Aus der Universitätsklinik und Poliklinik für Innere Medizin I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Direktor: Prof. Dr. med. Patrick Michl)

Schwerpunkt Pneumologie

Quantitativer Nachweis zellfreier methylierter short stature

homeobox 2 DNA von Lungentumorpatienten vor und nach

operativer Therapie

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

vorgelegt

der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

von Christian Georg Fuhrmann geboren am 1. November 1987 in Oldenburg Betreuer: Prof. Dr. Bernd Schmidt (Berlin) Gutachter:

1. Prof. Dr. med. J. Neudecker (Berlin) 2. PD Dr. med. A. Zipprich 3. PD Dr. med. C. Schäfer (Greifswald)

02.05.2017 04.12.2017

Referat Die vorliegende Dissertation untersucht den molekularen Marker mSHOX2 in Bezug auf dessen Eignung als Tumormarker für das Lungenkarzinom. Dies mit besonderem Augenmerk auf dessen Verhalten vor und nach operativer Tumortherapie. Untersucht wurde der Methylierungsgrad des SHOX2-Gens bei 28 Patienten mit Lungenkarzinom im Stadium I-IIIA, welche sich zur operativen Tumortherapie im Studienzentrum vorstellten. Es wurden prä-/postoperative Plasmaproben, sowie Bronchiallavage und intraoperativ Tumorgewebe gewonnen und auf ihren Gehalt an mSHOX2 untersucht. Darüberhinaus wurden die Patienten, soweit möglich, postoperativ weiter verfolgt und bei diesen im Rahmen der Nachsorgeuntersuchungen in weiteren follow-up Blutplasmaproben erneut der Methylierungsgrad des SHOX2-Gens gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Patienten, die präoperativ einen hohen Methylierungsgrad aufwiesen, es postoperativ zu einem deutlichen Abfall von mSHOX2 kam. Ebenso weisen einige Patienten in den follow-up Untersuchungen nach initial unauffälligem mSHOX2 Nachweis im Verlauf ansteigende Werte auf. Schließlich zeigte sich, dass mSHOX2 sowohl in Blutplasma als auch in Lavage und Tumorgewebe nachweisbar ist und einige wichtige Charakteristika eines Tumormarkers aufweist. Die durch diese Pilotstudie gewonnenen Erkenntnisse sind vielversprechend. Einzelne Aspekte bedürfen jedoch der Überprüfung in einem größeren Maßstab im Rahmen einer multizentrischen Studie. Fuhrmann, Christian Georg: Quantitativer Nachweis zellfreier methylierter short stature homeobox 2 DNA von Lungentumorpatienten vor und nach operativer Therapie, Halle/Saale, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Medizinische Fakultät, Dissertation, 50 Seiten, 2017

I

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1

1.1 Das Lungenkarzinom 1

1.1.1 Epidemiologie und Ätiologie 1

1.1.2 Histologische Einteilung 2

1.1.3 Diagnostik 2

1.1.4 Stadieneinteilung 2

1.1.5 Symptome 5

1.1.6 Screeningmethoden 5

1.2 Therapie des Nicht-Kleinzelligen-Bronchialkarzinoms (NSCLC) 6

1.2.1 Operation 7

1.2.2 Radiatio 7

1.2.3

1.2.4

Chemotherapie

Immuntherapie

7

8

1.3

1.4

Therapie des Kleinzelligen-Bronchialkarzinoms (SCLC)

Genetische Alterationen von Lungentumoren

8

9

1.4.1 Epigenetik 9

1.4.2

1.4.3

1.4.4

Punktmutationen

Numerische Chromosomenaberationen

DNA-Methylierung

9

10

10

1.5 Freie zirkulierende Nukleinsäuren (CNA) 12

2 Zielstellung 13

3 Material und Methoden 14

3.1 Patienten 14

3.2 Probengewinnung 14

3.2.1 Blutproben 14

3.2.2 Bronchiallavage 14

3.2.3 Tumorgewebe 15

3.3 DNA Isolation 15

3.3.1 DNA Isolation aus Blutplasma 15

3.3.2 DNA Isolation aus Bronchiallavagezellen 16

3.3.3 DNA Isolation aus Tumorgewebe 17

3.4 Bisulfitbehandlung 17

3.4.1 Bisulfitbehandlung und Aufreinigung der Blutplasmaproben 17

3.4.2 Bisulfitbehandlung und Aufreinigung der Bronchiallavage- und

Tumorgewebeproben

18

3.5 PCR-Untersuchung 19

II

3.6 Bestimmung der Vaskularisierung im Tumorgewebe 20

3.7 Statistische Berechnungen 20

4 Ergebnisse 21

4.1 Demographische und klinische Daten 21

4.1.1 Geschlechtsverteilung 21

4.1.2 Alter 21

4.1.3 Raucherstatus 22

4.2 Tumore 23

4.2.1 Tumorhistologie 23

4.2.2 Tumorgröße 24

4.2.3 Lymphknotenstatus 27

4.2.4 Fernmetastasen 27

4.2.5 Tumorstadium 28

4.3 PMR-Werte 28

4.3.1 Vergleich prä- / postoperative Werte im Blutplasma 28

4.3.2 Follow-up Blutplasmawerte 30

4.3.3 Vergleich PMR-Werte in Gewebe / Bronchiallavage / Blutplasma 31

5 Diskussion 36

5.1 Diskussion der Methoden 36

5.1.1 Das Patientenkollektiv 36

5.1.2 Probengewinnung 36

5.1.3 Tumorstadien 37

5.1.4 Angewandte analytische Methoden 38

5.2 Diskussion der PMR-Werte 38

5.2.1 Vergleich prä- / postoperativer Werte im Blutplasma 38

5.2.2 Follow-up Blutplasmawerte 40

5.2.3 Vergleich PMR-Werte in Gewebe / Bronchiallavage / Blutplasma 41

5.3

6

Limitationen

Zusammenfassung

43

44

7 Literaturverzeichnis 45

8 Thesen 50

III

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Symbole

Abb. Abbildung

AML Akute Myeloische Leukämie

bezgl. Bezüglich

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CNA circulating nucleic acids (zirkulierende Nukleinsäuren)

CpG Cytosin-Phosphat-Guasin (5’-3’)

CT Computertomographie

CT Differenz Cycle Threshold

CTC Circulating tumor cells

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytidintriphosphat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

dUTP Desoxyuraciltriphosphat

d.h. das heißt

DNA desoxribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

DNMT DNA-Methyltransferasen

DTT Dithiotreitol

EBV Epstein-Barr-Virus

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ggf. gegebenenfalls

HPV Humane Papillomaviren

HPF High Power Field – hochauflösendes Gesichtfeld

mSHOX2 methyliertes Short-Homeobox-Gen 2

n.d. not determined (nicht bestimmt)

NEC Neuroendokrines Karzinom

Nr. Nummer

NSCLC Non-Small Cell Lung Cancer (Nicht-Kleinzelliges-Bronchialkarzinom)

o.g. oben genannt

Pat. Patient

PBS phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)

PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

PET Positronenemissionstomographie

PMR Prozent-Methylierung-Ratio

RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

IV

SCLC Small-Cell Lung Cancer (Kleinzelliges Bronchialkarzinom)

SD Standard-Deviation (Standardabweichung)

SHOX2 Short-Stature-Homeobox-Gen 2

sog. so genannt

Tab. Tabelle

TNM Tumor, node, metastasis – Primärtumor, Lymphknotenmetastasen,

Fernmetastasen

UICC Union internationale contre le cancer (Internationale Vereinigung gegen

Krebs)

v.a. vor allem

vWF von-Willebrand-Faktor

WHO World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation)

z.B. zum Beispiel

♂ männlich

♀ weiblich

V

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. 1

Abb. 2

Verteilung Tumorhistologie

Verteilung PMR-Werte im Plasma Prä-OP / T-Stadium

23

26

Abb. 3

Abb. 4

Verteilung PMR-Werte in Bronchiallavage Prä-OP / T-Stadium

Verlauf PMR-Werte follow-up (Pat: 5; 11; 14; 16; 17; 24) im

Plasma

26

31

Tab. 1 TNM Klassifikation nach UICC (7.Auflage) 3

Tab. 2 UICC-Stadien (7. Auflage) 4

Tab. 3 Geschlechtsverteilung 21

Tab. 4 Altersstatistik 21

Tab. 5 Altersverteilung 22

Tab. 6 Raucherstatus 22

Tab. 7 Tumorhistologie 23

Tab. 8 Korrelation T-Stadium / PMR-Werte Gewebe, Lavage, Plasma 25

Tab. 9 Tumorgröße (T) 25

Tab. 10 Lymphknotenstatus (N) 27

Tab. 11 Fernmetastasen (M) 27

Tab. 12 Tumorstadium 28

Tab. 13 Vergleich %-Methylierung prä- / postoperativ im Blutplasma 29

Tab. 14 follow-up PMR-Werte im Blutplasma 31

Tab. 15 Verteilung PMR-Werte Gewebe / Lavage / Plasma 32

Tab. 16 Übersicht PMR Werte in einzelnen Subgruppen (Median + SD) 33

Tab. 17 Korrelationen Gewebe / Lavage / Plasma nach Spearman 33

Tab. 18 PMR-Werte Gewebe / Lavage / Plasma 34

Tab. 19 Korrelation Plasma / Lavage / Vaskularisierung 35

Tab. 20 Korrelation Plasma / Neutrophile Granulozyten 35

1

1 Einleitung

1.1 Das Lungenkarzinom

1.1.1 Epidemiologie und Ätiologie

Das Lungenkarzinom ist weltweit das am häufigsten zum Tode führende Karzinom

beim Mann und das 4. häufigste bei der Frau und insgesamt verantwortlich für 18%

aller karzinombedingten Todesfälle.1,2

Während sich bei den anderen häufigen Karzinomarten wie Mamma- oder

Kolonkarzinom die Überlebenswahrscheinlichkeit in den letzten Jahren verbessert hat,

liegt das 5-Jahres-Überleben beim Lungenkarzinom immer noch bei unter 20%.3

Dies liegt vor allem daran, dass Patienten mit einem Lungenkarzinom nur in 16% der

Fälle zu einem Zeitpunkt diagnostiziert werden, in dem der Tumor noch lokal begrenzt

und damit eine kurative Therapie möglich ist.4

Die Hauptursache für das Entstehen eines Lungenkarzinoms ist inhalativer

Tabakkonsum.5 80% aller Patienten mit Lungenkarzinom sind Raucher und bis zu 20%

aller Raucher entwickeln im Laufe ihres Lebens ein Lungenkarzinom.2 Es ist davon

auszugehen, dass Langzeitraucher ein 10-30fach höheres Risiko haben, an einem

Lungenkarzinom zu erkranken als Nichtraucher.6

So steigt das Risiko proportional zu der Menge an täglich gerauchten Zigaretten, der

Dauer und dem Alter bei Beginn des Konsums, der Menge an in den Zigaretten

enthaltenem Teer und Nikotin, sowie Dauer und Tiefe der Inhalation.7,8 Hierbei muss

die Zigarette noch nicht einmal selbst konsumiert werden, denn auch Passivrauchen

erhöht nachweislich das Karzinomrisiko.9

Weitere wichtige Karzinogene sind eine berufsbedingte Arsenexposition

(Metallverarbeitung, Bergbau) und der Umgang mit Asbest (Zementherstellung,

Baugewerbe). Besonders gefährlich ist hierbei die parallele Exposition von Asbest und

Zigarettenkonsum. Man schätzt, dass sich durch diese Kombination das relative Risiko

an einem Lungenkarzinom zu erkranken gegenüber einem Nicht-Exponierten um bis

zu 60-fach erhöht.

2

1.1.2 Histologische Einteilung

Die WHO unterteilt das Lungenkarzinom in Kleinzellige- (SCLC) und Nichtkleinzellige

Karzinome (NSCLC). Letztere beinhalten das Plattenepithel-, Adeno- sowie das

Großzellige Karzinom.

Weitere seltenere Karzinome sind adenosqamöse Mischtumoren, das sarkomatoide

Karzinom sowie das neuroendokrine Karzinom (NEC).

1.1.3 Diagnostik

Ergibt sich bei der klinischen Untersuchung und Anamnese oder einer

Röntgenaufnahme des Thorax (Strahlengang p.a. und seitlich) des Patienten der

Verdacht auf ein Lungenkarzinom empfiehlt die aktuelle S3-Leitlinie die initiale

Durchführung einer weitergehenden Diagnostik mit kontrastmittelverstärkter CT-

Untersuchung des Thorax und eine Bronchoskopie. Bei verdächtigen

Läsionen/Lymphknoten schließt sich eine Biopsie an, welche lageabhängig entweder

endobronchial im Rahmen der Bronchoskopie oder transthorakal, ggf. jeweils unter

Zuhilfenahme von Ultraschall zur besseren Lokalisation, durchgeführt wird.10 Die

gewonnenen Biopsien werden anschließend vom Pathologen zytologisch bzw.

histologisch untersucht.

Bei Bestätigung des Karzinoms folgen weitere Staginguntersuchungen. Hierzu zählen

Sonographie und Computertomographie des Abdomens sowie des Schädels. Ergänzt

werden diese durch nuklearmedizinische Untersuchungen wie Szintigraphie oder

Positronenemissionstomographie (PET) zur Metastasensuche und

Lymphknotenbeurteilung.

1.1.4 Stadieneinteilung

Nach erfolgtem Staging wird das Karzinom nach der TNM-Klassifikation der WHO

(Tab.1) eingeteilt und einem UICC-Stadium (Tab.2) zugeteilt. Hierbei sind maßgeblich

die Tumorgröße sowie -Lokalisation (T), der Lymphknotenstatus (N) und die

Fernmetastasierung (M).

