344 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 46 119

R E L A T I O N S E N T R E L ' A S S I M I L A T I O N P H O T O S Y N T H ] ~ T I Q U E DU CO s ET

LA P H O T O P H O S P H O R Y L A T I O N DES C H L O R O P L A S T E S ISOLES

I I . L ' U T I L I S A T I O N D E L ' A T P DANS L ' A S S I M I L A T I O N

P H O T O S Y N T H I ~ T I Q U E DU CO s

M. MIGINIAC-MASLO\V* ET M. L. CHAMPIGNY

Laboratoire de Physiologie Cellulaire Vdg~tale, Associd az, C.N.R.S., Facult~ des Sciences d'Orsay, 9I-Orsay (France)

(Re~u le 23 decembre, 197 o)

SUMMARY

Relations between photosynthetic assimilation of CO 2 and phosphorylation of isolated chloroplasts. 11. Utilization of A T P in photosynthetic assimilation of CO 2

I. Whole spinach chloroplas ts incorpora ted 32p into organic compounds in the l ight in the presence of r ibose 5-phosphate , wi thou t added A D P or b icarbonate . This incorpora t ion was inh ib i ted b y an t imyc in A.

2. The s imul taneous addi t ion of A D P and ribose 5-phosphate resul ted in a higher 3sp incorpora t ion than wi th ei ther compound added alone, p rovid ing t ha t res idual b icarbona te was present to allow some ca rboxy la t ion to occur: photophos- phory la t ion seems to be s t imu la t ed under ca rboxy la t ing condit ions.

3- The CO2-fixation act iv i t ies in the presence of r ibose 5-phosphate were iden- t ica l whether an t imyc in was present or not, when the phospha te concent ra t ion was low. Under these condit ions, a re la t ive accumula t ion of phosphoglycer ic acid was observed in all cases, bu t in the presence of an t imyc in , this accumula t ion appea red sooner. In the presence of high phospha te concent ra t ion chloroplasts accumula ted only tr iose phosphates : the phosphoglycer ic acid accumula t ion seems to be re la ted to a lack of ATP. This observat ion allows the assumpt ion t ha t an t imyc in inhibi ts photo- phosphory la t ion even under condi t ions where the CO s f ixation ac t iv i ty is enhanced or unaffected.

4. A working hypothes is is p roposed to account for the s t imula t ion of ca rboxy- la t ion l inked to the inhibi t ion of pho tophosphory la t ion : b ica rbona te would be ab- sorbed b y chloroplasts a t the expense of a h igh-energy in termedia te .

Abrdviations : Rib-5-P, ribose 5-phosphate ; Ribul-5-P, ribulose 5-phosphate ; Ribul-1,5-P,, ribulose 1,5-diphosphate.

* Cet article constitue l'article principal d'une th~se de Doctorat d 'Etat (Sci. Nat.) pr6sentde par M. IV[IGINIAC-MASLOW le IO juin, 197 o, ~. la Facult6 des Sciences d'Orsay et enregistr~e sous le No. A.O. 4509 au Centre National de la Recherche Scientifique.

Bioehim. Biophys. $cta, 234 (1971) 344-352

A T P ET FIXATION DU CO 2 345

INTRODUCTION

Le probl~me de la participation de la phosphorylation cyclique ~ l 'assimilation photosynth6tique du CO21, a 6t6 soulev6 ~t la suite d'6tudes de stoechiom6trie de la phosphorylation non cyclique (cf. r6f. 2) et d'exp6riences de fixation photosynth~tique du CO 2 en pr6sence d'inhibiteurs. Ces derni~res ont montr6 que certains inhibiteurs, auxquels la phosphorylation cyclique semble particuli~rement sensible (d6saspidine, antimycine A) n'inhibent pas la fixation du CO 2 ~ des concentrations off cette phos- phorylation est net tement diminu6e a,l.

L 'antimycine A, employ6e ~ faible concentration, peut m~me stimuler la fixation du CO~ et l 'incorporation de phosphate concomitante effectu6e par des chloroplastes intacts 5-7. Cependant, la sp6cificit6 d'action de l 'antimycine sur la phosphorylation cyclique a 6t6 raise en doute 8,2. D'autre part, des inhibiteurs de transfert d'6nergie tels que la phloridzine 9-12 ou le Dio-913 semblent avoir un effet semblable ~ celui de l 'antimycine sur la fixation de CO 2. D~s lots, c'est sur l'utilisation de I 'ATP lui-mSme dans les r6actions du cycle de Calvin que se transpose le probl~me. Pour tenter d 'y r~pondre, VOSE ET SPENCER 9,11 ont propos6 que la phosphorylation du Ribul-5-P se ferait aux d6pens non de I'ATP, mais d'un pr6curseur phosphoryl6 riche en 6nergie. Cette hypoth~se, formul6e ~ la suite d'6tudes faites en pr6sence de phloridzine pourrait ~'~ priori convenir pour l 'antimycine, dans la mesure 0/1 celle-ci peut 6tre consid6r6e comme un inhibiteur du transfert d'6nergie 8, 2.

