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BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang

SASCHA GIEGOLD

SHIMADZU DEUTSCHLAND GMBH, DUISBURG

Proteins are analysed in many research and development areas, e. g. thesearch for biomarkers, and the pharmacological development. The stan-dard method is tryptic digestion which disassembles the proteins in theirpeptides before they are determined by mass spectrometry. The biggestinfluence on the reproducibility and speed of the analysis has the samplepreparation. Therefore, a new online trypsin digestion platform automatesthe sample preparation, reduces the analysis duration from hours tominutes, and achieves high reproducibility.

DOI: 10.1007/s12268-014-0410-9© Springer-Verlag 2014

Vom Protein zum Peptidó Trypsin, 1876 von Wilhelm Kühne imSekret der Bauchspeicheldrüse entdeckt,gehört zu den Endopeptidasen, welche Pro-teine an bestimmten Positionen der Protein-kette spalten und somit zerkleinern können[1]. Es spaltet selektiv nach den basischenAminosäuren Lysin, Arginin und nach modi-fiziertem Cystein. Für die Proteomanalytik istTrypsin die am häufigsten eingesetzte Pro -tease, da es nicht proteinspezifisch ist, son-

dern auf gleiche Aminosäuresequenzen inner-halb der Proteine spezialisiert [2]. Die Pro-dukte der Proteinspaltung durch Trypsin sindmeist so klein, dass sie sich sehr gut mittelsmassenspektrometrischer (MS) Detektionbestimmen lassen.

Arbeitsablauf eines tryptischenVerdausUm eine Proteinstruktur aufklären zu kön-nen, muss das Protein zunächst enzymatisch

verdaut werden. Hierzu wird es zuerst dena-turiert und reduziert, um die Cystinbindungaufzubrechen und so das Protein zu entfal-ten. Anschließend wird es alkyliert, um dieEffizienz des Verdaus zu erhöhen. So vorbe-reitet, wird das Protein entweder mittels Gele-lektrophorese (in-gel) oder in einem Puffer-system (in-solution) enzymatisch verdaut.

Nach diesem sehr zeitaufwendigen Schrittmuss die erhaltene Probe manuell aufgerei-nigt werden, sodass sie sich mit einem Mas-senspektrometer zur Identifizierung undQuantifizierung untersuchen lässt. Der Tryp-sin-Verdau-Prozess ist bei der Proteinanalyseder zeitbestimmende Schritt, der bis zu24 Stunden dauern kann. Nach dem trypti-schen Verdau liegt die Probe in einer Puffer-lösung oder im Gel vor, welche nicht kompa-tibel mit der MS-Detektion sind. Bei dermanuellen Aufreinigung kann es leicht zueinem Verlust von Probenkomponenten kom-men, was letztlich einen großen Einfluss aufdie Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hat.Eine weitgehende Automatisierung derArbeitsschritte der Analyse von verdautenProteinen beseitigt somit viele Fehlerquellen.

Bioanalytik

Schnelle und reproduzierbareProteinanalyse

˚ Abb. 1: Verdauzeiten von Insulin mit der on-line-Trypsin-Verdau-Plattform Perfinity iDP. Nach einer Minute ist das Insulin vollständigverdaut.

˚ Abb. 2: Analyse von reduziertem und alkyliertem Transferrin mit deron-line-Trypsin-Verdau-Plattform Perfinity iDP. Es sind sechs aufein-anderfolgende Analysen gezeigt.

Automatisierter Protein-VerdauDie on-line-Trypsin-Verdau-Plattform Perfini-ty iDP übernimmt die Schritte vom Verdaubis zur Analyse in einem vollständig auto-matisierten System. Das vorbereitete Proteinwird auf eine wiederverwendbare Säule inji-ziert, welche immobilisiertes Trypsin mithoher Packungsdichte enthält. Die Immobi-lisierung hat u. a. den Vorteil, dass sie Selbst-verdau des Trypsins nahezu vermeidet. Umdie Effizienz des tryptischen Verdaus zu steigern, wird ein optimierter Puffer einge-setzt, der speziell auf die Trypsinsäule abge-stimmt ist. Innerhalb von einer Mi nute kannz. B. Insulin vollständig verdaut werden(Abb. 1).

Danach werden die erhaltenen Peptideautomatisch auf eine Entsalzungssäule über-führt, die sämtliche Puffer entfernt, welchedie Analyse mit einem Massenspektrometerbeeinflussen könnten. Nach der Entsalzungwird die Probe über eine Umkehrphasen-Chromatographie in die einzelnen Peptidegetrennt und direkt mittels MS-Detektion ana-lysiert. Der enorme Zeitgewinn durch denschnellen on-line-Trypsin-Verdau lässt sichnoch weiter steigern, indem eine zweite Ent-salzungssäule parallel eingesetzt wird. Sokann während der Analyse der ersten Probebereits eine zweite Probe verdaut und ent-salzt werden, wobei die parallele Entsal-zungssäule regeneriert wird. Mit diesem Sys-temaufbau lassen sich bis zu 200 Proben amTag messen.

