Rapport annuel d’activité 2013 - École du Val-de-Grâce · INSTITUT DE RECHERCHE ... Francisella tularensis, Burkholderia pseudomallei, B. mallei, ... qui n'a pas fait apparaître

Rapport 2012 CNR charbon Page 1 sur 19

INSTITUT DE RECHERCHE BIOMEDICALE DES ARMEES ANTENNE DE LA TRONCHE CENTRE DE RECHERCHES DU SERVICE DE SANTE DES ARMEES

Rapport annuel d’activité 2013

Centre de national de référence

CHARBON

Année d’exercice

2012


Résumé analytique

Le charbon est la maladie provoquée par la bactérie Bacillus anthracis. Cette maladie est une

zoonose des herbivores et, dans sa forme naturelle, ne concerne qu'accidentellement les

humains. En anglais, le charbon humain est désigné par le terme "anthrax".

Cette bactérie, comme les autres Bacillus possède la propriété de former des spores

extrêmement résistantes aux agressions physico chimiques, pouvant ainsi persister dans

l'environnement tellurique. Ces spores constituent la forme contaminante de B. anthracis.

Chez l'homme, le charbon revêt trois formes cliniques principales :

- le charbon cutané donnant une escarre noirâtre caractéristique, qui a donné son

nom à la maladie,

- le charbon gastro-intestinal, généralement consécutif à l'ingestion de viande ou

d'aliments contaminés par des spores

- le charbon d'inhalation, forme gravissime autrefois rencontrée dans les usines de

traitement de la laine. Cette forme n'est plus naturellement rencontrée dans les pays

occidentaux, mais pourrait survenir en cas d'agression par aérosolisation de spores, comme

cela a été les cas lors des évènements de 2001 aux U.S.A. Cette possibilité de contamination

malveillante justifie une surveillance des cas de charbon humains.

A ces formes classiquement décrites, il convient désormais d'ajouter une forme identifiée

pour la première fois en 2000, désignée charbon d'injection et rencontrée chez des usagers

d'héroïne par injection. La présentation clinique en est très particulière et est caractérisée

par un œdème fébrile massif de la zone d'injection. Plusieurs dizaines de cas ont été décrits,

en Europe uniquement depuis 2009. La seule souche de B. anthracis adressée au CNR

pendant l'année 2012 provient d'un tel cas. L'origine de la contamination reste encore

indéterminée et justifie l'attention portée à ce cas.


1 Mission & organisation du CNR

1.1 Rappel des missions et objectifs majeurs du CNR et des laboratoires associés

1.2 Description de l’équipe

1.3 Description des locaux et de l’équipement

Ces renseignements figurent en annexe 1.

1.4 Description de la démarche qualité du laboratoire :

Le laboratoire a entamé une démarche qualité portant sur les aspects suivants : - métrologie : étalonnage annuel des outils de pipetage, suivi des enceintes

thermostatées par sondes raccordées COFRAC, contrôle annuel des thermocycleurs conventionnels et en temps réel

- gestion documentaire pour le suivi des échantillons et les protocoles analytiques - participation à des exercices interlaboratoires en l'absence de contrôle de qualité

externe spécifique : o Le laboratoire est partenaire du projet européen QUANDHIP portant sur le

diagnostic des bactéries hautement pathogènes (B. anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Burkholderia pseudomallei, B. mallei, Brucella spp., Coxiella burnetii). Un exercice annuel d'identification des ces bactéries par méthodes phénotypiques ou moléculaires est réalisé.

o Le laboratoire appartient au réseau national des laboratoires Biotox-Piratox et à ce titre participe aux exercices annuels qui sont proposés par le Conseil scientifique de ce réseau.

2 Activités d’expertise

2.1 Capacités techniques du CNR : Ces renseignements figurent en annexe 1

2.2 Activités d'expertise de l'année 2012

- -Nombre de souches réceptionnées : 2

o Souche "2012-011"

Souche adressée par un LABM de Senlis (60), isolée d'un hématome consécutif à une chute chez une personne âgée. Identification comme Bacillus cereus. par spectrométrie de masse, les marqueurs moléculaires de B. anthracis étant absents.

Ni la clinique ni le contexte n'étant pas en faveur du charbon, il s'avère que cette souche nous a été adressée abusivement suite à la mise en évidence d'un bacille à Gram positif dans une plaie.

o Souche "2012-014"

Souche adressée par le centre hospitalier de Chambéry (73).

