UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

DEPARTAMENTO DE SAÚDE

CURSO DE FARMÁCIA

LEONARDO LEAL MACEDO

WENDY MORAES

RELATÓRIOS DE BIOFÍSICA

FEIRA DE SANTANA – BA2015

LEONARDO LEAL MACEDO

WENDY MORAES

RELATÓRIOS DE BIOFÍSICA

Relatório apresentado à Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS – para fins avaliativos da Disciplina de biofísica do curso de Farmácia, sob a orientação do Professor Hilberto.

FEIRA DE SANTANA – BA2015

CENTRIFUGAÇÃO

Princípio

Baseia-se no princípio da teoria dos campos como, por exemplo, de aproveitamento de campo gravitacional, realizando experiências simples de laboratório mostrando efeitos deste campo nas aplicações biológicas e médicas.

Introdução

A centrifugação é um método de separação de misturas que se baseia na diferença

de densidade entre os seus componentes.

Geralmente, quando temos dispersões grosseiras de um sólido misturado a um

líquido, como no caso da areia misturada com água, basta deixar o recipiente em

repouso e esperar que, pela ação da gravidade, o sólido que é mais denso que o líquido

se deposite no fundo. Esse método de separação é chamado de sedimentação.

A centrifugação é usada para acelerar esse processo ou para separar soluções

coloidais, em que as partículas do sólido ficam dispersas no líquido e não se

sedimentam. Para tal é usado um equipamento chamado de centrífuga, mostrado abaixo:

Na centrífuga, colocamos um tubo de ensaio contendo a mistura que se quer

separar e, então, ligamos o aparelho, que começa a rotacionar de forma bem acelerada.

A velocidade de ultracentrífugas, que são centrífugas bem mais potentes, pode chegar a

60 000 rpm (rotações por minuto), o que gera forças centrífugas até 750 000 vezes mais

intensas que a da gravidade. A força centrífuga (daí o nome do processo) empurra o

sólido para o fundo do recipiente, enquanto que a parte líquida fica límpida na parte de

cima.

Essa técnica é usada principalmente em laboratórios para separar proteínas e

ácidos nucleicos (DNA, RNA) das soluções e até mesmo para separar frações do

sangue. Nesse fracionamento do sangue pela centrifugação são obtidos os seus

principais componentes, que são: concentrado de hemácias (parte do sangue que contém

os glóbulos vermelhos), concentrado de plaquetas (parte sólida do sangue) e plasma

(parte líquida do sangue).

Células sanguíneas:

O sangue é composto aproximadamente 90% de água sendo dividido em plasma

e células, no processo de centrifugação do sangue não-coagulado ocorrerá essa divisão.

1- Eritrócitos/Hemácias/Células vermelhas do sangue: são os mais numerosos

dos elementos celulares no sangue. As hemácias dão a cor vermelha ao sangue. São

responsáveis por transportar o oxigênio dos pulmões aos tecidos e o dióxido de carbono

dos tecidos de volta aos pulmões. Esta ação é realizada pela hemoglobina, o principal

componente das células vermelhas do sangue. Os eritrócitos realizam suas funções no

sistema circulatório.

2- Leucócitos/Células brancas do sangue: são os menos numerosos. Existem 5

tipos: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos. Cada tipo tem função

diferente, mas todos associados a imunidade ou defesa. Executam suas funções dentro

dos tecidos. Usam o sangue apenas como meio de transporte entre um lugar do corpo

para outro.

3- Plaquetas/Trombócitos: são fragmentos do citoplasma que foram liberados no

sangue circulante por grandes células da medula óssea. Plaquetas são importantes nos

vários estágios da hemostasia. Ex.: agem nas paredes dos vasos parra estancar

hemorragias.

Diferença entre soro e plasma:

A centrifugação do sangue sem anticoagulante levará à coagulação do

centrifugado; durante este processo, há o consumo de fibrinogênio, assim como todos os

fatores envolvidos na coagulação, com liberação de substâncias que se encontravam

dentro das plaquetas, dessa forma, constitui-se o soro.

Para a obtenção do plasma, faz-se a centrifugação do sangue com

anticoagulante. Observa-se, então que o fibrinogênio não está presente no soro, pois este

foi utilizado para a formação de fibrina, ao contrário do plasma, que o possui.

Encontram-se no soro, mediadores liberados pelas plaquetas, que não estão presentes no

plasma. Pode-se dizer que o soro é, basicamente, o plasma sem o fibrinogênio.

Hematócrito

É o volume de eritrócitos compactados por centrifugação em um dado volume

de sangue e expressos em porcentagem. É um teste ideal para acompanhar o progresso

de pacientes anêmicos ou com hemorragia.

Micro Hematócrito

É um hematócrito feito em pequeno volume de sangue utilizando tubo capilar.

Tanto no hematócrito quanto no micro hematócrito, o teste é baseado no

princípio de separação dos elementos celulares do plasma. Em ambas as técnicas, o

processo de separação é acelerado pela centrifugação. Após a centrifugação do sangue

em um tubo, as células brancas e as plaquetas formam uma camada no topo das células

vermelhas e o plasma estará na parte de cima. As células vermelhas estarão no fundo do

tubo.

O hematócrito ou micro hematócrito é determinado comparando o volume de

hemácias com o volume total da amostra de sangue.

Valores de referências de micro hematócrito: Homens (42-52) e mulheres (36-

48).

OBS.: Valor baixo de micro hematócrito: pode indicar anemia ou a presença de

hemorragias no paciente.

OBS.: Valor alto de micro hematócrito: pode ser causado por desidratação ou

condição de policitemia (um excesso de hemácias no sangue periférico).

