Saccharomyces boulardii module les propriétés des cellules dendritiques et le déséquilibre du microbiote intestinal après un traitement antibiotique ✰

Saccharomyces boulardii modulates dendritic cell properties and intestinal microbiota disruption after antibiotic treatment

A. Collignon a,c,*, C. Sandré b, M.-C. Barc a

a EA 4043, USC INRA Ecosystème Microbien Digestif et Santé, faculté de Pharmacie, Université Paris Sud-XI, Châtenay-Malabry Cedex, France b INSERM, UMR756, Signalisation et Physiopathologie des Cellules épithéliales, faculté de Pharmacie, Université Paris Sud-XI, France c Hôpital Jean-Verdier, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, France

PEUT-ON RECONSTITUER LE MICROBIOTE ? L’EXEMPLE DE S.BOULARDII

* Auteur correspondant Adresse e-mail : anne.collignon@u-psud.fr (A. Collignon).✰ La version originale anglaise de cet article a été publiée dans le Suppl. 1. Pour citer cet article : Collignon A, Sandré C, Barc M-C. Sac-charomyces boulardii modulates dendritic cell properties and intestinal microbiota disruption after antibiotic treatment Gastroenterol Clin Biol 2010;34:S71—S78.

© 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Gastroentérologie Clinique et Biologique (2010) 34, 76-83

Résumé Saccharomyces boulardii (S. boulardii) est considéré comme un agent biothéra-peutique qui a été largement utilisé pour prévenir et traiter diverses diarrhées infectieuses et post-antibiotique. Le microbiote intestinal est à l’origine de la résistance à la colonisation par des pathogènes mais peut être perturbé par des traitements antibiotiques et perdre ainsi ses propriétés de barrière. Les cellules dendritiques sont des cellules professionnelles présentatrices d’antigène dotées d’un double rôle permettant, soit d’induire une réponse immune primaire, soit une tolérance immune. Nous avons évalué, dans un modèle de souris à microbiote humain, l’influence de S. boulardii sur les propriétés des cellules dendritiques et parallèlement sur la composition du microbiote intestinal dans des conditions d’homéos-tasie et après un stress antibiotique. Les cellules dendritiques ont été obtenues à partir de précurseurs spléniques. L’étude de leurs antigènes membranaires et de leur capacité pha-gocytaire a été réalisée par cytométrie de flux. L’analyse moléculaire du microbiote a été réalisée par hybridation fluorescente in situ associée à la cytométrie de flux ou la microscopie confocale avec des sondes spécifiques ARN ribosomique 16S fluorescentes. Cette évaluation a été réalisée durant et après 7 jours de traitement par l’amoxicilline-acide clavulanique per os associé ou non à l’administration de la levure. Le traitement antibiotique maintient et augmente l’activité phagocytaire des cellules dendritiques issues de la rate des souris traitées par l’antibiotique. Les marqueurs membranaires d’activité de présentation de l’anti-gène (antigène de classe II du CMH et molécule co-stimulatrice CD86) sont aussi positivement régulés. En présence de S. boulardii, l’expression des antigènes membranaires est négati-vement régulée. Le microbiote a été analysé parallèlement pendant et après le traitement par l’amoxicilline-acide clavulanique associé ou non à l’administration de S. boulardii pour

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2010 Vol. 34 5

Gastroentérologie Clinique et BiologiqueCLINICS AND RESEARCH IN HEPATOLOGY AND GASTROENTEROLOGY

● Mini-symposium on New Perspectives in Irritable Bowel ● Predicting liver failure after major hepatectomy● Syndrome d’activation macrophagique● Cholécystectomie ambulatoire● Rectite radique● Cancers du côlon et du rectum

