Regulation der Bindung von Annexin 6 an endosomale .Rab-Proteine und die ihnen assoziierten Moleküle,

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  • Aus dem Institut für Biochemie und Molekularbiologie II:

    Molekulare Zellbiologie

    des Zentrums für Experimentelle Medizin

    des Universitätskrankenhauses Hamburg-Eppendorf

    Direktorin: Prof. Dr. rer. physiol. Dr. h.c. Ulrike Beisiegel

    Regulation der Bindung von Annexin 6 an

    endosomale Membranen

    Dissertation

    zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

    dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von

    Paul Dauterstedt

    aus Dresden

    Hamburg, 2006

  • Angenommen vom Fachbereich Medizin

    der Universität Hamburg am:

    Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs

    Medizin der Universität Hamburg

    Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende:

    Prüfungsausschuss, 2. Gutachter/in:

    Prüfungsausschuss, 3. Gutachter/in:

  • ________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis

    1. Einleitung 1

    1.1 Endozytose und Regulation ....................................................... 1

    1.1.1 Rezeptorvermittelte Endozytose............................................ 2

    1.1.2 Rab-Proteine...................................................................... 5

    1.1.3 SNARE-Proteine.................................................................. 8

    1.2 Das endosomale System............................................................ 9

    1.2.1 Frühe Endsosomen ........................................................... 10

    1.2.2 Späte Endosomen............................................................. 11

    1.3 Lipide und Membrantransport ................................................. 12

    1.3.1 Lipoproteinstoffwechsel ..................................................... 13

    1.3.2 Aufnahme und intrazellulärer Stoffwechsel von

    Cholesterin...................................................................... 16

    1.3.3 Einfluss von Lipiden auf Membranen .................................... 18

    1.3.4 Cholesterin in zellulären Membranen ................................... 19

    1.3.5 Cholesterintransport aus dem spät-endozytotischen

    Kompartiment und seine klinische Relevanz......................... 20

    1.4 Annexine................................................................................. 23

    1.4.1 Struktur .......................................................................... 23

    1.4.2 Lokalisation ..................................................................... 25

    1.4.3 Funktion.......................................................................... 26

    1.4.4 Annexin 6........................................................................ 26

    1.4.5 Regulation der Membranbindung von Annexinen ................... 30

    1.5 Ziel der Arbeit ......................................................................... 33

    2. Material und Methoden 34

    2.1 Material .................................................................................. 34

    2.1.1 Geräte ............................................................................ 34

    2.1.2 Verbrauchsmaterialien....................................................... 34

    2.1.3 Chemikalien..................................................................... 35

    2.1.4 Zellkultur......................................................................... 37

    2.1.5 Antikörper ....................................................................... 37

  • ________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

    2.2 Methoden ................................................................................ 38

    2.2.1 Zellkultur......................................................................... 38

    2.2.2 Ausplattieren von Zellen .................................................... 38

    2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen...................................... 38

    2.2.4 Transfektion von Zellen ..................................................... 39

    2.2.5 Präparierung von Membranproteinen ................................... 39

    2.2.6 Bestimmung der Proteinkonzentration ................................. 39

    2.2.7 Fluorometrische Bestimmung der Cholesterin-

    konzentration.................................................................. 40

    2.2.8 Subzelluläre Fraktionierung ................................................ 40

    2.2.9 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................. 42

    2.2.10 Western-Blot .................................................................. 43

    3. Ergebnisse 45

    3.1 Calciumabhängige Bindung von Annexin 6 an

    Membranen von CHO-Zellen .................................................... 45

    3.2 Einfluss von Cholesterin auf die Bindung von Annexin 6

    an Membranen ........................................................................ 46

    3.2.1 Einfluss von Filipin auf die Membranbindung von

    Annexin 6 in Gegenwart von Calcium.................................. 46

    3.2.2 Einfluss von Filipin auf die Membranbindung von

    Annexin 6 in Abwesenheit von Calcium ............................... 52

    3.2.3 Einfluss von Digitonin auf die Membranaffinität

    calciumabhängig bindender Annexin-6-Proteine.................... 53

    3.2.4 Einfluss von Digitonin auf die Membranbindung

    calciumunabhängig bindender Annexin-6-Proteine ................ 55

    3.2.5 Einfluss von Cholesterin auf die Membranbindung

    von Annexin 6 an frühen und späten Endosomen.................. 58

    3.2.6 Einfluss von Digitonin auf die Membranbindung von

    Annexin 6 in vivo ............................................................. 62

    3.2.7 Zusammenfassung der von Filipin und Digitonin

    vermittelten Effekte auf das Bindungsverhalten von

    Annexin 6 ....................................................................... 63

  • ________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

    3.3 Etablierung einer GFP-Anx6-exprimierenden CHO-Zell-

    linie zur Analyse der Membranaffinität von Annexin 6 ............. 64

    3.3.1 GFP-Anx6 bindet an endosomale Membranen........................ 66

    4. Diskussion 68

    4.1 Calcium- und cholesterinabhängiges Bindungsverhalten

    von Annexinen ........................................................................ 68

    4.1.1 Calciumabhängige Bindung von Annexinen ........................... 68

    4.1.2 Cholesterinabhängige Bindung von Annexin 6 an

    Membranen..................................................................... 72

    4.1.3 Cholesterinabhängige Bindung von Annexin 2 an

    Membranen..................................................................... 75

    4.2 Funktion von Annexin 6 beim Targeting von LDL-

    Cholesterin in späten Endosomen ........................................... 78

    4.3 Funktion von Annexin 6 im Cholesterintransport aus

    dem spät-endozytotischen Kompartiment ............................... 80

    4.4 Klinische Relevanz von Annexinen........................................... 81

    4.4.1 Potentielle Rolle von Annexin 6 im Lipidstoffwechsel .............. 82

    5. Zusammenfassung………………………………………………………………………84

    6. Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………85

    7. Literaturverzeichnis……………………………………………………………………88

    8. Danksagung………………………………………………………………………………….98

    9. Lebenslauf…………………………………………………………………………………….99

    10. Erklärung………………………………………………………………………………….100

  • ______________________________________________________ Einleitung

    1

    Partikel

    Phagozytose

    Partikel

    Phagosom

    Makro- pinosom

    Pinozytose

    Endosom

    Endozytose via Caveolae

    Fluid-Phase Endozytose (clathrinunabhängig)

    rezeptorvermittelte Endozytose (clathrinabhängig)

    Plasma- membran

    1

    2

    3

    4

    5

    Partikel

    Phagozytose

    Partikel

    Phagosom

    Makro- pinosom

    Pinozytose

    Endosom

    Endozytose via Caveolae

    Fluid-Phase Endozytose (clathrinunabhängig)

    rezeptorvermittelte Endozytose (clathrinabhängig)

    Plasma- membran

    1

    2

    3

    4

    5

    1. Einleitung

    1.1 Endozytose und Regulation

    Die Zelle als kleinste Bau- und Funktionseinheit von Eukaryonten bedient sich

    bei der Aufnahme von extrazellulärem Material einer Vielzahl von