Dentre os exames realizados em laboratórios, tem-se o hematócrito que é um exame de

diagnóstico que serve para avaliar a percentagem dos glóbulos vermelhos ou hemácias

no volume total de sangue, sendo dividido em hematócrito alto ou baixo. O valor de

referência para homens é de 40 – 50% e para mulheres de 35 – 45%, caso o resultado

apresente valores diferentes, pode ser gerado alguma doença.

Outro exame realizado é o de VHS, velocidade de hemo-sedimentação, um fenômeno

que acontece quando o sangue é deixado em repouso na posição vertical, dentro de um

tubo. Nessa situação, as hemácias se depositam no fundo do tubo, separando-se do

plasma, que permanece na parte superior. Após uma hora de repouso, a linha de

separação entre as hemácias e o plasma serve para a leitura direta do resultado do exame

em uma escala numérica.

Sedimento urinário

A urina é um liquido excretado pelos rins através das vias urinárias, pelo qual

são eliminadas substâncias desnecessárias ao organismo.

 Desempenha um papel importante na regulação do balanço de líquidos e no

equilíbrio entre ácidos e bases. Nas pessoas sadias possui coloração clara (amarelada).

Além disso, a urina é composta aproximadamente por 95% de água e 2 % de uréia. Nos

3% restantes, podemos encontrar fosfato, sulfato, amônia, magnésio, cálcio, ácido úrico,

creatina, sódio, potássio e outros elementos.

Componentes do sedimento urinário:

1- Leucócitos e hemácias: na urina normal pode conter poucas dessas células.

2- Células epiteliais: são constantemente descamadas do revestimento do trato urinário.

3- Micro-organismos (bactérias, leveduras, protozoários): não devem estar presentes em

urina fresca, normal e colhida de maneira adequada. A presença de micro-organismos

em grande número indica infecção.

Objetivos

Observar e aplicar a centrifugação como procedimento clínico de fracionamento de

células e moléculas e separar ou fracionar substratos biológicos de interesse médico e

biológico.

Materiais

Microcentrífuga, tubos de micro hematócritos, cartão de leitura de hematócritos, sangue,

urina, microscópio, luvas, fósforo, lamparina, álcool e papel toalha.

Método

Centrifugação sanguínea - Enchemos 4 tubos capilares de micro hematócrito

com a amostra de sangue, fechando uma das pontas, de cada tudo, com a chama da

lamparina. Depois de vedados, foram levados a macro centrífuga, dentro de tubos de

ensaio, passando pelo procedimento de centrifugação por 5 minutos na velocidade

adequada. Em seguida observamos o sedimento e o sobrenadante resultante da

centrifugação dos tubos na escala para micro hematócrito.

Centrifugação da urina - Colocamos em 4 tubos a amostra de urina, com

aproximadamente igual volume cada, sendo submetida à macro centrífuga por 5

minutos na velocidade adequada. Em seguida, colocamos o sobrenadante de 2 tubos na

lâmina e o sedimento dos outros dois tubos em outra lâmina para podermos visualizar

no microscópio.

Discussão e resultados

Após a centrifugação as células e partículas presentes, respectivamente, no

sangue e na urina, que são mais densas se depositaram no fundo do tubo.

Com o tubo centrifugado, levamos ao cartão de leitura de hematócritos, que

permitiu quantificar a porcentagem de volume de células presentes na amostra de

sangue. O tubo, que possuía uma parte sedimentada e outra sobrenadante, foi colocado

sobre o cartão, onde o sobrenadante ficou na parte superior, com o menisco ajustado a

linha 100% e o fundo das células ajustado a linha 0. A partir desse ajuste pudemos então

ler o alto da coluna das células, contatando a porcentagem de volume de células que

aquele sedimento possuía.

Com a amostra centrifugada de urina, disposta nas lâminas, pudemos

visualizar pelo microscópio, as partículas encontradas no seu sedimento e sobrenadante.

Dentre outros, encontramos no sedimento os lactobacilos.

Conclusão

Com a prática, conclui-se que os métodos de fracionamento celular

consistem na separação e isolamento de diversos componentes celulares, para seu

posterior estudo através de técnicas bioquímicas ou de biologia molecular. E que um

dos métodos mais utilizados é o método de fracionamento por centrifugação

Pudemos aplicar na prática, a centrifugação e a partir dela, realizar

procedimentos clínicos, como a análise microscópica dos sedimentos encontrados na

urina. Sendo assim, este método concretiza a sua importância, principalmente nos

exames de sumário de urina, possibilitando os diagnósticos mais fidedignos

possíveis.Pudemos separar os substratos estudados: sangue e urina por meio da

utilização da centrífuga.

MICROSCOPIA

.Introdução

A microscopia é a percepção dos corpos de um modo que não podemos

enxergar a olho nu. Ela tem como componente principal a LUZ, e segundaria as lentes,

que compõe o microscópio (instrumento utilizado na microscopia), que é captada a luz e

aumentada a sua resolução. O contraste também possui relevância, pois ao interagir com

a matéria nos permite a distinção das estruturas.

A partir disto, a ampliação dos objetos, se dá com a produção de contrastes,

por diferenças nos índices de refração da luz (os quais dependem do meio) e por

indução de coloração. Portanto as propriedades físicas das substancias observadas são

determinantes na produção dos efeitos de ampliação e contraste.

Objetivo

- Observar efeitos dos contrates em sistemas a fresco e em sistemas fixados e corados.

- Observar o poder de resolução nos diferentes sistemas a fresco e corado.