ISSN

018

1-98

01

The intestinal microbiotia:Equilibrium and disorders

Guest editors: G. Corthier & P. Marteau

2010september

Supplement 1 – Vol. 34

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Propriétés modulatrices de Saccharomyces boulardii 77

corréler l’activation des cellules dendritiques aux modifications du microbiote. Le traitement par l’association amoxicilline-acide clavulanique associé ou non à S. boulardii ne modifie pas quantitativement le microbiote total. En revanche, après un jour de traitement antibiotique, la proportion du groupe Clostridium coccoides diminue massivement dans les deux groupes de souris traités par l’antibiotique. Puis, après l’arrêt du traitement antibiotique, la proportion de ce groupe augmente régulièrement ; à j17, j22 et j24, le pourcentage augmente plus vite dans le groupe antibiotique plus S. boulardii (AB+ Sb) que dans le groupe AB seul (P < 0,05) pour atteindre le niveau initial à j29. Dans les deux groupes de souris, le groupe Bacteroides augmente pendant le traitement antibiotique et diminue après l’arrêt de l’antibiothérapie pour retrouver les valeurs initiales. La diminution est plus rapide dans le groupe AB+ Sb que dans le groupe AB (P < 0,05) à j17 et j22). Pendant le traitement antibiotique, les Enterobac-teriaceae deviennent détectables dans les deux groupes et leur proportion augmente dans les deux groupes traités par l’antibiotique. Après arrêt de l’antibiotique, le taux diminue dans les deux groupes pour redevenir indétectable à j29. Ces résultats montrent que S. boulardii a tendance à restaurer plus rapidement l’équilibre du microbiote intestinal après perturbation par un traitement antibiotique et suggèrent que S. boulardii a des effets modulateurs de la réponse immune spécifique vis-à-vis des antigènes microbiens. Ces propriétés pourraient expliquer au moins en partie les effets bénéfiques de la levure dans la prévention des diar-rhées associées aux antibiotiques. Cela suggère aussi un rôle régulateur dans le maintien de l’homéostasie digestive.© 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés

Summary Saccharomyces boulardii (S. boulardii) is a non-pathogenic yeast with biothera-peutic properties that has been used successfully to prevent and to treat various infectious and antibiotic-associated diarrheas. The intestinal microbiota is responsible for coloniza-tion resistance and immune response to pathogens but can be disrupted by antibiotics and lose its barrier effect. Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells of the immune system with the capacity to initiate primary immune response or immune tolerance. We evaluated, in a human microbiota-associated mouse model, the influence of S. boulardii on the composition of the microbiota and on the properties of dendritic cells (DCs) in normal homeostatic conditions and after antibiotic stress. The dendritic cells were derived from splenic precursors. Membrane antigen expression and phagocytosis of FITC-latex beads by dendritic cells were evaluated by flow cytometry. The molecular analysis of the microbiota was performed with Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) associated to flow cytometry or confocal microscopy using group specific 16S ribosomal RNA targeted probes. This evaluation was conducted during and after a 7-day oral treatment with amoxi-cillin clavulanic acid combined or not with the administration of the yeast. The antibiotic treatment increased the phagocytic activity of DCs. Their antigen presenting function (MHC class II antigen and CD 86 costimulatory molecule membrane expression) was upregulated. This reflects a functional activation of DCs. In the presence of S. boulardii, the modification of membrane antigen expression was down regulated. To correlate these modifications to the microbiota disruption, we analyzed in parallel the composition of the intestinal mi-crobiota. As previously shown, the amoxicillin clavulanic acid treatment with or without S. boulardii did not quantitatively alter the total microbiota. In contrast, after one day of the antibiotic treatment, the Clostridium coccoides group decreased dramatically in the two groups of mice treated by the antibiotic. Then, the level increased regularly and at days 17, 22 and 24 it increased faster (P < 0.05) in the AB+ Sb group than in the AB group to reach the initial level at day 29. The Bacteroides group in the two groups of mice increased during the antibiotic treatment and decreased after the antibiotic was stopped to reach the initial level. The decrease rate was faster for the AB+ Sb group than for the AB group, with a significant difference (P < 0.05) at days 17 and 22. During antibiotic treatment, the Ente-robacteriaceae group became detectable and its level increased in the two groups of mice. After antibiotic stop, its level decreased to become undetectable at day 29 without signifi-cant difference between the two groups. These results showed that S. boulardii treatment has a trend to more rapidly restore the balance of human microbiota after disruption by antibiotics, and suggested a role for the yeast in modulating the specific immune response to microbial antigens. This may explain, at least in part, the beneficial effects of S. bou-lardii in preventing antibiotic-associated diarrhea. This also suggests a role of the yeast in maintaining intestinal homeostasis.© 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