Ayant isolé un bacille à Gram positif chez un homme de 27 ans présentant un œdème massif du bras après une injection d'héroïne, le CH a été incité à contacter le CNR suite à l'alerte de l'INVS sur les cas de charbon chez des toxicomanes européens.

La souche a été confirmée comme B. anthracis par méthodes moléculaires (recherche de marqueurs des plasmides de virulence par PCR en temps réel) et phénotypiques (coloration


de Gram, aspect en culture, mobilité, hémolyse) et par spectrométrie de masse MALDI TOF. Un antibiogramme par Etest® a été réalisé, qui n'a pas fait apparaître de résistance inattendue.

La caractérisation de la souche par génotypage et séquençage génomique a montré sa proximité avec les souches de l'épidémie européenne.

- Nombre de souches testées pour leur sensibilité aux anti-infectieux et résultats : 1

L'antibiogramme de la souche "2012-014" figure dans le tableau ci-dessous :

Etest Antibiotique CMI

(mg/L) Limite de sensibilité (CLSI et CASFM)

Interprétation S : sensible

NS : non sensible

CI Ciprofloxacine 0,047 ≤0,25 S

LE Lévofloxacine 0,094 ≤0,25 S

OF Ofloxacine 0,19 ≤0,25 S

DC Doxycycline <0,016 ≤1 S

AC Amoxicilline 0,023 ≤4 S

XL Amoxicilline-acide clavulanique 0,023 ≤4/2 S

PG Benzylpénicilline 0,016 ≤0,12 S

AM Ampicilline 0,023 ≤4 S

GM Gentamicine 0,50 ≤4 S

CM Clindamycine 0,75 ≤2 S

TS Triméthoprime-sulfaméthoxazole >32 ≤2/38 NS

EM Erythromycine 1 ≤1 S

CT Céfotaxime 32 ≤4 NS

VA Vancomycine 2 ≤4 S

IP Imipénème 0,023 ≤4 S

- Nombre de souches ou échantillons de matériel biologique issus des collections du CNR distribué : 1

La souche "2012-014" a été transmise au laboratoire de l'Institut de Microbiologie de la Bundeswehr à Munich (Allemagne). En échange, le CNR a pu obtenir une souche isolée d'un cas similaire afin de réaliser un génotypage comparatif des deux souches dans des conditions identiques.


3. Activités de surveillance

3.1. Surveillance de l’évolution et des caractéristiques des infections

Le laboratoire collabore historiquement avec le Laboratoire vétérinaire départemental de Savoie en raison non seulement de la proximité géographique mais également de l'importance des cas de charbon animal recensés annuellement dans ce département.

Des campagnes de prélèvements ont été réalisées dans des "champs maudits" savoyards à l'occasion de l'étude sur les phages de B. anthracis mentionnée ci-après.

Des contacts ont été pris avec le l'ANSES de Maisons-Alfort qui héberge le LNR charbon. Des opportunités de collaboration ont été identifiées, mais nécessitent toutefois l'établissement de conventions de collaboration de plus haut niveau entre l'ANSES et le Service de santé des armées.

3.2. Surveillance de la résistance des agents pathogènes aux anti-infectieux

- Le seul cas isolé en 2012 n'a pas montré de résistance particulière aux antibiotiques.

3.3. Détection et investigation des cas groupés et des phénomènes anormaux

Bref rappel de l'épidémie européenne de charbon chez des usagers d'héroïne :

Après un cas isolé survenu en 2000 en Norvège et passé inaperçu, l'épidémie a réellement débuté en 2009, avec 119 cas similaires au Royaume-Uni (majoritairement en Ecosse) et 3 en Allemagne enregistrés sur la période 2009-2010, dont 18 décès. Après une période silencieuse en 2011, 13 cas ont à nouveau été identifiés en 2012 (Danemark, Royaume-Uni, Allemagne, France). Depuis le début 2013, 8 nouveau cas sont apparus, dont 6 groupés au Royaume-Uni pouvant être liés à un même lot d'héroïne contaminée.

L'origine de cette épidémie reste pour l'instant indéterminée. Les similitudes épidémiologiques entre les cas sont avérées, les patients sont tous des consommateurs d'héroïne par injection, et les souches sont génétiquement très proches les unes des autres. Une contamination du produit lors de sa préparation, de son transport ou par les produits de coupe a été suspectée, cependant, aucun lot d'héroïne contaminée n'a pour l'instant été retrouvé.