- Ter o primeiro contato com amostras de sangue afresco e realizar a técnica do

esfregaço sanguíneo para identificar os seguintes componentes do sangue humano:

linfócitos, neutrófilos, monócitos, basófilos e eosinófilos.

Microscopia do sedimento urinário

Material: Microscópio óptico, luva de procedimento, lâmina, lamínulas, papel

toalha, centrífuga, vasilhame para desprezar o material e urina.

Metodologia: Observar coloração, aspecto e odor da urina. Colocar em tubos e

posicioná-los na centrífuga de maneira equilibrada. Centrifugar por cinco minutos. Após

centrifugação retira-se o excesso de líquido e homogeneizar. Colocar uma gota de urina

em uma lâmina limpa. Fazer esfregaço. Iniciar a observação microscópica com objetiva

de 10.

Resultado e discussão: Durante a observação microscópica das duas amostras

dos sedimentos urinários pode-se encontrar células epiteliais, diversas bactérias como:

cocos, estafilococos e bastões. Foram encontrados também leucócitos, raras hemácias,

cristais de oxalato de cálcio, os que são indicadores de pH como os uratos amorfos

(ácido) e os fosfatos (básicos), aglomerados de células epiteliais provenientes do trato

urinário, cilindros (são complexos grandes e elementos exclusivamente renais) e muco

que protege a mucosa da acidez urinária.

O sedimento urinário dos alunos se diferenciava nas colorações um mais

amarelo que o outro, ambos com odor característico.

Microscopia do Sangue

Materiais: Microscópio óptico, lâminas, lamínulas, sangue total, solução

corante, luvas, galeria de coloração, papel toalha, vasilhame para desprezar material.

Metodologia: Conforme a orientação do professor, para começar o experimento

foi necessária colher amostras de sangue humano e coloca-las em tubos de ensaios

tampados. Essa parte não foi realizada na aula, as amostras foram colhidas pelo

professor e já estavam prontas para serem utilizadas.

Resultado e discussão: Os resultados do experimento foram satisfatórios, pois

nas lâminas foi possível obervar :

Hemácias

- Uma contagem elevada de hemácias pode indicar policitemia absoluta ou relativa.

- Uma contagem deprimida de hemácias pode indicar anemia, sobrecarga de líquido ou

hemorragia além de 24 horas. Teste adicionais, como, por exemplo, exame de célula

colorida, hematócritos, hemoglobina, índices hematimétricos e estudos de glóbulos

brancos são necessários para confirmar o diagnóstico.

Leucócitos

- A contagem de leucócitos varia de 4.000 a 10.000/ml.

- Os glóbulos brancos são classificados de acordo com os cinco tipos principais:

Neutrófilos - Fazem parte da porção do sangue responsável pela defesa ou imunidade

do organismo. Eles são responsáveis por envolver as células doentes matando-as a

seguir e são especializados no combate à bactérias e fungos. A correta  interpretação de

seus valores no sangue pode auxiliar no diagnóstico de diversas doenças. Os valores de

neutrófilos estarão altos, condição conhecida como neutrofilia, quando houver:

infecções, desordens inflamatórias, diabetes, uremia, eclampsia, necrose hepática,

leucemia mielóide crônica, policitemia, pós-esplenectomia, anemia hemolítica. A

neutropenia, ou a baixa concentração de neutrófilos, ocorre quando existem: infecções,

anemia aplástica, leucemias agudas, anemia megaloblástica, anemia ferropriva,

hipotireoidismo, cirrose.

Eosinófilos - São leucócitos granulares com um núcleo que usualmente apresenta

dois lobos conectados por um filamento delgado de cromatina. Essas células fagocitam

e eliminam complexos de antígenos com anticorpo que aparecem em casos de alergia,

como a asma brônquica. Os valores de eosinófilos abaixo no normal podem ocorrer

quando o paciente está em eclampsia, após grandes cirurgias ou está em choque.

Quando os valores dos eosinófilos estão altos ou levemente aumentados significa que o

indivíduo pode ter alguma alergia; asma; ou infecção parasitária. 

Basófilos – É um tipo de célula que fazem parte da porção do sangue responsável pelas

defesas ou imunidade do organismo. Eles são avaliados pelo hemograma e ajudam na

detecção de várias doenças. Acredita-se que eles também estão relacionados às alergias

assim como os eosinófilos, pois produzem histamina e heparina. Os números de

basófilos estarão aumentados, condição chamada de basofilia, quando o paciente

apresentar: colite ulcerativa, nefrose, anemia hemolítica, doença de hodgking. Os

valores de basófilos estarão baixos, condição chamada de basopenia, quando houver:

hipertiroidismo, infecção aguda, síndrome de cushing.

Monócitos

É um grupo de células que tem a função de defender o organismo de corpos estranhos.

Os valores de monócitos estão altos, condição denominada monocitose, na presença de:

tuberculose; leucemia monocítica aguda, lúpus. Os monócitos baixos, condição

chamada de monocitopenia, podem ser causados por: anemia aplástica, uso de

corticoides, terapia com imunossupressores, leucemia aguda, Infecções.

Linfócitos

Os linfócitos são um tipo de célula de defesa do organismo que é um ótimo indicador do

estado de saúde do indivíduo. Os valores de linfócitos estarão altos (linfocitose) quando

o paciente apresentar alguma infecção, como hepatite viral, toxoplasmose, rubéola,

infecção aguda por HIV, leucemia linfocítica crônica ou aguda, por exemplo. Os

linfócitos baixos podem significar a presença de infecções e enfermidades agudas,

doença de Hodgkin, lúpus, anemia aplásica, insuficiência renal, Aids e estado terminal

de câncer, por exemplo. Os valores também ficam alterados quando o paciente está

desnutrido, situação que se normaliza assim que o estado de desnutrição se reverte.