78 A. Collignon et al.

Introduction

Saccharomyces boulardii, levure non pathogène dotée de propriétés biothérapeutiques, a été utilisée avec succès pour la prévention et le traitement de la diarrhée associée aux antibiotiques et de diverses diarrhées infectieuses [1-3]. Bien que l’on ait démontré que S. boulardii pro-tège l’hôte vis-à-vis des pathogènes par des mécanismes multiples, ceux-ci ne sont pas entièrement élucidés. Ils mettent en jeu i) des effets trophiques, antisécrétoires et anti-inflammatoires sur la muqueuse intestinale ; ii) une stimulation du système immunitaire de l’hôte, notamment la stimulation de la production d’immunoglobulines A sécrétoires et la modulation de la signalisation cellulaire de l’hôte ; iii) ainsi que des effets spécifiques sur les bactéries entéropathogènes, en particulier par son activité protéo-lytique et par l’inhibition de l’adhérence bactérienne aux cellules épithéliales [4-9].

Le tube digestif humain est un écosystème bactérien complexe composé de plusieurs centaines d’espèces, prin-cipalement des bactéries anaérobies strictes, dotées d’un large spectre d’activités métaboliques. Le développement de techniques moléculaires fondées sur les gènes des ARN ribosomiques (ARNr) 16S a permis l’identification de nom-breuses espèces anaérobies qui n’avaient auparavant pas été obtenues en culture [10].

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans la santé humaine, en particulier dans la résistance à la colonisation et la réponse immune aux agents pathogè-nes. Le microbiote est sujet à variations en fonction du régime alimentaire, de l’environnement et des traitements antibiotiques, qui rompent son équilibre et son rôle de barrière. L’association d’amoxicilline et d’acide clavula-nique est largement utilisée en thérapeutique humaine et bien connue pour les perturbations qu’elle induit dans le microbiote intestinal. Comme beaucoup d’autres, cet antibiotique a été reconnu responsable de diarrhées associées aux antibiotiques et de pathologies induites par Clostridium difficile [11].

Il existe des modèles animaux qui permettent d’ana-lyser le microbiote intestinal dans sa complexité. Nous avons précédemment montré que le modèle murin HMA (human-microbiota associated) était un outil de choix pour étudier cet écosystème et sa modulation [12, 13]. Par la technique d’hybridation fluorescente in situ (FISH), les groupes les plus abondamment détectés dans ce modèle comme chez le volontaire sain l’ont été par les sondes des groupes Clostridium coccoides et Bacteroides [12, 14].

Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules du système immunitaire professionnelles de la présentation de l’antigène, dotées de la capacité de déclencher une réponse immune primaire. Cependant, elles participent aussi à la tolérance immune et jouent un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie entre le microbiote intestinal et l’hôte.

L’objectif de la présente étude était d’évaluer dans notre modèle murin HMA l’effet de Saccharomyces bou-lardii sur les propriétés des CD et, en parallèle, sur le microbiote, dans les conditions d’homéostasie normale et après un stress antibiotique par l’amoxicilline-acide clavulanique.

Matériel et méthodes

Le modèle de souris HMA a été développé à partir de souris axéniques (souris C3H, Institut national de la recherche agronomique, Jouy-en-Josas, France) alimentées avec une suspension de microbiote fécal humain, comme décrit précédemment [12].

Des CD ont été isolées de trois groupes de neuf souris : 1) un groupe traité par l’amoxicilline-acide clavulanique (150 mg/kg/j) administré par sonde gastrique pendant sept jours (AB) ; 2) un groupe recevant S. boulardii (5 x 108 UFC) plus l’antibiotique pendant sept jours (AB+ Sb) ; 3) un groupe témoin sans antibiotique ni traitement par S. boulardii. Des cellules spléniques ont été recueillies dans les différents groupes un jour après l’interruption de l’antibiotique.