3

Tab. 1 - TNM Klassifikation nach UICC (7. Auflage)

T1a Tumor ≤ 2cm in größter Ausdehnung

T1b Tumor > 2cm, aber ≤ 3cm in größter Ausdehnung

T2 Tumor > 3cm, aber ≤ 7cm oder Tumor mit Invasion des Hauptbronchus, > 2cm

distal der Hauptcarina, Invasion der viszeralen Pleura, oder

Atelektase/obstruktive Pneumonitis von weniger als einer ganzen Lunge

T2a Tumor > 3cm, aber ≤ 5cm in größter Ausdehnung

T2b Tumor > 5cm, aber ≤ 7cm in größter Ausdehnung

T3 Tumor > 7cm oder direkte Invasion von Brustwand, Diaphragma, N. phrenicus,

mediastinaler Pleura, parietalem Perikard, oder Tumor im Hauptbronchus < 2cm

von der Hauptcarina entfernt oder Atelektase/obstruktive Pneumonitis einer

ganzen Lunge oder separate/r Tumorknoten im gleichen Lungenlappen

T4 Tumor jeder Größe mit Invasion von Mediastinum, Herz, großen Gefäßen,

Trachea, N. laryngeus linksseitig, Ösophagus, Wirbelkörper, Hauptcarina oder

separater Tumorknoten in einem ipsilateralen separaten Lungenlappen

M Fernmetastasen

M1a Separate/r Tumorknoten in einem kontralateralen Lungenlappen; Tumor mit

Pleuraknoten oder maligner Pleura- / Perikarderguss

M1b Fernmetastasen

N Regionale Lymphknoten

N1 Metastasen in ipsilateralen peribronchialen und/oder hilären Lymphknoten

N2 Metastasen in ipsilateralen mediastinalen Lymphknoten und/oder ipsilateralen

subcarinalen Lymphknoten

N3 Metastasen in kontralateralen mediastinalen Lymphknoten von paratracheal bis

Lig. subpulmonale oder in kontralateralen hilären Lymphknoten oder in ipsi- /

kontralateralen Skalenus- oder subklavikulären Lymphknoten

4

Stadium Tumorgröße Lymphknoten-

status

Fernmetastasen

Okkultes Karzinom Tx N0 M0

Stadium 0 Tis N0 M0

Stadium IA T1a

T1b

N0

N0

M0

M0

Stadium IB T2a N0 M0

Stadium IIA T1a

T1b

T2a

T2b

N1

N1

N1

N0

M0

M0

M0

M0

Stadium IIB T2b

T3

T3 (gleicher Lappen)

N1

N0

N0

M0

M0

M0

Stadium IIIA T1

T2

T3

T3

T3 (gleicher Lappen)

T3 (gleicher Lappen)

T4 Ausdehnung

T4 Ausdehnung

T4 Herd ipsilateral

T4 Herd ipsilateral

N2

N2

N1

N2

N1

N2

N0

N1

N0

N1

M0

M0

M0

M0

M0

M0

M0

M0

M0

M0

Stadium IIIB T4 Ausdehnung

T4 Herd ipsilateral

Jedes T4

N2

N2

N3

M0

M0

M0

Stadium IV

Jedes T

Jedes T

Jedes N

Jedes N

M1a (mal. Pleura-

/Perikarderguss od.

kontralat. Metastase)

M1b (Fernmetastase)

Tab. 2 - UICC – Stadien (7.Auflage)

5

1.1.5 Symptome

Etwa 90% der Patienten mit Lungenkarzinom zeigen – oft unspezifische - klinische

Symptome wie Husten, Dyspnoe, Brustschmerzen, sowie die klassischen B-Symptome

Gewichtsverlust, Nachtschweiß und Fieber. Ebenso sind paraneoplastische Symptome

oder das komplette Ausbleiben von Symptomen zu beobachten.11 Insgesamt ist die

Ausprägung der Symptome stark von der Lage, der Größe und dem Stadium des

Tumors bzw. dessen Metastasen abhängig.12

1.1.6 Screeningmethoden

In einer großangelegten Studie in den Vereinigten Staaten, in die mehr als 50.000

Patienten eingeschlossen wurden, konnte gezeigt werden, dass ein Screening mittels

Low-Dose Computertomographie im Vergleich zur herkömmlichen Röntgendiagnostik

die relative Mortalität in der Testgruppe (d.h. LDCT Patienten) um 20% reduzierte.13 In

diese Untersuchungen wurden Hochrisikopatienten im Alter von 55 bis 74 Jahren

eingeschlossen, die ein Tabakkonsum von mindestens 30 pack-years aufwiesen bzw.

mit dem Rauchen innerhalb der letzten 15 Jahre aufgehört hatten.

Diese Methode ist zwar in den USA als Screeningverfahren zugelassen, jedoch stehen

die hohen Kosten einer breiten Implementierung in die tägliche Routine entgegen.14

Ein weiteres Problem ist die große Anzahl (>95%) an Falsch-Positiven Ergebnissen im

Screening mit Low-Dose CT, welche weitere teure und invasive Folgeuntersuchungen

wie Bronchoskopie und Biopsie notwendig machen.15

Ein weiterer aktueller Forschungsansatz zur Früherkennung des Lungenkarzinoms

sind molekulare Biomarker.16 Per Definition ist ein Biomarker „eine Eigenschaft, welche

in vitro gemessen oder identifiziert werden kann und hilfreich bei der Prävention,

Diagnose, Prognose, Behandlung und Nachsorge von Krankheiten, sowie deren

Verständnis ist“.17

Unter diese Definition fallen verschiedenste Marker wie Blutparameter, Proteine,

Hormone, Lipide, sowie genetische- und epigenetische DNA-Merkmale.18

Trotz verschiedener Anstrengungen in den letzten Jahren gibt es bisher keinen

zufriedenstellenden Tumormarker zur Früherkennung des Lungenkarzinoms.

6

1.2 Therapie des Nicht-Kleinzelligen-Bronchialkarzinoms (NSCLC)

Bei der Therapie des Lungenkarzinoms wird zwischen den Nicht-Kleinzelligen-

Bronchial-Karzinomen (NSCLC) und den Kleinzelligen Bronchialkarzinomen (SCLC)

unterschieden. Des Weiteren erfolgt die Therapie Stadien bezogen und ist vom Alter

und der Verfassung des Patienten abhängig.

Das therapeutische Arsenal zur Behandlung von Patienten mit einem Lungentumor

beinhaltet eine operative Tumor-/Metastasenresektion, Radiotherapie, Chemotherapie

sowie die Kombination einzelner Verfahren. Die folgenden Abschnitte beruhen auf der

aktuellen S3-Leitlinie zur Therapie des Lungenkarzinoms.10

Darüberhinaus etablieren sich in den letzten Jahren zunehmend sog. targeted

therapies, welche zielgerichtet in das Tumorwachstum eingreifen.

Zu diesen gehören einerseits die monoklonalen Antikörper wie Bevacizumab, die

gegen den VEGF-Rezeptor (Vascular Endothelial Groth Factor) gerichtet sind und so

die Bildung von Tumorgefäßen unterbinden und damit das Tumorwachstum

einschränken.

Auf der anderen Seite sind die spezifischen Tyrosinkinase Inhibitoren wie Gefitinib,

Erlotinib und Nintedanib zu nennen, die ebenfalls zielgerichtet die Signalübertragung

von Wachstumssignalen über die Tyrosinkinase des EGF (Epidermal Growth Factor)

Rezeptors hemmen und auf diese Weise das Tumorwachstum beeinflussen. Eine

weitere zielgerichtete Therapie ist für Lungenkarzinome mit einer spezifischen

Translokation (EML4/ALK oder ROS) zugelassen.

Diese neuen Therapieansätze gewinnen zunehmend, vor allem auf Grund ihres

Überlebensvorteils und des geringeren Nebenwirkungsspektrums, an Bedeutung für

die Therapie des fortgeschrittenen Lungenkarzinoms.10

Ein weiterer aktueller Forschungsschwerpunkt sind Wirkstoffe auf dem Gebiet der

Immuntherapie, welche ebenfalls vielversprechende neue Ansätze zur Therapie des

Lungenkarzinoms liefern (s. 1.2.4).

7

1.2.1 Operation

Für Patienten mit ausreichender Lungenfunktion und ohne limitierende Komorbiditäten,

stellt die Resektion des Tumors die präferierte Therapie dar. Für eine Operation

kommen nach derzeitigen Empfehlungen der S3-Leitlinie nur Patienten bis

einschließlich Stadium IIIA in Frage. Hierbei stellen die Lobektomie bzw. bei

eingeschränkter Lungenfunktion eine parenchymsparende Lungenlappenteilresektion

mit anschließender radikaler Lymphknotendissektion das Verfahren der Wahl dar.19

Das Ziel ist die vollständige Entfernung des Tumors im gesunden Gewebe.

Bei Vorliegen einer R1-Situation, d.h. einer unvollständigen Tumorentfernung, ist eine

Nachresektion zu empfehlen. Bei Vorliegen solitärer Hirn- oder

Nebennierenmetastasen wird deren Resektion empfohlen, sofern es sich um einen

operablen Primärtumor und einen Patienten in gutem Allgemeinzustand handelt.20,21

Bei diesen Patienten mit einem Karzinom im Stadium IV bleibt eine chirurgische

Therapie eine Einzelfallentscheidung.

1.2.2 Radiatio

Auch die Empfehlungen zur Strahlentherapie beim Lungenkarzinom sind Stadien

abhängig. So werden auf Grund von Komorbiditäten oder aus sonstigen Gründe

inoperable Patienten alternativ zur sonst angestrebten Operation (bis einschließlich

Stadium IIIA) mit einer fraktionierten Bestrahlung von >60 Gy z.B. nach dem CHART-

Schema (hyperfraktionierte, akzelerierte Radiotherapie) therapiert.22

Darüberhinaus kommt die Radiatio bei Patienten in höheren Tumorstadien, Stadium

IIIB oder Stadium IV, entweder als alleinige Therapieoption oder in Kombination mit

einer Chemotherapie zur Anwendung.

Eine neoadjuvante Bestrahlung wird in den aktuellen Therapieleitlinien mit Ausnahme

zur Behandlung eines Pancoast-Tumors nicht empfohlen.23,24

1.2.3 Chemotherapie

Die Chemotherapie ist ein weiterer wichtiger Baustein in der Therapie des

Lungenkarzinoms. Während die Operation vornehmlich bei Patienten mit niedrigeren

Stadien Anwendung findet, wird die Chemotherapie heutzutage vor allem in höheren

Tumorstadien bzw. postoperativ als adjuvante Therapie angewendet. Hierbei kommen

verschiedene Therapieschemata zur Anwendung.

Als Grundmedikament werden häufig Platin-haltige Chemotherapeutika eingesetzt,

diese können ggf. mit einem weiteren Chemotherapeutikum wie Pemetrexed oder auch

mit Antikörpern wie Bevacizumab kombiniert werden.

8

1.2.4 Immuntherapie

Ein weiterer Meilenstein in der Behandlung des Lungenkarzinoms zeichnet sich aktuell

im Bereich der Immuntherapie ab.

So konnte gezeigt werden, dass Tumorzellen, mittels programmiertem Zelltod, T-Zellen

in ihrer Umgebung inhibieren und so das Immunsystem im Bereich des Tumors

hemmen können. Diesen Effekt erreicht die Tumorzelle über den PD-L1 und PD-L2

(PD- Programmed Death) Liganden der T-Zellen.

Neuartige Checkpoint-Inhibitoren inhibieren diesen Mechanismus und ermöglichen so

dem körpereigenen Immunsystem effektiver gegen den Tumor vorzugehen.

So zeigte eine aktuelle Vergleichsstudie zwischen dem neuen PD-L1 Checkpoint

Inhibitor Nivolumab und der klassischen Platin-basierten Chemotherapie bei Patienten

mit metastasiertem NSCLC einen signifikanten Überlebensvorteil von 3,2 Monaten bei

Plattenepithelkarzinomen (HR: 0,59; KI: 0,44-0,79; p: .00025) und bei Nicht-

Plattenepithelkarzinomen von 2,8 Monaten (HR: 0,73; KI: 0,59-0,89; p: .0015).25,26

Diese und weitere Substanzen wie Pembrolizumab sind aktuell in der Erforschung und

teilweise für einzelne Subgruppen bereits zur Therapie zugelassen.27

1.3 Therapie des Kleinzelligen-Bronchialkarzinoms (SCLC)

Die Therapieoptionen beim kleinzelligen Bronchialkarzinom sind denen beim Nicht-

Kleinzelligen Karzinom sehr ähnlich. Der Hauptunterschied besteht in der Tatsache,

dass bei ca. 70% der Patienten kleinzellige Bronchialkarzinome erst im Extensive-

Disease-Stadium diagnostiziert werden und daher auf Grund der Inoperabiliät palliativ

mittels Polychemotherapie und Radiatio behandelt werden. Bei Patienten im Limited-

Disease Stadium besteht die Möglichkeit der kurativen operativen Tumortherapie mit

anschließender adjuvanter Polychemotherapie bzw. Radiatio.

9

1.4 Genetische Alterationen von Lungentumoren

1.4.1 Epigenetik

Die Epigenetik bezeichnet verschiedene DNA-Modifikationen, welche Einfluss auf die

Genexpression haben, ohne die DNA-Sequenz selbst zu verändern.28 Diese führen zu

einer Beeinflussung des Phänotyps, nicht jedoch des Genotyps.29 Zu diesen

Modifikationen zählen die DNA-Methylierung, Histonveränderungen und eine

epigenetisch-basierte Modifikation der Expression kleiner nichtcodierender Mikro-RNA.

Diese DNA-Modifikationen entstehen während der Zelldifferenzierung und können über

mehrere Zellzyklen bestehen bleiben. Ebenso führt das Altern der Zelle und die

Tumorgenese zu epigenetischen Veränderungen. Auf diese Weise ermöglichen diese

Modifikationen den Zellen trotz des gleichen Erbgutes unterschiedlichen Eigenschaften

zu entwickeln.30

1.4.2 Punktmutationen

Bei der Punktmutation kommt es zu Veränderungen eines einzelnen Nukleotids. Diese

Veränderungen können sich entweder durch den Ersatz einer Base durch eine andere

(Substitution) oder durch das Hinzufügen (Insertion) bzw. Entfernen (Deletion) einer

Base äußern.

Wird eine Base durch eine andere ersetzt, bleibt das ursprüngliche Leseraster zwar

erhalten, aber die codierende Sequenz wird verändert.

Ein Beispiel, bei dem Punktmutationen zur Tumorgenese beitragen, ist die

Veränderung der ras-Gene. Hierbei kommt es durch Punktmutationen an den Codons

12, 13 und 61 zu einem veränderten ras-Protein, das die Fähigkeit zur Inaktivierung

verloren hat und so autonom das Zellwachstum und ihre Differenzierung fördert.31

Bei der Substitution werden vier verschiedene Arten unterschieden:

Erstens die sog. Nonsense-Mutation, bei der das neu entstandene Triplet als Stopp-

Codon fungiert oder in ein Stopp-Codon umgewandelt wird.