A contagem diferencial é o valor percentual de cada tipo de glóbulo branco no

sangue. Para adultos, os valores absolutos e porcentagens normais incluem o seguinte:

- Basófilos: 0 a 200/ml; 0 a 2%

- Eosinófilos: 40 a 500/ml; 1 a 5%

- Linfócitos: 880 a 4.000/ml; 22 a 40%

- Monócitos: 120 a 1.000/ml; 3 a 10%

- Neutrófilos: 1.800 a 7.500/ml; 45 a 75%.

Plaquetas

- As plaquetas ou trombócitos, promovem a coagulação, ou seja, a formação de um

coágulo hemostático em locais de comprometimento vascular.

- As contagens normais de plaquetas variam entre 130.000 a 370.000/ml

- Uma contagem diminuída de plaquetas (trombocitopenia) pode resultar de medula

óssea aplástica ou hipoplástica; uma doença infiltrativa de medula óssea, como, por

exemplo, carcinoma ou leucemia; hipoplasia megacariocítica; trombopoiese infecciosa

proveniente de deficiência de ácido fólico ou vitamina B12; acúmulo de plaquetas em

um baço aumentado; destruição aumentada de plaquetas devido à drogas ou desordens

imunes; coagulação intravascular disseminada; síndrome de Bernard-Soulier; ou lesões

mecânicas às plaquetas.

- Uma contagem aumentada de plaquetas (trombocitose) pode resultar de hemorragias,

desordens infecciosas; câncer; anemia por deficiência de ferro; cirurgia recente,

gravidez, ou esplenectomia e desordens inflamatórias. Em tais casos, a contagem de

plaquetas retorna ao normal após o paciente recuperar-se da desordem primária.

Todavia, a contagem permanece elevada em trombocitemia primária, mielofibrose com

metaplasia mielóide, policitemia vera e leucemia mielóide crônica. Em tais desordens,

as plaquetas podem estar disfuncionais, resultando em sangramento.

Microscopia da Citologia Vaginal

A vagina possui uma flora bastante rica e nos permite avaliar seus diversos

elementos através da observação microscópica de uma amostra dessa secreção. O

preventivo, também conhecido como Papanicolau é um exame no qual a secreção

vaginal é colhida para análise microscópica. Após ser colhido o material é fixado e seco

e então corado com dois corantes a hematoxilina e a eosina. A hematoxilina é um

corante básico que possui afinidade com o núcleo da célula, já a eosina é um corante

ácido que cora o citoplasma que tem natureza básica.

Método Corado

Ao observar a mucosa vaginal em microscópio, foi possível identificar as

diversas células existentes ali. As células superficiais possuem núcleo pequeno e

amadurecem mais rapidamente por conta do hormônio estrogênio. As células

intermediárias e profundas possuem núcleos de maiores extensões. Encontramos

também lactobacilos (essenciais na defesa da mucosa vaginal), leucócitos, cocos e

bacilos.

O material colhido de mulheres mais maduras possui uma coloração azulada

e células que possuem núcleos maiores, já o material de mulheres mais jovens possui

justamente o contrário uma coloração rosa - avermelhada com núcleos menores. É

válido ressaltar que o material recolhido em mulheres jovens é mais rico (cheio de

células) do que de mulheres mais velhas. Porém as células vaginais assim como

qualquer outra, podem sofrer modificações a depender do estímulo que lhes é aplicado,

como por exemplo, na presença de herpes e de HPV. O vírus do herpes e do HPV fazem

reações celulares diversas como as modificações perinucleares, ou seja, mudanças

reativas ao redor do núcleo. Estas modificações são consideradas como atípicas, afinal

fogem da normalidade. Células binucleadas; células dicarióticas (com núcleo grande);

células multinucleadas; com reações perinucleares; células com núcleo e citoplasma

alterados; aspecto de vidro fosco. Todas estas são determinantes no que diz respeito à

normalidade da amostra.

A partir do momento em que estas modificações celulares ocorrem, as

células passam a se comportar também de modo diferente. Quanto mais tempo levam,

ou a depender da carga genética individual, podem se desenvolver patologias graves,

como o câncer do colo do útero. As lesões consideradas como percussoras do câncer são

denominadas: neoplasias intraepiteliais de grau I, II e III (NIC), as lesões pré-

neoplásicas são atípicas (binucleações e multinucleações). A depender da quantidade de

alterações, e da profundidade das lesões estas podem ser estadeadas e também

classificadas em NIC I, NIC II e NIC III. Sendo a NIC I designada como lesão de baixo

grau e as NIC II e NIC III como alto grau.

Resultados e discursão

Após a análise de lâminas de mulheres de várias idades, foi possível

constatar a presença em grande quantidade de neutrófilos e hemácias. Assim como, a

dificuldade em encontrar basófilos e eosinófilos, possibilitou a conclusão de que estes

estão presentes em menor quantidade em nosso corpo. A idade na citologia vaginal trás

grandes diferenças entre os materiais de mulheres de acordo com as faixas etárias,

ficando evidente que quanto mais jovem é a mulher, mas rico era o material biológico

que foi recolhido.

REFRATOMETRIA

INTRODUÇÃO:

A velocidade da luz depende do meio no qual esta se propaga, por exemplo, se

um feixe de luz propagado por um equipamento atravessar a água, a velocidade da luz

diminui e sua direção muda, diz-se então que a luz foi refratada, portanto a refratometria

da luz nada mais é do que conhecer o quanto a luz que esta sendo propagada em um

meio ao penetrar um novo meio é desviada por este, é isto que chamamos de refração da

luz.