Les CD dérivées de la rate ont été obtenues à partir des précurseurs spléniques après culture in vitro en présence de facteur stimulant les colonies granulocyto-macropha-giques (GM-CSF) pendant neuf jours (CD jour 9). En bref, une suspension de cellules spléniques a été préparée par dilacération et tamisage des rates. Le tamis a été lavé en milieu RPMI-1640 et la suspension a été centrifugée à 4 °C et 1400 tours par minute pendant 5 minutes. Le surnageant a été remis en suspension dans le chlorure d’ammonium à 0,83 % et incubé dans la glace pendant 5 minutes afin de lyser les érythrocytes. Les cellules ont été lavées deux fois dans le milieu RPMI-1640 avec HEPES 25 mm, supplémenté avec de la glutamine 200mM, du 2-mercaptoéthanol 50μM et du sérum de veau fœtal (SVF) à 10 % inactivé par la chaleur. Les cellules isolées de trois souris ont été regroupées. Les cellules spléniques ont été cultivées sur des plaques pour culture cellulaire à 24 puits (2 x 106 cellules par puits) en présence de GM-CSF recombinant (rGM-CSF, 10 ng/ml, PeproTec Inc.), pendant 9 jours à 37 °C, dans un incubateur en atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Aux jours 2, 4, 6 et 8, le milieu a été renouvelé par moitié afin de fournir du rGM-CSF.

La maturation des CD a été obtenue grâce à 24 h de culture supplémentaire, soit avec 1μg/ml de LPS d’E. coli O55 : B5 (CD jour 10/lPS), soit sans LPS (CD jour10/0).

L’expression de divers marqueurs de membrane a été testée par cytométrie de flux. Les anticorps utilisés étaient dirigés contre les antigènes suivants : CD11c, marqueur des CD de souris ; antigène Ia de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), reflet de la capacité à présenter l’antigène ; molécule costimulatrice CD86 (B7-2), reflet de la capacité à activer les cellules T. Les anticorps dirigés contre CD11c [HL3, IgG1, conjugué à la phycoérythrine (PE)] et CD86 [GL1, IgG2a, dirigé contre la molécule B7-2, conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)] ont été acquis auprès de la société BD Pharmingen (San Diego, Californie). Les anticorps dirigés contre Ia (OX6, IgG1, FITC, dirigé contre un antigène de classe II du CMH) ont été acquis auprès de la société Caltag (San Francisco, Californie). En bref, les cellu-les dérivées de la rate ont été mises en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS) additionné de sérumalbumine bovine (BSA) à 0,5 % et de SVF à 1 % dépourvu de LPS. Après une préincubation de 20 min à 4 °C avec des IgG sériques de souris (Caltag) pour éviter les liaisons non spécifiques, les cellules ont été incubées pendant 30 min à 4 °C avec l’anticorps approprié. L’absence de liaison non spécifique

Propriétés modulatrices de Saccharomyces boulardii 79

a été vérifiée avec un anticorps non pertinent. Après trois lavages dans le PBS froid à 0,5 % de BSA et 1 % SVF, une analyse par cytométrie de flux a été effectuée à l’aide d’un cytomètre de flux FACS Calibur (Becton Dickinson, Oxford, Royaume-Uni) équipé d’un laser argon à 488 nm. L’analyse a été effectuée sur 10 000 événements dans chaque échan-tillon à l’aide du logiciel CellQuest (Becton Dickinson). Les données ont été exprimées sous forme de pourcentage de cellules colorées.

L’activité phagocytaire des CD a été étudiée par cytométrie de flux avec des billes de latex fluorescentes. Un ml de milieu complet additionné de SVF et contenant 2,5.107 billes de latex fluorescentes (Fluoresbrite carboxy Y.G. 2 mm, Polysciences, Warrington, Pennsylvanie) a été ajouté à 1 ml de CD (106 cellules par ml). Les cellules ont été incubées à 37 °C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 1 h. Après deux lavages au PBS froid, l’analyse a été réalisée à l’aide du cytomètre de flux FACS Calibur. Les histogrammes de fluorescence représentant le nombre de cellules fluorescentes en fonction de l’intensité de la fluorescence ont été analysés. L’activité phagocytaire a été quantifiée comme le pourcentage de cellules positives qui avaient ingéré au moins 3 billes de latex marquées au FITC. L’examen au microscope confocal a permis de vérifier que les billes avaient été internalisées par les cellules et n’étaient pas simplement attachées à la membrane cytoplasmique (données non présentées).