Zweitens die sog. Read-Through-Mutation, bei der aus einem ursprünglichen Stopp-

Codon eine kodierende Sequenz entsteht.

Als dritte Möglichkeit kann es zu einer Missense-Mutation kommen, wodurch eine

andere Aminosäure codiert wird und so ein fehlerhaftes Protein entsteht.

Als vierte und letzte Möglichkeit kann es zu einer sog. silenten, also stummen

Mutation kommen, bei der die ersetzte Base für die gleiche Aminosäure codiert und es

dadurch zu keiner Veränderung kommt.

10

Bei der Insertion bzw. der Deletion kommt es durch das Hinzufügen/Löschen einer

einzelnen Base zu einer Verschiebung des nachfolgenden Leserasters, dem sog.

Frameshift. Dies führt dazu, dass sämtliche im DNA-Strang folgenden Basentripletts in

dem betroffenen Gen verändert werden. Durch Insertionen bzw. Deletionen kommt es

somit meist zu einem vollständigen Funktionsverlust des zu codierenden Proteins.

1.4.3 Numerische Chromosomenaberrationen

Zu den wichtigsten numerischen Chromosomenaberrationen oder auch

Genommutationen beim Menschen werden die Polyploidie und die Aneuploidie

gezählt.

Polyploidie beschreibt einen Zustand, bei dem der gesamte Chromosomensatz nicht

wie normal diploid sondern triploid oder noch häufiger vorkommt. Meist beruht diese

Veränderung auf einer fehlenden Ausbildung des Spindelapparats während der

Zellteilung. Beim Menschen ist die Polyploidie in der Regel letal.

Ausgelöst durch non-disjunction während der Meiose kommt es bei der Aneuploidie zu

einer Vermehrung bzw. Verminderung einzelner Chromosomen, es entstehen

Monosomien oder Trisomien. Bekanntestes Beispiel hierfür ist die Trisomie 21.

1.4.4 DNA-Methylierung

Die Methylierung von DNA wurde in den 1960er Jahren ursprünglich in

prokaryontischen Zellen entdeckt und 1977 von Razin und Cedar als 5-Methylcytosin

in eukaryontischen Zellen nachgewiesen.32

Seitdem ist die DNA-Methylierung eine der am besten erforschten epigenetischen

Veränderungen. Im Rahmen dieser Forschung zeigte sich, dass die DNA-Methylierung

vor allem eine wichtige Rolle in der zellulären Differenzierung, der X-Chromosom

Inaktivierung und der DNA-Reparatur spielt.33–35

Enzyme aus der Familie der DNA-Methyltransferasen (DNMT) methylieren

Cytosinbasen durch Übertragung einer Methylgruppe von einem S-Adenosylmethionin

an die C5-Stelle des Cytosins zu Methylcytosin.36 Es werden jedoch fast ausschließlich

Cytosine methyliert, die innerhalb eines Cytosin-Guanosin-Komplexes (5’-CpG-3’)

vorliegen.36,37

CpG-Dinukleotide finden sich vermehrt in bestimmten Regionen des DNA-Stranges,

z.B. in Promotorregionen. Diese Ansammlungen von CpG-Dinukleotiden werden dann

als sogenannte CpG-Inseln bezeichnet. In einer gesunden Zelle sind diese CpG-Inseln

in der Regel unmethyliert und ermöglichen so die Transkription beispielsweise der

Housekeeping Gene.38

11

Kommt es jedoch zu einer Hypermethylierung dieser CpG-Inseln, können

Transkriptionsfaktoren nicht mehr binden und es kommt zusätzlich zu einer Anlagerung

sog. Methylierter-CpG-Binding Proteine, welche ihrerseits zu einer Veränderung der

Histone führen. Letztlich kommt es dadurch zu einer Unterdrückung der

Genexpression.

Es konnte nachgewiesen werden, dass es durch Hypermethylierung in nahezu allen

Tumortypen zum Abschalten diverser Gene kommt. Beispiele hierfür sind DNA-

Reparaturgene, Zellzyklus-regulierende Gene, sowie diverse Gene, die einen Einfluss

auf die Signalwege, die Transkription und die Apoptose der Zelle haben.39

Ein Beispiel für ein solches Gen, ist das in dieser Studie untersuchte SHOX2 Gen:

Das Short Stature Homeobox-Gen 2 (SHOX2) gehört zur Familie der Homöobox-Gene

und ist auf dem langen Arm von Chromosom 3 lokalisiert (3q25.32).40

Der Namen der SHOX Familie rührt daher, dass Mutationen innerhalb der SHOX Gene

zu verschiedenen Krankheiten führen können, bei denen Wachstumsretardierungen

eine wesentliche Rolle spielen, wie z.B. beim Turner-Syndrom.41 Das SHOX2-Gen

spielt im Speziellen in der Entwicklung von Skelett und Herz eine Rolle. 42–44

In den letzten Jahren sind von verschiedenen Arbeitsgruppen Veränderungen in der

Methylierung im SHOX2-Gen bei mehreren Tumore wie z.B. dem hepatozellulärem-

und Mammakarzinom nachgewiesen worden.45,46 Insbesondere konnte methylierte

SHOX2 (mSHOX2) DNA bei Patienten mit Lungenkarzinomen nachgewiesen werden

und hier besonders bei Plattenepithelkarzinomen.47

Bei genaueren Untersuchungen stellte sich heraus, dass sich mSHOX2 als Biomarker

für die Diagnose von Lungenkarzinomen eignen könnte.48,49 So konnten Schmidt et al.

2010 zeigen, dass Lungenkarzinome über den quantitativen Nachweis von mSHOX2 in

der Bronchiallavage mit einer Sensitivität von 68% und einer Spezifität von 95%

detektiert werden können.48 In einer Folgestudie von Kneip et al. 2011, in der der

Nachweis von mSHOX2 im Blutplasma untersucht wurde, zeigte der Test eine

Sensitivität von 60% und eine Spezifität von 90% bei der Identifizierung von

Lungenkarzinomen.49 In weiteren Studien wurde untersucht, welchen Benefit die

Kombination einer Messung von mSHOX2 mit Standardmethoden der Tumordiagnostik

bietet. So zeigte sich z.B. durch die zusätzliche Messung von mSHOX2 eine

Verbesserung der Genauigkeit und Verlässlichkeit der Untersuchung mittels EBUS

gewonnener Lymphknotenbiopsien. Ebenso konnte hierdurch die Qualität der

zytologischen Untersuchung von Bronchiallavage gesteigert werden.50,51

12

1.5 Freie zirkulierende Nucleinsäuren (CNA)

Circulating Nucleic Acids (CNA) also freie (= extrazelluläre) zirkulierende

Nukleinsäuren beschreiben DNA, RNA oder Mikro-RNA, welche frei im Plasma/Serum

zirkulieren. Entdeckt wurden die CNAs 1948 von Mandel und Métais, die nachwiesen,

dass CNAs sowohl bei gesunden als auch bei kranken Menschen vorkommen.52

Zirkulierende Nukleinsäuren gerieten nach ihrer frühen Entdeckung zunächst schnell in

Vergessenheit, und wurden erst in den 1960er Jahren im Zusammenhang mit

Forschungen zu Lupus Erythematodes wieder neu entdeckt.53

1989 zeigte eine Arbeitsgruppe um Stroun et al., dass Veränderungen in den CNAs bei

vielen Tumorerkrankungen nachgewiesen werden können.54 Die Herkunft der

zirkulierenden DNA aus den Tumorzellen konnte schließlich mit dem Nachweis von

Tumor-assoziierten Veränderungen des N-ras Genes bei Patienten mit AML oder

Myelodysplastischem Syndrom durch Vasioukhin et al. bewiesen werden.55

Mit der Möglichkeit des Nachweises von Tumor-assoziierten Alterationen im

Plasma/Serum rückten CNAs 1996 durch die Arbeiten von Chen et al. sowie Nawroz et

al. zur Detektion und Charakterisierung von Tumoren ins Interesse der Forschung.56,57

Heute kennt man diverse Tumor-assoziierte Veränderungen der CNAs wie z.B.

Mutationen im Bereich von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen (Kras, p53).58–60

Darüberhinaus konnten CNAs bei vielen Karzinomen wie Mamma-, Lungen- und

Kolonkarzinom im Plasma/Serum nachgewiesen werden.61–63

Diese Untersuchungen von CNAs werden heutzutage zusammen mit den

zirkulierenden Tumorzellen unter dem Begriff der „Liquid Biopsy“ zusammengefasst.

Diese neue Entwicklung ist aktuell Gegenstand intensiver Forschung und soll in

Zukunft eine genauere Diagnostik und ein besseres Monitoring von Tumoren

ermöglichen.64,65

In den letzten Jahren konnte auch gezeigt werden, dass im Plasma/Serum freie Virus

DNA zirkuliert und deren Menge mit Remission und Rezidiven korreliert. Beispiele

hierfür sind der quantitative Nachweis der Ebstein-Barr-Virus DNA (EBV-DNA) beim

Larynx-/Pharynxkarzinom und des Humanen-Papilloma-Virus (HPV-DNA) beim

Zervixkarzinom.66,67

13

2 Zielstellung

Ziel der vorliegenden Studie war es, den Methylierungsmarker mSHOX2 im Hinblick

auf seine Eignung als Tumor- bzw. Verlaufsmarker bei Patienten mit einem

Lungenkarzinom im frühen Stadium genauer zu untersuchen. Dies geschah mit

besonderem Augenmerk auf die Veränderung der Werte nach operativer

Tumortherapie. Weiter sollte geklärt werden, ob sich mSHOX2 in verschiedenen

Probenarten nachweisen lässt und inwieweit die erhaltenen Werte zwischen den

einzelnen Probenarten korrelieren.

Diese Untersuchung ist von besonderem Interesse, da der Marker mSHOX2 bereits in

einer Pilotstudie seine Qualität als Verlaufsparameter im Therapiemonitoring bei

Radiochemotherapie des fortgeschrittenen Lungenkarzinoms bewiesen hat.68

Prospektiv soll diese Untersuchung ihren Beitrag zur Erweiterung der

Früherkennungsmethoden und Verlaufsbeurteilung des Lungenkarzinoms leisten, vor

dem Hintergrund, dass trotz intensiver Forschung diesbezüglich bisher noch kein

signifikanter Fortschritt gelungen ist.

Um dies zu erreichen wurden über einen Zeitraum von 2 Jahren bei 28 Patienten

Daten erhoben mit dem Ziel folgende Fragen zu beantworten:

1.) Wie verhält sich der Methylierungsmarker mSHOX2 prä-/postoperativ?

2.) Wie verhält sich die Menge an mSHOX2 in den unterschiedlichen Probenarten

(Blut/Lavage/Gewebe) eines Patienten?

3.) Eignet sich mSHOX2 als möglicher Tumor-/Rezidivmarker bei Patienten mit

einem Lungenkarzinom?

14

3 Material und Methoden

3.1 Patienten

In die Untersuchungen wurden 28 Patienten mit einem nachgewiesenen

Lungenkarzinom im Tumorstadium I-IIIA69 einbezogen, die sich zur Therapie im

Krankenhaus Maria-Martha in Halle-Dölau (Chefarzt: Prof. Dr. W. Schütte) vorstellten.

Die Volljährigkeit wurde überprüft und eine schriftliche Einwilligungserklärung

eingeholt.

Die Aufklärung der Patienten und die Vorstellung der Studie wurden bei stationärer

Aufnahme durch den behandelnden Arzt durchgeführt.

Das Studienprotokoll wurde der Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der

Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg vorgelegt, es bestanden keine Einwände

gegen die Durchführung des Projektes (Votum-Nummer: 2012-72 vom 20.08.2012).

3.2 Probengewinnnung

3.2.1 Blutproben

Im Rahmen der standardmäßig durchgeführten Blutentnahmen vor der Tumorresektion

wurden zusätzlich jeweils 2 x 10 mL EDTA Blut zur Plasmagewinnung entnommen.

Weitere Blutentnahmen fanden vor Entlassung und bei den follow-up Untersuchung

statt, die postoperativ in der Regel alle 6 Monate durchgeführt werden sollen.

Die Proben wurden am Tag der Abnahme aufgearbeitet. Dazu wurden die

Abnahmeröhrchen für 10 min bei 4°C und 350 xg zentrifugiert. Anschließend wurde der

Plasmaüberstand vorsichtig abgenommen und in einem neuen Probenröhrchen erneut

bei 2900 xg für weitere 15 min zentrifugiert. Die zellfreien Plasmen wurden in Aliquots

von ca. 3 mL aufgeteilt und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.

3.2.2 Bronchiallavage

Im Rahmen der diagnostischen Abklärung wurde bei Aufnahme der Patienten in der

Regel eine Bronchoskopie durchgeführt. Von der gewonnenen Bronchiallavage wurde

uns ein Aliquot für die molekularen Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Die

Bronchiallavage wurde für 15 min bei 2900 xg zentrifugiert und der Überstand durch

Zusatz von Saccomanno Reagenz fixiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

Das gewonnene Zellpellet wurde bei -80 °C gelagert.

15

3.2.3 Tumorgewebe

Von denen im Rahmen der Operation gewonnenen Tumorgewebeproben wurden,

sofern genügend Material für weitergehende klinische Fragen vorhanden war, durch

den bearbeitenden Pathologen 1-3 Schnitte (abhängig von deren Zellularität) zu je 10

μm angefertigt. In diesen wurde dann zur Erhöhung der Tumorzellzahl in der

untersuchten Probe mikroskopisch die vorhandenen Tumorareale markiert,

anschließend makroskopisch ausgeschnitten und in 2 mL Reaktionsgefäßen gelagert.

Alle Proben wurden nach Entnahme durch die behandelnden Ärzte im Krankenhaus

Martha-Maria durch fortlaufende Nummern pseudonymisiert, sodass die Zuordnung

von Proben mit Patientendaten nur den behandelnden Ärzten möglich ist.

3.3 DNA Isolation

Sämtliche gewonnenen Untersuchungsproben wurden nach den unten erläuterten

Verfahren aufgearbeitet. Hierzu zählen die DNA-Extraktion aus den unterschiedlichen

Ausgangsmaterialien, die Bisulfitumwandlung und das abschließende Messen des

Methylierungsgrades mittels Real-Time PCR.