Reproduzierbare ErgebnisseDie vollständige Automatisierung des Protein-Verdaus erlangt jedoch nicht nur einen gro-ßen Zeitgewinn. Die Eliminierung der manuel-len Aufarbeitungsschritte verbessert auchdeutlich die Reproduzierbarkeit der Messun-gen. Abbildung 2 zeigt sechs aufeinander-folgende Analysen von reduziertem und alky-liertem Transferrin. Am Beispiel von drei Mes-sungen sind in Tabelle 1 die Standardabwei-chungen der Peakflächen von 20 Peptideneines Transferrin-Verdaus gezeigt, welche alleim Bereich von 0,4 bis acht Prozent liegen.Dies ist mit manuellen Aufarbeitungsmetho-den nur sehr schwer zu erreichen, und auchmit teilweise automatisierten Methoden liegen die Standardabweichungen typischer-

20,0 77.551 72.199 80.057 76.602,33 4.014 5,24

20,4 123.633 106.875 121.037 117.181,7 9.020 7,70

20,9 101.131 108.713 105.673 105.172,3 3.816 3,63

21,1 164.803 168.049 167.296 166.716 1.699 1,02

21,5 261.128 236.951 234.215 244.098 14.812 6,07

22,2 290.171 290.735 288.299 289.735 1.275 0,44

22,4 186.600 178.884 178.861 181.448,3 4.461 2,46

22,7 143.964 144.298 142.517 143.593 947 0,66

22,9 104.212 114.875 110.346 109.811 5.352 4,87

23,2 267.686 255.772 249.757 257.738,3 9.125 3,54

23,4 130.573 124.909 129.993 128.491,7 3.116 2,43

23,5 53.220 48.288 49.150 50.219,33 2.634 5,25

23,6 31.610 32.296 31.467 31.791 443 1,39

23,8 102.430 105.401 101.824 103.218,3 1.914 1,85

24,0 49.022 56.231 53.091 52.781,33 3.614 6,85

24,2 91.279 86.549 78.148 85.325,33 6.650 7,79

24,4 85.161 85.883 82.149 84.397,67 1.981 2,35

24,8 241.992 243.983 250.666 245.547 4.544 1,85

25,0 483.586 471.184 467.367 474.045,7 8.480 1,79

25,5 34.326 36.274 31.764 34.121,33 2.262 6,63

Tab. 1: Standardabweichung und Variationskoeffizient (CV) der Peakflächen von 20 Peptiden nach tryptischem Verdau von Transferrin mit der on-line-Trypsin-Verdau-Plattform Perfinity iDP.

Zeit Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 Mittelwert Standard - CV (%)abweichung

¯ Abb. 3: Massenspektrometrische Analyseund TIC(total ion current)-Chromatogrammeines Verdaus von 300 Pikomol ImmunglobulinG (IgG).

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weise bei zehn Prozent [3]. Die sequence cove-rage (SQ, %) beim on-line-Verdau von Trans-ferrin liegt bei 93 Prozent [4].

Direkte Kopplung mit Massen spektrometrieDie beim Trypsin-Verdau eingesetzten Puffersind nicht verwendbar für die direkte Analy-se mit einem Massenspektrometer. Daherwerden im Perfinity iDP Entsalzungssäuleneingesetzt, die den Puffer aus der Probe ent-fernen. So kann z. B. die Analyse eines Ver-daus von Immunglobulin G mittels on-line-gekoppelter LC(liquid chromatography)/MSdurchgeführt werden (Abb. 3).

FazitDer vollständig automatisierte Trypsin-Ver-dau mit Perfinity iDP ermöglicht schnelle Ana-lysen von Proteinen mit hoher Reproduzier-barkeit. Durch die direkte Kopplung miteinem Massenspektrometer können Peptid-fragmente schnell und sicher identifiziert wer-den. Diese Möglichkeit der direkten LC/MS-Analyse eröffnet den Einsatz des Systemssowohl in der Biomarkerforschung als auchin der Pharmakokinetik und Bioanalytik. ó

Literatur[1] Crlscitelli F (1977) Friedrich Wilhelm Kühne 1837–1900.Vision Res 17:1317–1323[2] Olsen JV, Ong S, Mann M (2004) Trypsin cleaves exclusi-vely C-terminal to arginine and lysine residues.Mol Cell Proteomics 3:608–614[3] Rodriguez J, Gupta N, Smith RD et al. (2008) Does trypsincut before proline? J Proteome Res 7:300–305[4] Kannan K, Mulkerrin MG, Zhang M et al. (1997) Rapidanalytical tryptic mapping of a recombinant chimeric mono-clonal antibody and method validation challenges.J Pharm Biomed Anal 16:631–640

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