En relation avec ces probl&mes, le pr6sent travail concerne l'utilisation de I 'ATP au cours des premieres 6tapes de l 'assimilation photosynth6tique du CO~.

MATI~RIEL ET TECHNIQUES

Les chloroplastes sont isol6s de feuilles d'6pinard (Spinacia oleracea L., var. America) provenant de plantes cultivdes en conditions contr61~es 14. La technique d'isolement, inspir6e de celle de JENSEN ET BASSHAM 15, a d6jk fit6 dfcrite 14.

Le culot de chloroplastes entiers est mis en suspension dans un tampon tris- (hydroxym6thyl)m6thylglycine ("Tricine") 50 raM, pH 8.1; sorbitol 330 raM, NAN03 2 raM; MnC12 I mM; MgC12 I mM; EDTA 2 mM; K2HPO 4 0.15 raM. Ce m~me tampon constitue le milieu de base du mflange r6actionnel dont les autres constituants sont indiqu6s dans les ldgendes des tableaux.

Le dosage de chlorophylle est Iait selon ARNON 16. L'incubation se fait ~ 16 ° sous 6clairement saturant. L'incorporation de 32p dans les composds organiques est d6terminde par la

m6thode d'AVRON ~7. Le 14CO2 fix6 est d6termin6 par comptage apr~s 61imination du 1~CO 2 non fix6

par addition d'acide formique 7. L'analyse des produits form~s par incorporation de 3~p ou de I~C est faite par

chromatographie unidimensionnelle sur papier Whatman No. I avec le solvant GWa de WOOD TM.

Les produits sfpar~s sont localisfs par autoradiographie. Leur radioactivit6 est d6termin6e par comptage au compteur ~ scintillation.

Biochim. Biophys. Acta, 234 (I971) 344-352

346 M. MIGINIAC-MASLOW, M. L. CHAMPIGNY

R I ~ S U L T A T S

L 'an t imyc ine inhibe l ' incorporation de a.,,p eu prdsence de R ib -5 -P L'Exp . I du Tableau I montre que l ' incorporat ion de aap par les chloroplastes

la lumi6re, en prfsence de Rib-5-P est inhibSe par les fortes concentrat ions d 'an t i -

mycine (20 et 3 ° # ~ ) . Ce fait ne serait pas en faveur de l 'hypotfigse de VOSE ET

SPENCER, reals, curieusement, les faibles concentrat ions d ' an t imyc ine (5 et IO/~M)

la s t imulent au contraire, alors que l ' incorporat ion en pr6senee d ' A D P est toujours

inhib6e. (Les concentrat ions d6sign6es ici comme faibles le sont moins que pr6c6dem-

ment ~, car pour cet te s6rie de chloroplastes, la s t imulat ion op t imum de la carboxy-

lat ion 6tait obtenue k 5 et io/~M.)

TABLEAU [

E F F E T D E L ' A N T I M Y C I N E S U R L ' I N C O R P O R A T I O N D E 3 2 p E N P R I ~ S E N C E D E RiB-5-P ou D'ADP

Le milieu rdactionnel contient, par ml, outre le tampon de suspension des chloroplastes : 2/mmh, s de phost)hate marqu~ au ao.p, des chtoroplastes correspondant h 5 ° / lg de chlorophylle, et les additious indiqudes dans le tableau. Durde de l'incubation en prdsence d'une lumi6re saturante: 2o rain. L'Exp. [est fake sous circulation d'azote, la lumi6re dtant allumde to rain apr6s le ddbut du passage de l'azote. Dans l'Exp. 2, le milieu r6actionnel est soumis h i h de barbotage d'azote. Les chloroplastes sont alors ajoutds sans interruption du barbotage. L'illumination dOmte ro rain apr6s l'addition des chloroplastes.

l£xp. Substrat ajoutd Conch. a2p incorpord ~Xro. (2 ,t~*~oles/ml) e~* antimycine (/¢atomes,/,l,; ck/oro-

(l&li) phylh" par h)

I (circulation N,.,)

2 (barbotage prolong4 N2)

- - O 0 . 0 5

Rib-5-P o 3"35 5 4.7 o

[o 4.7 ° 3 ° o

ADP o 7.20 .5 4.00

Rib-5-P o 22.0 I O I 5 . O

2o 5.o ADP o 35.0

10 2 0 . 0

* Cette valeur ne reprdsente pas une vitesse, car l'incorporation endog6ne de a2p atteint un plateau en 45 sec.