Cette épidémie est également bien particulière car elle a conduit à identifier une nouvelle forme de charbon chez l'homme, très différente des formes cutanées habituellement décrites. En effet, le charbon d'injection se caractérise par un œdème massif, vraisemblablement dû à l'action du facteur d'œdème de B. anthracis. Dans cette forme, le traitement antibiotique n'est souvent pas suffisant et une intervention chirurgicale, avec débridement massif de la lésion, est alors nécessaire pour améliorer le pronostic.

Le charbon d'injection reste mal connu, que ce soit pour sa physiopathologie, les doses infectieuses, ou l'origine de la contamination, ce dernier point étant bien sûr primordial en termes de surveillance et de prévention.

Génotypage de la souche isolée en France :

Le laboratoire DGA MNRBC a procédé au typage de la souche et au séquençage de son génome. Le typage a été réalisé par l'analyse des polymorphismes nucléotidiques (SNPs, single nucleotide polymorphism) et des séquences répétées en tandem (MLVA, multiple locus variability analysis). La souche isolée en France appartient au cluster A.Br.008/009 et est très proche de souches asiatiques (Turquie, Iran). Elle présente de plus une grande


similarité avec la souche isolée chez des héroïnomanes britanniques et allemands, d'après les données de la littérature.

Compte tenu de la proximité des souches, il est apparu souhaitable que les mêmes déterminations soient réalisées dans les mêmes conditions sur d'autres isolats afin de confirmer la proximité, voire l'identité des souches européennes. Ce travail est en cours d'une part sur un échantillon de matériel génétique d'une souche britannique fourni par la Health Protection Agency, et sur la souche allemande obtenue de l'Institut de Microbiologie de la Bundeswher de Munich d'autre part.

Le compte-rendu du génotypage de la souche figure en annexe.

3.4. Contribution aux réseaux de surveillance internationaux, en particulier européens

Le nombre relativement faible de cas rend difficile la constitution d'un réseau permanent de laboratoires. Les échanges d'informations restent basés sur les contacts individuels noués historiquement avec les acteurs de recherche publique des pays concernés (HPA au Royaume-Uni, Institut Robert-Koch et Académie militaire de médecine en Allemagne).

L'absence de réel réseau européen des CNR, à l'instar de ce qui existe en santé animale, a été un frein à l'échange de matériel biologique, la compétition scientifique ayant tendance à prendre la pas sur la veille sanitaire.

3.5. Enquêtes ou études ponctuelles concourant à la surveillance Le laboratoire Santé publique – Environnement de la faculté de Pharmacie de Châtenay-Malabry réalise une surveillance des pratiques addictives en identifiant les produits employés, par analyse des "fonds de seringues" collectés à l'occasion des opérations d'échange de seringues. Une collaboration a été initiée afin de mettre à profit ce processus de collecte de ces échantillons pout tenter une détection de spores de B. anthracis dans ces résidus. Une méthode de détection par PCR en temps réel a été développée pour cette occasion et montre une limite de détection entre 1 et 10 spores. Les chances de succès restent évidemment très réduites compte tenu des faibles volumes recueillis. A ce jour, une quarantaine d'échantillons ont été testés qui se sont tous avérés négatifs.

4. Alerte L'alerte montante est réalisée directement auprès de l'InVS. A l'occasion du seul cas identifié, et compte tenu du contexte, l'alerte a été réalisée téléphoniquement dès la suspicion d'un cas de charbon. La déclaration de MDO a été réalisée par le centre hospitalier ayant accueilli le patient. Le CNR a également été préalerté par l'INVS dans deux situations particulières : - suspicion de contamination humaine liée à un cas animal suspect (finalement non

confirmé), - infection par un bacille à Gram positif avec tableau respiratoire (identification

définitive comme B. cereus, réalisée par le CHU de zone). La suspicion de charbon pulmonaire a justifié l'alerte transmise par la Cire à l'InVS.