Les données sont exprimées sous forme de moyennes ± écart type de la moyenne. L’analyse statistique a fait appel à une analyse de variance à un facteur.

En parallèle, le microbiote fécal a été étudié dans qua-tre groupes de six souris : 1) un groupe traité par l’amoxi-cilline-acide clavulanique (150 mg/kg/j) pendant 7 jours par sonde gastrique ; 2) deux groupes avec administration par sonde orale d’une suspension de S. boulardii (5.108 UFC) pendant 14 jours, le premier recevant seulement la levure, le second la levure plus l’antibiotique pendant les sept premiers jours ; 3) un groupe témoin sans antibiotique ni S. boulardii. Les fèces de chacune des souris ont été recueillies pendant toute la durée de l’expérience aux fins d’analyse moléculaire du microbiote et de numération de la levure.

La FISH combinée à la cytométrie de flux pour les échan-tillons fécaux et la microscopie confocale pour les coupes de caecum ont été utilisées selon les méthodes décrites précédemment [12, 14]. Des sondes ont été préparées pour les groupes Eubacteria, Bacteroides, Clostridium coccoides-Eubacterium rectale et Enterobacteriaceae. S. boulardii a été dénombré par culture et visualisé par microscopie confocale sur coupes de caecum.

L’analyse statistique des données relatives au microbiote a été effectuée à l’aide du test de Wilcoxon.

Résultats et discussion

Au cours de l’expérience, la concentration de levure dans les deux groupes de souris traitées est restée stable (107 UFC/g). Après l’arrêt de l’administration orale, elle a diminué pour devenir indétectable à partir du jour 21.

Effet de l’amoxicilline-acide clavulanique avec et sans la levure S. boulardii sur les cellules dendritiques

Le protocole de différenciation a permis d’obtenir une majorité de cellules CD11c+. Leur capacité à présenter l’antigène a été vérifiée par l’expression de l’antigène Ia (CMH de classe II) et de la molécule costimulatrice CD86.

L’antigène Ia était exprimé par 66 ± 6 % des cellules des souris témoins (HF), 81 ± 3,5 % des cellules des souris traitées par l’antibiotique seul (AB) et 83,5 ± 2,1 % des cellules de souris traitées par l’antibiotique plus S. boulardii (AB+ Sb). Après maturation pendant 24 heures, ce pourcentage a augmenté à 87,6 ± 6,1 % dans le groupe HF+ AB et 87 ± 2,8 % dans le groupe AB+ Sb. Toutefois, les différences majeures constatées entre les groupes portaient sur l’intensité de fluorescence par cellule, reflet du nombre de molécules d’antigène Ia. L’intensité moyenne de fluorescence était basse au jour 9 (150-200 dans chaque groupe). Par contraste, au jour 10, l’intensité moyenne de fluorescence des CD isolées du groupe des souris traitées par l’antibiotique (AB) et maturées avec ou sans LPS a augmenté pour devenir significativement plus élevée que celle des CD isolées des souris témoins (HF) ou du groupe de souris traitées par AB+ Sb (Fig. 1).

L’expression de la molécule costimulatrice CD86 était faible et similaire entre les groupes au jour 9. Après matu-ration par le LPS, le pourcentage de cellules CD86+ était significativement plus élevé parmi les CD originaires du groupe de souris AB (61,6 ± 12,5 %) par comparaison aux CD des souris témoins HF (11,6 ± 0,6 %) et des souris AB+ Sb (34 ± 2,4 % ; Fig. 1). En d’autres termes, le LPS a augmenté le nombre de cellules CD86+ parmi les CD isolées de souris traitées par AB seul, mais non parmi celles isolées des souris témoins ou des souris ayant reçu AB+ Sb. L’administration de S. boulardii a diminué le nombre de CD CD86+ après maturation par le LPS.

