Richiami di Bioenergetica

Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare col

Potenziale Elettrochimico

Il Potenziale Elettrochimico è l’Energia disponibile nelle Reazioni

Chimiche per compiere Lavoro

Potenziale Elettrochimico

J/Mol

Unità = Energia/Mole

o=Go/mol

L’Energia in una Reazione

= iprodotti – Nireagenti Ni = Rapporto Molare dei Reagenti

1 A + 1 B 2C

= C – A – B

In generale:

Per la nosra particolare reazione:

All’Equilibrio:

= 0

Equilibrio

Ene

rgia

del

Sis

tem

a

Per una Reazione che va verso l’Equilibrio:

< 0

Equilibrio

Ene

rgia

del

Sis

tem

a

Il Potenzale Elettrochimico è la risultante di diversi fattori:

1) Composizione Molecolare

4) Pressione Osmotica, …

2) Concentrazione3) Potenziale Elettrico

Energia dovuta alla Composizione Molecolare

• Energia Conformazionale – Energia Entropica contro Stabilità dei legami

• Solubilità-Interazione con il Solvente– Coefficiente di Partizione

• Misurata in Condizioni Standard

o

Condizioni Standard

• Concentrazione 1 Molare • In Acqua Pura• pH=7• Pressione = 1 atmosfera

Le Condizioni Standard sono le condizioni della reazione appropriate per l’esperimento con i reagenti ad una concentrazione Molare:

Energia di Concentrazione

• L’Energia del Gradiente di Concentrazione:

= RT ln([C]/Molare)

R = Costante dei Gas (Joules*Mole-1*K-1)

T = Temperatura (Kelvin, K)

Energia del Potenziale Elettrico

• L’Energia dovuta alle cariche in un Campo Elettrico:

= z F z = Cariche (Moli di Carica/Mole) = Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica) V = J/C F = Costante di Faraday: 105 Coulomb/Mole di Carica

Potenziale Elettrochimico

= o + RT ln + zF[Conc]

[Conc]o

[Conc]o è la Concentrazione in Condizioni Standard

Cambiamento Conformazionale

A B

= (oB +RT ln([B]))-(o

A + RT ln([A]))

= B – A= 0

All’Equilibrio:

(oB + RT ln([B]))-(o

A + RT ln([A])) = 0

-RT ln ([B]) + RT ln ([A]) =oB – o

A =o

-RT ln ([B]) + RT ln ([A])

Distribuzione di Boltzmann

A B(o

B + RT ln([B]))-(oA + RT ln([A])) = 0

-RT ln ([B]/[A]) =o

[B]/[A] = Keq

All’Equilibrio:

Risolvendo rispetto a:

= exp (-o/RT)

Cambiamento Conformazionale

Modello di Gating del Canale

Le particelle di gating agiscono all’interno della proteina-canale con modalità interpretabili in termini di una distribuzione di Boltzmann.

Consideriamo un sistema a due stati nel quale ciascun canale è aperto dal movimento di una singola particella di gating di carica z

Secondo il modello di H&H un unico movimento della particella di gating causato da una variazione del campo elettrico provoca un cambiamento conformazionale del canale:

)(A)(C 21

Voltaggio-dipendenza del gating

Le posizioni e corrispondono a due minimi nel profilo energetico e vi è una singola barriera energetica tra di esse. In una popolazione di N canali simili, n1 avranno la loro particella di gating in posizione e n2 in posizione , cosicchè n1+n2=N.

En

erg

ia

Barrieraenergetica

+ +

Equazione di Boltzmanndella meccanica statistica

Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato o nello stato con le differenze di energia u2-u1=u dei due stati:

kTuu

PP 12

1

2exp

k cost. di BoltzmannT temp. assolutau2-u1 è espressa in joules

La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore

Stato 1 Stato 2

Energiau

In assenza di campo elettrico (E=0) la distribuzione di Boltzmann dell’energia della popolazione di molecole sarà:

Dove:n1 il no di particelle con energia u1 in posizione (1) (canale chiuso)n2 il no di particelle con energia u2 in posizione (2) (canale aperto),u2-u1 è la variazione di energia libera (G) relativa al cambio conformazionale da 1 a 2

kT

wexp

kT

uuexp

n

n 12

1

2

Quindi, in assenza di un campo elettrico la differenza di energia conformazionale (u2-u1) tra le posizioni 1 e 2 corrisponde al lavoro chimico (w) per muovere ciascuna particella di gating da 1 a 2.