5. Activités d’information, de formation et de conseil

- Activités de formation auxquelles participe le CNR :

o Stage "NRBC Médical" de formation des personnels de santé et primo

intervenants à la prise en charge des victimes NRBC, IRBA La Tronche

o Stage pratique de formation "Biotox-biosécurité" pour les personnels des laboratoires hospitaliers, IRBA La Tronche

o Master 2 Pro "Risque sanitaires NRBC", Université Paris VI et Ecole du Val-de-Grâce

o Certificat d'Etudes Universitaires "Bioterrorisme et agents contagieux hautement pathogènes", Faculté de Médecine de Marseille

- Activités de conseil aux professionnels Le CNR s'est doté de points de contact spécifiques : une adresse Email : [email protected] un téléphone mobile d'astreinte : 06 30 55 70 15 Ces points de contact sont à privilégier en raison de la restructuration en cours de l'IRBA (cf. perspectives 2013). Les demandes de conseils émanant de professionnels ont été peu nombreuses :

o après l'isolement d'une souche de charbon chez un héroïnomane à Chambéry, l'avis du CNR a été sollicité pour la surveillance des personnels hospitaliers potentiellement exposés et la décontamination des matériels de laboratoire, la souche ayant été manipulée avant son identification dans des conditions inadaptées à sa classe de risque

o trois demandes provenant de laboratoires hospitaliers concernaient l'identification différentielle de B. anthracis avec B. cereus après l'isolement de bacilles à Gram positif chez des patients. Les conseils ont porté sur la prise en charge médicale des patients, ainsi que sur les protocoles de diagnostic. Aucun cas de charbon n'a été confirmé à l'occasion de ces sollicitations.

o une demande a été formulée par un laboratoire tunisien pour la confirmation d'identification d'une souche de B. anthracis, sans qu'il y soit donné suite

o deux demandes ont eu trait à la prise en charge de contamination par B. cereus dans des filières de production alimentaire. Les demandeurs étaient à la recherche d'un hypothétique CNR pour cet agent et ont été orientés vers l'ANSES.

- Activités d’expertises auprès du ministère chargé de la santé, de l’Institut de veille sanitaire, des agences de sécurité sanitaire, de l’Haute Autorité en Santé ou de structure européenne (ECDC…) ou internationale (OMS…) Les activités d'expertise auprès des autorités nationales ont eu trait aux cas de contamination d'usagers d'héroïne en Europe :

o conférence téléphonique le 9 juillet 2012, autour du cas de Chambéry et sur la prise en charge des personnes exposées

o conférence téléphonique nationale le 10 juillet, organisée par la DGS/DUS o conférence téléphonique internationale le 11 juillet entre les agences de santé

européennes organisée par la Commission européenne DG Sanco/EWRS


Le CNR a été également sollicité dans le cadre de la prévention des risques chez les toxicomanes :

o réunion le 26 juillet avec le responsable du Centre d'évaluation et d'information sur la pharmacodépendance et la sociologue du Programme Usage de drogues de l'INVS,

o rencontre d'information sur les pratiques des usagers avec des représentants de l'association "SAFE". Cette association distribue des kits d'injection à usage unique pour la prévention des risques infectieux. A cette occasion, le CNR a été sollicité pour réaliser la démonstration de l'efficacité des filtres contenus dans ces kits vis-à-vis des spores de charbon. Cette étude est techniquement réalisable mais n'a pas pu être encore menée à bien car le modèle de filtre à tester n'est pas encore fixé.

6. Travaux de recherche et publications en lien direct avec l’activité du CNR Le CNR participe à des travaux de recherche portant sur le développement de contre-mesures médicales spécifiques vis à vis de la maladie du charbon. Il est le responsable scientifique d’un projet portant sur l’isolement et la caractérisation de phages spécifiques de B. anthracis. Ce projet mené en collaboration avec l’institut ELIAVA de Tbilissi (Géorgie) a pour objectifs d’évaluer le potentiel en termes de décontamination et de diagnostic d’un cocktail de phages. Il est conduit dans le cadre du PMG8 (Partenariat global G8) Au sein de l’IRBA, le CNR entretient de nombreux échanges scientifiques avec d’autres unités travaillant sur l’agent du charbon, notamment avec l’unité d’interactions hôtes-pathogènes. Son responsable est le conseiller technique de la DGA pour le développement d’un candidat-vaccin de l’Institut Pasteur, qui est en phase d’étude de toxicologie réglementaire. Des travaux sont également menés au sein de son unité sur l’utilisation de nanoparticules en tant que vecteur d’antibiotiques mais également en tant que nouvel adjuvant. Le CNR participe au comité de suivi d'une thèse financée par un projet ANR-ASTRID et encadrée par l'ANSES de Maisons-Alfort : "Développement d’outils de typage moléculaire de haute résolution et production d’anticorps recombinants (scFv) pour la détection et la différentiation de Bacillus anthracis". Le cas de charbon identifié en 2012 a fait l'objet d'une communication affichée lors du congrès de la Société française de microbiologie à Lille les 7-8 février 2013 : Premier cas de charbon d’injection chez un toxicomane en France : difficultés d'identification d'un pathogène rare en clinique humaine GEBEILE R., COMIO E., FORCET S., BEAUDOUIN E., DELPEUCH B., LEVAST M., THIBAULT F.