L ' examen chromatographique des produits marqu6s form6s (Tableau I IA) montre qu 'en p%sence de Rib-5-P, il y a non seulement du Ribu l - I ,5 -P 2 marqu6,

mais aussi des produits de fixation du CO2. En pr6sence d 'ADP, le seul produi t marqu6 est I 'ATP. Cependant en pr&ence de phosphate 0.15 mM (Tableau I IB) , on observe dans t o u s l e s cas des produits de carboxylat ion. I1 semble donc qu' i l reste

des traces non n6gligeables de bicarbonate dans la solution malgr4 la circulat ion

d 'azote. L 'absence de fixation du CO 2 en pr6sence d ' A D P et de phosphate z mM est due, de toute 6vidence, k l 'effet inhibi teur du Pi sur la carboxylat ion 19, 20,14. L 'addi t ion

de Rib-5-P st imule la fixation du CO221 et 16ve l ' inhibit ion de celle-ci par le pfl2,

d 'oh l ' appar i t ion de produits de carboxylat ion en absence de bicarbonate exog~ne.

Biochim. Biophys. Acta, 234 (I97 I) 344-352

TA

BL

EA

U

II

AN

AL

YS

E D

ES

P

RO

DU

ITS

FO

RM

I~S

PA

R

INC

OR

PO

RA

TIO

N

DE

;~

2p

EN

P

RIL

SE

NC

E

DE

R

ib-5

-P

ou

D

'AD

P,

ET

I)

'AN

TIM

YC

INE

E

T

DE

D

EU

X

CO

NC

EN

TR

AT

ION

S

~'~

EN

P

HO

SP

HA

TE

D

IFF

IER

EN

TE

S

[~q ~4

Mil

ieu

r6

acti

on

nel

: ta

mp

on

d

e su

spen

sio

n.

Ph

osp

hat

e en

co

nce

ntr

atio

n

ind

iqu

~e.

C

hlo

rop

last

es

corr

esp

on

dan

t "~

5 °

/tg

d

e ch

loro

ph

yll

e p

ar

nil

. A

d-

dit

ion

s,

s'il

y

a li

eu:

AD

P,

Rib

-5-P

2

nlM

; N

aHC

O

a lO

nlM

; an

tin

lyci

ne

A

5 t A

~I-

Cir

cula

tio

n

d'a

zote

. 20

ra

in

d'i

ncu

bat

ion

5~

la

lum

i~re

. >

Pro

duit

s fo

rmds

as

p in

corp

ord

(#at

omes

/mg

chlo

roph

ylle

pa

r h)

(A)

Pho

spha

te 2

mM

(B

) P

hosp

hate

o. t

5 m

M

+ A

DP

+

R

ib-5

-P

+ A

DP

+

R

ib-5

-P

End

og~n

e +

R

ib-5

-P

~ R

ib-5

-P

+ A

DP

H

CO

~-

+

anti

myc

ine

+

anti

myc

ine

~q

~3

©

to

AT

P

3.6

0

--

Rib

ul-

i,5

-p

~ --

0

.35

I-

Iex

ose

s-P

--

O

. I i

T

rio

ses-

P

--

1.6

8

Aci

de

3-P

-gly

c~ri

qu

e --

o.

19

To

tal

3.6

o

2.3

3

4.6

0

..

..

2

.1o

-

-

o.4

1

0.0

4

o.i

i o

.12

--

--

o

.18

0

.03

0

.08

o

.io

--

Tra

ces

2.1

5

0.4

3

0-5

3

0.5

7

0.4

8

0.3

8

0.2

4

o.4

8

0.5

9

0.2

8

4.6

0

3.1

2

0.7

4

1.2

o

i .3

8 2

.86

e~

TA

BL

EA

U

III

INC

OR

PO

RA

TIO

N

DE

32

p E

N

PR

I~S

EN

CE

D

'AT

MO

SP

HI~

RE

S

I)IF

Ft~

'RE

NT

ES

Co

nd

itio

ns

exp

dri

men

tale

s:

ef.

