1

LP Imuno 2 REACTII DE AGLUTINARE IMUNA

Reactiile de aglutinare sunt reactii Ag-Ac vizualizate prin formarea de aglutinari ale Ag particulate (natural sau artificial) de catre Ig; aglutinarea rezulta din cross-linkarea particulelor Ag de catre Ac.Avantaje: sunt relativ usor de realizat din punct de vedere tehnic, sunt relativ sensibile si specifice, unele sunt foarte rapide.

Se folosesc: Ac - aglutinine ( Ac care produc aglutinarea Ag) Ag:

Ag corpusculate/particulate “natural”: celule (hematii, bacterii s.a) = aglutinarea directa Ag solubile care sunt adsorbite pe suprafata unei hematii sau pe particule de latex = aglutinare pasiva

Cand Ag corpusculat este hematia/ cand epitopul este situat pe hematie se foloseste termenul de hemaglutinare.Se pot utiliza pentru evidentierea unui Ac intr-un lichid biologic folosindu-se un Ag particulat cunoscut.Se pot utiliza pentru detectia unui Ag necunoscut intr-un lichid biologic (ser, LCR) folosindu-se seruri diagnostice cu Ac cunoscut;Pot fi calitative sau semicantitative (titrul Ac serici).Se pot efectua in tuburi/ pe lame/ pe microplaci Reactia Ag-Ac este vizualizata prin formarea de mici agregate (vizualizate macroscopic sau microscopic, in functie de tehnica).

Factori care influenteaza reactia de aglutinare: Tipul de Ig folosite: IgM sunt aglutinine mult mai eficiente prin forma lor pentamerica Excesul de Ac in reactie poate inhiba aglutinarea = efect prozone = la concentratii mari de Ac, situsurile de legare ale acestora

depasesc numeric epitopii care pot fi legati astfel incat probabilitatea ca un Ac sa se lege doar la un situs de legare este foarte mare; daca Ac se leaga doar printr-un situs de legare el nu poate produce aglutinare; acest lucru se probeaza prin cresterea dilutiei solutiei in care se gasesc Ac: la concentratii mai mici de Ac se va produce aglutinarea.

IgG leaga mai greu 2 epitopi de pe particule diferite, mai ales eritrocite sau alte celule care se resping fiind incarcate electric la suprafata; insa daca se realizeaza conditii specifice, ex. modificarea concentratiei de ioni din solutie a.i. sa scada fortele de respigere dintre hematii si aceste Ig pot deveni aglutinante.

limitarea reactiei de aglutinare apare in cazul unor epitopi ‘ascunsi’ in ‘buzunare’ membranare ale Ag corpusculat (bacterie). Temperatura la care se realizeaza reactia; pH-ul mediului; miscarea tubului/ centrifugarea

I. HEMAGLUTINAREA IMUNA

A) Hemaglutinare directa = aglutinarea e realizata de Ac care interactioneaza cu Ag proprii de pe suprafata hematiei.B) Hemaglutinare pasiva = aglutinarea e realizata de Ac care interactioneaza cu Ag solubile adsorbite pe suprafata hematei (nu

propii)C) Hemaglutinare indirecta = aglutinarea nu e realizata de Ac care interactioneaza cu epitopii de pe hematie, ci de Ac secundari,

care recunosc si leaga Ac primari (Ac primari recunosc epitopi ai hematiei)

A) HEMAGLUTINAREA DIRECTA - se foloseste pentru determinarea grupelor de sange.

Sistemul antigenic eritrocitar ABO (ABH) - grup complet Ag +Ac

Ag I codificat de gena de pe cr. 19; Ag H codificat de gena H (codifica fucozil transferaza transformand 98-99% din Ag I in Ag H 45%Ag A, B, codificati de gena de pe cr. 9 care prezinta trei alele: alela A si alela B codifica NAGA respectiv Gal - transferaze care modifica Ag H in Ag A (40%) respectiv Ag B (10%). 5% din populatie prezinta si alela A si alela B (exprimate codominant) prezentand ambele tipuri de Ag A si B. Alela O este o alela silentioasa care lasa Ag H nemodificat.