7. Programme d’activité N+1 et N+2 Délocalisation du CNR : L'évènement marquant pour l'année à venir est lié à la restructuration de l'institut de recherche biomédicale des armées. En effet, les antennes de l'IRBA fermeront le 30 juin 2013 en vue du regroupement de l'Institut sur le site unique de Brétigny sur Orge. Avant la mise à disposition des infrastructures définitives, des laboratoires tels que le CNR charbon vont être délocalisés provisoirement dans des laboratoires d'accueil. La permanence des activités sera cependant assurée. A compter du 1er juillet 2013, les coordonnés du CNR vont ainsi être modifiées comme suit: Adresse géographique :

Hôpital d'Instruction des Armées Desgenettes Service de Biologie

108, Boulevard Pinel 69275 LYON Cedex 03

Contacts :

Mobile : 06 30 55 70 15 Central téléphonique 04.72.36.60.00 Mél : [email protected]

Programme technique

Acquisition et caractérisation de spectres de référence en spectrométrie de masse Recherche de phages spécifiques d'intérêt médical Validation de détection immunochromatographique de PA dans les cultures de B.

anthracis Poursuite de la démarche qualité. L'hébergement par un établissement hospitalier

permettra de bénéficier de la démarche d'accréditation de celui-ci. Par ailleurs un ingénieur membre de l'équipe du CNR préparera un master2 de management de la qualité pendant l'année universitaire 2013-2014. Etablissement de convention de collaboration entre l'ANSES et le SSA en vue du partage d'information et de développements conjoints. Projet de séminaire sur le charbon. Les différents évènements auxquels le CNR a été associé cette année font ressortir une méconnaissance chez les intervenants professionnels des outils de diagnostic, des moyens de prise en charge des patients, voire des plans nationaux de crise. Il paraît opportun de proposer l'organisation, avec l'appui de l'InVS, d'un séminaire à destination des acteurs du domaine. Un tel séminaire permettrait de présenter les cas récents, les moyens de diagnostic et de gestion et serait de plus un moyen de renforcer la visibilité d'un CNR dont le volume d'activité reste très restreint. Ce séminaire pourrait être éventuellement organisé en satellite du séminaire annuel du réseau national des laboratoires Biotox-Piratox.


ANNEXES


ANNEXE 1 Cette annexe présente les points du rapport ne devant pas figurer dans le document principal. 1.1 Rappel des missions et objectifs majeurs du CNR d'après le cahier des charges publié en 2011 :


1.2 Description détaillée de l’équipe Le CNR charbon est hébergé par l'Institut de recherche biomédicale des armées, antenne de La Tronche (38). Il collabore avec l'Etablissement DGA-Maîtrise NRBC de Vert-le-Petit (91) qui réalise les opérations de génotypage et de séquençage de génomes. L'IRBA est organisé en divisions, en distinguant les activités de recherche et d'expertise. Le CNR charbon est coordonné par l'Unité d'Expertises biologiques (Division Expertises Infrastructures) et l'unité de bactériologie (Division Recherche scientifique) Les personnels participant aux activités du CNR appartiennent aux deux unités et sont listés dans le tableau ci-dessous :

Noms et Prénoms Qualifications* Statut ETP

PC THIBAULT François Responsable Unité Expertise

Biologique Praticien du service de

santé des armées 15%

MC VALADE Eric Responsable Unité Bactériologie Praticien du service de


PP BIOT Fabrice Scientifique - bactériologie Praticien du service de


FORCET Samuel Ingénieur-responsable qualité Agent sous contrat 5%

BADAUT Cyril Ingénieur de recherche Agent sous contrat 5%

TLCS CACLARD Arnaud Technicien - bactériologie Technicien de

laboratoire militaire 5%

TLCN BRUN Solenne Technicien - bactériologie Technicien de

laboratoire militaire 5%

Tous ces personnels sont rémunérés par le Ministère de la Défense. L'organigramme du CNR est présenté en page suivante.


