RECENTI ACQUISIZIONI NELLA DIAGNOSTICA … · i micobatteri???? I MICOBATTERI noti anche come: BK – Bacillo di Koch (colui a cui si deve la loro scoperta, nel 1882) BAAR – cio

RECENTI ACQUISIZIONI RECENTI ACQUISIZIONI

NELLA DIAGNOSTICA NELLA DIAGNOSTICA

MICROBIOLOGICA DELLA MICROBIOLOGICA DELLA

MALATTIA TUBERCOLAREMALATTIA TUBERCOLARERoma, 26 Giugno 2013Roma, 26 Giugno 2013

ANNA CAMAGGI ANNA CAMAGGI S.C. MICROBIOLOGIA E VIROLOGIAS.C. MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA

A.O.U. MAGGIORE DELLA CARITAA.O.U. MAGGIORE DELLA CARITA’’-- NOVARANOVARA

i micobatteri????i micobatteri????

I MICOBATTERII MICOBATTERI

noti anche come:noti anche come:

��BK BK –– BBacillo di acillo di KKoch (colui a cui si deve och (colui a cui si deve

la loro scoperta, nel 1882)la loro scoperta, nel 1882)

��BAAR BAAR –– ciocioèè BBastoncini astoncini AAlcollcol-- AAcido cido

RResistentiesistenti

MICOBATTERI DI INTERESSE CLINICOMICOBATTERI DI INTERESSE CLINICO

��M. tuberculosis M. tuberculosis complexcomplexoo M. tuberculosisM. tuberculosisoo M. bovisM. bovisoo M. bovis M. bovis BCGBCGoo M. africanumM. africanumoo M. canettiiM. canettiioo M. microtiM. microti

��M. lepraeM. leprae

��micobatteri non tubercolari o micobatteri non tubercolari o MNT MNT (O NTM, in inglese)(O NTM, in inglese)

TB malattia storica, che non appartiene alla storiaTB malattia storica, che non appartiene alla storia

Infatti nel 2011 secondo lInfatti nel 2011 secondo l’’OMS:OMS:�� oltre oltre 8 milioni di nuovi casi 8 milioni di nuovi casi di tubercolosi, e circa di tubercolosi, e circa 2 milioni di tali di tali pazienti sono morti (quasi pazienti sono morti (quasi 50005000 persone al giorno)persone al giorno)

��1/3 della popolazione mondiale 1/3 della popolazione mondiale risulta infettata dal micobatterio risulta infettata dal micobatterio tubercolaretubercolare

Dopo più di 130 anni dalla scoperta del bacillo della tubercolosi, R. Koch 24 marzo 1882, la malattia, rappresenta ancora oggi la principale causa di morte da singolo agente infettivo

(11(11°°Congresso Nazionale della SIMIT, la SocietCongresso Nazionale della SIMIT, la Societàà Italiana di Malattie Infettive e TropicaliItaliana di Malattie Infettive e Tropicali, ottobre 2012)

GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2012GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2012GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2012GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2012

Certo per una malattia Certo per una malattia prevedibile e curabile come la prevedibile e curabile come la tubercolosi sono dei numeri tubercolosi sono dei numeri

drammatici!! drammatici!!

La maggior parte dei casi era localizzata nei paesi in La maggior parte dei casi era localizzata nei paesi in via di sviluppo, ma da diversi anni si via di sviluppo, ma da diversi anni si èè registrato un registrato un aumento anche nei paesi industrializzatiaumento anche nei paesi industrializzati..Fra le cause di tale inversione di tendenza

Lo smantellamento del sistema di sorveglianza antitubercolareL’aumento dei flussi migratori, in particolare dai paesi ad alta

endemia tubercolareL’invecchiamento della popolazioneL’aumento della popolazione con deficit del sistema immunitarioLa presenza di sacche di emarginazione e povertà

Nel 1993 lNel 1993 l’’OMS dichiara la TB: OMS dichiara la TB: ““unun’’emergenza mondialeemergenza mondiale””

The The Global Plan to Stop TB 2006Global Plan to Stop TB 2006––20152015

WHO (through its Strategic and Technical Advisory Group on TB [STAG-TB])

has endorsed since 2007:

�liquid culture for rapid drug susceptibility testing, combined with rapid

speciation methods; endorsed by WHO in 2007.

�Molecular line probe assay (LPA) for rapid screening for multidrug resistance

endorsed in 2008.

�Non-commercial culture methods for rapid drug susceptibility testing endorsed

by WHO in 2009.

�Coupled with the recommended use of light-emitting diode (LED) fluorescence

microscopy for more sensitive smear microscopy (endorsed in 2009) and the

use of same-day sputum collection and examination to reduce initial default

(also called ‘front-loaded’ microscopy, also endorsed in 2009), this approach

significantly increases the likelihood of better case detection at the most

peripheral levels of health systems.