Der Zwischenschritt der Bisulfitbehandlung ist notwendig, da sich Methylcytosin und

unmethyliertes Cytosin auf Grund gleicher Basenpaarungseigenschaften, bei

Verfahren, die auf Hybridisierung basieren, nicht voneinander unterscheiden.

Im Rahmen der Bisulfitkonversion der DNA werden unmethylierte Cytosine zu Uracil

desaminiert, während Methyl- und Hydroxymethylcytosin unverändert bleiben.

Auf diese Weise werden die durch das spezifische Methylierungsmuster vermittelten

epigenetischen Informationen in eine DNA-Sequenzinformation umgewandelt und so

durch Standardmethoden wie eine PCR messbar gemacht.

3.3.1 DNA Isolation aus Blutplasma

Die eingefrorenen Plasmaproben wurden bei 37°C für 45 min im Brutschrank aufgetaut

und anschließend mit 3,5 mL des Silane Lysis/Binding Puffers versetzt (Life

Technologies, viral NA). Anschließend wurden die Proben bei Raumtemperatur für 10

min inkubiert. Plasmaproben mit einem kleineren Volumen wurden vor Zugabe des

Lyse/Bindungspuffers mit destilliertem Wasser auf 3,5 mL aufgefüllt.

Zu der lysierten (s.o.) Lösung wurden anschließend 75 μl frisch resuspendierte

Dynabeads® Silane (Life Technologies, Art-Nr. 37005D) sowie 2,5 mL absoluter

Ethanol zugegeben und für 45 min bei 20 rpm bei Raumtemperatur auf einem Rotator

(Winkel ca. 45°) gemischt.

16

Das Zentrifugationsröhrchen wurde für 5 min in den DynaMag™-15 Magneten (Life

Technologies, Art-Nr. 123-01D) gestellt und der Überstand vorsichtig mit einer 15,5 cm

Transferpipette abpipettiert und verworfen. Darauf folgte eine Waschung der Partikel

mit 1,5 mL Waschpuffer 1 (50% (v/v) Silane Lysis/Binding Puffer, 50% (v/v) Ethanol.

Die Lösung mit den resuspendierten Magnetpartikeln wurde in ein 2 mL

Reaktionsgefäß überführt. Unter Benutzung des DynaMag™-2 Magneten (Life

Technologies, Art-Nr. 123-21D) und einer 1 mL Pipette wurde möglichst viel vom

Überstand abpipettiert. Nach kurzem Zentrifugieren wurde dieser Schritt wiederholt.

Zur Elution der DNA wurden 100 μl Elutionspuffer (1% (v/v) 1 M Tris, pH 8,0, 99% (v/v)

dest. Wasser) hinzugegeben und die Suspension bei 85°C und 1000 rpm für 10 min im

Thermomixer inkubiert. Nach kurzem Abzentrifugieren wurde nun der gesamte

Überstand mit der darin enthaltenen DNA in ein neues Reaktionsgefäß überführt und

das Reaktionsgefäß mit den Magnetpartikeln verworfen.

Die extrahierte DNA ist max. 24 h bei 8°C im Kühlschrank lagerbar.

3.3.2 DNA Isolation aus Bronchiallavagezellen

Die Bronchiallavageproben wurden mit dem InnuCONVERT Bisulfit Conversion All in

One-Kit der Firma Analytik Jena AG entsprechend mitgeliefertem Protokoll

aufgearbeitet.

Um die Lavageproben für die weitere Untersuchung vorzubereiten, mussten die

Proben aufgereinigt werden. Hierzu wurden zur Reduzierung der vorhandenen Muzine

10 mL Bronchiallavage in einem 15 mL Falconröhrchen abgefüllt und mit 50 μL DTT

(Dithiothreitol) mittels Vortexen vermischt.

Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lavage bei 3500 rpm für 15

min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen.

Das gewonnene Zellpellet wurde in 5 mL PBS gelöst und erneut bei 3500 rpm

zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde mit 1 mL PBS wiederholt und das gewonnene

Pellet anschließend mit 190 μL Lysepuffer und 15μL Proteinase K vermischt.

Schließlich wurde die Lösung bei 60° C und 800 rpm für 3 Stunden im Thermomixer

inkubiert.

17

3.3.3 DNA Isolation aus Tumorgewebe

Die Tumorgewebsproben wurden mit dem InnuCONVERT Bisulfit Conversion All in

One-Kit der Firma Analytik Jena AG entsprechend beiliegendem Protokoll

aufgearbeitet.

Die in 2 mL Reaktionsgefäßen gelagerten Schnitte wurden bei maximaler

Geschwindigkeit für 1 min herunterzentrifugiert und mit 190 μL Lysepuffer und 15 μL

Proteinase K vermischt. Die Proben wurden anschließend bei 60° C und 800 rpm für 3

Stunden im Thermomixer inkubiert.

Anschließend erfolgte die u.g. Bisulfitbehandlung.

3.4 Bisulfitbehandlung

3.4.1 Bisulfitbehandlung und Aufreinigung der Blutplasmaproben

Für die notwendige Bisulfitumwandlung wurden zu der DNA im 2 mL Reaktionsgefäß

150 μl Bisulfitreagenz und 25 μL Denaturierungspuffer hinzugegeben. Nach gutem

Mischen und kurzer Zentrifugation zur Vermeidung von Tröpfchenbildung am Deckel

wurde das Reaktionsgemisch für 45 min bei 85°C im Wasserbad inkubiert. Bei diesem

Schritt ist die genaue Zeit- und Temperatureinhaltung wichtig. Im Anschluss erfolgte

die sofortige Aufreinigung der Proben.

Hierzu wurden in das Reaktionsgefäß 1000 μL Waschpuffer 1 (50% (v/v) Silane

Lysis/Binding Puffer, 50% (v/v) Ethanol, und 15 μL frisch resuspendierte Dynabeads®

Silane hinzugegeben und bei 23° C und 1000 rpm für 45 min im Thermomixer

gemischt.

Unter Zuhilfenahme eines DynaMag™-2 Magneten und einer 1 mL Pipette wurde der

Überstand entfernt und die Magnetpartikel anschließend erneut mit 800 μL

Waschpuffer (50% (v/v) Silane Lysis/Binding Puffer, 50% (v/v) Ethanol) gewaschen.

Anschließend erfolgte dreimaliges Waschen der DNA mit jeweils 800 μl, 900 μl und

1000 μl Waschpuffer 2 (15% (v/v), 85% (v/v) Ethanol) und jeweils Entfernen des

Überstandes mittels DynaMag™-2 Magneten und 100-1000 μl Pipette. Dabei war

darauf zu achten, keine Magnetpartikel zu verwerfen.

Nach kurzer Zentrifugation wurde der restliche Überstand mit dem DynaMag™-2

Magneten und einer 2,5-10 μL Pipette entfernt und die Magnetpartikel im offenen

Reaktionsgefäß für 10 min bei 60°C im Thermomixer ohne Schütteln getrocknet.

Zur Elution der DNA wurden 68 μL Elutionspuffer (1% (v/v) 1M Tris, pH 8,0, 99% (v/v)

dest. Wasser) hinzugegeben und nach gründlichem Mischen bei 85°C und 1000 rpm

für 10 min inkubiert.Abschließend wurde der Überstand mit der enthaltenen gereinigten

DNA mit Hilfe des DynaMag™-2 Magneten und einer Pipette in neues Reaktionsgefäß

transferiert und war nach diesem Schritt bereit für die PCR-Messung.

18

3.4.2 Bisulfitbehandlung und Aufreinigung der Bronchiallavage- und

Gewebeproben

Die Bisulfitbehandlung der Lavage- und Tumorgewebeproben erfolgte nach dem

gleichen Protokoll.

Hierzu wurde ein Reaktionsansatz aus 50 μL der oben beschriebenen extrahierten

DNA 70 μL Konversionsreagenz und 30 μL Konversionspuffer hergestellt. Dieser

Ansatz wurde dann bei 85°C für 45 min inkubiert.

In diesem Schritt war darauf zu achten, dass eventuelle Tröpfchen am Deckel des

Reaktionsgefäßes vor Beginn der Inkubation herunterzentrifugiert wurden. Für die

Inkubation war die Einhaltung der Zeit und der genauen Temperatur essentiell.

Es folgte die zeitnahe Desulfonierung und Aufreinigung.

Hierzu wurde die konvertierte DNA in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt und mit

700 μL Bindepuffer vermischt. Anschließend wurde das Gemisch auf die in einem

Receiver Tube platzierte Spinnsäule geladen (im Kit enthalten) und für 3 min bei 14000

xg zentrifugiert. Nach Wechseln des Receiver Tubes wurden 200 μl Waschlösung auf

die Spinnsäule gegeben und erneut für 1min bei 14000 xg zentrifugiert.

Für die Desulfonierung wurden 700 μL Desulfonation Buffer auf die Spinnsäule

gegeben, für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und abschließend für 1min bei

14000 xg zentrifugiert. Nach erneutem Wechsel des Receiver Tubes wurde die DNA

zweimalig mit je 400 μL Washing Solution und Zentrifugation für je 1min bei 14000 xg

gewaschen. Um eventuellen Restalkohol im Filter zu entfernen wurde das

Reaktionsgefäß vor der Elution nochmals für 3 min bei 14000 xg zentrifugiert.

Sodann wurde die Spinnsäule in ein Elution Tube platziert, wobei das Übertragen von

Waschpufferesten unbedingt zu vermeiden war. Die Säulen wurden für 10 min bei

60°C im Thermomixer getrocknet.

Zur Elution der DNA wurde 50 μL Elution Buffer auf die Mitte der Membran gegeben, 1

min inkubiert und abschließend bei 8000 xg für 1 min zentrifugiert. Dieser letzte Schritt

kann zur Erhöhung der Gesamtausbeute ggf. mit 50 μL Elution Buffer wiederholt

werden. Die gewonnen DNA war nun bereit für die PCR-Untersuchung.

19

3.5 PCR-Untersuchung

Für die PCR-Untersuchung wurde ein Methylierungs-spezifischer Heavy-Methyl Assay

für die quantitative Bestimmung von methyliertem SHOX2 in einem Duplexformat-

verwendet. Dabei werden die Menge an mSHOX2 und beta-Actin DNA (letzteres als

Referenzgen) parallel gemessen. Verwendet wurde hierzu das Protokoll nach Dietrich

et al.70

Jeweils 10 μL der vorbereiteten DNA-Proben sowie 10 μL des Mastermixes bestehend

aus jeweils 6 mM MgCl2, 35 mM Tris (aus 1 M Tris pH 8,4), 50 mM KCl, 5% Glycerol,

0,006 μl ROX wurden in einem Reaktionsgefäß vermischt.

Dieser Mischung wurden 0,5 μL dNTP/dUTP-Mix (10 mM dATP,10 mM dCTP, 10 mM

dGTP, 20 mM dUTP) der Firma Bioline (Best-Nr.: BIO-39041; Bioline USA Inc,

Taunton, MA, USA), 0,4 μl FastStart™ Taq Polymerase der Firma Roche (Best-Nr.:

4738420001; Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Deutschland) und

1,6 μL gereinigtes Wasser der Firma Sigma-Aldrich (Best-Nr.: W4502-6X1L; Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO, USA) zugegeben. Jede Probe wurde in vier Replikaten

gemessen, um eine hohe Validität der Messung zu gewährleisten. Von der Kontroll-

DNA (= Kalibrator) und Negativkontrollen (Wasser oder NTC _ no template control)

wurden jeweils Triplikate gemessen.

Die Kalibratorprobe wurde ebenfalls nach dem Protokoll von Dietrich et al. hergestellt:

Hierzu wurde 80 μL methylierte DNA (100 ng/mL, CpGenome Universal Methylated

DNA, Millipore, Billerica, MA) mit 80 μL Bisulfit- [65% ammonium bisulfite, pH 5.3 (TIB

Chemicals, Mannheim, Germany)] und 40 μl Denaturierungsreagenz [0.07 g/mL Trolox

(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) in THFA (VWR International, Darmstadt, Germany)]

vermischt und anschließend für 45min bei 85°C und 1000rpm im Thermomixer

inkubiert.71

Durchgeführt wurden die Messungen an einem Applied Biosystem™ 7500 Real-Time

PCR System der Firma Life Technologies (Life Techologies™, Forster City, CA, USA),

mit folgendem Temperaturprofil:

Nach initialer Denaturierung bei 95°C für 20 min folgten 50 Zyklen mit jeweils 2 sec bei

62°C, 45 sec bei 56°C und 15 sec bei 95°C. Für die quantitative Bestimmung des

methylierten SHOX2 verwendeten wir die CT-Methode.72

Hierzu wurde ermittelt wie viele PCR-Zyklen benötigt werden, um ein signifikant

erhöhtes Fluoreszenzsignal des methylierungsspezifischen Assays über dem

Hintergrundsignal zu erhalten.

20

Der Punkt, an dem erstmals ein Signal über dem Hintergrundsignal detektiert wird, wird

als Cycle-Threshold (Ct) bezeichnet und gilt als Maß für die Anzahl der Zielmoleküle zu

Beginn der Reaktion.Anschließend wird eine Differenz (Ct) aus den CT-Werten der

methylierungsspezifischen SHOX2-PCR und der methylierungsunspezifischen

Referenz-PCR, hier Beta-Actin, aus dem Duplex-Assay der gleichen Probe

berechnet.Die erhaltene Zahl stellt einen quantitativen Wert der Methylierung des

SHOX2 Genlocus dar. Abschließend erfolgte die Kalibrierung.

Die aus dieser Kalibrator-DNA gewonnenen Ct-Werte wurden zur Kalibrierung der

Ct-Werte der Patientenproben verwendet. Als Ergebnis erhält man den kalibrierten

Ct-Wert der Patientenprobe, der auch als PMR-Wert (=percent methylation ratio)

bezeichnet wird und ein Maß für die relative Menge an mSHOX2-Gen im Vergleich

zum Referenzgen Beta-Actin darstellt.

3.7 Bestimmung der Vaskularisierung im Tumorgewebe

Für den Nachweis eines möglichen Zusammenhangs zwischen einer erhöhten

Tumorvaskularisierung und hohen PMR-Werten im Blutplasma wurde der Grad der

Vaskularisierung für jeden Tumor durch einen erfahrenen Pathologen bestimmt.