1o caso: il campo elettrico transmembrana è zero

Se esiste un campo elettrico (E0) la componente energetica posseduta dalla particella in quanto elettricamente carica sarà: -zeV

z no di cariche in ciascuna particella di gatinge carica elementare dell’elettrone (=4.8·10-10 ues=1.6·10-10 coulombV potenziale elettrico

Quindi, includendo la componente di energia (lavoro) elettrica, avremo:

kT

zeVwexp

n

n

1

2

Se nel nostro sistema il canale è aperto quando la particella di gating è in (2) e chiuso quando è in (1),

la frazione di canali aperti è anche uguale alla frazione di particelle in (2):

)(A)(C 21

kT/zeVwexpnn

nPo

1

1

21

2

2o caso: il campo elettrico transmembrana è da zero

Fra

z. d

i can

ali a

pert

i Po

Ponendo si ottiene:ze

wV / 21 kTVVze

Po/)(exp1

12/1

dove V1/2 è il voltaggio V al quale metà dei canali sono aperti (Po=0.5).

Notare che quanto più è elevata la carica z, tanto maggiore è la pendenza della curva

kT/zeVwexpPo

1

1Ritorniamo all’equazione:

Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per muovere ciascuna particella di gating dalla posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di energia tra le due posizioni in assenza di un potenziale di membrana.

L’equazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in un grafico lineare di Po in funzione di V. Quanto più elevata è z tanto maggiore è la pendenza della curva

Fittando i dati sperimentali di H&H per il Na e per il K con

l’equazione si ottiene z(K)3.9 e z(Na)

4.8 kTzeV

Po/exp1

1

Z=4.8 (Na) Z=3.9 (K)

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Co

nd

utt

an

za (

S)

Voltaggio (mV)

0

0.5

1

Pro

b.

ca

na

le a

pe

rto

Gmax

1) Semplicemente potrebbe essere la quantità di carica mossa da un lato all’altro della membrana durante il processo di gating.

2) Potrebbero però esistere più particelle di gating per canale.

Che significato ha il valore di z?

Per esempio con quattro particelle che si muovono indipendentemente, il valore di z ottenuto applicando la precedente equazione si riferirebbe a ciascuna singola particella e la carica di gating per l’intero canale sarebbe 4z.

)kT/qVexp(

)RT/FVexp(

)kT/Gexp(

)RT/exp(

]A[

]B[

P

P

o

o

A

B

R=8.3143 joule·K-1·mol-1

k=1.38054·10-23 joule·K-1

R=NA·k (6.0222·1023 mol-1·1.38054·10-23 joule·K-1)

NA≡Numero di Avogadro: n. di molecole contenute in una mole (6.0222·1023mol-1)

F=96490 C·mol-1

V=statVolt (299.8 volt)=erg/ues=10-7 joule/0.333 ·10-9 C

eo ≡carica elementare dell’elettrone (0.16022 ·10-18 C)

o=Go/mol

F/RT=eo/kT

Alcune definizioni…..

A 0 mV

L’attività del canale è caratterizzata dalla

relativa stabilità dello Stato Attivato rispetto

a quello chiuso e non dipende dalla

posizione delle cariche rispetto al campo

elettrico, dal momento che non c’è un

gradiente di potenziale elettrico.

A)=o(A)

C)=o(C)

Bagno

Citoplasma

Membrana

EM

0 mV

Distribuzione di Boltzmann Basata solo su o

EM Nessun Effetto

EM Nessun Effetto

A)=o(A)

C)=o(C)

+

+

(Gate) = zG · F · 0 mV = 0

(Gate) = zG · F · 0 mV = 0C

A

En

erg

ia

A -70 mV

L’attività del canale è caratterizzata dalla

relativa stabilità dello Stato Chiuso e

dipende dalla posizione delle cariche

rispetto al campo elettrico, dal momento che

c’è un gradiente di potenziale elettrico.