�The recent development of a fully automated, real-time Nucleic Acid

Amplification; test that allows a diagnosis of TB and assessment of rifampicin

resistance in less than two hours could have a profound impact on the detection

of TB and MDR-TB cases, at least at district and referral level. The technology

was endorsed by WHO in late 2010 and plans for its operationalization in

endemic countries were immediately initialized

A proposito di laboratoriA proposito di laboratori

I principali organismi internazionali I principali organismi internazionali

ritengono necessari, per i paesi a bassa ritengono necessari, per i paesi a bassa

incidenza di tubercolosi, centralizzare le incidenza di tubercolosi, centralizzare le

procedure diagnostiche in pochi laboratori. procedure diagnostiche in pochi laboratori.

La qualitLa qualitàà delle prestazioni diagnostiche delle prestazioni diagnostiche èè

infatti legata allinfatti legata all’’esperienza professionale esperienza professionale

degli operatori che si acquisisce e si degli operatori che si acquisisce e si

mantiene con la continua attivitmantiene con la continua attivitàà su un su un

adeguato numero di campioni.adeguato numero di campioni.

Tests Tests Maximum turnaround timeMaximum turnaround time

Microscopy for acidMicroscopy for acid--fast fast bacillibacilli

≤≤≤≤≤≤≤≤ 24 hours from specimen collection or 24 hours from specimen collection or ≤≤≤≤≤≤≤≤ 24 24 hours from receipt in laboratoryhours from receipt in laboratory

Nucleic acid amplification Nucleic acid amplification assayassay

≤≤≤≤≤≤≤≤ 48 hours from date of specimen collection48 hours from date of specimen collection

Mycobacterial growth Mycobacterial growth detection by culturedetection by cultureIdentification of cultured Identification of cultured mycobacteriamycobacteria

≤≤≤≤≤≤≤≤ 14 days from date of specimen collection14 days from date of specimen collection

≤≤≤≤≤≤≤≤ 21 days from date of specimen collection21 days from date of specimen collection

Drug susceptibility testingDrug susceptibility testing ≤≤≤≤≤≤≤≤ 30 days from date of specimen collection30 days from date of specimen collection

Drug susceptibility testing Drug susceptibility testing of secondof second--line drugsline drugs

≤≤≤≤≤≤≤≤ 4 weeks from date of request4 weeks from date of request

Essential laboratory tests for Essential laboratory tests for tuberculosis controltuberculosis control

MMWR MMWR -- November 4, 2005 / Vol. 54 / No. RR-12

Viste le necessitViste le necessitàà organizzative esistenti in Italia, organizzative esistenti in Italia, èè stato stato recentemente emanato un Documento lineerecentemente emanato un Documento linee--guida guida sullsull’’organizzazione dei laboratori.organizzazione dei laboratori.

EE’’ necessario che le procedure di laboratorio per necessario che le procedure di laboratorio per ll’’isolamento, la tipizzazione e lisolamento, la tipizzazione e l’’antibiogramma antibiogramma raggiungano elevati livelli di qualitraggiungano elevati livelli di qualitàà e standardizzazione. e standardizzazione. Proprio in questProprio in quest’’ottica, ottica, èè necessario effettuare una necessario effettuare una valutazione e successivamente una ridefinizione del valutazione e successivamente una ridefinizione del livello di attribuzione di attivitlivello di attribuzione di attivitàà dei laboratori presenti sul dei laboratori presenti sul territorio.territorio.

Non ultimo, per garantire la qualitNon ultimo, per garantire la qualitàà e la completezza e la completezza delldell’’osservatorio di livello regionale, i laboratori che osservatorio di livello regionale, i laboratori che eseguono colture per micobatteri sono tenuti ad inviare i eseguono colture per micobatteri sono tenuti ad inviare i ceppi isolati al Laboratorio del Centro di Riferimento ceppi isolati al Laboratorio del Centro di Riferimento Regionale.Regionale.

In ItaliaIn Italia……..

��INTERVENTI EFFICACI INTERVENTI EFFICACI

��TERAPIE ADEGUATETERAPIE ADEGUATE

��CORRETTO FOLLOWCORRETTO FOLLOW--UP DEL PAZIENTEUP DEL PAZIENTE

��SORVEGLIANZA DELLE RESISTENZESORVEGLIANZA DELLE RESISTENZE

��SORVEGLIANZA EPIDEMIOLOGICASORVEGLIANZA EPIDEMIOLOGICA

PER ARRESTARE LA TB PER ARRESTARE LA TB ……

SONO NECESSARISONO NECESSARI…….

DIAGNOSIDIAGNOSI

RAPIDARAPIDA

PRECISAPRECISA

ATTENDIBILEATTENDIBILE

ATTRAVERSOATTRAVERSO……..

19531953--La nascita della biologia molecolare si può far risalire alla La nascita della biologia molecolare si può far risalire alla scoperta della struttura del DNA da parte di J. Watson e F. Cricscoperta della struttura del DNA da parte di J. Watson e F. Crickk

Dieci anni dopo,nel 1963, quella Dieci anni dopo,nel 1963, quella pubblicazione valse a Watson, Crick ed pubblicazione valse a Watson, Crick ed a Maurice Wilkins, il premio Nobel per a Maurice Wilkins, il premio Nobel per la medicina e la fisiologia.la medicina e la fisiologia.

