Ringversuch zur Validierung einer Methode für den Nachweis ... · Validierung der optimierten Methode nach Szabo et al., 2015 • Validierungs-Studie zur Erstellung einer neuen amtlichen

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Ringversuch zur Validierung einer Methode für den Nachweis von Hepatitis E-Virus in

Fleisch und Fleischprodukten

Dr. Nadine Althof4. Symposium “Lebensmittel-assoziierte Viren”

07. November 2018

Übertragung von Hepatitis E-Virus in industrialisierten Ländern

Fleisch Fleischprodukte

Tier-Reservoire

?

TransfusionTransplantation

Reisenin endemische Länder

direkter Kontakt

Kontamination von Lebensmitteln/

Trinkwasser

Umwelt-Kontaminationen

Althof, 07.11.2018 – 4. Symposium „Lebensmittel-assoziierte Viren“

50% seropositiv

30% seropositiv

keine Krankheitszeichen!

Übertragung von Hepatitis E-Virus in industrialisierten Ländern

Fleisch Fleischprodukte

Tier-Reservoire


keine Krankheitszeichen!

Japan

rohe Leber von Wildschwein → 2 Personen (2003)

gegrilltes Fleisch Wildschwein → 1 Person (2004)

→ 2 Personen seropositiv

gegrilltes Fleisch Wildschwein → 1 Person (2005)

Frankreich

Figatellu → 7 Personen (2009)

(Wurst mit roher Schweineleber)

Figatellu → 1 Person (2013)


Schweiz

Mortadella di fegato crudo → 1 Person (2016)


Matsuda et al. (2003)

Masuda et al. (2005)

Li et al. (2005)

Colson et al. (2010)

Renou et al. (2014)

Kubacki et al. (2017)

Seite 4

Virusisolation aus Fleisch & Fleischprodukten → Nachweis von Hepatitis E-Virus

→ nur wenige Protokolle/Methoden publiziert:

Optimiertes Protokoll(Leberwurst/Salami)

Homogenisation

RNA-Extraktion

Virus-Nachweis

HEV-NachweisOne-step Real-time RT-PCR

(Jothikumar et al., 2006/12)

→

Virus-Nachweis

Zentrifugation(20 min bei 10.000 x g @ 4 °C)

HomogenisationStomacher

(2 min @ RT/höchste Geschwindigkeit)

→

5 g Rohwurst (Salami)2 g Leberwurst

+ 7 ml TRI® Reagent→

Homogenisation


RNA-Extraktionaus 1 ml wässriger Phase

(Adsorption an Silica-Partikel)

Reinigung + 0,2 ml Chloroform

pro 1 ml TRI® Reagent(2 min @ RT/höchste Geschwindigkeit)

→

RNA-Extraktion

+ MS2 + MS2-Nachweis

Prozess-KontrolleBakteriophage MS2(Zusatz zu jeder Proben

noch VOR TRI® Reagent-Zugabe )

→


Seite 5

Virusisolation aus Fleisch & Fleischprodukten → Nachweis von Hepatitis E-Virus

→ nur wenige Protokolle/Methoden publiziert: Homogenisation

RNA-Extraktion

Virus-Nachweis

HEV-NachweisOne-step Real-time RT-PCR

(Jothikumar et al., 2006/12)

→

Virus-Nachweis


HomogenisationStomacher

(2 min @ RT/höchste Geschwindigkeit)

→

5 g Rohwurst (Salami)2 g Leberwurst

+ 7 ml TRI® Reagent→

Homogenisation


RNA-Extraktionaus 1 ml wässriger Phase

(Adsorption an Silica-Partikel)

Reinigung + 0,2 ml Chloroform

pro 1 ml TRI® Reagent(2 min @ RT/höchste Geschwindigkeit)

→

RNA-Extraktion

→ Fleischprodukte aus deutschem Handel:

Infektiosität & Infektionsrisiko?