Tab

leau

II

. P

ho

sph

ate

2 in

M.

Pro

duit

s fo

rmds

3~

p in

corp

ord

(im

tom

es/m

g eh

loro

phyl

le

pa

r h)

N 2

(ci

rcul

atio

n)

+ A

DP

+

Rib

-5-P

+

AD

P

+

Rib

-5-P

N 2

(ba

rbot

age

prol

ongg

)

+ A

DP

+

Rib

-5-P

+

AD

P

+

Rib

-5-P

Air

+ A

DP

R

ib-5

P

+ A

DP

+

Rib

-5-P

4~

AT

P

2.2

~"

Rib

ul-

i,5

-P

~ -a

k

Iex

ose

s-P

v

Tri

ose

s-P

A

cid

e 3

-P-g

lycd

riq

ue

I T

ota

l 2.

2

t0

--

3.8

8

0.4

2

1.7

8

0.0

7

o.I

o

1.23

1.

46

o.3

4

0.3

5

2.0

6

7-57

1.65

--

0

.97

--

o

.41

2

.07

-

-

0.0

2

--

0

.05

0

.48

__

_

_

o.0

4

1.65

0

-46

3

-58

5.2

7

--

2.9

5

--

0.4

4

2.8

3

--

--

0.0

6

--

0.8

7

0.5

7

5.2

7

1.31

6

.41

¢o

-i

x

348 M. MIGINIAC-MASLOW, M. L. CHAMPIGNY

L'effet stimulant de faibles concentrations d'antimycine sur l 'incorporation de 32p en pr6sence de Rib-5-P peut donc ~tre assimil6 ~ son effet stimulant sur l 'assimilation du CO.~.

Effectivement, si l 'on soumet le milieu r6actionnel "~ un barbotage d'azote prolong6 (I h) avant l'exp6rience, la formation de produits de carboxylation devient tr&s faible (Tableau I I I ) et l 'antimycine ne stimule plus, mais inhibe l 'incorporation de 32p en pr6sence de Rib-5-P.

La solution de l'effet de l 'antimycine ne semble donc pas r6sider dans son absence d'action sur la phosphorylation du Ribul-5-P: soit qu'elle inhibe la formation de l'interm6diaire phosphoryl6 riche en 6nergie pr6sum6, soit que la phosphorylation du Ribul-5-P ne se fasse que par I'ATP. Cette derni6re possibilit6 parait plus vraisem- blable, car la phloridzine, dont le site d'action semble 4tre incontestablement au niveau de l'est6rification de I 'ADP en ATP 23, inhibe 6galement l 'incorporation de a2p

la lumi6re en pr6sence de Rib-5-P (observation faite avec des chloroplastes entiers de f6ve, dont l 'activit6 de carboxylation est tr6s faible2~).

Stimulation de la phosphorylation par la carboxylation L'addition simultan6e d 'ADP + Rib-5-P, dans des conditions off, grace au

bicarbonate r6siduel, la carboxylation peut avoir lieu, se traduit par une incorporation de s2p nettement sup6rieure ~ la somme des incorporations obtenues avec chacun des compos6s offerts s6par6ment (Tableau III) . Cet effet synergique devient plus faible, ou m6me n 'apparal t pas, lorsque la carboxylation est faible (barbotage d'azote prolong6 ou a6robiose): simplement, la synth6se du Ribul-i ,5-P 2 est alors bien plus importante en pr6sence d 'ADP + Rib-5-P, ce qui est en faveur de l'utilisation de I 'ATP dans la phosphorylation du Ribul-5-P.

Le fonctionnement de la carboxylation semble donc entralner une stimulation de la phosphorylation. Cette stimulation n'est probablement pas due uniquement la consommation de I 'ATP par les kinases du cycle de Calvin: en effet, en pr6sence d 'ADP q- Rib-5-P, m~me la quantit6 d 'ATP non consomm6 est plus 61ev6e qu'en pr6sence d 'ADP seul. Cette remarque est tr6s importante pour l'6tude de l'effet d'in- hibiteurs de la phosphorylation sur la carboxylation: si l 'on veut pr6ciser les carac- t6ristiques de Faction de ces compos6s, il semble n6cessaire de comparer des activit6s de carboxylation analogues.