Ag H = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -FucAg A = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc - NAGalAAg B = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc - Gal

Glu= glucoza; Gal = galactoza; NAGA= N-acetil-glucozamina; Fuc = fucoza

Transmiterea genelor ABO se face mendelian.Grup de sange O = alele de tip OGrup de sange A = alele AA sau AO; Grup de sange B = alele BB sau BOGrup de sange AB = alele AB

Exista si alte celule care exprima Ag din grupul ABO pe suprafata lor (in special celule epiteliale si endoteliale).Exista posibilitatea ca aceste Ag sa se excrete in unele secretii (saliva, sperma) la unii indivizi numiti secretori

2

Grup Ag Ac anti A Ac anti BO H + +A A - +B B + -AB A + B - -

Ac anti-A si/sau anti-B apar ca urmare a cross-imunizarii cu Ag bacteriene ( enterobacteriaceae ) care poseda in membrana externa oligozaharide similare cu antigenele A si B. Se vor dezvolta Ac (in general de tip IgM; persoanele de grup O pot dezvolta si IgG) impotriva Ag care lipsesc de pe membrana hematiei gazdei (clonele care produc Ac anti-Ag gazdei sunt deletate in cursul procesului de toleranta).

Testul Beth-Vincent : pentru aflarea grupei ABO se pun in contact hematiile pacientului cu ser anti A, anti B

Grupul sg. + ser anti-A + ser anti-BO (-) hemaglutinare (-) hemaglutinareA (+) (-)B (-) (+)AB (+) (+)

Test Simonin : serul pacientului se pune in contact cu hematii care prezinta antigen A respectiv antigen B

Grupul sg. Ac din ser Hematii cu Ag A Hematii cu Ag BO anti-A anti-B (+)hemaglutinare (+)hemaglutinareA anti-B (-) (+)B anti-A (+) (-)AB - (-) (-)

Pentru transfuzii : grupele pot primi sange izogrup; toate grupele pot primi grup O; grupul AB poate primi toate grupele (compatibilitate relativa ! donatori periculosi !!)

Transfuzie de sange incompatibil grup ABO: Exemplu: transfuzie de sange grup B la un pacient grup A: IgM anti-A prezenti in sangele pacientului vor recunoaste Ag B de pe suprafata hematiilor donorului si vor declansa liza hematiilor intravascular prin activarea cascadei complemetului cu formare de MAC. Manifestari clinice si paraclinice(se dezvolta rapid de la momentul transfuziei): stare de rau, febra, frisoane, dureri lombare, hemoglobinemie, hiperbilirubinemie neconjugata, hemoglobinurie, necroza tubulara renala ( prin precipitarea unei cantitati mari de Hb care ajunge la nivelul tubilor contorti; +/- insuficienta renala), CID, soc.

Donatori periculosi = politransfuzati; femei in primul an dupa nastere: au nivele crescute de Ac anti Ag care le lipsesc: ex. donator grup O cu nivele f. mari de Ac anti-A si Ac anti-B care ajung in plasma unui primitor de grup A/B/AB si, chiar daca sufera un efect de dilutie, fiind in cantitati mari pot determina o hemoliza semnificativa.

Sistemul antigenic eritrocitar Rh - grup incomplet - doar Ag

Sistemul antigenic Rh consta in proteine transmembranare, exprimate strict pe membrana eritrocitelor codificate de 2 gene: RhD si RhCE situate pe cr. 1 .

gena RhD: alela D codifica proteina D (Ag D) in timp ce alela d = lipsa codificarii Ag Dgena RhCE codifica proteinnele C/c si E/e.

Rh pozitiv - Ag D este exprimat pe suprafata hematiei Rh negativ - Ag D nu este exprimat pe suprafata hematiei

Lipsa (codificata genetic) a unei proteine (ex. D) apartinand acestui grup face ca, in urma expunerii persoanei respective la eritrocite care au exprimata pe suprafata lor Ag D, in sangele primitorului sa apara Ac antiD de tip IgG.Expunerea la hematii Rh(+) a unei persoane Rh(-) se poate face in urma transfuziilor, sau in urma sarcinii: femei Rh(-) cu fat Rh (+).

Transfuzii cu sange Rh(+) la persoane cu Rh (-) - Se dezvolta Ac anti-D. - La transfuzii repetate cu Ac anti-D vor reactiona cu Ag D de pe hematiile Rh(+) ale donorului si vor opsoniza aceste hematii,

care vor fi recunoscute de Mf splenice si indepartate din circulatie.- Semnele apar de obicei la cateva zile dupa transfuzie: febra si anemie hemolitica ( extravasculara).