Organigramme hiérarchique du CNR charbon

DIVISION SUPPORT DE LA

RECHERCHE

DIVISION APPUI

SCIENTIFIQUE

Département infrastructure

Département services

Département plates-formes

Département expertises

Cellule métrologie et maintenance

Pôle Biologie Agents

Infectieux

Pôle Nucléaire, Radiologique,

Chimique

Pôle Recherche Médicale

Opérationnelle

Pôle Facteurs humains

Unité « Toxicologie et

chimie analytique »

Unité « Expertises biologiques » PC Thibault ASC Forcet ASC Badaut

Unité « Médecine

aéronautique opérationnelle»

Unité Interaction

hôte/ agents pathogènes

Unité de bactériologie

MC Valade PP Biot

TLCS Caclard TLCN Brun

Unité Biotechnologie des anticorps-

toxines

Unité de virologie

Département de

microbiologie

Direction centrale du service de santé des armées (DCSSA)

Offre de soins et Expertise Sous-direction Hôpitaux-Recherche

DIVISION EXPERTISE ET

INFRASTRUCTURE

DIVISION RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

Institut de recherche biomédicale des armées

(IRBA)

DIRECTION

Seules Les entités encadrées en rouge sont concernées par le CNR Biotypage des souches

bactériennes

DGA Maîtrise NRBC


1.3 Description des locaux et de l’équipement du CNR L'IRBA – La Tronche dispose de laboratoires de niveau de sécurité biologique 2 et 3 pour la manipulation des agents pathogènes, dont : - un laboratoire de bactériologie de 250 m2 comportant les moyens conventionnels de culture et d'identification phénotypique des bactéries et une zone d'expérimentation animale - un laboratoire modulaire de bactériologie de 28 m2, équipé pour l'infection de petits animaux par aérosols Les principaux équipements sont : - automates d'extraction d'ADN (MagNApure Roche, EZ1 Qiagen) - appareils de PCR conventionnelle et en temps réel (LighCycler 2.0 Roche, ABI 7000 Applied, SmartCycler Cepheid, GeneXpert Cepheid) - système MALDI Biotyper Bruker pour l'identification des bactéries par spectrométrie de masse - microscopes à épifluorescence OLYMPUS - microscope électronique à transmission JEOL 1010 - microscope biphotonique confocal Zeiss LSM 710 - vidéomicroscope Olympus IX81 Sur le site DGA-Maîtrise NRBC : - thermocycleurs conventionnels et en temps réel - séquenceurs capillaires (Beckman et Applied) - Labchip (Calliper) pour la mesure de taille des amplicons - séquenceur haut débit, MiSeq (Illumina) 2.1 Capacités techniques du CNR : - Liste des techniques : o Techniques disponibles Techniques phénotypiques : détermination des caractères culturaux (Gram, hémolyse, mobilité, isolement sur milieux sélectifs) Etude de la sensibilité aux antibiotiques en milieu solide (bandelettes Etest®) ou liquide Techniques moléculaires : détection de marqueurs plasmidiques de virulence et chromosomiques spécifiques de B. anthracis Identification par spectrométrie de masse MALDI TOF Sur le site DGA-Maîtrise NRBC : génotypage par VNTR er SNP, séquencage génomique NGS o Techniques développées l’année N: brève description (principes, validation)

-Validation de détection multiplexe de pathogènes bactériens de classe 3 sur automate GeneXpert® Cepheid

-Constitution de base de données de spectres de référence MALDI TOF sur MALDIBiotyper®. La collection de souches du laboratoire est mise à profit pour réaliser une base de données pour l'identification des bactéries hautement pathogènes. Les panels de souches sont bien plus étendus que les bases de données natives de l'appareil, et devrait à terme autoriser une détection plus fine des différences subspécifiques.

-Validation d'une méthode de détection des spores de B. anthracis en milieu méthanol. Ce développement a été réalisé pour soutenir l'étude mentionnée plus haut, réalisée en collaboration avec le faculté de Pharmacie de Châtenay-Malabry pour l'analyse des "fonds seringues". La limite de détection réalisée sur des suspensions de spores titrées préparées au laboratoire, est inférieure à 10 spores/mL. o Techniques en développement : principes et état d’avancement Identification de B. anthracis en culture par détection immunologique de l'antigène protecteur PA.