Nessun riconoscimento fu invece Nessun riconoscimento fu invece assegnato a Rosalind Franklin, la donna assegnato a Rosalind Franklin, la donna che, con le sue fotografie, permise la che, con le sue fotografie, permise la pipiùù grande rivoluzione scientifica del XX grande rivoluzione scientifica del XX secolo.secolo. NellNell’’anonimato, Rosalind anonimato, Rosalind Franklin muore di cancro nel 1958Franklin muore di cancro nel 1958.

Premio Nobel per la Chimica nel 1993Premio Nobel per la Chimica nel 1993

P.C.R.P.C.R.

(Polymerase Chain Reaction)(Polymerase Chain Reaction)

1983 – K. B. Mullis, con la scoperta della PCR, K. B. Mullis, con la scoperta della PCR,

poneva le basi per una innovazione tecnologica poneva le basi per una innovazione tecnologica

che ha rivoluzionato la ricerca biomedica in che ha rivoluzionato la ricerca biomedica in

generale e la biologia molecolare in particolare generale e la biologia molecolare in particolare

tecnologiatecnologia

microarray,microarray,

proteomica, e...proteomica, e...

IL LABORATORIO DI IL LABORATORIO DI

MICOBATTERIOLOGIA OGGIMICOBATTERIOLOGIA OGGI…….. ..

��Preparazione dei campioni (NALCPreparazione dei campioni (NALC--NaOH)NaOH)

��Esame microscopicoEsame microscopico

��Esame colturaleEsame colturale

��Test di amplificazione diretta (DAT) Test di amplificazione diretta (DAT)

��Test di sensibilitTest di sensibilitàà

��IdentificazioneIdentificazione

��Epidemiologia Epidemiologia

FASE PREFASE PRE--ANALITICAANALITICA

NON CORRETTANON CORRETTA

= = REFERTO ERRATOREFERTO ERRATO

INUTILEINUTILE

DANNOSODANNOSO


MICOBATTERIOLOGIA OGGIMICOBATTERIOLOGIA OGGI…….. ..




��Test di amplificazione diretta (DAT) Test di amplificazione diretta (DAT)




PREPARAZIONE DEI CAMPIONI….

dati del Lab. Novara

Poster ESM - Lubecca 2011

Percentage of contaminated samples

NALC + idrossido di sodio +citrato trisodico + rosso fenolo (indicatore di pH)


MICOBATTERIOLOGIA OGGIMICOBATTERIOLOGIA OGGI……....




��Test di amplificazione diretta (DAT)Test di amplificazione diretta (DAT)




ESAME MICROSCOPICOESAME MICROSCOPICO

AlcolAlcol--acido resistenzaacido resistenzaColorazioniColorazioni••ZiehlZiehl--NielsenNielsen (carbolfucsina a caldo(carbolfucsina a caldo)

••Kinyoun (carbolfucsina aKinyoun (carbolfucsina a freddo)

•Auramina (fluorescenza)

1000x1000x1000x1000x 400x

The The Global Plan to Stop TB 2006Global Plan to Stop TB 2006––20152015Objective 1: Increase access to qualityIncrease access to quality--assured AFB microscopy with effective assured AFB microscopy with effective

external quality assurance (EQA). By the end of 2015, all of theexternal quality assurance (EQA). By the end of 2015, all of the 149 Countries 35 149 Countries 35

considered in the Global Plan should have at least one laboratorconsidered in the Global Plan should have at least one laboratory per 100 000 y per 100 000

population able to perform AFB microscopy with effective EQA. Mopopulation able to perform AFB microscopy with effective EQA. More than 90% of AFB re than 90% of AFB

laboratories assessed for quality assurance should meet internatlaboratories assessed for quality assurance should meet internationalional

standards. In recognition of the new technologies now available,standards. In recognition of the new technologies now available, 20% of AFB 20% of AFB

laboratories laboratories should have replaced conventional bright field microscopes with should have replaced conventional bright field microscopes with

lightlight--emitting diode (LED) microscopesemitting diode (LED) microscopes. These LED microscopes enable enhanced . These LED microscopes enable enhanced

diagnostic accuracy (and increased detection of smeardiagnostic accuracy (and increased detection of smear--positive cases of TB) by positive cases of TB) by

allowing laboratory staff to visualize TB bacilli allowing laboratory staff to visualize TB bacilli much more easily.much more easily.










TERRENI SOLIDI:TERRENI SOLIDI:Terreni di coltura a base di uovo:Loewenstein-Jensen (+ PACT)Gottsacker (+PACT)StonebrinkPetragnani

Terreni di coltura a base di agar:Middlebrook 7H10Middlebrook 7H11 Colt. terreni solidi Colt. terreni solidi

osservazione osservazione

60 giorni a 3760 giorni a 37°°CC

Esame colturaleEsame colturale

TERRENI LIQUIDI:TERRENI LIQUIDI:Metodo radiometrico (Metodo radiometrico (BACTEC 460 TB):BACTEC 460 TB):

lala produzione di COproduzione di CO22 radiomarcata viene radiomarcata viene

rilevata da un rilevata da un ββ––counter.counter.