Hierfür wurden die Tumorschnitte mit einem Monoklonalen Maus Anti-Human

CD31 Antikörper (Dako, High Wycombie, UK) inkubiert, der Endothelzellen markiert

und damit Untersuchungen zur Gefäßversorgung in normalem und Tumorgewebe

ermöglicht. Dabei wurde die Zahl der Gefäße in je 10 high power field Gesichtsfeldern

gezählt. 73

3.8 Statistische Berechnungen

Die Statistischen Berechnungen wurden mit SPSS 21 der Firma IBM (Armonk, NY)

durchgeführt. Als Signifikanzniveau für die Berechnung der Korrelationen wurde ein

Standardfehler von 0,05 angesetzt.

Für die Untersuchung der Korrelation unter den verschiedenen Probenarten wurde der

Korrelationskoeffizient nach Spearman-Rho errechnet. Bei der weiteren genaueren

Analyse hinsichtlich der einzelnen Histologie-Subtypen, sowie der Tumorstadien

wurden die nicht-parametrischen Tests nach Kruskal-Wallis und Mann-Whitney

verwendet. Des Weiteren erfolgte eine deskriptive Statistik der erhobenen

Patientendaten, der untersuchten Tumore sowie der gemessenen PMR-Werte.

21

4 Ergebnisse

4.1 Demographische und klinische Daten

Die 28 Patienten, die nach den oben genannten Kriterien in die Studie eingeschlossen

wurden (s. 3.1), wiesen folgende Charakteristika auf

4.1.1 Geschlechtsverteilung

Die Geschlechterverteilung zeigte mit 78,6% eine deutliche Mehrheit der männlichen

Probanden im Vergleich zu den weiblichen Probanden mit 21,4% (s. Tab. 3).

Tab. 3 - Geschlechtsverteilung

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte Prozente

Männlich 22 78,6 78,6 78,6

Weiblich 6 21,4 21,4 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

4.1.2 Alter

Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 72 Jahre. Dabei war der jüngste Patient

53 Jahre und der älteste Patient 84 Jahre alt.

Die Altersverteilung zeigt, dass 2/3 der eingeschlossenen Patienten zwischen 65 und

79 Jahre alt waren (s. Tab. 4+5).

Tab. 4 - Altersstatistik

N Gültig 28

Fehlend 0

Mittelwert 72,32

Standardabweichung 7,124

Minimum 53

Maximum 84

Perzentile

20 66,60

40 72,60

60 76,00

80 78,00

22

Tab. 5 - Altersverteilung

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte

Prozente

Gültig

53 1 3,6 3,6 3,6

59 1 3,6 3,6 7,1

60 1 3,6 3,6 10,7

63 1 3,6 3,6 14,3

65 1 3,6 3,6 17,9

67 1 3,6 3,6 21,4

68 1 3,6 3,6 25,0

70 2 7,1 7,1 32,1

71 1 3,6 3,6 35,7

72 1 3,6 3,6 39,3

73 1 3,6 3,6 42,9

74 2 7,1 7,1 50,0

75 2 7,1 7,1 57,1

76 4 14,3 14,3 71,4

77 2 7,1 7,1 78,6

78 2 7,1 7,1 85,7

79 2 7,1 7,1 92,9

80 1 3,6 3,6 96,4

84 1 3,6 3,6 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

4.1.3 Raucherstatus

Bei 71,4% der Patienten konnte im Rahmen der Anamnese ein Tabakkonsum erhoben

werden. Insgesamt gaben 39,3% der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung an

Ex-Raucher zu sein, während 32,1% der Patienten nach eigenen Angaben nie

geraucht haben (s. Tab. 6).

Tab. 6 - Raucherstatus

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte Prozente

Nicht Raucher 8 28,6 28,6 28,6

Ex-Raucher 11 39,3 39,3 67,9

Raucher 9 32,1 32,1 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

23

4.2 Tumore

4.2.1 Tumorhistologie

Die histologische Untersuchung zeigte, dass alle Patienten an einem Nicht-

Kleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC) erkrankt waren. Dabei handelte es sich bei

53,6% der untersuchten Karzinome um Plattenepithelkarzinome, 32,1% der Patienten

hatten ein Adenokarzinom. Bei 3 Patienten wurden die Karzinome als undifferenzierte-

und bei einem Patienten als ein adenosquamöses Bronchialkarzinom klassifiziert (s.

Abb. 1/ Tab. 7).

Hinsichtlich des Einflusses der Tumorhistologie auf die Höhe der gemessenen PMR-

Werte in den unterschiedlichen Probenarten konnte keine statistische Korrelation nach

Kruskal-Wallis nachgewiesen werden.

Abb. 1 - Verteilung Tumorhistologie

Tab. 7 - Tumorhistologie

Häufigkeit Prozent Kumulierte Prozente

Adenokarzinom 9 32,1 32,1

Plattenepithelkarzinom 15 53,6 85,7

Adenosquamöses Karzinom 1 3,6 89,3

Undifferenziertes Karzinom 3 10,7 100,0

Gesamt 28 100,0

24

4.2.2 Tumorgröße

Etwa die Hälfte der untersuchten Tumore war zum Diagnosezeitpunkt kleiner als 3 cm

und wurde daher als pT1 klassifiziert. Bei diesen insgesamt 13 Patienten mit pT1-

Tumoren wurden in 7 Fällen Tumore der Größe pT1a und in 6 Fällen Tumore der

Größe pT1b festgestellt. Die mit insgesamt 8 Patienten (28,6%) größte Einzelgruppe

wies Tumore der Größe pT2a auf.

Bei drei Patienten wurden Tumore >7 cm nachgewiesen und diese daher einem pT3

Stadium zugeordnet. Bei weiteren 4 Patienten wurden Tumore der Klasse pT4

diagnostiziert (s. Tab. 9).

Es zeigt sich eine signifikante Korrelation zwischen Tumorgröße (T-Stadium TNM) und

den PMR-Werten in Lavage und Blutplasma (Korrelationskoeffizient Lavage: 0,528 p:

0,004; Plasma: 0,501 p: 0,007). Bei den PMR-Werten im Gewebe ist ebenfalls eine

Korrelation zur Tumorgröße erkennbar, die jedoch beim angewandten Standardfehler

nicht signifikant ist (s. Tab. 8 sowie Abb. 2+3).

25

Tab. 8 – Korrelation T-Stadium / PMR-Werte Gewebe, Lavage, Plasma

Geweb

e

Lavage

Prä-OP

Plasma

Prä-OP T-Stadium

Spearman-

Rho

Gewebe

Korrelations

koeffizient 1,000 ,466 ,362 ,365

Sig.

(2-seitig) . ,016 ,069 ,067

N 26 26 26 26

Lavage

Prä-OP

Korrelations

koeffizient ,466 1,000 ,247 ,528

Sig.

(2-seitig) ,016 . ,205 ,004

N 26 28 28 28

Plasma

Prä-OP

Korrelations

koeffizient ,362 ,247 1,000 ,501

Sig.

(2-seitig) ,069 ,205 . ,007

N 26 28 28 28

T-Stadium

Korrelations

koeffizient ,365 ,528 ,501 1,000

Sig.

(2-seitig) ,067 ,004 ,007 .

N 26 28 28 28

Tab. 9 – Tumorgröße (T)

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte

Prozente

pT1a (<2 cm) 7 25,0 25,0 25,0

pT1b (2-3 cm) 6 21,4 21,4 46,4

pT2a (3-5 cm) 8 28,6 28,6 75,0

pT3 (>7 cm) 3 10,7 10,7 85,7

pT4 4 14,3 14,3 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

Deutliche Korrelation zwischen den PMR-Werten von Lavage und Blutplasma mit der Tumorgröße (T-Stadium) (Lavage: 0,53 p=0,004; Plasma: 0,5 p=0,007).

26

Abb. 2 – Verteilung PMR-Werte im Plasma Prä-OP / T-Stadium

Abb. 3 – Verteilung PMR-Werte in Bronchiallavage Prä-OP / T-Stadium

27

4.2.3 Lymphknotenstatus

Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung konnte bei 18 der 28 Patienten (=64,3%) kein

Befall der regionalen Lymphknoten nachgewiesen werden (N0). Bei 6 Patienten

(=21,4%) wurde ein ipsilateraler peribronchialer und/oder hilärer Lymphknotenbefall

diagnostiziert (N1).Bei 4 Patienten (=14,3%) fand sich Befall ipsilateraler subcarinaler-

oder mediastinaler Lymphknoten (N2) (s. Tab. 10).

Bei der Untersuchung des Zusammenhanges zwischen einer

Lymphknotenmetastasierung und der Höhe der PMR-Werte, zeigte sich in den

Lavageproben ein messbarer Zusammenhang. Der durchgeführte Mann-Whitney-Test

ergab hier einen durchschnittlich höheren Rang für Patienten mit N1-/N2-Status als für

solche mit N0 (N0: 12,44; N1/N2: 18,20; p: 0,076).

Tab. 10 - Lymphknotenstatus (N)

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte

Prozente

Gültig

N0 18 64,3 64,3 64,3

N1 6 21,4 21,4 85,7

N2 4 14,3 14,3 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

35,7% zeigten bei Diagnosestellung einen positiven Lymphknotenbefall.

4.2.4 Fernmetastasen

Im Rahmen der präoperativen Diagnostik wurden bei 89,3% der Patienten keine

Fernmetastasen nachgewiesen.

Drei Patienten zeigten zu diesem Zeitpunkt bereits Fernmetastasen (M1), und zwar in

einem Fall ossäre- und in zwei Fällen cerebrale Metastasen.

In unserer Untersuchung konnten wir keinen Einfluss der Fernmetastasen auf die Höhe

der PMR Werte nachweisen.

Tab. 11 – Fernmetastasen (M)

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte

Prozente

Gültig

M0 25 89,3 89,3 89,3

Cerebral 2 7,1 7,1 96,4

Ossär 1 3,6 3,6 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

Bei drei Patienten wurden im Rahmen der Untersuchungen Fernmetastasen festgestellt und diese als Stadium IV klassifiziert.

28

4.2.5 Tumorstadium Bei der Untersuchung zur Verteilung der Tumorstadien zeigte sich, dass 50% der

Karzinome dem UICC Stadium I zuzuordnen waren. Von diesen 14 Patienten waren 10

im Stadium Ia und 4 im Stadium Ib. Auf das Stadium II entfielen 5 Patienten (=17,9%).

Von den 6 Patienten mit einem Stadium III Tumor wiesen 5 Patienten (=17,9%) einen

Stadium IIIa Tumor und ein Patient (=3,6%) einen Stadium IIIb Tumor auf. Bei

weiteren drei Patienten (=10,7%) wurden Tumore im UICC Stadium IV diagnostiziert

(s. Tab. 12). Wir konnten keinen Zusammenhang zwischen Tumorstadium und der

Höhe der PMR Werte in Blutplasma oder Bronchiallavage finden.

Tab. 12 - Tumorstadium

Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte

Prozente

Stadium Ia 10 35,7 35,7 35,7

Stadium Ib 4 14,3 14,3 50,0

Stadium IIa 4 14,3 14,3 64,3

Stadium IIb 1 3,6 3,6 67,9

Stadium IIIa 5 17,9 17,9 85,7

Stadium IIIb 1 3,6 3,6 89,3

Stadium IV 3 10,7 10,7 100,0

Gesamt 28 100,0 100,0

4.3 PMR – Werte

Im Folgenden werden die gemessenen PMR-Werte der unterschiedlichen Probenarten

unter verschiedenen Fragestellungen ausgewertet.

4.3.1 Vergleich prä- / postoperative PMR-Werte im Blutplasma

Von den 28 Patienten, die die Einschlusskriterien erfüllten und von denen eine

präoperative Blutplasmaprobe vorhanden war, erhielten wir in 21 Fällen ebenfalls eine

postoperative Probe.

Wie in Tabelle 13 dargestellt, konnte bei 16 Patientenproben präoperativ keine

Methylierung im SHOX2-Gen nachgewiesen werden während wir bei den übrigen 12

Patienten PMR-Werte bis maximal 23,22% messen konnten.

Bei der Untersuchung der 21 postoperativen Plasmaproben ergab sich, dass nach der

Operation noch in vier Fällen eine Methylierung messbar (Pat. 13;14;16;21) war.

In den übrigen Proben war die prozentuale Methylierung entweder auf 0,00%

abgefallen oder auf diesem Wert konstant geblieben.

29

Die genauere Betrachtung der Differenz zwischen prä- und postoperativen Werten

zeigte, dass 9 Patienten einen Abfall der prozentualen Methylierung um

durchschnittlich 93,88% aufwiesen während bei 11 Patienten der Ausgangswert von

0,00% konstant blieb.

Ein Patient (Pat. 14) zeigte postoperativ einen Anstieg von 0,00% auf 0,24% (s. Tab.

13).

Tab. 13 – Vergleich %-Methylierung prä- / postoperativ im Blutplasma

Pat. Präoperativer PMR Postoperativer PMR Differenz abs. Differenz %

1 0,00 0,00 0,00 0,00%

2 0,00 0,00 0,00 0,00%

4 0,00 0,00 0,00 0,00%

5 1,19 0,00 -1,19 -99,99%

7 0,00 0,00 0,00 0,00%

8 0,00 0,00 0,00 0,00%

9 0,00 0,00 0,00 0,00%

11 0,00 0,00 0,00 0,00%

12 0,05 0,00 -0,05 -100,00%

13 17,27 3,23 -14,04 -81,30%

14 0,00 0,24 0,24 100,00%

15 0,00 0,00 0,00 0,00%

16 0,57 0,04 -0,53 -93,88%

17 0,00 0,00 0,00 0,00%

19 0,00 0,00 0,00 0,00%

20 0,00 n.d. --- ---

21 1,04 0,21 -0,83 -80,26%

22 0,00 0,00 0,00 0,00%

23 0,00 n.d. --- ---

24 0,08 0,00 -0,08 -100,00%

25 0,00 n.d. --- ---

26 23,22 0,00 -23,22 -100,00%

27 0,00 0,00 0,00 0,00%

28 0,39 n.d. --- ---

29 0,00 n.d. --- ---

30 0,68 0,00 -0,68 -100,00%

31 7,74 n.d. --- ---

32 0,01 n.d. --- ---

33 0,83 0,00 -0,83 -100,00%

Bei 9 Patienten war postoperativ ein Abfall in den PMR-Werten von durchschnittlich 95% zu messen. n.d. – not determined

30

4.3.2 Follow-up Blutplasmawerte

Sechs Patienten stellten sich zur regelmäßigen Nachuntersuchung im Studienzentrum

Krankenhaus Maria-Martha in Halle-Dölau vor, sodass von diesen follow-up Proben

abgenommen werden konnten (siehe Tab. 14 / Abb. 4).