A ntimycine et accumulation d'acide 3-phosphoglycdrique Cette comparaison est possible pour l 'antimycine en pr6sence de Rib-5-P et de

phosphate o.15 mM, car l 'activit6 de carboxylation avec ou sans antimycine est alors identique (cf. Tableau II, sans bicarbonate exog6ne, et Tableau IV, avec bicarbonate exog6ne). Apr6s 20 rain de r6action, l 'analyse des produits form6s r6v61e une accumu- lation d'acide 3-phosphoglyc6rique, que ce soit en pr6sence d'antimycine seule, de Rib-5-P ou de Rib-5-P + antimycine. Le t6moin (sans additions), dont l 'activit6 de fixation du CO2 est beaucoup plus faible, n'accumule que des trioses phosphates.

L'accumulation d'acide 3-phosphoglyc6rique n 'apparai t pas lorsque Rib-5-P ou Rib-5-P + antimycine sont ajout6s en pr6sence de phosphate 2 raM: elle semble li6e ~t un d6ficit en phosphate, donc en ATP. On peut en conclure, en accord avec l 'hypoth6se de COCKBURN et al. 19, que lorsque la synth6se d 'ATP est limitante, la phosphorylation du Ribul-5-P semble pr6dominer sur celle de l'acide 3-phospho-

Biochim. Biophys. dcta, 234 (1971) 344-352

A T P ET FIXATION" DU CO 2 3 4 9

T A B L E A U IV

]~FFET COMPARI~ DE L 'ANTIMYCINE ET DE Rib-5-P SUR LA CARBOXYLATION ]~N PRI~SENCE DE PHOS-

PHATE O.15 mM ET DE BICA.RBONATE IO HIM, MARQUI~ AU 14C

Condi t ions exp6r imenta les : cf. Tab leau I I , mais le phospha t e o.15 mM n 'es t pas marqu6, e t du NaH14COa io mM (act ivi td sp6cifique : 2/tC//2mole) es t a jout6 au milieu. Une exp6rience parall61e (non nlontrde ici) fa i te avec le m6me lo t de chloroplas tes , mais en prdsence de phospha t e 2 mM marqu6 au a2p mon t r e une ne t t e a c c um ula t i on de t r ioses (on ob t i en t 8 fois plus de t r ioses que d ' ac ide 3-phosphogtycdrique, en 20 rain de r6action) en prdsence de R ib -5 -P seul ou de Rib-5 -P + an t imyc ine . Atmosph6re : c i rcu la t ion d 'azote .

Produits formds 14C incorpord (/zatomes/mg chlorophyl&)

Sans addition

±o rain 20 min

+ A nt imycine 5 ! z M + R ib -5 -P 2 m M + Rib-5-P 2 m M + ant imycine 5 I ~

~:o min 20 rain IO rain 20 min zo min 20 min

R i b u l - i , 5 - p ~ - - - - o.o6 o . Io o.18 o.29 o.o 7 o. Io Glucides d ivers o.14 o.17 o.34 o.69 o.34 o.91 o.15 o.41 Tr ioses -P 0.32 0.62 1.52 2.39 1.18 1.24 0.54 1.5o Acide 3-P-glyc~rique - - --- 1.56 2.82 0.36 1.19 1.52 1.76

To ta l 0.46 0.79 3.48 6.oo 2.06 3.63 2.28 3.77

glyc6rique, li6e k la r6duction de ce dernier. (Sans que le d6ficit de synth6se de I 'ATP soit obligatoirement la cause primaire de ce ph6nom~ne.)

Apr6s IO min de r6action, en pr6sence de phosphate o.15 mM (Tableau IV), l 'accumulation d'acide 3-phosphoglyc6rique est tr6s importante en pr6sence de Rib- 5-P + antimycine, mais en pr6sence de Rib-5-P seul, il y a encore une pr6dominance des trioses-phosphates, alors que les activit6s de fixation du CO 2 sont 6gales: l 'anti- mycine semble induire un d6ficit pr6coce en ATP. On peut donc penser qu'elle exerce un effet inhibiteur sur la phosphorylation. Cette inhibition n 'apparai t pas dans les valeurs d'incorporation globale du 32p, car elle se manifeste au niveau de la trans- formation de l'acide 3-phosphoglyc6rique en trioses, r6action qui consomme I'ATP, sans donner lieu k une fixation de 32p. Lorsqu'on se place dans des conditions 06 l 'ant imycine stimule la carboxylation, l 'incorporation de 32p est m~me augment6e, par suite de la stimulation de l'activit6 phosphorylante cons6cutive ~ la stimulation de la carboxylation.