Metodo fluorimetrico (Metodo fluorimetrico (MGIT 960):MGIT 960):

la fluorescenza di un composto, inibita dalla presenza dila fluorescenza di un composto, inibita dalla presenza di ossigeno ossigeno

nel terreno, viene evidenziata per effetto del consumo di ossigenel terreno, viene evidenziata per effetto del consumo di ossigeno. no.

Tale tecnologia, esclusiva, rende il Sistema, estremamente Tale tecnologia, esclusiva, rende il Sistema, estremamente

sensibile e pisensibile e piùù sensibile delle tecnologie che sfruttano la sensibile delle tecnologie che sfruttano la

produzione di COproduzione di CO22 ..

Metodo colorimetrico (Metodo colorimetrico (BacT ALERT 3D):BacT ALERT 3D):

la produzione di COla produzione di CO22 fa virare un sensore che a sua volta fa virare un sensore che a sua volta

modifica lmodifica l’’intensitintensitàà di un raggio di luce riflessa.di un raggio di luce riflessa.

Metodo pressometrico (Metodo pressometrico (Versa TREK):Versa TREK):

ll’’aumento di pressione, dovuto a produzione di gas, viene rilevatoaumento di pressione, dovuto a produzione di gas, viene rilevato

da un manometro.da un manometro.

Tempo di Tempo di

osservazioneosservazione::

42 giorni a 3742 giorni a 37°°CC

Tempi medi di Tempi medi di

rilevamento 7rilevamento 7--13 gg13 gg

Esame colturaleEsame colturale







�� Test di sensibilitTest di sensibilitàà



TEST MOLECOLARITEST MOLECOLARI

rilevamento, identificazione, determinazione della farmacorilevamento, identificazione, determinazione della farmaco--resistenza di resistenza di Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis complex e per complex e per epidemiologia molecolare della TBepidemiologia molecolare della TB

I TEST MOLECOLARII TEST MOLECOLARI……..

TEST MOLECOLARI DIRETTI TEST MOLECOLARI DIRETTI

PER PER M. tuberculosisM. tuberculosis complexcomplex

TEST MOLECOLARI realTEST MOLECOLARI real--time time

PER PER M. tuberculosisM. tuberculosis complexcomplex

Identification of MTB complex directly from pulmonary and extrapulmonarypatient specimens

FluoroTypeFluoroType®® MTB is based on MTB is based on HyBeacon technologyHyBeacon technology. .

Mycobacterial DNA is extracted from the sample material and specMycobacterial DNA is extracted from the sample material and specifically ifically

amplified via PCR. Then fluorescence labeled HyBeacon probes areamplified via PCR. Then fluorescence labeled HyBeacon probes are

bound to singlebound to single--stranded amplicons. Subsequently, the decrease in stranded amplicons. Subsequently, the decrease in

fluorescence is measured and displayed as a melting curve. The fluorescence is measured and displayed as a melting curve. The

evaluation is done by the test specific software. Amplification evaluation is done by the test specific software. Amplification and and

detection run fully automated in the FluoroCyclerdetection run fully automated in the FluoroCycler®® instrument. instrument.

Circa 3 oreCirca 3 ore

Circa 2,5 oreCirca 2,5 ore

DNA STRIPDNA STRIP®®--TechnologyTechnology……..

NASBARNA


Tecnologia, DNA strip

Mycobacterium CM (14 NTM)

Mycobacterium AS (16 NTM)

M. xenopi

M.gordonaeM. abscessus/M. immunogenum +

M.scrofulaceum

M.abscessus/ M. immunogenum

Non identificato si procede con AS

M. szulgaiM. szulgai

MTBC

M. tubercolosisM. tubercolosis

M. bovisM. bovis

M. BCGM. BCG

GenoTypeGenoType®®

GenoTypeGenoType®®M. africanum, M. microti, M. africanum, M. microti,

M. bovis ssp. bovis,M. bovis ssp. bovis,

M. bovis ssp. capreae, BCG M. bovis ssp. capreae, BCG


A chipA chip--based nucleic based nucleic

acid amplification test in acid amplification test in

the detection ofthe detection of

Mycobacterium Mycobacterium

tuberculosis (MTB) in tuberculosis (MTB) in

clinical sputum clinical sputum

specimens in specimens in

approximately one hourapproximately one hour


CONFRONTO TRA CONFRONTO TRA

REALREAL--TIME PCR E TEST MOLECOLARI DI ITIME PCR E TEST MOLECOLARI DI Iaa GENERAZIONEGENERAZIONE

�� DRDR--TB Ceppo con una farmaco resistenzaTB Ceppo con una farmaco resistenza

��MDRMDR--TB Ceppo resistente ad almeno INH e RIFTB Ceppo resistente ad almeno INH e RIF

��XDRXDR--TB Ceppo MDR resistente anche ai fluorochinoloni TB Ceppo MDR resistente anche ai fluorochinoloni

e almeno uno tra i farmaci di seconda linea e almeno uno tra i farmaci di seconda linea

((capreomicina, kanamicina e amikacina)capreomicina, kanamicina e amikacina)WHO Global Task Force on XDRWHO Global Task Force on XDR--TB TB -- October 2006October 2006

La XDRLa XDR--TB TB èè gigiàà comparsa nel mondo in almeno 25 Paesicomparsa nel mondo in almeno 25 Paesi. .