Cette technique a été publiée et nécessite une validation complémentaire sur un large panel de souches avant d'entrer en utilisation de routine. - Collections de souches, antigènes ou immun-sérums de référence : L'IRBA dispose d'une collection de 600 souches dont environ 150 de B. anthracis. Ces souches sont conservées à -80°C en milieu glycérolé, soit en tubes soit en paillettes à usage unique. Compte tenu de la rareté des cas, la majorité des souches ne provient pas des activités de CNR. La collection appartenant au Ministère de la Défense est soumise à une gouvernance spécifique, sous le contrôle de l'Etat-Major des armées (EMA). Les souches appartenant à la Défense ne peuvent être distribuées que sur autorisation de l'EMA. Celles provenant des activités de CNR peuvent être distribuées sur autorisation de l'INVS et avec déclaration à l'EMA. Ces dispositions ne dispensent pas de l'application des autres règlementations relatives aux microorganismes et toxines et au transport des substances infectieuses;


ANNEXE 2 Compte rendu du génotypage de la souche 2012-014 réalisé par l'établissement DGA-Maîtrise NRBC

Compte-rendu d’analyse de l’échantillon 2012-014

1. Généralités

DGA Maîtrise NRBC a analysé l’échantillon 2012-014 en juillet 2012.

Une mesure de contrôle de la concentration d’ADN a été réalisée sur Qubit et a donné une

concentration de 4.5 ng/µL.

L’échantillon a été alors séparé pour réaliser :

- une analyse SNP ;

- une analyse MLVA ;

- un séquençage haut débit.

2. Analyse SNP

L’analyse SNP consiste en la caractérisation d’un petit nombre de SNPs qui permettent de

placer la souche analysée dans une des grandes branches de l’arbre phylogénétique de

l’espèce Bacillus anthracis. La méthode a été développée par Van Ert, et la Figure 1 présente

les grandes branches définies par cette méthode.

Figure 1 : arbre dressé à partir de 14 marqueurs SNP (canonical SNP ou canSNP) indiqués en rouge dans la figure. D’après Van Ert et al. 2007.

10 SNPs ont été testés sur l’échantillon 2012-014, indiquant que la souche analysée

appartenait au cluster A.Br.008/009, dont A.Br.WNA est un sous-groupe. La répartition

géographique de ce cluster est représentée dans la Figure 2. Cette répartition est très large,

couvrant l’essentiel de l’hémisphère nord, avec quelques isolats en Amérique du Sud et dans

la corne de l’Afrique (cluster le plus répandu géographiquement).


Figure 2 : répartition géographique des clusters définis par les canSNPs. Le code couleur est identique à la figure 1. Pour mémoire, le cluster auquel appartient la souche étudiée est représenté en rouge et en bleu roi sur la figure. D’après Van Ert et al. 2007.

3. Analyses par MLVA de l’échantillon ADN 2012-014 par l’analyseur de taille de fragments CEQ-8000 Beckman-Coulter

I- Introduction

Afin d’identifier une souche bactérienne, DGA Maîtrise NRBC a développé des outils

moléculaires de génotypage permettant la caractérisation précise d’un agent bactérien. La

technique utilisée est appelée MLVA pour Multiple Loci Variable Tandem Repeat Analysis.

Elle est basée sur la mesure de la taille de régions polymorphes VNTR (Variable Number

Tandem Repeats) de l’ADN, c’est-à-dire de régions dont la taille est variable d’une souche à

l’autre après l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction).

L’amplification pour chacun des VNTR produit un fragment (allèle) dont la taille est

variable en fonction des souches. La taille des différents allèles en paires de bases (bp)

observés est convertie en nombre d’unités répétées pour chacun des locus ce qui permet de

générer, au final pour chaque souche, un code numérique ou profil génétique constitué par

une série de nombres.

Les profils sont ensuite comparés dans des bases de données développées par DGA

Maîtrise NRBC afin de distinguer les souches entre elles. Les protocoles de typage mis en

œuvre s’appuient sur l’analyse de marqueurs (VNTR) qui font actuellement référence dans le

domaine et qui ont été décrits dans plusieurs revues internationales. Ainsi l’identification

s’effectue à l’aide de 30 VNTRs (MLVA-30) de l’agent Bacillus anthracis.

II- Méthodes d’analyse

Afin de générer le profil génétique d’un isolat, les réactions de PCR sont réalisées en

format multiplex. Le multiplexage réduit la quantité de matériel génétique initialement

nécessaire et permet d’obtenir plus rapidement les résultats. Les 30 marqueurs polymorphes

informatifs sont amplifiés en 5 réactions de PCR. Les tailles des fragments d’ADN produits

sont mesurées après électrophorèse capillaire sur un analyseur de taille de fragments (CEQ-

8000 Beckman Coulter) qui convertit automatiquement la taille des fragments en nombre


d’unités répétées. Les résultats sont ensuite exportés dans des bases de données (Bionumerics)

afin d’analyser le profil génétique de la souche comparativement aux données publiées.