O índice de refração é uma propriedade física importante de sólidos, líquidos e

gases e este varia de acordo com a concentração de uma substancia em um destes

estados físicos.

O índice de refração é útil na caracterização e identificação de líquidos ou para

indicar a pureza deste liquido.

Este índice é definido como sendo a razão entre a velocidade da luz no vácuo e

na substância analisada, ou seja, quando um feixe de luz se desloca em um meio

homogêneo e incide sobre a superfície de outro meio, este será refratado e mudará de

direção em relação à trajetória original.

Este fenômeno é regido pela lei da refração onde a relação do seno do ângulo de

incidência para o ângulo de refração é sempre uma constante.

n1 sen i = n 2 sen r

sen i = n2 = Nsen r n1

Onde:

i = ângulo de incidênciar = ângulo de refração n1 = índice de refração do meio 1n2 = índice de refração do meio 2N = índice de refração relativa

O índice de refração varia de acordo com a temperatura, comprimento de onda e

com o teor de sólidos dissolvidos, além de ser proporcional à concentração em

porcentagem de sólidos dissolvidos em soluções aquosas (%Brix), o que, no caso dos

alimentos corresponde principalmente ao açúcar que eles contêm.

A escala Brix é calibrada pelo número de gramas de açúcar contidos em 100 g

de solução. As escalas em percentagem de Brix apresentam as concentrações

percentuais dos sólidos solúveis contidos em uma amostra (solução com água). Os

sólidos solúveis contidos em uma solução é o total de todos os sólidos dissolvidos na

água, começando com açúcar, sais, proteínas, ácidos, etc.

O instrumento empregado para a determinação do índice de refração ou

diretamente Brix é chamado de refratômetro.

O refratômetro é um instrumento simples que pode ser usado para medir

concentrações de soluções aquosas, consumindo apenas umas poucas gotas da solução.

Sua aplicação estende-se pelas áreas de alimentos, agricultura, química e em indústrias

de manufaturados.

Existem refratômetros para diversas finalidades, como refratômetros de campo,

de laboratório e industrial, sendo todos baseados no mesmo princípio.

OBJETIVO:

- Observar o índice de refração (IN) e a densidade (D) da água destilada para servir de

base para outras soluções biológicas.

- Saber manusear e aferir o refratômetro com água destilada considerando o IN: 1,33 e

D=1000.

- Aferir o aparelho com água destilada utilizando a escala de concentração.

- Criar diferentes soluções (Ex: Glicose 1%, sacarose 2%, dextrose1%), conhecidas e ou

desconhecidas e aferir na escala de concentração.

- Observar a densidade de diferentes soluções biológicas (Ex: urina, saliva, etc.).

MATERIAL:

- Refratômetro

- Solução de glicose 1%

- Solução de sacarose 2%

- Solução de dextrose 1%

- Urina

- Saliva

- Gases

- Pipetas volumétricas

- Água destilada

- béquer

- Proveta

MÉTODO:

- Preparar as soluções de glicose 3%, sacarose 2% e dextrose 1%

- Aferir o refratômetro com água destilada

- Testar cada solução no refratômetro, construir tabelas e gráficos, relacionando

densidade, índice de refração e concentrações.

- Testar a urina e a saliva.

RESULTADOS/ CONCLUSÃO:

Amostra Densidade n g/100ml %

Sol. Glicose 1013 1337,5 2,4 2,4

Sol. Sacarose 1035 1,346 7,6 7,6

Sol. Lactose 1015 1,3385 3,2 3,2

Urina 1022 1,341 4,4 4,4

A partir dos experimentos realizados em laboratório foi possível perceber que a

refratometria é uma técnica de simples utilização sem necessitar de grandes recursos. É

bastante útil para analisar substâncias atentando assim para a sua qualidade.

Para validar a teoria vista foram analisadas diferentes substâncias no

experimento e a cada análise tornou-se possível conhecer a %Brix de cada uma, além do

seu índice de refração, temas abordados anteriormente nesse relatório.

ESPECTROFOTOMETRIA

INTRODUÇÃO

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um

procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies

químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).

A variação da cor de um sistema com a mudança da concentração de um

componente é base da análise colorimétrica. A cor é, usualmente, devida à formação de

um composto colorido pela adição de um reagente apropriado ou é inerente ao

constituinte que se deseja analisar. A intensidade da cor é comparada com a intensidade

da cor que se obtém com o mesmo procedimento pelo tratamento de uma amostra cuja

quantidade e concentração são conhecidas. Na análise espectrofotométrica usa-se uma

fonte de radiação que alcança a região ultravioleta do espectro. Para isso, escolhem-se

comprimentos de onda de radiação bem-definidos e com largura de banda de menos de

um nanômetro, o que exige um espectrofotômetro, um instrumento mais complicado e,

conseqüentemente, mais caro.

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória,

caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (ג –(lambda), expressos em μm ou

nm) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua

energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é

resultante da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta

absorção, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de usa

concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela luz.

Através da Lei de Beer, intensidades da radiação incidente e emergente podem

ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução.

A Lei de Beer é dada por:

Aג = εגbc, onde

A – Absorbância

ε – constante

b- distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra

c- concentração da solução absorvente

Como normalmente usam-se cubetas de 1 cm de comprimento, a equação fica:

Aג = εגc

Ou seja, a absorbância da luz a cada comprimento de onda ג é diretamente

proporcional à concentração da solução contida na cubeta. Esta linearidade deixa de

ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nesses casos diluir

previamente a amostra a medir.