La m4me interpr6tation, au moins en ce qui concerne l 'absence apparente d'in- hibition, semble pouvoir s 'appliquer k l 'action de la phloridzine qui, employ6e en concentration relativement 61ev6e (2 mM), donne lieu ~ une accumulation d'acide 3-phosphoglycfrique, m~me en pr6sence de phosphate 2 mM, sans affecter cependant l ' incorporation globale de 3~p 24

Cette rfparti t ion des produits de la fixation du CO2, ainsi que le faible taux global de la carboxylation, sont 6videmment repr6sentatifs de pr@arations sans ad- dition d'ascorbate et de pyrophosphate, compos6s qui permettent d 'obtenir des ac- tivit6s plus 61ev6es, mais moins propiees k l '6tude de l'effet de l 'antimycine.

DISCUSSION

Ces exp6riences montrent que l'action stimulante (ou l 'absence d'action) d'in- hibiteurs tels que l 'antimycine ou la phloridzine, sur la fixation photosynth6tique

Biochim. Biophys. Acta, 234 (1971) 344-352

35 ° M. MIGINIAC-MASLOW, M. L. CHAMPIGNY

du CO2, pourrait s'accompagner d'une action d@ressive simultan6e sur la phospho- rylation, m6me lorsque les valeurs d'incorporation globale du a2p sont inchang6es ou augment~es. Or, la production d'ATP dans des conditions oil la carboxylati(m a lieu, ne semble pas excessive, puisque l'addition de petites quantit~s d'ATP stimule la fixation du CO~ 9,1~. D'autre part, l'hypoth~se de l'utilisation d'un interm6diaire phosphoryl~, riche en ~nergie, par la Ribul-5-P kinase, ne semble pas pouvoir ~tre utilis6e ici. La mfime hypoth~se appliqu6e ~ l'acide 3-phosphoglyc6rique kinase serait peu vraisemblable, 6tant donn6e l'accumulation d'acide 3-phosphoglyc&ique observ6e en pr6sence d'antimycine.

Enfin, l'utilisation de polyphosphates, propos6e par des auteurs travaillant avec des algues 2~,26 est difftcile £ appliquer aux plantes supfirieures, qui n'en accunIulent pas.

Actuellement, l'hypoth~se qui nous semble la plus satisfaisante (mais qui n'est sans doute pas la seule valable) pour expliquer l'ensemble des effets de l'antimvcine repose sur l'utilisation d'un interm6diaire ou ~tat riche en 6nergie dans un m6canisme de concentration du bicarbonate par les chloroplastes.

En effet, bien que purement sp~culative, cette hypoth~se aurait l 'avantage de rendre compte des observations suivantes:

(i) Les activit6s de fixation du CO~ obtenues i n v ivo sont relativement (qev~es, alors que l'affmit6 de la Ribul-I,5-P,, carboxylase pour le bicarbonate, mesur6e lit vi[ro,

est faible 27. Cette comparaison avait amen6 GIBBS et al. ~s et LATZKO ET GIBBS 2~ ~t con- sid6rer que les plantes peuvent concentrer le CO2 au niveau de la membrane p6ri- ph~rique des chloroplastes. Dans le present travail, l'apparition d'une quantit6 non n~gligeable de produits de carboxylation en absence d'addition de bicarbonate est 6galement en accord avec la possibilit~ d'existence d'une "pompe" ~k CO 2 dans les chloroplastes.

(2) L'addition d'antimycine diminue le Km apparent des chloroplastes intacts pour le bicarbonate v. De plus, il semble que la stimulation de la fixation du CO,, et l'inhibition de la photophosphorylation puissent fitre concomitantes.

(3) L'antimy cinel~ et le pyrophosphate a° l~vent l'inhibition de la carboxvlation par le Pi. Or l'inhibition par le phosphate est lev6e comp6titivement par le bicar- bonatelL Quant au pyrophosphate, il pourrait ~tre g6n&ateur d'un interm(*diaire riche en ~nergie, au m&me titre que I'ATP al.

(4) Le bicarbonate stimule la r~action de Hill, en absence de syst~me phos- phorylant. (Cette constatation, faite avec des chloroplastes isol6s par des mdthodes classiquesa~, aa, a ~t~ confirm6e par nous avec des chloroplastes intacts.) De plus, il inhibe la formation de l'interm6diaire riche en 6nergie X~.