Mame Rh(-) cu fat Rh(+)

3

Daca mama nu a fost anterior imunizata prin transfuzii de sange Rh(+), ea va dezvolta Ac anti-D in cursul primei sarcini, cand va fi expusa la eritrocitele fatului ( mai ales in timpul nasterii, cand se separa placenta de peretele uterin, o cantitate din sangele fetal ajunge in circulatia materna). Se formeaza initial IgM care reactioneaza cu eritrocitele fetale ajunse in circulatia materna; apoi IgG (←LB cu memorie). La urmatoarea sarcina IgG anti-D din sangele matern pot traversa placenta si ajung in sangele fatului si afecteaza eritrocitele fatului care dezvolta anemie – forme variate, de la usoara la severa cand riscul de moarte intrauterina a fatului e crescut. Post-partum in cazurile de hemoliza severa la fat apare exces de bilirubina indirecta, lipofila, care se poate depune la nivelul structurilor cerebrale (nucleii caudati), cu afectarea acestora - icterul nuclear.Preventia aparitiei Ac anti-D la femeia insarcinata se realizeaza prin administrarea cu ~ 48 ore inaintea nasterii /avortului /amniocentezei unei doze de Ig anti-D care vor reactiona cu eritrocitele fetale si impiedica reactia materna la acestea.

B) HEMAGLUTINAREA PASIVA Hematiile sunt tratate cu acid tanic sau clorura de crom ( care promoveaza adsorbtia Ag pe membrana hematiei), dupa care se amesteca cu o solutie ce contine un Ag solubil, Ag care va fi ulterior adsorbit pe suprafata hematiei.Serul pacientului care contine sau nu Ac specific pentru Ag adsorbit se pune in contact cu hematiile asfel tratate. Daca serul pacientului contine Ac se observa aglutinarea.

C) HEMAGLUTINAREA INDIRECTA

TESTUL COOMBS = testul antiglobulinei

TESTUL COOMBS DIRECT = detecteaza prezenta Ac anti-hematie si sau/a complementului pe suprafata hematiilor pacientului

- Se incubeaza hematiile pacientului si un ser anti-Ig umana/ ser anti complement uman- Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor Ac anti-hematie si sunt puse in contact cu ser anti-Ig umana atunci Ac anti-

hematie sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umana si se produce aglutinarea. - Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor depuse componente ale complementului si sunt puse in contact cu ser anti-

complement uman, atunci complemetul depus va fi recunoscut de Ac anti-complement uman si se produce aglutinarea.

TESTUL COOMBS INDIRECT = detecteaza prezenta Ac anti-hematie liberi in serul pacientului

- Se folosesc hematii normale (din alta sursa); serul pacientului; ser anti-Ig umana- Se incubeaza initial hematiile cu serul pacientului; daca serul pacientului contine Ac anti-hematie, acestia se vor depune pe

suprafata hematiilor; ulterior se incubeaza hematiile cu serul anti-Ig umana; daca exista depusi Ac pe suprafata hematiilor, acestia sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umana si se produce aglutinarea.\

Test Coombs direct/indirect pozitiv = se produce aglutinarea. Aplicatii:

- diagnosticul AHAI: Coombs direct +indirect pozitiv => AHAI cu auto Ac la cald (tip IgG anti AgD - Rh), Coombs direct pozitiv pt complement si restul negative => AHAI cu auto Ac la rece (tip IgM anti Ag ABO)

- tipizarea grupelor de sange: testul Coombs indirect – evidentiaza prezenta Ac anti-A, anti-B, anti-D. – in ser; direct - evidentiaza IgG anti-D materni pe suprafata hematiilor fetale.

II. AGLUTINAREA BACTERIANA

Metoda tip Widal = detectarea Ac in serul pacientului

Principiu: un pacient infectat cu o bacterie produce Ac specifici pentru determinanti Ag ai bacteriei respective.- din serul pacientului banuit infectat cu o anume bacterie se efectuaza dilutii seriate care se pun in contact cu bacteria respectiva- daca pacientul prezinta infectia si Ac respectivi va apare aglutinarea bacteriana. - in functie de cea mai mare dilutie la care apare aglutinarea se calculeaza titrul Ac aglutinanti; titrul se exprima ca inversul ultimei

dilutii la care apare aglutinarea; ex. aglutinarea apare la dilutie 1/320 si nu mai apare la dilutie 1/640 atunci titrul Ac este 320;

Aplicatii practice:- Reactia Widal – pentru diagnosticul febrei tifoide/paratifoide – serul pacientului in dilutii seriate se pune in contact salmonella

typhi/paratyphi sau cu Ag O, H, Vi – obtinute prin prelucrare in laborator a unor culturi de germeni- Reactia Weil-Felix – pentru diagnosticul unor Rickettsii; serul pacientului infectat cu Rickettsii aglutineaza cu unele Ag ale unor

tipuri de Proteus (cross-reactivitate): pentru Rickettsile care dau tifosul exantematic se foloseste Proteus vulgaris tulpina OX.19. Reactia poate fi adaptata cu alte tulpini de Proteus pentru alte tipuri de Rickettsii. Nu toate Rickettsiile pot fi diagnosticate astfel. Reactii fals (+) in infectiile cu Proteus!!!