Von drei Patienten (Pat. 5; 14; 26) erhielten wir jeweils eine follow-up Probe, von drei

Patienten jeweils 3 follow-up Proben (Pat. 11; 16; 24) und von Patient Nr. 17 konnten

wir vier follow-up Werte untersuchen.

Die Ergebnisse der Untersuchung dieser Proben lassen sich in drei Gruppen aufteilen:

1.) Bei den Patienten 5 und 26 blieb der PMR-Wert nach einem Abfall der Methylierung

auf 0,00% nach der Operation in der ersten follow-up Untersuchung konstant.

2.) Die Patienten 11 und 24 zeigten postoperativ einen kurzzeitigen Anstieg der PMR-

Werte. In den jeweils letzten untersuchten follow-up Proben dieser Patienten war in

beiden Fällen der PMR-Wert wieder auf 0,00% abgefallen.

3.) Die dritte Gruppe schließt jene Patienten ein, bei denen es zu einem Anstieg der

prozentualen Methylierung im Verlauf der postoperativen Untersuchungen kam. Hierzu

zählen die Patienten 14, 16 und 17.

Während bei Patient 14 präoperativ kein mSHOX2 nachgewiesen werden konnte, kam

es postoperativ zu einem leichten Anstieg und einem weiteren fast linearen Anstieg in

der ersten follow-up Probe.

Patient 16 zeigt nach einem kurzzeitigen Abfall in der post-operativen Probe einen

kontinuierlichen Anstieg in den darauf folgenden drei Nachsorgeuntersuchungen bis

auf einen Maximalwert von 3,8%.

Eine Sonderstellung nimmt Patient 17 ein, bei dem es nach komplett unauffälligen prä-

/postoperativen Untersuchungen sowie den gleichfalls unauffälligen ersten drei follow-

up Proben erst in der 4. Nachsorgeuntersuchung zu einem Anstieg der Methylierung

kam. In der 5. follow-up Untersuchung fiel der Wert jedoch wieder auf 0,00% ab.

31

Abb. 4 - Verlauf follow-up PMR-Werte (Pat. 5; 11; 14; 16; 17; 24) im Plasma

Es zeigte sich bei Patient 14, 16 und 17 im Verlauf ein Anstieg der PMR-Werte, teilweise eine Erhöhung auf das 7-fache des präoperativen Wertes (Pat. 16).

Tab. 14 - Follow-up PMR-Werte im Blutplasma

Pat. ID

Prä-OP

Post-OP

follow-up 1

follow-up 2

follow-up 3

follow-up 4

follow-up 5

5 1,19 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.

11 0,00 0,00 0,09 0,14 0,00 n.d. n.d.

14 0,00 n.d. 0,24 0,59 n.d. n.d. n.d.

16 0,57 0,04 0,30 1,25 3,80 n.d. n.d.

17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00

24 0,08 0,00 0,00 0,05 0,00 n.d. n.d.

26 23,22 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.

n.d. – not determined 4.3.3 Vergleich PMR-Werte in Gewebe / Bronchiallavage / Blutplasma

Im Rahmen der Studie konnte von allen 28 eingeschlossenen Patienten eine prä-

operative Lavage- sowie Plasmaprobe gewonnen werden. Bei zwei Patienten

(Pat.: 13;14) stand kein Tumorgewebe zur Verfügung, da bei der Operation nicht

genügend Tumorgewebe zur weiteren Untersuchung gewonnen werden konnte.

Es konnte in allen gewonnenen Gewebeproben mSHOX2 mit einem medianen PMR-

Wert von 55,55% mit einer Standardabweichung von 85,55% nachgewiesen werden.

Die präoperativen Lavageproben zeigten eine mediane Shox2-Methylierung von 0,42%

bei einer Standardabweichung von 4,47%.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

Plasma präOP

Plasmapost OP

Follow-Up1

Follow-Up2

Follow-Up3

Follow-Up4

PM

R

Pat. Proben

Pat. 5

Pat. 11

Pat. 14

Pat. 16

Pat. 17

Pat. 24

32

Bei der Untersuchung der präoperativ gewonnenen Plasmaproben wurde bei mehr als

der Hälfte der Patienten (53,6%) keine Methylierung gemessen.

Bei der Analyse der Daten konnte eine statistisch signifikante Korrelation zwischen den

PMR-Werten im Gewebe und den Lavageproben nachgewiesen werden (Tab. 17, -

Korrelation nach Spearman: 0,47; p: 0,02).

Wir konnten aber keine Korrelation zwischen der Menge an mSHOX2 in den

unterschiedlichen Probenarten nachweisen. So zeigten etwa Patienten mit einem

hohen mSHOX2 Anteil in der Blutplasmaprobe nicht automatisch einen hohen PMR-

Wert in der Bronchiallavage.

Ebenso zeigte sich keine Korrelation zwischen der Höhe der PMR-Werte im

Blutplasma und dem Grad der Vaskularisierung der Gewebe.

Dies gilt in gleicher Weise für den Vergleich der PMR-Werte mit der Anzahl an

neutrophilen Granulozyten im Blutplasma., welche eine wichtige Rolle im Rahmen

einer Tumorerkrankung spielen. So werden sie u.a. mit einer erhöhten

Thromboseneigung bei Tumorpatienten in Verbindung gebracht.74

Es zeigten sich deutliche Unterschiede in der medianen Methylierung, absteigend von den Gewebe- (55,55%) über die Lavage- (4,47%) bis zu den Plasmaproben (0%).

Tab. 15 – Verteilung PMR-Werte Gewebe / Lavage / Plasma

Plasma Prä-OP Lavage Prä-OP Gewebe

N Gültig 28 28 26

Fehlend 0 0 2

Median 0 0,42 55,55

Standardabweichung 5,45 4,47 83,55

Minimum 0,00 0,00 0,00

Maximum 23,22 23,20 238,64

33

Tab. 16 – Übersicht PMR Werte in einzelnen Subgruppen (Median + SD)

Wir konnten keine Korrelation der unterschiedlichen Histologien und den PMR-Werten der einzelnen Probenarten nachweisen. Es zeigten sich jedoch signifikante Zusammenhänge zwischen der Tumorgröße (T-Stadium) und den PMR-Werten von Lavage und Plasma.

Die errechneten Korrelationen zeigen bis auf eine leichte Korrelation zwischen Gewebe und Bronchiallavage (0,47 p=0,02) keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen den gemessenen PMR-Werte der verschiedenen Probenarten.

N Gewebe Bronchiallavage Blutplasma

Adenokarzinom 9 24,29 ± 39,70 0,12 ± 0,19 0,00 ± 0,25

Plattenepithelkarzinom 15 58,35 ± 85,15 1,23 ± 5,85 0,05 ± 4,68

Adenosquamöses Karzinom 1 238,64 1,04 0,01

Undifferenziertes Karzinom 3 0,67 ± 118,87 0,24 ± 0,30 0,00 ± 13,40

T1a (<2cm) 7 4,63 ± 52,69 0,19 ± 0,2 0,00

T1b (2-3cm) 6 71,4 ± 81,15 0,19 ± 0,38 0,01± 0,33

T2a (3-5cm) 8 77,43 ± 76,78 1,11 ± 1,62 0,04 ± 2,68

T3 (>7cm) 3 1,32 ± 13,37 0,33 ± 0,48 0,39 ± 9,86

T4 4 197,43 ± 97,01 1,72 ± 11,01 0,88 ± 11,33

N0 18 46,54 ± 69,71 0,31 ± 5,20 0 ± 4,34

N1 6 183,06 ± 105,83 2,96 ± 8,56 0 ± 0,58

N2 4 49,48 ± 91,09 0,28 ± 0,19 0,61 ± 11,41

Tab. 17 – Korrelationen Gewebe / Lavage / Plasma nach Spearman

Gewebe Lavage

Prä-OP

Plasma

Prä-OP

Spearman-

Rho

Gewebe

Korrelationskoeffizient 1,00 ,47 ,36

Sig. (2-seitig) . ,02 ,07

N 26 26 26

Lavage

Prä-Op

Korrelationskoeffizient ,47 1,00 ,25

Sig. (2-seitig) ,02 . ,21

N 26 28 28

Plasma

Prä-Op

Korrelationskoeffizient ,36 ,25 1,00

Sig. (2-seitig) ,07 ,21 .

N 26 28 28

34

Tab. 18 – PMR-Werte Gewebe / Lavage / Plasma

Pat. Gewebe Lavage Prä-OP

Plasma Prä-OP Vaskularisierung

Neutrophile Granulozyten

1 10,03 0,07 0,00 30 0,87

2 133,21 0,12 0,00 73 0,72

4 232 23,2 0,00 65 0,56

5 188,58 1,23 1,19 24 0,63

7 172,86 0,77 0,00 44 0,73

8 5,75 0,25 0,00 23 0,61

9 2,62 0,2 0,00 38 0,6

11 10,31 0,00 0,00 42 0,77

12 145,64 0,14 0,05 43 n.d.

13 n.d. 0,94 17,27 n.d. 0,72

14 n.d. 0,67 0,00 n.d. 0,56

15 0,09 0,19 0,00 76 0,73

16 18,31 2,21 0,57 49 0,39

17 56,09 0,10 0,00 65 0,64

19 68,11 0,25 0,00 28 0,59

20 42,19 0,38 0,00 11 0,51

21 210,59 3,51 1,04 60 n.d.

22 3,51 0,01 0,00 61 0,68

23 177,53 6,74 0,00 40 0,72

24 50,88 4,84 0,08 36 0,71

26 206,27 0,24 23,22 44 0,67

27 24,29 0,33 0,00 23 0,59

28 1,32 0,00 0,39 n.d. 0,92

29 0,37 2,42 0,00 42 0,71

30 54,75 0,57 0,68 28 0,69

31 100,11 1,44 7,74 2 n.d.

32 238,64 1,04 0,01 7 n.d.

33 74,68 0,45 0,83 14 0,74

n.d. – not determined

35

Tab. 19 – Korrelation Plasma / Lavage / Vaskularisierung

Plasma

Prä-OP

Lavage

Prä-OP

Vaskularisierung

Spearman-

Rho

Plasma

Prä-OP

Korrelationsk

oeffizient 1,000 ,247 -,278

Sig.

(2-seitig) . ,205 ,178

N 28 28 25

Lavage

Prä-OP

Korrelationsk

oeffizient ,247 1,000 -,197

Sig.

(2-seitig) ,205 . ,345

N 28 28 25

Vaskula-

risierung

Korrelationsk

oeffizient -,278 -,197 1,000

Sig.

(2-seitig) ,178 ,345 .

N 25 25 25

Zwischen den PMR-Werten im Plasma bzw. Lavage und dem Grad der Vaskularisierung im untersuchten Tumorgewebe ist keine statistisch signifikante Korrelation nachweisbar.

Tab. 20 – Korrelation Plasma / Neutrophile Granulozyten

Plasma

Prä-OP

Neutrophile

Granulozyten

Spearman-Rho

Plasma

Prä-OP

Korrelations

koeffizient 1,000 ,202

Sig.

(2-seitig) . ,344

N 28 24

Neutrophile

Granulozyten

Korrelations

koeffizient ,202 1,000

Sig.

(2-seitig) ,344 .

N 24 24

Es zeigte sich keine signifikante Korrelation zwischen der SHOX2-Werten im Plasma und der Anzahl an neutrophilen Granulozyten.

36

5 Diskussion

5.1 Diskussion der Methoden

5.1.1 Das Patientenkollektiv

Bei unserem Studiendesign handelt es sich um eine prospektive Beobachtungsstudie,

bei der alle Patienten eingeschlossen wurden, die sich im Studienzentrum mit der

Fragestellung der operablen Tumorversorgung vorstellten und dem Studienprotokoll

zustimmten. Es erfolgte keine Randomisierung nach Alter, Geschlecht oder

Tumorstadium.

Die Geschlechterverteilung unserer Patienten zeigte im Vergleich zum weltweiten

Durchschnitt eine leichte Verschiebung zu den Männern (weltweit: ♂ 60%, ♀: 40% im

Vergleich zu ♂ 78%, ♀: 22% in unserem Patientenkollektiv).75

Das mediane Alter der Patienten bei Diagnosestellung eines Lungenkarzinoms

entspricht mit 72 Jahren in unserer Studie nahezu dem weltweiten Durchschnitt von ca.

70 Jahren.75

Während im Durchschnitt bei Männern bis zu 90% und bei Frauen bis zu 65% der

Lungenkarzinome einen Bezug zu Tabakkonsum haben, zeigten in unserer Studie nur

2/3 der Patienten eine positive Raucheranamnese.76 Ebenso konnten wir keinen

Zusammenhang zwischen Raucherstatus und Höhe der PMR-Werte nachweisen.

Die genannten Abweichungen lassen sich sowohl durch regionale Unterschiede, als

auch durch die geringe Fallzahl von 28 Patienten und die damit verbundene

statistische Abweichung erklären.

5.1.2 Probengewinnung

Die Gewinnung der prä- und postoperativen Plasmaproben, sowie der Bronchiallavage

konnte im Rahmen der Aufnahme- bzw. Entlassungsuntersuchung problemlos

durchgeführt werden. Die Tatsache, dass das Krankenhaus Maria-Martha in

Halle/Dölau ein überregionales Zentrum in der operativen Tumorversorgung bei

Lungenkarzinomen ist, erschwerte jedoch die Nachbeobachtung der Patienten und die

Gewinnung von follow-up Proben. Viele Patienten wurden in ihren regionalen

Krankenhäusern primär diagnostiziert und befanden sich dann lediglich zur operativen

Versorgung und dem postoperativen Aufenthalt in unserem Studienzentrum.

Die weiteren Kontrolluntersuchungen fanden in der Regel wieder in den

Heimatkrankenhäusern statt. Dies erklärt den Umstand, dass lediglich von einem

Viertel der eingeschlossenen Patienten follow-up Werte erhoben werden konnten.