(5) Un transport d'anions a ~t~ mis en ~videnee dans les chloroplastes ~ la lumi~re a5 et un modgle de co-transport d'anions et de H + a fit6 propos6 a~. L'hypotll~se qu'il existe, chez certaines algues, une polnpe m6tabolique ~ HCOa , like au fonction- nement du transfert d'6lectrons photosynth6tique, a ~t6 avanc~e par RAVEXaL CuM- .~IINS et al. as ont montr6 que le gradient d 'H + induit par la lumi~re se manifeste dans le milieu d'incubation d'Ulva et qu'il requiert la pr6sence de HCOa-.

La difflcult6 majeure d'admettre l'existence d'un transport actif de bicarbonate r6side dans le fait que le bicarbonate n'exerce pas d'effet inhibiteur sur la photo- phosphorylation et que m~me, il peut la stimuler a9. I1 faut donc supposer qu'en ab- sence d'inhibiteurs, un syst~me d'absorption active du bicarbonate ne pourrait fonc-

Hiochim. Biophys. Acta, 234 (1971) 344-352

ATP ET FIXATION DU C 0 2 351

tionner que lorsque la photophosphorylation est limit6e au niveau de son 6tape terminale (concentration limitante de phosphate, accumulation d'ATP). La concen- tration intrachloroplastique en ATP pourrait ainsi avoir un r61e r6gulateur d'une part sur l 'absorption du bicarbonate, et d 'autre part, sur la r6partition des produits de la photosynth6se. En effet, nous avons vu qu'un d6ficit en ATP s'accompagne d'une accmnulation d'aeide 3-phosphoglyc6rique. Or l'aeide 3-phosphoglycfrique, lorsqu'il n 'est pas r6duit en trioses et engag6 ainsi dans les synthhses glucidiques, peut donner lieu 5 la synth6se d'acides aminds, d'aeides organiques ou de lipides.

R£su.~Ik

I. En absence d 'ADP ou de bicarbonate ajout6, les chloroplastes entiers d'4pi- nard incorporent du a2p 5 la lumi~re en pr6sence de ribose-5-phosphate. Cette incorpo- ration est inhib6e par l 'antimycine.

2. L'addition simultan6e d 'ADP + ribose-5-phosphate entraine une incorpo- ration de a~p plus importante qu'en prfsence de chacun de ces compos6s ajout6 s6par6ment, 5 condition que la pr6sence de bicarbonate r6siduel permettre une carboxylation non n6gligeable: le fonctionnement de la carboxylation semble en- trainer une stimulation de la phosphorylation.

3. Les activit6s de fixation du CO 2 sont identiques en pr6sence de ribose-5-phos- phate ou de ribose-5-phosphate + antimycine, lorsqne la concentration en phosphate est faible. Dans ces conditions, on observe toujours une accumulation relative d'acide phosphoglycfrique, cette accumulation &ant plus pr6coce en pr6sence d'antimycine. En pr6sence de concentrations en phosphate 61ev6es, les chloroplastes n 'accnmulent que des trioses-phosphate: l 'accumulation d'acide phosphoglyc6rique semble li6e 5~ un d6ficit en ATP. Cette observation permet de supposer que l 'antimycine inhibe la photophosphorylation hi ,me lorsque l'activit6 de fixation du CO.2 est stimul6e ou inchang6e.

4- Pour rendre compte de la stimulation de la carboxylation life ~ une inhibition de la phosphorylation, l 'hypoth6se d'une absorption de bicarbonate aux dfpens d 'un intenn6diaire riche en 6nergie est proposfe.

REMERCIEMENTS

Nous voudrions exprimer notre gratitude ~ Monsieur le Professeur A. Moyse pour l 'at tention eonstante qu'il a port6e ~ ce travail. Ce travail a b6n6fici6 de la collaboration technique d6vou6e de Mme A. Hoarau que nous voudrions remercier ici.

B I B L [ O G R A P H I E

1 D. I. ARNON, in W. RUHLAND, Handbuch der Pflanzenphysiologie, Vol. V, Springer-Verlag, Berl in, 196o, p. 211.

2 M. MIGINIAC-MASLOW, Biochim. Biophys. Acta, 234 (1971) 335. 3 \V. TANNER, L. DACHSEL ET O. KANDLER, Plant Physiol., 4 ° (1965) 1951. 4 \V. TANNER, •. LOFFLER ET O. KANDLER, Plant Physiol., 44 (1969) 422. 5 p. ELLYARD, Ph .D. Thesis, 1968, Cornell Univers i ty , U.S.A. 6 M. L. CHAMPIGNY ET M. GIBBS, 1969, in I t . ]V[ETZNER, Progress in Photosynthesis Research,

Vol. 3, IUBS, Tiibingen, 1969, p. 1534. 7 B. SHACTER, M. t . CHAMPIGNY ET .XI. GIBBS, Plant Physiol., sous presse.