III- Résultats

Un résultat interprétable a été obtenu pour 28 locus (sur 30) pour l’échantillon. Néanmoins,

les 28 mesures exploitables sont suffisantes pour permettre l’exploitation des données de

génotypage dans les bases de données.

La représentation en minimum spanning tree montre que l’échantillon se groupe avec des

isolats appartenant à la branche A.Br 008/009, confirmant l’analyse par les SNP.

La réalisation d’un dendrogramme montre à la fois l’unicité du profil par rapport aux

données connues, tant dans la littérature que dans le souchier Défense et une grande proximité

avec la souche Ba-Héroïne. Plus largement, la souche analysée s’agrège dans un groupe

comprenant des souches de Turquie, Pakistan et Iran.

Conclusion : la souche analysée est proche de souches asiatiques (Turquie, Iran) et

présente une grande similarité avec la souche isolée chez des héroïnomanes britanniques et

allemands. La souche est donc probablement issue de la même zone géographique,

déterminée comme étant la Turquie centrale lors de l’épisode écossais de contamination de

l’héroïne. Il avait alors été conclu à une contamination accidentelle de lots d’héroïne en

Turquie, zone de transit connue de l’héroïne entre Afghanistan et Europe. Cette contamination

serait due au contact de l’héroïne avec des peaux d’animaux contaminés, tels les chèvres, ces

peaux servant à la dissimulation de la drogue.

4. Séquençage massif

I. Introduction

Le séquençage complet du génome bactérien est une source d’information substantielle.

L’accès à cette information est devenu moins onéreuse et plus rapide grâce aux

développements des biotechnologies de ces dernières années. En effet, ces technologies de

séquençage à haut débit (NGS pour Next Genome Sequencing) permettent, à présent, de

séquencer plusieurs génomes procaryotes et eucaryotes complets en quelques jours alors que

plusieurs mois voire des années étaient nécessaire auparavant. L’acquisition récente à DGA

Maîtrise NBRC du séquenceur haut débit, MiSeq (Illumina), a permis de réaliser le

séquençage de l’échantillon.

II. Méthodes

La librairie (lib014) a été réalisée à l’aide du kit Nextera DNA Sample Preparation (Illumina).

Le séquençage de lib014 a été réalisé en « Paired end » (PE) avec le MiSeq Reagent kit (300-

cycles) d’Illumina sur le séquenceur haut débit MiSeq (Illumina). Le séquençage en « Paired

end » permet de séquencer en une seule réaction de séquençage, les deux extrémités d’ADN

fragmenté (~ 500 pb) provenant d’une librairie.

En complément, un contrôle interne a été réalisé. Ce dernier est constitué d’une librairie phiX,

qui a été ajouté à la réaction de séquençage contenant lib014. La proportion des librairies était

de 1% et 99% pour celle du phiX et celle de lib014, respectivement.


III. Résultats

A partir des données de séquençage, deux types d’analyses ont été réalisées. Pour la première

analyse de « re-sequencing », l’ensemble des lectures a été aligné sur des génomes

entièrement séquencés et disponibles. La seconde analyse a consisté à reconstituer les VNTR

à partir du jeu de données brut.

A. Analyse « re-sequencing »

La souche séquencée est très proche des souches CDC684 et H9401 avec 98,3% et 98,2%

d’identité de séquence respectivement.

C. Analyse MLVA, reconstruction des VNTR

L’identification des 31 marqueurs du schéma MLVA31 est recherchée grâce au programme

interne VNTRRecontruction développé par DGA Maîtrise NRBC. L’étape cruciale dans ce

programme est l’assemblage.

L’analyse avec 2 assembleurs à permis de retrouver tous les marqueurs du schéma MLVA31

dans un cas et 29 dans l’autre.

IV. Conclusion

Dans l’analyse MLVA31, la souche séquencée est regroupée avec des souches d'Asie

centrale. Ces dernières sont regroupées avec les données obtenues par le CEQ-8000 (MLVA).

Parmi les trois souches les plus proches de ces dernières, l’une est annotée « Heroin », isolée

en Ecosse (2009) et les deux autres sont des souches d’origine turque.

Les données de séquences ainsi que leur analyse sont en cohérence avec celles obtenues par le

CEQ-8000.

Documents

Rapport annuel d’activité 2013 - École du Val-de-Grâce · INSTITUT DE RECHERCHE ... Francisella tularensis, Burkholderia pseudomallei, B. mallei, ... qui n'a pas fait apparaître