VergleichsstudieSzabo et al. (2015)

Lebensmittel-Matrix

Anzahlgetestet/ positiv

AnteilHEV-positiv

LOD[GE/g]

Salami 70/14 20% 7,03 x 103

Leberwurst 50/11 22% 3,20 x 104


Seite 6

Validierung der optimierten Methode nach Szabo et al., 2015

• Validierungs-Studie zur Erstellung einer neuen amtlichen Methode

• organisiert durch die §64 LFGB-Arbeitsgruppe „Viren in Lebensmitteln“

• Ringversuchsleitung: Dr. Eva Trojnar (BfR Berlin; Fachgruppe 42/Virologie)

Leberwurst aus dem Handel

(nachweislich HEV-negativ)

(2 g/Probe)

HEV – positiv(GT 3c)

Leber-Homogenat

Kontaminations-Level

4 ProbenHEV-negativ

(Negativ-Kontrollen)

[D0]

4 Probenleicht HEV-positiv(am „limit of detection“)

[D2]

4 Probenstark HEV-positiv

(über „limit of detection“)

[D1]

25

30

35

40

45

50

CtW

ert

e[H

EV

-sp

ezi

fisch

e R

eal-

tim

e

RT

-PC

R]

hohe Dosis[D1]

niedrige Dosis[D2]

→ jeweils 3 zufällig ausgewählte Proben

→ nachgewiesene HEV-Infektionsquelle

Colson et al. (2010)

Renou et al., (2014)

Kubacki et al., (2017)

→ herausfordernde Lebensmittel-Matrix (Protein- & Fettgehalt)

2015


→ LOD höher als bei Rohwurst

Seite 7

Validierung der optimierten Methode nach Szabo et al., 2015

• Validierungs-Studie zur Erstellung einer neuen amtlichen Methode

• organisiert durch die §64 LFGB-Arbeitsgruppe „Viren in Lebensmitteln“

• Ringversuchsleitung: Dr. Eva Trojnar (BfR Berlin; Fachgruppe 42/Virologie)

Leberwurst aus dem Handel

(nachweislich HEV-negativ)

(2 g/Probe)

HEV – positiv(GT 3c)

Leber-Homogenat

Kontaminations-Level

4 ProbenHEV-negativ

(Negativ-Kontrollen)

[D0]

4 Probenleicht HEV-positiv(am „limit of detection“)

[D2]

4 Probenstark HEV-positiv

(über „limit of detection“)

[D1]

Set aus 12 Proben

verblindet

9 Laboratorien (Deutschland, Schweiz)

Reagenzien einheitlich

Ringversuch

Optimiertes Protokoll(optional: Zentrifugation; Art der

Silica-basierten RNA-Extraktion;

Real-time PCR-Gerät)Szabo et al., 2015

→ nachgewiesene HEV-Infektionsquelle

→ herausfordernde Lebensmittel-Matrix (Protein- & Fettgehalt)

2015


→ LOD höher als bei RohwurstColson et al. (2010)

Renou et al., (2014)

Kubacki et al., (2017)

Seite 8

Auswertung der Ringversuchsdaten – HEV-spezifische Real-time RT-PCR

→ Silica-basierte RNA-Extraktion

Model HerstellerAnzahl der Anwender

ABI 7500 Applied Biosystems 2

Rotor Gene 6000 Corbett Research 1

LightCycler 480 Roche Diagnostics 2

MX3005P Stratagene 1

RotorGene Q Qiagen 1

RotorGene Q (5-plex) Qiagen 1

BioRad CFX 96 Bio Rad Laboratories 1

Methode SystemAnzahl der Anwender

voll-automatisch NucliSENS® easyMag 6

semi-automatisch NucliSENS® MiniMag 2

manuell Magnet 1

→ verwendete Real-time PCR-Geräte


Seite 9

Ergebnisse Ringversuch – Prozesskontrolle/Wiederfindungsrate

• MS2-Wiederfindungsrate [%] = 2-∆Ct x 100

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Du

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nit

tlic

he

Wie

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gsra

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MS

2-G

en

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e[%

]

WiederfindungsratenBakteriophage MS2

• Proben mit einer MS2-Wiederfindungsrate von ≥ 0,01 % → valides HEV-spezifisches Ergebnis!

MS2-spezifischerCt-Wert

Lebensmittel-Matrix-Probe

MS2-spezifischerCt-Wert (jeder)