Biochim. Biophys. Acta, 234 (I97 I) 344-352

352 M. MIC~INIAC-MASLOW, M. L. CHAMPIGNY

8 S. IZAWA, T. N. CONNOLLY, G. D. WINGET ET N. ]~. CrOOD, Broohhaven Syrup. Biol., 19 (1967) 169 .

9 J. R. VOSE ET M. SPENCER, Biochem. Biophys. Res. Commun., 29 (1967) 532. IO J. R. VOSE ET M. SPENCER, Can. J. Biochem., 46 (1968) 1475 . I I J. R. VOSE ET M. SPENCER, Can. J. Biochem., 47 (1969) 443- 12 J. A. RAVEN, J. Exptl. Botany, 19 (1968) 712. 13 J. A. RAVEN, E. A. C. McROBBIE ET J. ~-NIEUMANN, J. Exptl. Botany, 20 (1969) 221. 14 M. L. CHAMPIGNY ET M. MIGINIAC-MASLOW, Biochim. Biophys. Acta, 234 (1971) 359. 15 R. G. JENSEN ET J. A. BASSHAM, Proc. Natl..4cad. Sci. U.S., 56 (1966) lO95. 16 D. I. ARNON, Plant Physiol., 24 (1949) I. 17 M. AVRON, Biochim. Biophys. ,4cta, 4 ° (196o) 257. t8 T. WOOD, J. Chromatog., 6 (1961) 142. 19 W. COCKBURN, C. xcV. BALDRY ET D. A. WALKER, Biochim. Biophys. ,4cta, 143 (1967) 614. 20 P. P. KALBERER, B. B. ]DUCHANAN ET D. ][. ARNON, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 57 (1967) 1542- 2i C. ]~UCKE, D. A. W'ALKER ET C. W. BALDRY, Biochem. J., IOI (1966) 636. 22 ~vV. COCKBURN, D. A. V~rALKER ETC. W. BALDRY, Biochem. J., Io 7 (1968) 89 23 G. D. ~vVINGET, S. IZAWA ET N. E. GOOD, Biochemistry, 8 (1969) 2067. 24 M. MIGINIAC-MASLOV¢, Thbse Doc to ra t ~s Sciences (Etat) , Orsay, 197o. 25 A. KYLIN ET J. E. TILLBERG, Z. Pflanzenphysiol., 58 (1967) 165. 26 H. GIMMLER, W. SIMONIS ET W. URBACH, ~,\:aturwissenschaften, 56 (1969) 371. 27 J. M. PAULSEN ET M. D. LANE, Biochemistry, 5 (1966) 235 o. 28 ~[. GIBBS, E. LATZKO, R. G. EVERSON ET W. COCKBURN, in A. SAN PIETRO, F. A. GREER ET

J. T. ARMY, Harvesting the Sun, Academic Press, New York, 1967, p. i I i. 29 E. LATZKO ET M. GIBBS, Z. Pflanzenphysiol., 59 (1968) 184. 3 ° \¥ . COCKBURN, in H. ~1~ETZNER, Progress in Photosynthesis Research, Vol. i, I UBS, T~bingen,

1969, p. 267. 31 1R. BACHOFEN, H. LUTZ ET ][. SPECHT-J/.)RGENSEN, F E B S Letters, I (I968) 249. 32 N. E. GOOD, Arch. Biochem. Biophys., 96 (1962) 653. 33 N. E. GOOD, Plant Physiol., 38 (1963) 298. 34 P. P. I:{ATRA ETA. T. JAGENDORF, Plant Physiol., 4 ° (1965) lO74. 35 D. W. DEAMER ET L. PACKER, Biochim. Biophys..4cta, 172 (1969) 539. 36 J. D. KARLISH ET M. AVRON, Biochim. Biophys. Acta, 153 (1968) 878. 37 J- A. RAVEN, J. Exptl. Botany, 19 (1968) 193. 38 J. T. CUMMINS, J. A. STRAND ET B. E. VAUGHAN, Biochim. Biophys. Acta, 173 (1969) I9,~. 39 T. PUNNETT ET R. V. IYER, .[. Biol. Chem., 239 (t964) 23.35.

Biochim. Biophys. Acta, 234 (I97 r) 344-352