A equação A= εbc mostra que a absorbância depende da quantidade total de

substância absorvedora que há no caminho ótico através da cuba com a solução.

O conjunto de soluções de números 1 a5 constitui o que se denomina curva de

calibração ou curva padrão, indispensável para determinar concentração de qualquer

solução,desde que conheça sua absorbância. Na plotação do gráfico absorbância versus

concentração, teremos uma reta., como já era indicado pela Lei de Beer, que permite

calcular concentrações graficamente.

Na maioria das análises espectrofotométricas,é importante preparar um reagente

branco contendo todos os reagentes, mas com o constituinte em análise substituído por

água destilada. Também é importante usar uma série de padrões para estabelecer uma

curva de calibração. Os padrões devem ser preparados pelo mesmo procedimento usado

nas amostras desconhecidas. A absorbância da amostra desconhecida de diminuir dentro

da região coberta pelos padrões, de forma que não haja questionamento sobre a validade

da curva de calibração.

METODOLOGIA

ESPECTROFOTÔMETRO:

O aparelho contem comprimentos de ondas diversos e o material

utilizado se sensibiliza por algum dos valores de comprimentos de onda que o

mesmo possui.

 É um aparelho amplamente utilizado em laboratórios, cuja função é a

de medir e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por uma

determinada solução. Ou seja, ele é usado para medir (identificar e determinar)

a concentração de substâncias, que absorvem energia radiante, em um solvente.

Este aparelho possui uma gama de aplicações e está presente em várias áreas,

tais como em química, física, bioquímica e biologia molecular. O grande

inventor deste instrumento tão fundamental nos dias de hoje foi o químico

americano Arnold O. Beckman, em 1940.

Em geral, um espectrofotômetro possui uma fonte estável de energia

radiante (normalmente uma lâmpada incandescente), um seletor de faixa

espectral (monocromatizadores como os prismas, que seleciona o comprimento

de onda da luz que passa através da solução de teste), um recipiente para

colocar a amostra a ser analisada (a amostra deve estar em recipientes

apropriados como as cubetas e tubos de ensaio) e, um detector de radiação, que

permite uma medida relativa da intensidade da luz.  A base

da espectrofotometria, portanto é passar um feixe de luz através da amostra e 

fazer a medição da intensidade da luz que atinge o detector. O

espectrofotômetro compara quantitativamente a fração de luz que passa através

de uma solução de referência e uma solução de teste.

Antes de utilizar um espectrofotômetro sempre é feita uma calibração,

que é fundamental para garantir que as medições obtidas no aparelho sejam

precisas. Esta calibração pode variar em vários espectrofotômetros. A maioria

dos fabricantes fornece um guia sobre como calibrar o aparelho.

É muito importante ao colocar a amostra a ser analisada, não tocar no

tubo de ensaio na parte do meio, para evitar manchas de dedo que alteram a

leitura do aparelho. Assim, o ideal é pegar na parte superior do tubo e colocá-lo

no aparelho para que ele faça a leitura e dê o resultado almejado. Além disto,

para que um espectrofotômetro funcione corretamente, deve ser aquecido antes

de usar. Muitos dispositivos demoram cerca de 10 minutos para aquecer.

CURVA DE ABSORÇÃO ESPECTRAL: Significa a impressão digital da

substância, sendo assim o maior valor de absorção.

RESULTADOS:

Através de processos físicos realizados pelo aparelho de espectrofotometria,

podemos analisar as propriedades das soluções, por exemplo: as concentrações.

E com a utilização de cálculos juntamente com os resultados obtidos, pela

aparelhagem, é possível definir a concentração, em margens muito

aproximadas, de soluções de concentrações desconhecidas.

410 480 520 580 660

Glicose 0.7 0.6 0.1 0.01

Uréia 0.1

6

0.26 0.4 0,2

Proteínas

Totais

0,1

7

0,3 0,7 0,81

Curva de Absorção Espectral

410 480 520 580 6600

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

GlicoseUréiaProteínas

CROMATOGRAFIA

INTRODUÇÃO

A cromatografia envolve uma série de processos de separação de misturas,

acontece pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa)

e outra móvel. A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é

influenciado por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, bipolar, apolar, e

específicos efeitos de afinidade e solubilidade.

A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por

comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos,

separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma

mistura. As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-

se diversos critérios:

1. Classificação pela forma física do sistema cromatográfico

2. Classificação pela fase móvel empregada

3. Classificação pela fase estacionária utilizada

4. Classificação pelo modo de separação

1. Classificação pela forma física do sistema cromatográfico

Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser subdividida

em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar

resume-se à cromatografia em papel (CP), à cromatografia por centrifugação e à

cromatografia em camada delgada (CCD), são diversos os tipos de cromatografia em

coluna.

2. Classificação pela fase móvel empregada

São de 3 tipos: a cromatografia gasosa, a cromatografia líquida e a

cromatografia supercrítica (CSC). A cromatografia líquida apresenta uma importante

subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC) e a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE). No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por

cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).

3. Classificação pela fase estacionária utilizada

Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas,

líquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um

líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou

imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, como

fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus

mecanismos de separação.

4. Classificação pelo modo de separação

Separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica,

exclusão ou misturas desses mecanismos.

Cromatografia planar

A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição líquido–líquido.

Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre duas fases

imiscíveis, sendo geralmente a água um dos líquidos. Este método é muito útil para a

separação de compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica.

A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção

líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos

componentes de uma mistura pela fase estacionária.

