die Kon- trolle. Diese Tiere bekamen lediglich die LSsungsmittel in gleicher Menge und H~ufigkeit wie die Versuehsratten injiziert.

Alle Tiere wurden his zum natiirliehen Lebensende beobachtet, danach seziert und gegebenenfalls histologiseh untersucht. Da es sieh bei der eaneerogenen Wir- kung der TR K um eine lokale Wirkung handelt (Sehm~hl u. Thomas, 1964) haben wir -- aueh in Ubereinstimmung mit Dontenwill u. Mitarb. (1970) - nur die lokalen, am Injektionsort aufgetretenen Geschwiilste bei der Auswertung beriick- sichtigt.

Ergebnisse

Die Injektionen wurden yon den Rat ten -- abgesehen yon den unmittelbar naeh den Applikationen auftretenden Nieotin-Intoxikationen (Sehmghl, 1968) -- gut vertragen. Die Gewichtskurven lagen im Bereich der Norm; das durchschnitt- liche Tiergewieht betrug in allen Versuchsgruppen ~ 450 g. Die mittlere Lebens- erwartung lag in den verschiedenen Versuchsserien bei 23 • 3 Monaten und war damit gegenfiber den Kontrollen nicht verkfirzt.

Die Ergebnisse des Carcinogenese-Versuches shad in Tab. 1 zusammengefaBt. Es entstanden insgesamt 51 Tumoren am Injektionsort, die sieh histologisch meist als Fibrosarkome darstellten. In den Tumoren waren jewefls Reste des injizierten T R K nachweisbar. Metastasen beobaehteten wir nicht. Bei den Kontrollen ent- standen keine Tumoren an der Injektionsstelle.

Bei den Versuehsgruppen f~llt auf, dab in besthnmten Bereichen unabh~ngig yon der HShe der Einzeldosis (50 oder 25 mg/TRK) und der Behandlungszeit (64 oder 32 Woehen) bei versehiedenen Gesamtdosen (3,2 und 1,6 g]TRK) praktiseh die gleichen Sarkomausbeuten zu verzeiehnen waren (15 % bezogen auf die An-

1 Fiir die ~erlassung der TRK danke ich Herrn Prof. D. DontenwiU, Hamburg, fiir die histo]ogischen I)iagnosen Hcrrn Prof. Dr. Goerttler, Heidelberg.

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fangstierzahl, 22 % bezogen auf diejenigen Tiere, die beim Auftreten des ersten Tumors lebten; Tab. 1 ). Eine Erh6hung der Gesamtdosis yon 1,6 auf 3,2 g /TRK hat demnach kein vermehrtes Auftreten yon Sarkomen zur Folge. Erst wenn die Gesamtdosen auf 800 oder 400 m g / TR K gesenkt werden, sinkt auch die Frequenz an lokalen Sarkomen deutlieh ab (Tab. 1). Unterwirft man die H~ufigkeit der lokal entstandenen Tumoren der Probittransformation, so ergibt sieh in Abh~ngigkeit vom log der Gesamtdosis in beiden Versuchsgruppen eine klare Dosis-Wirkungs- Beziehung. Ein Anstieg der Wirkung mit ErhShung der Gesamtdosis ist in beiden F~llen statistisch zu sichern (~ = 0,05). Dabeiist auff/illig, dab in denjenigen Serien, bei denen bei geringerer TRK-Konzentra t ion fiber l~ngere Zeit bei vergleichbaren Gesamtdosen behandelt wurde, die Tumorausbeuten hSher lagen als bei nur kurz. fristiger Behandlung bei hSheren TRK-Konzentra t ionen (z. B. 9 und 4 Sarkome bei Wochendosen yon 12,5 oder 6,25 mg TI~K fiber 64 Woehen, Gesamtdosen 800 und 400 rag, gegenfiber 2 bzw. 0 Sarkomen bei Wochendosen yon 50 mg T R K fiber 16 oder 8 Wochen, Gesamtdosen wiederum 800 und 400 rag). Wenngleich diese Unterschiede statistisch nur schwer zu sichern sind (p > 0,05), so ist der Trend doch unverkennbar. Er entsprieht den Erfahrungen, die bei quanti tat iven Ver- suchen mit h6heren Polycyclen gemaeht wurden (Literatur bei Schm~hl, 1970). Aueh hier ist es so, da~ die langr~umig verzettelte Applikation der Kohlenwasser- stoffe in geringen Konzentrationen zu hSheren Tumorausbeuten ffihrt als die nur kurzfristige in vergleichsweise hohen Konzentrationen. Um diese Verhiiltnisse bei T R K jedoch eindeutig kl~ren zu kSnnen, sind Untersuchungen mit grSBerem Tier- material notwendig.

Bemerkenswert ist, dab die Induktionszeiten der Sarkome in allen Versuchs- gruppen identiseh waren. Sie betrugen mit praktisch gleicher Streuung jeweils 86 • 15 Wochen. Die applizierten unterschiedlichen Einzel- und Gesamtdosen haben also auf diesen Parameter keinen Einflul~. Eine indessen statistisch nicht

Tabelle 1. ~)ber~icht ~ber Verauche zur Krebserzeugu~ an mdnnUchen BR 46-Ratten mit Tabak- rau~hkondenaaJ bei Variation yon Einzeldoaen, Gesamtdasen und Behandlungszeiten ( Tierzald

1. Tumor = A~zald der Tiere, die beim Auftrete~ des I. Tumors noch lebten)

Tier- Einzeldosis Gesamt- Behsnd- N real. Tu- % zu Induktions- Zahl mg/Woche dosis lungszeit moren am zeit

mg Wochen Injektionsort Gesamt- Tierzahl Wochen tierzahl 1. Tu.

