Scopi della analisi molecolare

• Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti

• Ricerca dei portatori sani

• Diagnosi prenatale

Patologia Genetica

• Patologia Monogenica:– malattie dovute a mutazioni di un singolo

gene

• Patologia Poligenica:– malattie dovute a mutazioni di più geni,

generalmente con presenza di una componente ambientale

• Patologia Cromosomica:– malattie dovute ad alterazioni numeriche o

strutturali del cariotipo

Il cariotipo: una sola analisi per diverse

patologie

Analisi molecolare: una analisi specifica

per una specifica patologia

Tutto inizia dal DNA

• Molecola depositaria del patrimonio genetico

• Trasporta l' informazione genetica necessaria alla trasmissione dei caratteri ereditari

http://learn.genetics.utah.edu/

Campioni da cui si può estrarre DNA

• Una goccia di sangue• Saliva presente su una sigaretta o su

un chewing-gum• Tracce di sperma• Urine e feci• Un capello• Fossili • Mummie

Estrazione di DNA

• Varie metodiche per estrazione DNA

• Estrazione manuale: vari kit in commercio

( spin basket, biglie magnetiche)

• Estrattori automatici

Estrazione Dna da sangue mediante Kit commerciali

Campione di sangue in EDTA Aliquotare 200μl di Binding Buffer Aggiungere 40 μl di proteinasi K Vortexare ed incubare per 10 min a 72° C in termoblocco Spinnare Aggiungere 100μl di isopropanolo Assemblare il filtro High Pure con una provetta relativa Pipettare il campione nel serbatoio superiore e centrifugare

per 1 min Successivi lavaggi con Inibitor Remaval e con Wash Buffer Aggiungere 200μl di Elution Buffer Centrifugare per 1 min e raccogliere il DNA

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

• Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA

• Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo

PCR: 3 Fasi

• Denaturazione : apertura doppia elica

• Annealing : attacco dei primers

• Extension : copiatura da parte della Taq polimerasi

Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)

Reagenti necessari per la PCR

• DNA• Primers• Oligonucleotidi• Taq polimerasi• Baffer e Magnesio• H2O

Ciclo standard di PCR 94°C 10 m 1 ciclo

35 cicli

72°C 10 m 1 ciclo

94°C 30s58°C 30s72°C 30s

Preparazione di una PCR

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici

• Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato

• Permette di separare i frammenti amplificati mediante PCR

Elettroforesi su gel• Si preparano i gel di agarosio che costituiscono

una “matrice a setaccio”• Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i

campioni da analizzare e viene applicato un campo elettrico

• La direzione di migrazione dipende dalla carica delle molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente, migreranno verso il polo positivo

• La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del frammento di acido nucleico

• Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni (peso molecolare)

Sequenziamento diretto del DNA

• Metodo accurato per ottenere informazioni precise e definitive su un gene

• Metodo ideale per la rilevazione di mutazioni difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi

Sequenza di DNA

Mutazione in eterozigosi

MUTAZIONE IN OMOZIGOSI

Analisi di frammenti

• Riconoscimento di paternità

• Identificazione di autori di reati

• Identificazione di vittime di reati o sinistri