Lebensmittel-Matrix-freie Probe

∆

Wiederfindungsraten zwischen 0,01%-0,16%

bei allen Probenvalide Ergebnisse

Unterschiede v. a. zwischen den Laboratorien


Seite 10

Labor 1 Labor 2 Labor 3 Labor 4 Labor 5 Labor 6 Labor 7 Labor 8 Labor 9

Probe #1

ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Probe #2

ND ND ND ND ND ND 39,5 ND ND

Probe #3 ND 38,2 36,3 43,5 ND 36 35,3 36,2 36,6

Probe #4

33,5 35,1 34,4 32,3 32,7 33,9 33,9 34,6 32,4

Probe #5

38,1 35,3 34,8 31,7 34,6 33,5 32,2 34,2 32,1

Probe #6

ND 36,5 35,5 37,4 ND 35,9 ND ND 38,1

Probe #7

35,4 37,2 35,7 37,1 ND 35,5 35,94 ND 35,4

Probe #8


Probe #9

35,1 34,4 34,5 31,4 33,7 34,1 32,9 36,1 33,8

Probe #10

34,2 35,4 34,5 31,3 33,8 33,6 33,9 33,9 33,3

Probe #11

36,8 37,8 ND 39,3 35,5 35,8 36,8 35,2 ND

Probe #12


RT-PCR-Kontrolle(positiv)

29,5 29,9 27,2 24,5 27,2 29,5 27,9 31,1 25,5

RT-PCR-Kontrolle(negativ)


Negative Prozess-Kontrolle


Ergebnisse Ringversuch – HEV-spezifische Real-time RT-PCR


[ND = nicht detektiert]

Seite 11

25

30

35

40

45

50

CtW

ert

e[H

EV

-sp

ezi

fisch

e R

eal-

tim

e

RT

-PC

R]

HEV-negativ(Negativ-Kontrollen)

[D0] leicht HEV-positiv(am „limit of detection“)

[D2]stark HEV-positiv(weit über „limit of detection“)

[D1]

(1 Probe falsch-positiv; Ct = 39,5)

97 % korrekt(Ct ∼ 31-38)

100 % korrekt(10 Proben falsch-negativ)

72 % korrekt

Relative Spezifität 97,2 %Relative Sensitivität 86,0 %Relative Genauigkeit 90,0 %

Ergebnisse Ringversuch – HEV-spezifische Real-time RT-PCR


Seite 12

Zusammenfassung und Bewertung

• effizienter Matrixaufschluss → effiziente Virusfreisetzung• relativ hohe HEV-Ausbeute/-Detektion im Vergleich zu anderen Methoden• sehr geringe MS2-Wiederfindungsraten → Eignung für diese Methode?

Relative Spezifität 97,2 %Relative Sensitivität 86,0 %Relative Genauigkeit 90,0 %

� erfolgreiche Validierung der TRI®Reagent-basierten Methode zum Nachweis von HEV in Fleischprodukten

� Aufnahme der Methode in die „Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren“ nach §64 LFGB → L08.00-63 (Oktober 2016)

� Anwendung: → Überwachungsstudien

→ Lebensmittelkontrolluntersuchungen (Routine & Ausbruchsgeschehen)

� Publikation → Althof & Trojnar et al.: „Interlaboratory validation of a method for hepatitis E virus detection in meat and meat products“

(@ Food and Environmental Virology)

� Erstellung einer ISO geplant, jedoch noch nicht realisiert


Seite 13

Danke an T..

• Arbeitsgruppe „Viren in Lebensmitteln“ (§64 LFGB)

• Dr. Eva Trojnar (Ringversuchsleitung, -Durchführung und -Auswertung)

• Ringversuchsteilnehmer:

Landesbetrieb HessischesLandeslabor

(Dr. Thomas Böhm)

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt

Stuttgart(Dr. Matthias Contzen)

LandeslaborBerlin-Brandenburg

(Dr. Sabine Burkhardt)

Bayrisches Landesamt für Gesundheit

und Lebensmittelsicherheit(Dr. Anja Carl)

CONGENBiotechnologie GmbH

(Dr. Steffen Mergemeier)

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt

Westfalen(Dr. Jochen Kilwinski)

Bundesamt für Lebensmittelsicherheit

und Veterinärwesen Bern(Dr. Dominik Moor)

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt

(Prof. Dr. Dietrich Mäde)

Bundesinstitut für Risikobewertung

(Prof. Dr. Reimar Johne)


BU

ND

ES

INS

TIT

UT

FÜ

R

RIS

IKO

BE

WE

RT

UN

G Danke für Ihre AufmerksamkeitDr. Nadine Althof

Bundesinstitut für Risikobewertung

Max-Dohrn-Str. 8-10 � 10589 Berlin

Tel. 030 - 184 12 - 0 � Fax 030 - 184 12 - 47 41

[email protected] � www.bfr.bund.de

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Ringversuch zur Validierung einer Methode für den Nachweis ... · Validierung der optimierten Methode nach Szabo et al., 2015 • Validierungs-Studie zur Erstellung einer neuen amtlichen