37

5.1.3 Tumorstadien

Voraussetzung für den Einschluss in die Studie war ein Lungenkarzinom im operablen

Stadium, also UICC-Stadium I-IIIA. Auf Grund dieser Einschlusskriterien entspricht

unsere Stadienverteilung nicht dem üblichen Durchschnitt, bei dem nur 15% aller

diagnostizierten Karzinome im lokalen Stadium diagnostiziert werden.

Von den eingeschlossenen 28 Patienten zeigten vier Patienten einen dem Stadium IIIB

oder Stadium IV entsprechenden Tumor. Dies ist wahrscheinlich darauf zurück zu

führen, dass diese Patienten bei Diagnosestellung als operabel eingestuft wurden,

während des Klinikaufenthaltes jedoch bis zu diesem Zeitpunkt unbekannte Fern-

/Lymphknotenmetastasen diagnostiziert wurden, sodass die Tumorformel bei

Entlassung daher ein Stadium IIIB/IV-Tumor auswies.

Darüber hinaus könnte es sich um Einzelfallentscheidungen gehandelt haben, welche

z.B. bei paralleler Therapie solitärer cerebraler oder adrenaler Metastasen eine

chirurgische Tumortherapie auch im Stadium IV rechtfertigt.

Wir konnten in unserer Untersuchung keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium

und der Höhe der PMR Werte in Bronchiallavage und Blutplasma nachweisen. Dies

führen wir auf die vornehmlich frühen Tumorstadien in unserer Studie zurück.

Sowohl Kneip et al. als auch Schmidt et al. konnten zeigen, dass die

Methylierungsrate mit höherem Tumorstadium ansteigt.48,49

Die gefundene Korrelation zwischen einem positiven Lymphknotenstatus (N1+N2) und

einer erhöhten Methylierung des SHOX2-Gens spricht für eine höhere

Wahrscheinlichkeit des Nachweises von mSHOX bei Patienten mit

Lymphknotenmetastasen.

Gründe hierfür sind möglicherweise eine größere Tumormasse, aggressivere

Eigenschaften des individuellen Tumortyps oder vermehrter Anschluss an das Gefäß-

und Bronchialsystem durch die Metastasen. Hierbei muss jedoch beachtet werden,

dass ein p-Wert von 0,076 nicht signifikant im Rahmen unseres angesetzten

Standardfehlers von 0,05 ist. Wir halten den gefundenen Zusammenhang aber

dennoch für einen deutlichen Trend und sehen die fehlende statistische Signifikanz der

geringen Fallzahl geschuldet. Daher wird eine größere Nachfolgestudie benötigt, um

den gefundenen Zusammenhang zu verifizieren.

Die nachgewiesene signifikante Korrelation zwischen der Tumorgröße und der Höhe

der PMR-Werte in Bronchiallavage (Korrelationskoeffizient: 0,528; p=0,004) und

Blutplasma (Korrelationskoeffizient: 0,501; p=0,007) ist ein weiterer interessanter

Befund (siehe Tab.8).

Unter Berücksichtigung der sehr groben Einteilung der Tumorgröße in der TNM-

Klassifikation zeigt diese Korrelation, dass es einen Zusammenhang zwischen der

38

Größe von Tumoren und der Höhe an methylierter SHOX2 DNA gibt. Diese

Beobachtung sollte ebenfalls in einer weiteren Nachfolgestudie mittels genauerer

Messung der Tumorgröße z.B. durch Volumenmessung im CT-Bild verifiziert werden.

5.1.4 Angewandte analytische Methoden

Die von uns verwendeten Methoden zur Aufarbeitung und Messung der Probe mittels

HeavyMethyl (HM) PCR-Assay für die quantitative Bestimmung von methyliertem

SHOX2-Gen wurde bereits erfolgreich in Blutplasma und Lavage angewandt.48,49

Dieser Test erhielt zudem die CE-Zertifizierung und ist daher für die Anwendung am

Patienten zugelassen.77 Die CE-Zertifizierung garantiert ein hohes Maß an Sensitivität

und Spezifität, sowie eine zuverlässige Reproduzierbarkeit der gewonnenen

Ergebnisse.

Um die Konzentration an Tumorzellen in den untersuchten Gewebeproben zu erhöhen,

wurden die angefertigten Tumorschnitte von einem Facharzt für Pathologie

begutachtet und tumorzellreiche Areale unter dem Mikroskop markiert.

Anschließend konnten diese markierten Areale makroskopisch ausgeschnitten und im

weiteren Prozess untersucht werden. Auf diese Weise erreichten wir eine

höchstmögliche Menge an Tumorzellen in unserer Messprobe.

Mit der quantitativen Bestimmung von mSHOX2 in mehreren

Untersuchungsmaterialien (Blutplasma, Lavage, Tumorgewebe) des gleichen

Patienten konnten wir erstmals einen Eindruck von der Verteilung und dem

Vorkommen von methylierter SHOX2-DNA in den verschiedenen Probenarten

gewinnen. Dies wird eine Rolle bei der Auswahl der Probenart für zukünftige

Untersuchungen des mSHOX2-Gens spielen.

5.2 Diskussion der PMR-Werte

5.2.1 Vergleich prä- / postoperativer Plasmawerte

Bei der Suche nach neuen Tumormarkern steht häufig auch die Frage nach deren

Verhalten unter Therapie im Mittelpunkt. In Bezug auf mSHOX2 konnte in einer

aktuellen Pilotstudie bereits gezeigt werden, dass sich dieser Marker sehr gut dazu

eignet, das Ansprechen auf eine Radio-Chemotherapie bei Patienten mit

fortgeschrittenem Lungenkarzinom festzustellen.68

Ziel unserer Studie war es, die quantitative Messung von mSHOX2 bei

Lungentumorpatienten durchzuführen, die zu einem Zeitpunkt diagnostiziert wurden,

zu dem eine operative Tumortherapie möglich war. Dabei handelte es sich um

Patienten, die ein frühes Tumorstadium (I bis IIIA) zeigten.

39

Diese frühen Tumorstadien bedingen auch die verhältnismäßig niedrigen gemessenen

PMR-Werte für SHOX2 im Blutplasma. Wir konnten damit die von Kneip et. al.

publizierten Ergebnisse replizieren und zeigen, dass es eine Korrelation zwischen

Tumorstadium und der Menge an methylierter SHOX2-DNA im Blutplasma gibt.49

Wir konnten auch nachweisen, dass sich bei den 9 Patienten, bei denen präoperativ

eine Methylierung gemessen wurde, die Werte postoperativ um durchschnittlich knapp

95% verringerten. Dieser Abfall spricht für einen deutlichen Zusammenhang von

methyliertem SHOX2 und dem Tumor, da sich mit Entfernung des Tumors auch der

gemessene PMR-Wert stark verringerte. Die postoperativen Proben wurden in der

Regel am Tag der Entlassung des Patienten abgenommen, sodass sich der gezeigte

PMR-Abfall innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums von nur wenigen Tagen vollzog.

Dieses Ergebnis bestätigt damit die Messungen einer Pilotstudie an Patienten mit

einem fortgeschrittenen Lungentumor, die zeigten, dass eine systemische

Chemotherapie innerhalb von 7 bis 10 Tagen zu einer starken Reduktion der Plasma

mSHOX2 Werte führt.68,78

Mit diesem schnellen Abfall der Werte nach Beginn einer Therapie erfüllt mSHOX2

eine wichtige und wesentliche Voraussetzung zur Eignung als Tumormarker für ein

Therapiemonitoring.

Durch die mehrfache Bestimmung von mSHOX2 im Verlauf der Diagnostik und

Therapie eines Patienten erhält man ein kinetisches Profil und Abbild des Tumors zum

jeweiligen Zeitpunkt.

Für diese Art der Tumoruntersuchung wurde in den letzten Jahren der Begriff der

„Liquid Biopsy“ geprägt.64 Er beschreibt die Untersuchung von genetischem Material

des Tumors, welches entweder als ganze Tumorzellen (circulating tumor cells) oder in

Form von extrazellulären Nukleinsäuren im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten wie

Aszitis oder Urin nachweisbar sind. Im Vergleich zur herkömmlichen histologischen

Biopsie bietet die „Liquid Biopsy“ entscheidende Vorteile:

So handelt es sich bei dieser Art der Probenentnahme um eine einfache

Blutentnahme, welche bei minimaler Invasivität eine hohe diagnostische Aussagekraft

besitzt.

Mittels eines Nachweises von genetischem Material des Tumors aus dem Blut können

auch solche Tumore untersucht werden, welche einer herkömmlichen Biopsie nicht

zugänglich sind. Dies betrifft vor allem schwierige Tumorlokalisationen oder Patienten

mit schlechtem Allgemeinzustand.

40

Darüber hinaus werden bei herkömmlichen Biopsien nur maximal einige wenige

Lokalisationen biopsiert. Ein Analyse von circulating tumor cells (CTC) bzw.

extrazellulären Nukleinsäuren repräsentiert jedoch womöglich eine Abbild aller

Tumorlokalisationen bzw. erlaubt es sich ein genaueres Bild im Hinblick auf eine

eventuelle genetische Heterogenität des Tumors zu verschaffen, was mit einer

einzelnen herkömmlichen histologischen Biopsie nur selten gelingt.79

Da sich die Entnahme der Proben unter Therapie oft wiederholen lässt, erhält man

damit möglicherweise einen genaueren Einblick in die Kinetik der Erkrankung.

Weitere Studien müssen zeigen, ob sich damit ein Therapieerfolg oder eine mögliche

Resistenzentwicklung des Tumors gegenüber der angewendeten Therapie frühzeitig

feststellen lässt und der Patient damit von einer Anpassung der Therapie profitieren

kann. 80

Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber der herkömmlichen Biopsie, bei der eine

Re-Biopsie nach begonnener Therapie häufig nicht mehr möglich ist.

Insgesamt ist das Konzept der Liquid Biopsy aktuell Gegenstand vieler Studien und

Untersuchungen und sicherlich eine der erfolgversprechendsten Innovationen der

aktuellen Krebsforschung. So gibt es z.B. aktuell Arbeitsgruppen welche dieses

Konzept im Zusammenhang mit Lungenkarzinomen81,82, Colo-rektalen Karzinomen83,84,

Mammakarzinomen85–87 sowie malignem Melanom88 untersuchen. Die Ergebnisse

dieser Forschungen werden in Zukunft zunehmend Einfluss auf die Diagnostik und

Therapie maligner Erkrankungen haben.

5.2.2 Follow-up Blutplasmawerte

Das in Abschnitt 5.1.3 angesprochene Problem der Nachverfolgung der

Studienpatienten und der Gewinnung von follow-up Proben hat die Anzahl der

Patienten mit follow-up Proben deutlich reduziert.

Von 7 Patienten, die sich regelmäßig zur Nachkontrolle im Studienzentrum vorstellten,

ist besonders Pat. Nr. 16 interessant. Bei diesem Patienten kam es nach initialem

postoperativem Abfall der Menge an extrazellulärer Plasma mSHOX2 DNA im weiteren

Verlauf zu einem deutlichen Anstieg auf das 7-fache des präoperativen Wertes. Bis

jetzt (Stand Mai 2015) war in den standardmäßigen radiologischen

Kontrolluntersuchungen jedoch kein Rezidiv darstellbar. Hier ist eine weitere

Verfolgung des Werdegangs des Patienten besonders unter dem Gesichtspunkt der

frühzeitigen Rezidiverkennung durch die Bestimmung von mSHOX2 interessant.

Besonders beachtenswert ist auch der Verlauf von Pat. Nr. 17, bei dem es nach

unauffälligen drei follow-up Untersuchungen in der 4. Nachuntersuchung zu einem

leichten Anstieg von mSHOX2 im Plasma kam.

41

Beim Abgleich mit den klinischen Daten des Patienten wurde festgestellt, dass

zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten ein Rezidiv in Form einer solitären

Colon-Metastase des primär diagnostizierten Adenokarzinoms der Lunge

diagnostiziert wurde. Nach erfolgter Resektion der Metastase war in der

anschließenden 5. follow-up Untersuchung die gemessene Methylierung wieder auf

0,00% abgefallen.

Patient Nr. 14 ist ein Sonderfall: Bei ihm wurde keine operative Therapie des

Primärtumors der Lunge durchgeführt, da zuerst die solitäre cerebrale Metastase

entfernt wurde. Er erhielt daraufhin eine Chemotherapie sowie eine Radiatio. Die

ursprünglich geplante operative Therapie des Lungenkarzinoms wurde bei

zusätzlichem Auftreten von Lebermetastasen nicht mehr durchgeführt. Da der Patient

jedoch initial in die Studie aufgenommen wurde, wurden weiterhin im Rahmen der

Kontrolluntersuchungen Plasmaproben zur mSHOX Bestimmung abgenommen. Diese

zeigten in der initialen Messung keine Methylierung des SHOX2-Gens.

In follow-up Untersuchungen stiegen die PMR-Werte jedoch unter Chemotherapie und

Radiatio an. Der Patient verstarb 7 Monate nach der Erstdiagnose. Dies spricht für

einen Tumorprogress trotz intensiver Chemo- und Bestrahlungstherapie.

5.2.3 Vergleich PMR-Werte im Gewebe / Bronchiallavage / Blutplasma

Da neben Lavage- und Plasmaproben bei 26/28 Patienten die dazugehörigen

Gewebeproben vorhanden waren, konnten wir die Methylierungswerte von SHOX2 im

Tumorgewebe, Bronchiallavage und Blutplasma der einzelnen Patienten miteinander

vergleichen. Dies vor allem im Hinblick auf die Frage, welches Material sich am

ehesten für Bestimmung von mSHOX2 eignet.

Beim Vergleich der medianen Methylierungswerte der unterschiedlichen Probenarten

zeigten sich im Tumorgewebe mit 55,55% (SD: ±83,55) die höchsten medianen Werte.

Teilweise wurden Werte von über 200% gemessen. Die Prozentzahlen >100% erklären

sich dadurch, dass die PMR-Werte das Verhältnis von mSHOX2 zu Beta-Aktin

darstellen, also mehr mSHOX2 DNA als Beta-Aktin DNA in diesen Proben vorhanden

ist. Darüber hinaus ist der SHOX2 Genlocus bei vielen Lungentumorpatienten

amplifiziert, was ebenfalls zu höheren PMR Werten führt.