Cromatografia em coluna

A cromatografia líquida clássica é muito utilizada para isolamento de

produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. As fases estacionárias

mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir

simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. Fases estacionárias

sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição.

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica analítica usada para

separar e quantificar componentes numa mistura líquida. A utilização de suportes com

partículas diminutas são os responsáveis pela alta eficiência desse método de

cromatografia. A fase móvel (líquida) movimenta-se continuamente através da coluna

contendo a FASE ESTACIONÁRIA (sólido). O soluto interage com as fases

estacionária e móvel por adsorção, partição, exclusão molecular, troca iônica. As

separações em CLAE podem se dar por adsorção (separação sólido-líquido), partição

(separação líquido-líquido) ou ambos. O detector mais utilizado para separações por

CLAE é o detector de ultravioleta (Absorção da luz na faixa UV – visível), sendo

também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e

eletroquímicos, entre outros.

OBJETIVOS

- Enunciar o princípio da separação cromatográfica

- Descrever as fases da cromatografia e suas funções

- Saber construir um modelo cromatográfico simples de separação e identificação pela

cromatografia.

MATERIAL UTILIZADO:

- Corantes: verde malaquita, azul de metileno, vermelho neutro.

- solução eluente: álcool absoluto, éter, acetona.

- Papel filtro

- Becker

- Pipetas de 10 ml

- Micropipetas de 20um

- Placa de Petri

MÉTODO:

Construir sistemas bifásicos em placas com fase fixa e fase móvel, respectivamente de

álcool, água destilada, éter, acetona.

Obs: a mistura do substrato deve ter afinidade pelos eluentes do sistema que se move e

arrasta os componentes. Os componentes da mistura devem apresentar velocidade de

corrida, tempo de corrida, ou distância percorridas que deverão ser tomadas e

normatizadas. Construir um sistema suporte devidamente mensurado onde deveremos

observar as distâncias percorridas para aplicação do Rf e para serem relacionados com

padrões conhecidos.

PROCEDIMENTOS:

Misturaram-se diversos pigmentos de cores variadas e fez uma listra no papel

filtro que foi colocado na fase móvel.

CONCLUSÕES:

Os componentes de uma mistura são identificados pela cor. Colocando a tira

de papel com os pigmentos na solução móvel é possível identificar os componentes da

mistura. Os componentes da fase móvel são absorvidos gradativamente pela fase

móvel, devida as diferentes solubilidades de tamanho das moléculas, seus componentes

sobem com diferentes velocidades, permitindo a identificação das substâncias.

ELETROFORESE

INTRODUÇÃO:

Grande parte das pesquisas atuais em biologia estuda os aspectos ligados às

proteínas e aos ácidos nucléicos. Essas macromoléculas apresentam como característica

importante um grande número de regiões (grupamentos) com cargas elétricas, sendo

estas cargas, positiva ou negativas, provenientes dos aminoácidos que as constituem.

Estas cargas são resultado da ligação ou perda de prótons. Alguns grupos são

neutros e ao receberem um próton, tornam-se positivos (como por exemplo, o grupo –

NH2, que, ligando-se a prótons, é convertido a –NH3+). Outros grupos são neutros,

mas, ao perderem um próton, tornam-se negativos (é o caso do grupo –COOH, que se

converte em –COO-). Estas perdas e adição dependem do pH do meio em que a proteína

se encontra.

A somatória das cargas de todas as regiões carregadas de uma proteína confere

uma carga total à proteína, sendo que esta carga varia com o pH do meio.Para os ácido

nucléicos (DNA e RNA), estes apresentam uma situação mais simples do que as

proteínas, pois apenas apresentam cargas negativas dos grupos fosfato. Outra

característica interessante dos ácidos nucléicos que surge de sua estrutura polimérica

repetitiva é a razão entre o número de cargas negativas e o número de átomos que

compõem o ácido nucléico sendo praticamente constante, independentemente do

tamanho ou da sequência de nucleotídeos da molécula.

A migração das cargas elétricas quando são submetidas a uma diferença de

potencial é chamada de eletroforese. Isto ocorre porque uma das propriedades das

cargas elétricas em solução quando uma diferença de potencial é aplicada a solução – ou

seja, quando os pólos de uma bactéria são conectados à solução –as cargas negativas são

atraídas pelo pólo positivo e as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo,

deslocando-se em direção a eles. Os ácidos nucléicos, como são carregados

negativamente, migram em direção ao pólo positivo.

Apesar de corresponder a uma migração de cargas em solução, a eletroforese

não é normalmente realizada em soluções “puras”. Isso porque as soluções estão

sujeitas a uma série de influências físicas do ambiente que lhes causam perturbações.

Dentre as inúmeras fontes dessas perturbações destacam-se as ondas mecânicas e até

mesmo os movimentos de convecção do líquido pelo aquecimento da solução

causado pela aplicação da diferença de potencial. As perturbações fazem com que a

eletroforese, nessas condições, seja um processo muito pouco reprodutível, com as

cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas sim, dispersas.Para reduzir tal

problema, desenvolveram-se sistemas nos quais as perturbações à eletroforese são

reduzidas. Tais sistemas utilizam matrizes rígidas – conhecidas como suportes – onde

a solução interage e diminuindo as perturbações mecânicas e os movimentos de

convecção no líquido. Existem dois tipos básicos de suportes: os suportes de papel e os

suportes de gel.

Nos suportes de papel, a natureza hidrofílica da celulose faz com que uma

película de líquido sobre o papel seja formada. Como a interação entre a fase aquosa

e celulose é intensa, a solução sofre pouca influência de fatores 6 mecânicos.

Exemplos de suportes desse tipo são o papel de filtro e a acetato de celulose.