Dans les CD issues du groupe de souris AB, l’expression sur la membrane de l’antigène Ia et de la molécule CD86 a été significativement régulée à la hausse, ce qui témoigne pour ces CD d’une capacité augmentée à présenter l’antigène, par comparaison aux CD issues des groupes de souris HF et AB+ Sb, dont les capacités de présentation de l’antigène se situaient à un niveau intermédiaire.

Quinze pour cent des cellules dans chaque groupe ont phagocyté les billes fluorescentes au jour 9. L’activité phagocytaire s’est maintenue et accrue dans les CD isolées des deux groupes de souris traités par l’antibioti-que, avec ou sans levure (AB et AB+ Sb) après maturation (Fig. 1). Cette activation n’était significative que dans les CD du groupe AB après activation par le LPS. Cette constatation plaide en faveur d’une capacité de ces CD à capturer l’antigène supérieure à celle des CD des deux autres groupes.

En résumé, le traitement antibiotique a augmenté modérément l’activité phagocytaire des CD. Leur fonction de présentation de l’antigène (mesurée par l’antigène du CMH de classe II et la molécule costimulatrice CD86) a été régu-lée positivement. En présence de S. boulardii, l’expression

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Figure 1 Caractérisation phénotypique (antigène Ia et molécule costimulatrice CD 86) et activité phagocytaire des cellules CD11c+ iso-lées de 3 groupes de souris Human Microbiota Associated (HM : groupe témoin ; HM+ AB : groupe traité par amoxicilline-acide clavulanique ; HM+ AB+ Sb : groupe traité par amoxicilline-acide clavulanique + Saccharomyces boulardii). Les données sont des moyennes ± écart type. * : différence statistiquement significative (p < 0,05).

Propriétés modulatrices de Saccharomyces boulardii 81

membranaire de ces antigènes a été régulée négativement. La levure tendait ainsi à moduler l’activation des CD.

Effet de l’amoxicilline-acide clavulanique avec et sans la levure S. boulardii sur le microbiote

Parallèlement aux expériences ci-dessus, nous avons évalué l’effet de l’amoxicilline-acide clavulanique avec et sans la levure sur la composition du microbiote, par la technique de FISH combinée à la microscopie confocale (Fig. 2) ou la cytométrie de flux, comme décrit antérieurement, afin de corréler les fonctions des CD à la modulation du microbiote [12, 15].

La quantité totale de bactéries hybridées dans le groupe des souris traitées par l’antibiotique (AB) et dans le groupe traité par l’antibiotique plus S. boulardii (AB+ Sb) était analogue à celle mesurée dans le groupe témoin. Le traite-ment par la levure, associée ou non à l’amoxicilline-acide clavulanique, n’a pas altéré d’un point de vue quantitatif le microbiote total évalué par FISH [15, 16].

Comme nous l’avons montré dans une étude antérieure, le traitement antibiotique a modifié de façon très profonde la composition du microbiote [15]. Avant le traitement, les bactéries du groupe C. coccoides représentaient environ 50 % de l’ensemble des cellules bactériennes. Après un jour de traitement antibiotique, cette proportion a diminué dans

les deux groupes de souris (AB et AB+ Sb) jusqu’à moins de 10 % jusqu’à la fin de l’administration de l’antibiotique au jour 7 (Fig. 2). Par la suite, le niveau de C. coccoides a augmenté régulièrement ; aux jours 17, 22 et 24, l’aug-mentation a été plus rapide chez les souris qui recevaient S. boulardii que chez les souris traitées seulement par l’antibiotique (P < 0,05), pour retrouver le niveau initial au jour 29 (Fig. 3a). Le groupe Bacteroides a augmenté dans les deux groupes de souris (AB et AB+ Sb) durant le traitement antibiotique (Fig. 2), puis a diminué dans les deux groupes après son interruption. Le taux de décroissance a été plus rapide chez les souris qui recevaient la levure que chez celles qui étaient traitées seulement par l’antibiotique, la différence étant significative (P < 0,05) aux jours 17 et 22 (Fig. 3b). Cette décroissance plus rapide pourrait se révéler bénéfique. Avant le traitement antibiotique, le groupe des Enterobacteriaceae n’était détectable par la technique de FISH dans aucun des deux groupes de souris. Durant le traitement antibiotique, ce groupe bactérien est devenu détectable à un niveau compris entre 18 % et 42 % dans le groupe AB et entre 15 % et 27 % dans le groupe AB+ Sb. Après l’interruption de l’antibiothérapie au jour 7, le groupe des Enterobacteriaceae a diminué pour devenir indétectable dans les deux groupes de souris au jour 29. La décroissance plus rapide des groupes Bacteroides et Enterobacteriaceae pourrait être un effet bénéfique de la levure.