A)

Bagno

Citoplasma

CMembrana

EM

-70 mV

La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo stato C

EM Stabilizzante

+

+

A

(Gate) = zG · F · 0 mV = 0

(Gate) = zG · F · -70 mV < 0

EM Destabilizzante

o(A)

o(C)E

ne

rgia

C)

a +40 mV

L’attività del canale è caratterizzata dalla

relativa stabilità dello Stato Attivato e

dipende dalla posizione delle cariche

rispetto al campo elettrico, dal momento che

c’è un gradiente di potenziale elettrico.

Bagno

Citoplasma

Membrana

EM Destabilizzante

+

+

EM

+40 mV

La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo Stato A

C

A

(Gate) = zG · F · 0 mV = 0

(Gate) = zG · F · 40 mV > 0

EM Stabilizzante

A)=o(A)

C)=o(C)

A)C)

En

erg

ia

Il gating dei canalivoltaggio-dipendenti

Come fa il voltaggio ad aprire i canali?

Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling

ovvero

Canali ionici voltaggio-dipendentiFamiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)

Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità

Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)

Vi appartengono:Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+

Canali del K+ Ca2+-attivatiCanali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.

Questa è una delle 4 (pseudo)subunità

H5

I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci

Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

OUT

IN

N

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

C

Ca2+ channel

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

OUT

IN

N

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++

C

Na+ channel

OUT

IN

N C

S1 S2 S3 S4 S5 S6P+

+

++K+ channel X 4

Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa.

Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer

Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer

-

-

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

In

V

-

- +

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-Out

Attiva la spirale

2

5

4

2

4

5

Il movimento del sensore del voltaggio, facendo aprire il canale,

produce una corrente ionica

+50 mV-100 mV

1000 pACorrente Ionica

+50 mV-100 mV

Corr. di Gating Soluzione senza K+

1000 pA

10 pA1 ms

Corrente Ionica

Il movimento del sensore del voltaggio produce anche una corrente di gating

come è possibile smascherare la corrente di gating?

+50 mV-100 mV

10 pA1 ms

Carica totale di gating

Numero dei canali= cariche elementari /canale

Corr. di Gating Soluzione senza K+

Il movimento del sensore del voltaggio produce una corrente di gating

Ig = dqg/dt qg = ∫Igdt

Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL4

2

0

-2

-4

q/n

(e- charges)

1 2 3 4 5 6 7

R KR neutral AA

R=arginina

K=lisina

ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL4

2

0

-2

-4

q/n

(e- charges)

1 2 3 4 5 6 7

R KR neutral AA

Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

Nel canale del K+ “Shaker” la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la “ripida” dipendenza dell’attivazione del canale dal voltaggio.

Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte:

1) Prima indipendentemente l’una dall’altra;

2) Poi in maniera cooperativa, portando all’apertura.

MacKinnon_Nature01473.pdfMacKinnon_Nature01580.pdfMacKinnon_Nature01581.pdf

Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix

La visione del tetramero del canale K+ è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 -eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N-terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K+. Le eliche S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K+ sono colorati in verde.

Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix

Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)

Conformazioni del Sensore del Voltaggio

Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+.

Chiuso: Vr=-100 mV

Conformazioni del Sensore del Voltaggio

Aperto: depolarizz.

Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+.

Lo stato chiuso prevale al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV).

Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana.

In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.

Ingrandimento del Sensore del Voltaggio

chiusoUna Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata l’ossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche l’ossatura del filtro di selettività e gli ioni K+.

Ingrandimento del Sensore del Voltaggio

In aggiunta al movimento della “paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra l’Asp 80 e l’Arg 133.

aperto

Accessibilità dei Residui

Interno

Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno.

Accessibilità dei Residui

Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso.

Esterno

La struttura del canale del K+ KvAP è descritta in:A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, & MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a Voltage-Dependent K+ Channel". Nature 423: 33

I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in:B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ Channel". Nature 423: 42

[1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]

FINE