Metoda Gruber = detectarea Ag

4

Se recolteaza de la pacient probe biologice din care se realizeaza culturi bacteriene; aceste culturi sunt ulterior transferate intr-un mediu lichid si incubate cu Ac specifici pentru specie/tip de bacterie. Prezenta aglutinarii poate pune diagnosticul de specie, tip, etc. in functie de Ac folositi.

III. AGLUTINAREA PE PARTICULE DE LATEX (LATEX-AGLUTINARE)

A. Reactia de latex-aglutinare pasiva - detectarea Ac folosind un Ag cunoscut adsorbit pe particulele de latex

- se evalueaza prezenta unui Ac in serul pacientului pe care vrem sa il evaluam calitativ/semicantitativ - se folosesc dilutii seriate din serul pacientului care se pun in contact cu Ag adsorbit pe particule de latex- testul este pozitiv (exista Ac) daca apare latex-aglutinarea

Aplicatii practice:- Determinarea factorului reumatoid (FR)

- FR = autoanticorpi de tip IgM (majoritatea) indreptati impotriva (anti) Ig umane de tip IgG- pe particule de latex sunt adsorbite IgG (care aici joaca rol de Ag!) care se pun in contact cu serul pacientului.- daca FR este prezent se produce aglutinarea;- determinarea poate fi calitativa sau semicantitativa (utilizand dilutii seriate din serul pacientului) - FR apare in poliartrita reumatoida(cele mai mari titruri), dar si LES, Sd. Sjogren; in 5% din cazuri poate apare la normal;

- Determinarea ASLO - serul pacientului in contact cu SLO adsorbita pe particule de latex

B. Reactia de latex-aglutinare pasiva reversa - detectarea Ag folosind un Ac cunoscut adsorbit pe particule de latex

- se folosesc culturi bacteriene din probele biologice recoltate de la pacient care se pun in contact cu seruri imune ce contin Ac specifici adsorbiti pe particule de latex

- teste de evaluare rapida a infectiilor - testul este pozitiv (exista Ag) daca apare latex-aglutinarea

C. Reactii de aglutinoinhibare - testul se considera pozitiv daca nu se produce aglutinarea.

- sunt de tip calitativ; se evidentiaza prezenta sau absenta unui Ag intr-un produs biologic.- Exemplu: unele teste de sarcina sunt pe acest principiu. In cursul sarcinii creste nivelul β-hCG in plasma si in urina.

1. se pun in contact Ac anti- β-hCG cu produsul biologic de evaluat: urina 2. se adauga β-hCG (exogen) adsorbit pe particule de latex

- Test pozitiv: exista β-hCG in urina => Ac anti- β-hCG sunt deja legati de β-hCG si nu se mai pot lega de β-hCG adsorbit pe particulele de latex => nu se produce aglutinarea.

- Test negativ: nu exista β-hCG in urina => Ac anti- β-hCG sunt liberi si se pot lega de β-hCG adsorbit pe particulele de latex => se produce aglutinarea.

***REACTII DE AGLUTINARE NON-IMUNA

Exista virusuri, toxine bacteriene, compusi chimici, care induc hemaglutinare non-imuna. Virusurile pot determina aglutinarea hematiilor in absenta unei reactii Ag-Ac datorita prezentei unor proteine de suprafata – hemaglutinine. Aceasta hemaglutinare virala caracterizeaza vir. urlian, rujeolei, gripal, etc.

REACTIA DE HEMAGLUTINOINHIBARE VIRALA- acest tip de hemaglutinare poate fi inhibata de prezenta Ac neutralizanti ai virusului respectiv .- este in fapt o reactie de neutralizare = o reactie Ag-Ac in care efectele (negative) ale unui virus sunt blocate. - Testul este folosit pentru subtipizarea virusurilor gripale (se folosesc seruri imune cu Ac specifici impotriva unui

anume tip de virus gripal care se pun in contact cu produse biologice recoltate de la pacient).