Para os suportes de gel os exemplos encontrados são os géis de agarose e a

poliacrilamida, onde as macromoléculas ficam retidas dentro dos poros da trama do

polímero que compõe o gel. Dessa formam, a solução também pode ser poupada de

turbulências e convecções.

Como visto, diversos fatores físicos como choques mecânicos e alterações na

temperatura podem então drasticamente a migração de cargas em solução. Estes fatores

podem ser contornados pelo uso de suportes para a eletroforese. Além destes, outros

fatores também podem interferir na prática da eletroforese. A intensidade da diferença

de potencial, a carga total da macromolécula e o tamanho da macromolécula podem

influenciar o movimento de cargas, principalmente a velocidade de migração de

macromoléculas, mesmo se o suporte for utilizado. A diferença de potencial é a

principal força motriz para o movimento das cargas em solução. Conseqüentemente,

quanto maior a intensidade da voltagem aplicada, maior será a velocidade com que as

cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.

Por outro lado, se considerarmos a carga total da macromolécula, quanto maior

for essa carga, maior será a atração eletrostática da molécula pelo pólo de sinal oposto.

Dessa forma, quanto maior for a carga da macromolécula, maior será a sua velocidade

de migração eletroforética.

O tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade

de migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o

solvente, o suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a

macromolécula, menor será a sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal

oposto.

Tendo em vista todos os fatores influentes sobre a migração eletroforética,

consideramos uma solução em que haja uma mistura de macromoléculas com tamanho

e/ou cargas diferentes. Ao aplicarmos uma diferença de potencial a esta solução, as

moléculas migrarão com velocidades e/ou direções diferentes, dependendo de seus

tamanhos e cargas. Ao final de um dado intervalo de tempo, ao desligarmos a fonte da

diferença de potencial, cada tipo de molécula estará em um lugar diferente da solução

no espaço entre o pólo positivo e o negativo.

Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das

macromoléculas, podemos separá-las mais com base na carga ou mais com base em seu

tamanho. Na eletroforese, o suporte de papel, a fricção com o suporte que as

macromoléculas experimentam é pequena, o que faz com que o tamanho da molécula

não influencie profundamente a sua velocidade de migração. Sendo assim, as moléculas

são preferencialmente separadas com base em suas cargas. Esse tipo de eletroforese

encontra grande utilidade na separação de proteínas que, devido à variada composição

de seus aminoácidos, apresentam grandes diferenças na carga total.

OBJETIVO:

- Enunciar os princípios Qualitativos e Quantitativos do método.

- Descrever o mecanismo da participação das soluções tampões que condicionam o

perfil e a direção da corrida das cargas.

- Relacionar a migração das proteínas em função do PI e PH do meio

- Descrever o instrumento básico da eletroforese, e o modo de executar o processo.

CONCLUSÃO:

Ao término deste trabalho de pesquisa concluímos que a eletroforese é um

processo analítico de separação de misturas, cujo principal agente é o campo elétrico.

Essa técnica passou por evoluções, com a introdução de um suporte como papel de

filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou

poliacrilamida, entre outros.

Atualmente o campo de aplicação da eletroforese tem sido amplamente

difundido, devido á simplificação de aparelhagem utilizada e também á disponibilidade

de meios de suporte altamente purificados, o que veio diminuir em muito o tempo gasto

na separação.

As principais técnicas de eletroforese são: eletroforese em gel, eletroforese

capilar e capilar em gel. A técnica de eletroforese capilar possui uma série de vantagens,

tais como a rapidez, versatilidade, um baixo custo por análise, alto poder se separação

(resolução) e um consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes. Além disso,

oferece a possibilidade de automação e detecção on-line.

Entretanto esta técnica oferece algumas limitações, pois não é adequada para a

determinação de compostos voláteis, não polares e de massa molar baixa, os quais são

melhores determinados por cromatografia gasosa. Também não é muito adequada para a

análise de polímeros não iônicos de massa molar alta e não é tão sensível quanto a

cromatografia líquida de alta eficiência.

A eletroforese é de grande importância para as ciências, permitindo a separação

e identificação de moléculas de DNA por meio da diferença de velocidade de migração,

identificação de pessoas em testes de paternidade pela comparação de DNA, na

indústria farmacêutica e até mesmo na agropecuária.

Referências

CROMATOGRAFIA. Disponível em:<http://www.infoescola.com/quimica/cromatografia/>. Acesso em: 23 de setembro de 2015.

ESFREGAÇO SANGUÍNEO. Disponível em:<http://www.biomedicinabrasil.com/2011/03/esfregaco-sanguineo.html>. Acesso em: 23 de setembro de 2015.

ELETROFORESE. Disponível em:<http://www.infoescola.com/bioquimica/eletroforese/>. Acesso em: 23 de setembro de 2015.

ESPECTROFOTOMETRIA. Disponível em:<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAiFkAE/espectrofotometria>. Acesso em: 23 de setembro de 2015.

FOGAÇA, Jennifer Rocha Vargas. Centrifugação - Método de Separação de Misturas. 2015. Disponível em: <http://www.alunosonline.com.br/quimica/centrifugacao-metodo-separacao-misturas.html>. Acesso em: 23 set. 2015.

LEUCÓCITOS. Disponível em:<http://www.tuasaude.com/leucocitos/>. Acesso em: 23 de setembro de 2015.

REFRATOMETRIA. Disponível em: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfe9oAF/relatorio-refratometria>. Acesso em: 23 de setembro de 2015.

VOGEL, A. I. Análise química quantitativa. 6. Ed. Rio de Janeiro: LTC, 2002.