Bemerkenswert ist hier, dass wir im Gegensatz zu den anderen Probenarten in allen

zur Verfügung stehenden Gewebeproben mSHOX nachweisen konnten.

Im Vergleich zu den sehr hohen PMR-Werten im Gewebe (Median Gewebe PMR:

55,55%, SD: ±83,55) waren die gemessenen medianen Werte in der Bronchiallavage

mit 0,42% (SD: ±4,47) und im Blutplasma mit 0,00% (SD: ±5,45) deutlich geringer.

42

Für diese Differenz der PMR-Werte vom Gewebe über die Lavage bis zum Plasma

sehen wir verschiedene Ursachen:

So werden bei den einzelnen Proben die PMR-Werte in sehr unterschiedlich großen

Kompartimenten gemessen. Das Verteilungsvolumen der Menge an mSHOX2-DNA ist

in der Lavage und vor allem im Blutplasma deutlich größer als im zellreichen

Tumorgewebe. Ebenso wäre es möglich, dass diejenigen Nukleinsäuren, die vom

Tumor in Blut- bzw. Bronchialsystem abgegeben werden nur eine geringe Methylierung

im SHOX2-Gen aufweisen. Generell ist über die Mechanismen bei der Freisetzung von

Nukleinsäuren ins Blut bisher wenig bekannt.

Diaz et al. konnten zeigen, dass ein Zusammenhang zwischen der Höhe an

neutrophilen Granulozyten und der Menge an zellfreier DNA im Blutplasma bei

Patienten mit tiefer Beinvenenthrombose besteht.74 Darüber hinaus konnten andere

Arbeitsgruppen nachweisen, dass erhöhte Neutrophilenwerte im Rahmen eines

Tumorgeschehens von signifikanter Bedeutung sind und dort ebenfalls mit der Menge

an freigesetzten zellfreien Nukleinsäuren korrelieren.89,90 Die in diesen Arbeiten

beobachtet Korrelation konnten wir in unserem Patientenkollektiv nicht nachweisen.

Einen Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen hohen Methylierungswerten im

Blutplasma und einer erhöhten Vaskularisierung des Tumors konnten wir ebenfalls

nicht bestätigen. Dieser Befund deutet darauf hin, dass für die Freisetzung

extrazellulärer DNA möglicherweise mehrere Mechanismen verantwortlich sind, die wir

bisher nur ungenügend kennen. Schor et al. konnten jedoch zeigen, dass

Lungenkarzinome eine sehr heterogene Vaskularisierung, sowohl innerhalb eines

Tumors, als auch zwischen den untersuchten Tumoren, aufweisen.73 Es hängt daher

sehr wahrscheinlich von den individuellen Eigenschaften des Tumors ab, ob und in

welchem Umfang Nukleinsäuren bzw. Zellbestandteile an das Blutsystem abgegeben

werden. Das gilt ebenso für den Zugang des Tumors zum Bronchialsystem. Es ist

bisher nicht bekannt ob ein Anschluss des Tumors an das Bronchialsystem die

Methylierungswerte in der Bronchiallavage beeinflusst.

Die Tatsache, dass wir bis auf eine mittelgradige Korrelation zwischen Gewebe- und

Lavageproben keine weitere Korrelation unter den verschiedenen Probenarten

nachweisen konnten, führen wir ebenfalls auf die individuell unterschiedlichen

Eigenschaften der einzelnen Tumore zurück.

Insgesamt scheint die Untersuchung von mSHOX2 in der Bronchiallavage bei

Patienten mit frühen Tumorstadien und niedriger Tumorlast eher Erfolg versprechend

zu sein als die Bestimmung im Blutplasma. Dies erklärt sich durch den höheren

Verdünnungsgrad im Blutplasma.

43

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass die mSHOX2 Bestimmung in frühen

Tumorstadien beim Lungenkarzinom eine Methode darstellt, die interessante

Ergebnisse liefert. Allerdings konnten wir keine signifikante Korrelation zwischen der

Menge an mSHOX2 im Gewebe und extrazellulärer mSHOX2 DNA nachweisen.

Dennoch zeigten sich einige vielversprechende Ansätze in Bezug auf die

Verlaufsbeurteilung einer Antitumortherapie und die Möglichkeit einer frühzeitigen

Rezidiverkennung, welche jedoch im Rahmen einer multizentrischen Studie mit einer

größeren Anzahl von Patienten verifiziert werden muss.

5.3 Limitationen

Die Limitation unserer Pilotstudie ergibt sich vor allem vor allem aus der geringen

Fallzahl, die der Untersuchung zugrunde liegt. Diese lässt bei der Interpretation der

Daten nur erste Ansätze und Tendenzen zu. Viele Ergebnisse bedürfen Bestätigung im

Rahmen größerer Kontrollstudien.

Darüberhinaus zeigen die durch die Studie gewonnenen Daten, dass sich mSHOX2

bisher nur im Gewebe hinreichend sicher nachweisen lässt. Dies schränkt die

Praktikabilität für einen Einsatz als Tumormarker im klinischen Alltag ein.

Die Eignung als Marker zur Tumordiagnostik bzw. als Screeningparameter ist vor dem

Hintergrund der niedrigen Nachweisrate in frühen Tumorstadien eingeschränkt.

Hier könnte der Fokus in Zukunft auf dem Therapiemonitoring liegen, wo mSHOX2

bereits seine Eignung im Rahmen des Monitorings von Chemotherapien beim

Lungenkarzinom bewiesen hat.68

Der mögliche Einsatz als Rezidivmarker muss ebenfalls in größeren Follow-up Studien

weiter untersucht werden.

44

6 Zusammenfassung

Noch immer ist die 5-Jahres Überlebensrate von Patienten mit einem Lungenkarzinom

mit 10 bis 15% sehr niedrig. Das liegt vor allem daran, dass viele Tumore erst in einem

fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert werden. Die rechtzeitige Diagnose und

Verlaufskontrolle von Lungenkarzinomen in Verbindung mit der Entwicklung neuer

Medikamente und die Verbesserung bestehender Therapieregime ist daher von

zunehmender Wichtigkeit. Es ist bekannt, dass Lungentumore schon in einem frühen

Stadium eine Vielzahl verschiedener genetischer sowie epigenetischer Veränderungen

aufweisen. Dazu gehört u.a. die Methylierung des SHOX2-Gens, von dem bekannt ist,

dass diese bereits in Stadium I der Lungenkarzinome nachweisbar ist.

Ziel unserer Untersuchungen war es, den diagnostischen Wert von mSHOX2 im Bezug

auf die Verlaufsbeobachtung bei Patienten mit frühen Lungenkarzinomstadien zu

evaluieren. Dies beinhaltet vor allem Therapiemonitoring und mögliche frühzeitige

Rezidiverkennung.

Hierzu wurde bei 28 Patienten mit Lungenkarzinom im Stadium I-IIIA, die sich zur

operativen Tumortherapie vorstellten, der Methylierungsgrad des SHOX2-Gens

bestimmt. Es wurden prä- und postoperative Plasmaproben, sowie Bronchiallavage

und Tumorgewebe auf ihren Gehalt an methylierter SHOX2 DNA untersucht. Hinzu

kamen, sofern möglich, follow-up Plasmaproben im Rahmen der

Nachsorgeuntersuchungen.

Es zeigte sich, dass Patienten mit einem präoperativ erhöhten Methylierungsgrad,

post-operativ einen deutlichen Abfall in der Methylierung des SHOX2-Gens aufwiesen.

Aus dieser Beobachtung schlussfolgern wir, dass die extrazelluläre mSHOX2 DNA aus

den Tumorzellen stammt.

Ebenso zeigten einige Patienten in den follow-up Untersuchungen nach initial

unauffälligen mSHOX2 Werten im Verlauf ansteigende Werte, welche vor allem bei

Pat. 17 stark mit dem klinischen Verlauf der Tumorerkrankung korrelierten. Schließlich

konnte auch der Beweis erbracht werden, dass mSHOX2 sowohl in Blutplasma als

auch in Lavage und vor allem im Tumorgewebe vorhanden und nachweisbar ist,

jedoch die Werte im Vergleich untereinander, mit der Ausnahme von Gewebe und

Bronchiallavage, nicht korrelieren.

Dies sind vielversprechende Ergebnisse, welche Grundlage und Anstoß für weitere

Untersuchungen im größeren Maßstab sein sollten, insbesondere im Hinblick auf die

Frühdetektion möglicher Rezidive.

45

7 Literaturverzeichnis

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50

8 Thesen 1. Das Lungenkarzinom ist das häufigste zum Tode führende Karzinom beim Mann

und das 4. Häufigste bei der Frau.

2. Nur bei jedem 8. Patienten wird der Tumor in einem kurativ zu therapierendem

Stadium diagnostiziert.

3. Bisher ist kein verlässlicher Tumormarker (für Diagnose bzw. Screening) für das

Lungenkarzinom im klinischen Alltag implementiert.

4. Die Hyper-Methylierung führt in zahlreichen Tumorentitäten zur Veränderung

vieler für den Zellzyklus wichtiger Gene (z.B. SHOX2).

5. Die vorliegende Arbeit soll die Eignung von mSHOX2 als Tumor- / Rezidivmarker

bei Patienten mit Lungenkarzinom untersuchen, mit speziellem Augenmerk auf

die Veränderung der Werte nach operativer Tumortherapie.

6. Wir konnten keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen

Lymphknoten bzw. Fernmetastasen und der Höhe der Methylierungswerte

nachweisen.

7. mSHOX2 konnte in allen vorhandenen Gewebeproben nachgewiesen werden,

während die Nachweisquote über die Lavage bis zu den Plasmaproben stark

abnahm.

8. Unter Therapie (Operation) konnten wir bei 9 Patienten einen Abfall der

mSHOX2 Werte im Vergleich prä- zu post-operativ im Blutplasma nachweisen.

9. Das Konzept der „Liquid Biopsy“ ermöglicht Aussagen über die Kinetik der

Erkrankung, die histologische Heterogenität des Tumors sowie über das

Therapieansprechen.

10. Eine Eignung des quantitativen mSHOX2 Nachweises im Plasma zur

Rezidiverkennung muss in größeren Studien bestätigt werden.

VI

9 Selbstständigkeitserklärung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und

ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus

anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter

Angabe der Quelle gekennzeichnet. Die Regeln zur Sicherung guter wissenschaftlicher

Praxis wurden beachtet.

Ich versichere, dass ich für die inhaltliche Erstellung der vorliegenden Arbeit nicht die

entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- und Beratungsdiensten (Promotionsberater oder

andere Personen) in Anspruch genommen habe. Niemand hat von mir unmittelbar

oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit

dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form

einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Datum Unterschrift

VII

10 Erklärung über frühere Promotionsversuche

Ich versichere, dass von mir, Christian Georg Fuhrmann, keine früheren

Promotionsversuche mit dieser oder einer anderen Dissertation erfolgt sind.

Es wurde nur dieser Antrag auf Eröffnung eines Promotionsverfahrens eingereicht.

Datum Unterschrift

VIII

11 Lebenslauf Persönliche Daten

Name Christian Georg Fuhrmann

Geboren am / in 1. November 1987 / Oldenburg

Anschrift Isernhagener Str. 50, 30163 Hannover

Telefon 0151- 42319901

Email christian_fuhrmann@me.com

Familienstand ledig

Konfession evangelisch

Schule und Ausbildung

1994 - 1998 Grundschule – Hermann-Ehlers-Schule,

Oldenburg 1998 - 2000 Orientierungsstufe Osternburg,

Oldenburg 2000 - 2007 Altes Gymnasium Oldenburg, Abschluss: Abitur 2005 - 2006 Austauschjahr am Privatinternat Culford

School, Bury St. Edmunds, England Sommer 2008 Ausbildung zum Rettungssanitäter 2008-2014 Humanmedizinstudium an der Martin-

Luther-Universität Halle-Wittenberg November 2014 Abschluss 2. Staatsexamen Medizin &

Approbation Beruflicher Werdegang September 2007 – Juni 2008 Zivildienst Klinikum Oldenburg August - September 2008 Rettungssanitäter Malteser Hilfsdienst Oldenburg 2011-2014 ADAC-Ambulance-Service Halle (parallel zum Studium) seit August 2015 Assistenzarzt in der Klinik für Urologie

und urologische Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Datum Unterschrift

IX

12 Danksagung

An erster Stelle bedanke ich mich bei Herrn PD Dr. med. Bernd Schmidt für die

Überlassung des Themas und seine Bereitschaft, mich bei der Erstellung der Arbeit zu

unterstützen und zu begleiten.

In gleicher Weise gilt mein besonderer Dank Herrn Dr. rer. nat. Michael Fleischhacker,

der stets ein offenes Ohr für mich hatte und mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite

stand. Er hat mir für die Planung, Organisation und Durchführung der Dissertation

überaus hilfreiche Hinweise gegeben.

Des Weiteren danke ich den Mitarbeitern des Pulmologischen Labors der Martin-

Luther-Universität Halle-Wittenberg, vor allem Frau Dana Reinicke, die mich bei der

Bearbeitung der Proben ebenfalls tatkräftig unterstützt hat.

Mein Dank gilt darüberhinaus Frau S. Behl aus dem Klinischen Studienzentrum der

Universitätsklinik Halle für ihre Beratung in Fragen der Statistik.

Ferner möchte ich an dieser Stelle auch die Gelegenheit nutzen, mich bei den Ärzten

des Krankenhauses Maria Martha in Halle-Dölau zu bedanken. Hier in besonderer

Weise bei Herrn Prof. Dr. med. Wolfgang Schütte, Frau Dr. med. Sylvia Nagel und

Frau Dr. med. Katharina Reuse für die gute Kooperation beim Studieneinschluss der

Patienten.

In diesem Zusammenhang gilt mein Dank ebenfalls dem Studiensekretariat der

Inneren Klinik des Krankenhauses Maria Martha Halle/Dölau, insbesondere Frau

Gebauer, Frau Mertins und Frau Leysring, die mich bei der Organisation der

Probenabnahmen unterstützten und bei Nachfragen jederzeit ein offenes Ohr hatten.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden, die mir stets

zur Seite standen, mich immer wieder motivierten und so maßgeblich zum Gelingen

der Arbeit beigetragen haben.

Schließlich möchte ich auch den Patienten danken, ohne deren bereitwillige

Teilnahme an der Studie diese wissenschaftliche Arbeit nicht hätte durchgeführt

werden können.