La vera entitLa vera entitàà èè nota solo per tre paesi: Usa, Lettonia e Coreanota solo per tre paesi: Usa, Lettonia e Corea

La TB oggiLa TB oggi……..

LE RESISTENZE DEL M. tuberculosis complex….

� resistenza primaria, quando è già presente nel ceppo responsabile dell’infezione

� resistenza secondaria quando insorge durante la terapia

� le resistenze sono dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche

� sono state trovate una o più mutazioni associate alla resistenza nei confronti dei singoli farmaci anti-TB

� un Gene che non è Espresso “In Vitro” può Essere Espresso

“In Vivo”

Giugno 1998Giugno 1998

Geni coinvolti nella resistenza ai Geni coinvolti nella resistenza ai

maggiori antimaggiori anti--tubercularituberculariDrug Gene Gene product Mutations

Streptomycin rpsL 12S ribosomal protein Coding region (60%)

rrs 16S rRNA Reg. 530 and reg. 915 (8%)

Isoniazid katG Catalase-peroxidase coding region (cod. 315 - 60-80%)

inhA NADH-dep enoyl-ACP red promoter reg. (Ribosome binding site - 15%); coding region

ndh NADH dehydrogenase coding region

ahpC-OxyR regulon (controls katG and several other genes) promoter region (mutations relatively rare)

Rifampin rpoB RNA pol (β subunit) hot spot region (cod. from 508 to 535 - 98%); N-term region

Ethambutol embB Arabinosyl transferase ERDR (cod. 306 - 70%)

embC Arabinosyl transferase coding region

Ethionamide inhA NADH-dep enoyl-ACP red promoter reg. (Ribosome binding site); coding region

ethA Monooxygenase coding region

ethR Monooxygenase repressor coding region

ndh NADH dehydrogenase coding region

Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase coding region (70%)

Fluoroquinolones gyrA DNA gyrase (sub. A) QRDR (70%)

gyrB DNA gyrase (sub. B) QRDR

Rifabutin rpoB RNA pol (β subunit) coding region

Capreomycin rrs 16S rRNA coding region

tlyA rRNA methyltransferase coding region

Viomycin rrs 16S rRNA coding region

Kanamycin rrs 16S rRNA coding region

Amikacin rrs 16S rRNA coding region

D-Cycloserine alr D-Ala racemase promoter region

Para-salicylic acid thyA Thymidylate synthase coding region

cross-resistenze

Cross-resistances

CAP-VIO Mutations in tlyA or rrs C to T 1402, G to T 1484

AMK-KAN Mutations in tlyA and rrs A to G 1401

KAN-CAP Mutations in rrs: A to G 1401, G to T 1484

KAN-VIO

Mutations in rrs: A to G 705, A to G 1400, G to A/T 1483;

Mutations in rpsL: Lys43Arg (cross-R to STR)

KAN-CAP-VIO Mutations in rrs: C to T 1402, G to T 1484

RFB-RIF

Cross-resistance rate: 90%.

Mutations in rpoB (cod. 526, 531).

Mutations at cod. 516 and 522 in RIF-R predict RFB-S (Sintchenko 1999, Pathology).

INH-ETH

Mutations in inhA: Ser94Ala; Ribosome binding site;

Mutations in ndh: coding region

DCS-VCM Mutations in ddl

XpertXpert®® MTB/RIFMTB/RIF


The simultaneous detection, Screening ofThe simultaneous detection, Screening of MTB, MTB, MDRMDR--TB and XDRTB and XDR--TB on RealTB on Real--time PCRtime PCR


Innovative realInnovative real--time PCR time PCR

methodmethod: READ (Real Amplicon : READ (Real Amplicon

Detection) PCR combined with Detection) PCR combined with

Seegene's proprietary DPOSeegene's proprietary DPO™™

technology (Dual Priming technology (Dual Priming

Oligonucleotide). Oligonucleotide).