Figure 2 Mise en évidence du microbiote par hybridation fluorescente in situ combinée à la microscopie confocale sur sections de cae-cum de souris avant (A) et pendant (B) un traitement antibiotique.1 : sonde Eubacteria ; 2 : sonde Bacteroides ; 3 : sonde Eubacterium rectale-Clostridium coccoides ; 4 : sonde Bacteroides (groupe S. boulardii).

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Figure 3 Proportion des groupes prédominants de bactéries détectés par FISH et par cytométrie de flux à l’aide de sondes oligonucléoti-diques ARNr 16S, dans deux groupes de souris à microbiote fécal humain (HF) soumises à l’administration d’amoxicilline-acide clavulanique (AB) pendant 7 jours. Le groupe expérimental a reçu en outre S. boulardii (Sb) du jour 1 au jour 14 et le groupe témoin du sérum physio-logique pendant la même période.(A) Groupe Clostridium coccoides– Eubacterium rectale avec la sonde Erec 482. (B) Groupe Bacteroides– Porphyromonas– Prevotella avec la sonde Bacto 1080. Les données sont des moyennes ± écart type. (*) Différence significative.

Propriétés modulatrices de Saccharomyces boulardii 83

En résumé, S. boulardii n’a pas modifié le microbiote intestinal endogène. Au cours du traitement antibiotique, le microbiote anaérobie est resté globalement stable d’un point de vue quantitatif, mais le groupe C. coccoides a dimi-nué massivement, tandis que les groupes des Bacteroides et des Enterobacteriaceae ont augmenté. Dans la période post-antibiotique, S. boulardii a favorisé le retour à un niveau normal des deux groupes dominants.

Nicaise et coll. ont montré précédemment que le micro-biote exerce un effet à distance sur les macrophages et les CD isolés de la rate ou des précurseurs médullaires [17]. Le traitement antibiotique a régulé positivement l’expression de l’antigène Ia et de la molécule CD86, indispensables pour la présentation de l’antigène et la stimulation des cellu-les T. Cette activation des CD issues des souris traitées par l’antibiotique peut être liée à la rupture de l’équilibre du microbiote et à l’augmentation des groupes Bacteroides et Enterobacteriaceae. Par contraste, chez les souris traitées par AB+ Sb, l’expression de ces deux antigènes de membrane n’était pas modifiée de façon significative par rapport au groupe témoin. La levure tend à moduler l’activation des CD, comme l’ont déjà démontré les expériences in vitro menées sur des CD humaines myéloïdes par Thomas et coll., montrant une régulation négative des marqueurs d’activation des CD par un surnageant de culture de S. boulardii [18].

Conclusions

Nos résultats montrent que le traitement par S. boulardii tend à restaurer plus rapidement l’équilibre de la flore anaérobie dominante chez des souris à microbiote humain traitées par l’amoxicilline-acide clavulanique. Ils suggèrent que cette levure puisse jouer un rôle de modération de la réponse immune spécifique aux profils moléculaires microbiens. Ces faits pourraient rendre compte, au moins en partie, des effets bénéfiques de S. boulardii pour la prévention de la diarrhée associée aux antibiotiques chez l’Homme. Ils suggèrent également le rôle possible de cette levure dans le maintien de l’homéostasie intestinale.

Remerciements

Les auteurs remercient François Bourlioux et Céline Charrin-Sarnel pour leur apport technique et Valérie Nicolas pour sa contribution à la microscopie confocale à balayage. Ce travail a été réalisé en partie avec le soutien financier des laboratoires Biocodex.

Conflits d’intérêts

A. Collignon a reçu une subvention des laboratoires Biocodex. C. Sandré : aucun.M.-C. Barc : aucun.

Références

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