80* 50 3200 64 13 16 23 81 4- 14 80 25 1600 64 11 14 22 87:J:13 80 12,5 800 64 9 11 14 814-18 80 6,25 400 64 4 5 22 1054- 7

80" 50 3200 64 13 16 23 81 4- 14 80 50 1600 32 12 15 20 864-23 80 50 800 16 2 2 5 90 8O 50 400 8 0 0 0

80 0 0 0 0 0 0

�9 Versuchsgruppen identisch.

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gesicherte Ausnahme macht die Gruppe, bei der 6,25 nag T R K fiber 64 Wochen (Gesamtdosis 400 rag) gegeben wurden. Hier war die Induktionszeit mit 105 • 7 Wochen etwas verl~ngert (Tab. 1).

Neben den lokalen Geschwiilsten t ra t noch eine Reihe anderer gutartiger und bfsart iger Tumoren auf, die nicht auf die TRK-Behandlung zu beziehen sind. Bei den Kontrollen entstanden an gutartigen Neubfldungen 3 Thymome (3,7 %) sowie je ein Augenlid-, Sehwanz- und Inguinalsarkom, ein Ph~oehromoeytom und ein Lungenearcinom an bfsart igen Tumoren (6 %). In den mit T R K behandelten Gruppen sahen wir als gutartige Gesehwfilste 9 Thymome und 2 Mammafibrome (11/560 = 2 %) und an Malignomen 2 Ph~oehromocytome, 2 Leuk~mien, 2 Reti- eulosarkome, 2 Lymphosarkome, je 1 Pankreas-, Hoden- und Nasenhfhlen- carcinom, je 1 Thymus- und Mesentrialsarkom sowie 1 Pleuramesotheliom. Die Ausbeute an bfsart igen Neoplasmen ist demnach 14/560 = 2,5 % und damit niedriger als in der Kontrollpopulation.

Diskussion

Das wesentliche Ergebnis der vorliegenden Versuche wird in dem Befund ge- sehen, dab vorwiegend die applizierten Gesamtdosen, trendm/~Big zu erkennen aber aueh die Behandlungszeiten, die cancerogene Wirksamkeit der T R K bei Ra t ten bestimmen. Damit stehen diese Befunde in guter Ubereinstimmung mit den eingangs zitierten Arbeiten fiber Dosis-Wirkungsbeziehungen bei der Careino- genese mit T R K an M/~usen. Bemerkenswert und nur schwer erkl/~rbar bleiben die Beobachtungen fiber die identisehen Induktionszeiten der Sarkome trotz erheb- lich unterschiedlicher verabreichter Gesamtdosen, die sich wie 1:8 verhielten, sowie das Fehlen einer hfheren Tumorausbeute bei Erhfhung der Gesamtdosen yon 1,6 auf 3,2 g TRK. Offenbar liegt das Maximum an lokalen Sarkomen, das durch T R K bei Rat ten zu erzeugen ist, bei 20 % (Schm/ihl, 1964, 1968, 1970). Da- mit erweisen sieh T R K erneut als relativ schwach wirksame Careinogene, was sich aueh in den langen Induktionszeiten manifestiert.

Setzt man die vorliegenden Befunde zu den Beobaehtungen beim Mensehen in Beziehung, so ist zu fordern, dab der Kondensatgehalt der Tabakwaren, vor allem aber der Zigaretten, weiter gesenkt werden sollte, wie dies in der Bundesrepublik seit 1960 bereits zu erkennen ist (Timm, 1970). Dadurch wfirde auch der Menseh zu geringeren Gesamtdosen inhalierter T R K kommen. Die Bestrebungen in dieser Richtung sollten tunliehst welter intensiviert werden.

Literatur

Day, T. D. : Carcinogenic action of cigarette smoke condensate on mouse skin. Brit. J. Cancer 21, 56---81 (1967).

Dontenwill, W., Elmenborst, H., Harke, H. P., Reckzeb, G., Weber, K. H., Misfeld, J., Timm, J.: Experimentelle Untersuchungen fiber die tumorerzeugende Wirkung yon Zigarettenrauch. Kondensaten an der M~usehaut. Z. Krebsforsch. 78, 265---284 (1970).

Schm~hl, D., Thomas, C.: Vergleichende Priifung yon Tabakrauchkondensaten bei subcutaner und oraler Applikation auf cancerogene Wirkung bei Ratten. Z. Krebsforsch. 66, 281--296 (1964).

- - Vergleich der Empfindlichkeit zwischen Ratte und Maus gegen die carcinogene Wirkung yon Tabakrauchkondensaten. Arzneimittel-Forsch. 17, 404--405 (1967).

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Schm/~hl, D.: Yergleichende Untersuchungen an Ratten iiber die carcinogene Wirksamkeit ver- schiedener Tabakextrakte und Tabakrauchkondensate. Arzneimittel-Forsch. 18, 814--817 (1968).

- - Entstehung, Wachstum und Chemotherapie maligner Tumoren. Ed. Cant~r, Aulendoff, 2. Aufl. 1970.

Timm, J. : Einige Trendanalysen zum Problem des Cigarettenrauches in der Bundesrepublik Deutschland fiir die Jahre 1961--1969. Beitr. Tabak-Forsch. 5, 193--197 (1970).

Wynder, E.L., Hoffmarm, D.: Tobacco and tobacco smoke. New York-London: Academic Press 1967.

Prof. Dr. D. Sehm~thl Direktor d. Inst. f. exp. Toxikologie u. Chemotherapie Dtsch. Krebsf.ztr. ])-6900 Heidelberg, Berliner Str. 27 Deutschland