�� Test di sensibilitTest di sensibilitàà



METODI FENOTIPICIMETODI FENOTIPICI (valutazione dela crescita in terreno (valutazione dela crescita in terreno

solido/liquido in presenza del farmaco):solido/liquido in presenza del farmaco):

�� CostoCosto--efficaceefficace

�� Semplice da eseguire piSemplice da eseguire piùù complessa da standardizzarecomplessa da standardizzare

�� Risultati disponibili in settimane/mesiRisultati disponibili in settimane/mesi

METODI MOLECOLARIMETODI MOLECOLARI (identificazione delle mutazioni (identificazione delle mutazioni

responsabili di resistenza):responsabili di resistenza):

��Risultati disponibili in oreRisultati disponibili in ore�� Non richiedono ceppo vitale, indipendenti daNon richiedono ceppo vitale, indipendenti da

inquinamento del campioneinquinamento del campione

��Generalmente costosiGeneralmente costosi

�� DifficoltDifficoltàà di esecuzione, limitati ad alcuni targetsdi esecuzione, limitati ad alcuni targets

TEST DI SENSIBILITATEST DI SENSIBILITA’’ PER PER

M. tuberculosisM. tuberculosis complexcomplex

MGIT utilizzato per eseguire DST:MGIT utilizzato per eseguire DST:

confronto della crescita dei micobatteri con e senza confronto della crescita dei micobatteri con e senza l'aggiunta di farmaci. Il sistema usa un algoritmo, l'aggiunta di farmaci. Il sistema usa un algoritmo, basato sul principio del metodo delle proporzioni, per basato sul principio del metodo delle proporzioni, per comparare le cinetiche di crescita in assenza ed in comparare le cinetiche di crescita in assenza ed in presenza di farmaco e per interpretarle in termini di presenza di farmaco e per interpretarle in termini di S e di RS e di R

Dr. Scarparo

MGIT960 TB eXiSTMGIT960 TB eXiST

eXeXtended tended iindividual ndividual SSusceptibility usceptibility TTestingesting

LL‘‘unica soluzione per il test di unica soluzione per il test di sensibilitsensibilitàà ai farmaci di II linea ai farmaci di II linea

concon BD MGIT960BD MGIT960™™ e e BD BD EpiCenterEpiCenter™™

MGIT960 TB eXiSTMGIT960 TB eXiST

eXeXtended tended iindividual ndividual

SSusceptibility usceptibility TTestingesting

Poter testare tutti gli Poter testare tutti gli isolati ai farmaci isolati ai farmaci

standardstandard

Poter testare Poter testare qualunque farmacoqualunque farmaco

Poter testare i Poter testare i farmaci standard farmaci standard prolungando il prolungando il tempo di tempo di

protocollo e con protocollo e con pipiùù

concentrazioniconcentrazioni

ISTITU TO SUPERIOR E DI SANITA’

DIPARTIMENTO M.I.P.I.

A) Proficiency testing

Fig 1. 30 laboratories were enrolled in 18 regionsFig 2. 29/30 labs completed the proficiency testing. The average efficiency (correct results/total results) for S-I-R-E was > 95%. PVR and PVS are positive value of a resistant and susceptible result, respectively

RESULTS

B) Drug resistant TB in Italy, 2007

QuickTime™ and aTIFF (LZW) decompressorare needed to see this picture.

C) Molecular typing

(*) TB-CCM Study Group :The TB-CCM study group is composed of: Claudio Piersimoni (Ancona); Paolo Lorenzetti (Aosta); Danila Costa, Anna Grimaldi, Antonio De Santis (Bari);; Luisa Squintani, Concetta Mazza (Bologna); Clara Larcher, Eliana Frizzera, Ludwig Moroder (Bolzano); Gabriele Pinsi (Brescia); Antonio Farris, Rosanna Caddeu (Cagliari); Piero Castronovo (Catania); Giovanni Mantini, GiammarcoTomei (Chieti); Paolina Cavalcanti (Cosenza); Enrico Tortoli (Firenze); Evelina Senno (Genova); Leonardo Buono, Caterina Colonna (Matera); Paola Cichero, Alessandra Lombardi, Valeria Penati, Giovanni Gesu, Ester Mazzola, Daniela Cirillo, Emanuele Borroni, Paolo Miotto (Milano); Anna Fabio (Modena); Giulia Santoro (Napoli); Maria Gabriella Chirillo (Orbassano); Gianlorenzo Molinari, Anna Camaggi (Novara); Marta Peracchi, Loredana Fallico (Padova); Pietro Marone (Pavia); Rosanna Mazzolla (Perugia); Patrizia Chiaradonna, Patrizia De Mori, Lanfranco Fattorini, Manuela Pardini, Perla Filippini, Antonio Cassone (Roma); Troupioti Panaiota, Elena Libanori (Sondalo); Annamaria Barbui, Rosangela Milano (Torino), Iole Caola (Trento); Giovanni Battista Migliori (Tradate); Clara Fabris (Trieste).

Surveillance of drug-resistant tuberculosis in ItalyLanfranco Fattorini1, Manuela Pardini1, Daniela Cirillo2, Emanuele Borroni2, Paolo Miotto2, Perla Filippini1,

Antonio Cassone1, and the TB-CCM Study Group (*).

1Istituto Superiore di Sanità (ISS), Dipartimento di Malattie Infettive, Parassitarie e Immunomediate, Roma; 2Istituto Scientifico San Raffaele, Milano; Italy

INTRODUCTIONDrug-resistant TB is an increasing problem worldwide. In order to update the national data on drug resistance, we started a surveillance program including the most representative diagnostic centres in Italy.

PURPOSE OF THE STUDYThe study was designed to determine:

A) Accuracy of drug susceptibility testing (DST) for streptomycin (S), isoniazid (I), rifampicin (R), ethambutol (E).

B) Drug resistance in new cases (NC), previously treated cases (PTC), patients born in Italy, patients born abroad.

C) Molecular typing.

METHODSA) 30 laboratories were enrolled in 2006-07 in 18/20 regions for proficiency testing (PT), based on the amount of DST performed every year and geographic location. The laboratories received 20 strains each, and sent DST results to the Supranational Reference Laboratory (SRL) of ISS (Rome), which compared them with the judicial results of the WHO Global Network of SRLs.

B) A questionnaire was returned to ISS with DST results of TB cases diagnosed in 2007; strains resistant to >1 drugs and 10% of the susceptibleswere collected at ISS.

C) Molecular typing was performed at the SRL of the San Raffaele Hospital (Milan) by spoligotyping and MIRU-VNTR (12 loci).

CONCLUSIONSA) Proficiency testing results indicated that the first-line DST of the laboratory network was accurate (Figs 1-2).

B) MDR rate in Italy increased from 1999 (1.1%) to 2007 (2.5%) in the NC, likely due to immigration, particularly from former Soviet Union and African countries (Tab 1 & Figs 3-4).

This study is considered representative of drug-resistant TB in Italy, covering 92% antibiograms, i.e. 1698 DST out of 1842 total M.tuberculosis culture positives, as reported by the Ministry of Health (footnote to Tab 1).

C) No MDR-TB outbreak was detected, as shown by a low clustering rate (Fig 5).Noteworthy, unlike reported from other European countries, MDR strains are not associated with the Beijing lineage (Figs 5-6).

(This work was supported by the Italian Ministry of Health, CCM Project: Surveillance of resistance to anti-TB drugs, Grant N92).

4

6

2 1

2

1 11

11

2

1

1

21

1

1

1

(This study)

Eur o-TB data

Fig 3: Trend of MDR TB in Italy Fig 4: Nationality of 355 TB patients born abroad

Fig 6: Spoligotypes of 44 MDR strains Fig 5: In 257 strains examined for molecular typing, 146 spoligotypes and 29 clusters were found. Beijing genotype was detected in 5% of cases. In 44 MDR strains typed by the MIRU-12 technique the clustering rate was 0.023, indicating a low transmission rate.

Tab 1

46

21

2

11

1

11

2

1

1

21

1

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TB-CCM Study Group :The TB-CCM study group is composed of: Claudio Piersimoni (Ancona); Paolo Lorenzetti (Aosta); Danila Costa, Anna Grimaldi, Antonio De Santis (Bari);; Luisa Squintani, Concetta Mazza (Bologna); Clara Larcher, Eliana Frizzera, Ludwig Moroder (Bolzano); Gabriele Pinsi (Brescia); Antonio Farris, Rosanna Caddeu (Cagliari); Piero Castronovo (Catania); Giovanni Mantini, Giammarco Tomei (Chieti); Paolina Cavalcanti (Cosenza); Enrico Tortoli (Firenze); Evelina Senno (Genova); Leonardo Buono, Caterina Colonna (Matera); Paola Cichero, Alessandra Lombardi, Valeria Penati, Giovanni Gesu, Ester Mazzola, Daniela Cirillo, Emanuele Borroni, Paolo Miotto (Milano); Anna Fabio (Modena); Giulia Santoro (Napoli); Maria Gabriella Chirillo (Orbassano); Gianlorenzo Molinari, Anna Camaggi (Novara); Marta Peracchi, Loredana Fallico (Padova); Pietro Marone (Pavia); Rosanna Mazzolla (Perugia); Patrizia Chiaradonna, Patrizia De Mori, Lanfranco Fattorini, Manuela Pardini, Perla Filippini, Antonio Cassone (Roma); Troupioti Panaiota, Elena Libanori (Sondalo); Annamaria Barbui, Rosangela Milano (Torino), Iole Caola (Trento); Giovanni Battista Migliori (Tradate); Clara Fabris (Trieste).

TB-CCM Study Group = 30 laboratori in 18 regioni









IDENTIFICAZIONEIDENTIFICAZIONETest genetico molecolare tecnologia DNA stripTest genetico molecolare tecnologia DNA strip

LL’’ANALISI EANALISI E’’ COMPOSTA DA TRE FASICOMPOSTA DA TRE FASI

RILEVAMENTO dei prodotti di amplificazione RILEVAMENTO dei prodotti di amplificazione

tramite ibridazione inversatramite ibridazione inversa

ESTRAZIONE dellESTRAZIONE dell’’acido nucleicoacido nucleico

AMPLIFICAZIONEAMPLIFICAZIONE

Identificazione contemporanea del genere Mycobacterium e di :•16 diverse specie di micobatteri

test INNO-Lipa MYCOBACTERIA v2

•14+16 diverse specie di micobatteri test GenoType® Mycobacterium CM e ASMycobacterium CM e AS

Risultato utile:Risultato utile:< 6 ore dallapositività della coltura

Microarray………..Circa 5 oreCirca 5 ore

PROTEOMICAPROTEOMICA……....



La spettrometria di massa (MS) MALDILa spettrometria di massa (MS) MALDI--TOF TOF (Matrix Assisted Laser Desorption (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Ionization –– TimeOf Flight)TimeOf Flight), si basa sul desorbimento e la ionizzazione di , si basa sul desorbimento e la ionizzazione di specie chimiche mediante impulsi laser. Il loro rapporto massa/cspecie chimiche mediante impulsi laser. Il loro rapporto massa/carica, e di arica, e di conseguenza la loro massa, sarconseguenza la loro massa, saràà individuata in base al individuata in base al tempo di volo tempo di volo ((Time Time Of FlightOf Flight), che impiega la specie chimica per raggiungere il ), che impiega la specie chimica per raggiungere il detector. detector. LL’’insieme delle masse dei peptidi di una particolare proteina rappinsieme delle masse dei peptidi di una particolare proteina rappresenta il resenta il cosiddetto MALDI MS Pcosiddetto MALDI MS Peptide/Proteine Fingerprinteptide/Proteine Fingerprint, che confrontato con quelli , che confrontato con quelli disponibili nel disponibili nel databasedatabase, porta all, porta all’’identificazione della specie.identificazione della specie.

Desorbimento

Ionizzazione

Accelerazione

Separazione

RilevamentoMALDIMALDI--TOF MSTOF MS…….?.??











Epidemiologia molecolare Epidemiologia molecolare

della tubercolosi, perchdella tubercolosi, perché…é….?.?

La sorveglianza epidemiologica delle malattie infettive e, in La sorveglianza epidemiologica delle malattie infettive e, in

particolare, della TB particolare, della TB èè elemento centrale del programma di elemento centrale del programma di

controllo della malattia, permettendo di orientare controllo della malattia, permettendo di orientare

efficacemente gli interventi e le risorse.efficacemente gli interventi e le risorse.

Epidemiologia:Epidemiologia:� Conferma dei sospetti di microepidemieConferma dei sospetti di microepidemie

�� Valutazione dei sospetti di contaminazione di laboratorioValutazione dei sospetti di contaminazione di laboratorio

�� Valutazione delle recidive di tubercolosiValutazione delle recidive di tubercolosi

�� Screening sistematico e sorveglianza epidemiologicaScreening sistematico e sorveglianza epidemiologica

�� Patogenesi, virulenza e trasmissibilitPatogenesi, virulenza e trasmissibilitàà

Epidemiologia, come....?

� Sequenza d’inserzione IS6110

� RFLP (Restriction-Fragment-Length Polymorphism)

� Spoligotyping (PCR)

� MIRU (mycobacterial interspersed repetitive unit) (PCR)

� Delezioni genomiche e micro-arrays

CONFRONTO TRA I DUE CONFRONTO TRA I DUE ““GAMMAGAMMA--TESTTEST””

Altri strumenti per Altri strumenti per fermare una malattia fermare una malattia prevedibile e curabile come prevedibile e curabile come la tubercolosila tubercolosi……..?..?

Per saperne di piPer saperne di piùù....

COME FERMARE LA TBCOME FERMARE LA TB……....

�� Seguire il processo tecnologico per riuscire a fare diagnosi Seguire il processo tecnologico per riuscire a fare diagnosi

nel minor tempo possibilenel minor tempo possibile

�� Sensibilizzare, il maggior numero possibile del personale Sensibilizzare, il maggior numero possibile del personale

della propria Azienda, sulldella propria Azienda, sull’’importanza che i campioni inviati importanza che i campioni inviati

al laboratorio (al laboratorio (il piil piùù rapidamente possibilerapidamente possibile) rispondano ai ) rispondano ai

requisiti richiestirequisiti richiesti

�� Maggiore dialogo con i reparti e i centri afferenti, poichMaggiore dialogo con i reparti e i centri afferenti, poichéé

maggiori informazioni cliniche consentono una ricerca pimaggiori informazioni cliniche consentono una ricerca piùù

mirata e rapida mirata e rapida

La tubercolosi, che oggi, accanto allLa tubercolosi, che oggi, accanto all’’AIDS ed AIDS ed alla malaria, alla malaria, èè una delle malattie piuna delle malattie piùù diffuse, diffuse, va conosciuta da tutti, specie da coloro che va conosciuta da tutti, specie da coloro che operando in Sanitoperando in Sanitàà nei Paesi ove questa nei Paesi ove questa èèpoco diffusa lpoco diffusa l’’hanno dimenticatahanno dimenticata

(F. Mandler (F. Mandler –– MICOBATTERIOLOGIA CLINICAMICOBATTERIOLOGIA CLINICA))

“Solo dalla collaborazione, si ottengono grandi risultati”

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RECENTI ACQUISIZIONI NELLA DIAGNOSTICA … · i micobatteri???? I MICOBATTERI noti anche come: BK – Bacillo di Koch (colui a cui si deve la loro scoperta, nel 1882) BAAR – cio