Selbstanordnung von Trisoligonucleotidylen: „Nano-Acetylen” und „Nano-Cyclobutadien”

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    06-Jun-2016

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    Angew. Chem. 1999, 111, Nr. 22 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 1999 0044-8249/99/11122-3513 $ 17.50+.50/0 3513

    Nano-AcetylenMehr dazu auf denfolgenden Seiten.

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    3514 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 1999 0044-8249/99/11122-3514 $ 17.50+.50/0 Angew. Chem. 1999, 111, Nr. 22

    Selbstanordnung von Trisoligo-nucleotidylen: Nano-Acetylen undNano-Cyclobutadien**Matthias Scheffler, Axel Dorenbeck,Stefan Jordan, Michael Wstefeld undGnter von Kiedrowski*

    Sowohl DNA als auch DNA-artige Materialienermglichen in einzigartiger Weise eine sequenz-bezogene Selbstanordnung und somit eine In-formationsverarbeitung auf supramolekularerEbene. Seit den bahnbrechenden Experimentenvon Seeman[1] hat das Potential von DNA alsBaumaterial fr synthetische Objekte im Nano-metermastab innerhalb der Bioorganischen undSupramolekularen Chemie Beachtung gefunden.Stabfrmig zusammengesetzte molekulare Ob-jekte wurden aus drei- oder vierarmigen Verbin-dungselementen synthetisiert, die ihrerseits ausdrei bzw. vier linearen Oligonucleotiden aufge-baut sind.[2ae] Krzlich beschrieben Shi undBergstrom die Anordnung von nanometergroenMakrocyclen aus komplementren V-frmigenMoleklen, in denen die 3'-Enden zweier Oligo-nucleotide an einen bifunktionellen Linker ge-knpft waren.[3] Weitere Anstze auf dem Gebietder DNA-Nanotechnologie konzentrieren sichauf eine Oligonucleotid-adressierte rumlichePositionierung molekularer Objekte wie Metall-cluster, die kovalent an einzelstrngige, lineareOligonucleotide gebunden sind.[4ag]

    Wir beschreiben hier die Synthese und Se-quenz-adressierte Selbstanordnung von Trisoligo-nucleotidylen, einer neuartigen Klasse verzweig-ter Oligonucleotide, in denen ein trifunktionellerLinker drei Oligonucleotidstrnge ber ihre 3'-Enden miteinander verbindet. Unser Konzept frdie Synthese von DNA-Nanostrukturen ist dem von Seemanverwandt, es beruht jedoch allein auf der Selbstanordnungund enthlt somit keine Ligationsschritte zur Knpfungkovalenter Bindungen. Dies ermglicht zuknftige Anstzefr eine Selbstreplikation derartiger Nanostrukturen.

    Die auf dem Linker Y (Schema 1) basierenden Trisoligo-nucleotidyle wurden bereits 1993 nach der Phosphoramidit-Methode an fester Phase synthetisiert,[5a] das Fehlen geeig-neter analytischer Methoden zur Identifizierung dieser Mo-lekle machte jedoch damals eine Verffentlichung unmg-lich. Tabelle 1 gibt die Sequenzen und ausgewhlte analy-tische Daten fr die Trisoligonucleotidyle wieder.[5b] DasLinker-Phosphoramidit Y wurde aus dem Newkome-Dendri-mersynthon 1 ber eine vierstufige Reaktionssequenz in 50 %Gesamtausbeute erhalten.[6]

    Anhand von UV-Titrationsdaten bestimmten wir die st-chiometrische Zusammensetzung von verschiedenen Trisoli-gonucleotidylkomplexen. Gemische von Trisoligonucleotidy-len mit ihren linearen Komplementrstrngen wiesen immerein Molverhltnis von 1:3 auf (Abbildung 1 a), wohingegenGemische komplementrer Trisoligonucleotidyle immer einMolverhltnis von 1:1 ergaben (Abbildung 1 b). Die UV-spektroskopisch ermittelten Schmelzkurven der Komplexeaus komplementren linearen Oligonucleotiden und auskomplementren Trisoligonucleotidylen sowie die der obenerwhnten 1:3-Komplexe waren schwer zu unterscheiden,

    [*] Prof. Dr. G. von Kiedrowski, Dr. M. Scheffler, A. Dorenbeck,M. WstefeldLehrstuhl fr Bioorganische ChemieRuhr-Universitt BochumD-44780 BochumFax: (49) 234-7094-355E-mail : kiedro@ernie.orch.ruhr-uni-bochum.de

    Dr. S. JordanBayer AGD-51366 Leverkusen

    [**] Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft(SFB 452) und vom Fonds der Chemischen Industrie gefrdert. Wirdanken R. Breuckmann fr seine Hilfe bei der MALDI-MS-Analyseder Verbindungen..

    Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unterhttp://www.wiley-vch.de/home/angewandte/ zu finden oder knnenbeim Autor angefordert werden.

    Schema 1. Synthese der Trisoligonucleotidyle R3Y. a) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid, Pyridin;b) Acetoxyessigsurechlorid, Triethylamin, Toluol; c) 0.5n NaOH/THF (1:1); d) 2-(Cyanethoxy)-bis-N,N-(diisopropylamino)phosphan, Dichlormethan; e) Standard-Phos-phoramidit-Methode fr die Oligonucleotidsynthese an 500--Controlled-pore-glass(CPG)-Kgelchen, auer fr die Kupplung von Y, bei der die Reaktionszeit auf 315 min verlngert wurde; f) NH3 (aq.), 85 8C, 2 h, druckstabiles Gef. Unter diesenSpaltungsbedingungen wird die Amidogruppe an den 3'-Enden des Linkers nichtangegriffen, so da die erste(n) Base(n) X von der festen Phase in die Trisoligonucleotidyleeingebaut wird. CECyanethoxy.

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    Angew. Chem. 1999, 111, Nr. 22 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 1999 0044-8249/99/11122-3515 $ 17.50+.50/0 3515

    Abbildung 1. Bestimmung der stchiometrischen Zusammensetzung derTrisoligonucleotidylkomplexe durch UV-Titration. Die Extinktion E beil 260 nm wurde als Funktion des Molenbruchs c von H3Y gemessen. DieMischungskurve fr H3Y*I zeigt ein molares Verhltnis von 1:3 (a), die frH3Y*I3Yeines von 1:1. Alle Experimente wurden bei Konzentrationen, diezu gleichen Extinktionswerten fhren, in Gegenwart von 100 mm NaCl,0.5 mm EDTA und 10 mm Phosphatpuffer bei pH 7.5 und 25 8C durch-gefhrt. Die Konzentration von H3Y betrug 0.333 mm bei c 1.

    wobei die Konzentrationen jeweils so gewhlt wurden, dadie gleiche UV-Extinktion E resultierte.[5b] Die bergngewaren in allen Fllen monophasisch, selbst bei Variation derAufheizrate zwischen 0.1 und 2 K min1. Offensichtlich findetbei den Trisoligonucleotidylen eine Selbstanordnung ebensoeffizient statt wie bei ihren linearen Gegenstcken.

    Die Grenverteilung der Trisoligonucleotidylkomplexewurde durch Agarosegel-Elektrophorese sichtbar gemacht.Unbewegliche, hochmolekulare Aggregate wurden aus kom-plementren Trisoligonucleotidylen erhalten, wenn ein Stan-dardhybridisierungsverfahren angewendet wurde, bei dem dieProbe bei 95 8C denaturiert und dann langsam auf dieAnnealingtemperatur abgekhlt wird (mit 0.1 K min1 auf20 25 K unterhalb der Schmelztemperatur Tm). Die Entste-hung dieser polymeren Aggregate hngt von der Konzentra-tion der Trisoligonucleotidyle ab und wurde z. B. fr H3Y/I3Ybei einer Konzentration c> 1 mm beobachtet. Einzelne, gutgetrennte Banden konnten aber durch eine nderung derHybridisierungsbedingungen sichtbar gemacht werden (sieheHintergrundinformationen). Die neue Vorschrift beginnt miteiner Denaturierung bei 95 8C, gefolgt von raschem Abkhlenauf 0 8C (mit 1.8 K s1 zwischen 95 8C und 50 8C, siehe Hinter-grundinformationen); bei dieser Temperatur wird die Probe5 min belassen. Danach wird die Probe auf die von derjeweiligen Sequenz abhngige Annealingtemperatur er-wrmt. Der Hintergrund fr die neue Hybridisierungsmetho-de ist die Absicht, kinetisch kontrollierter Assoziationspro-zesse zu begnstigen. Dies ist vergleichbar mit einemKristallisationsproze, bei dem eine rasche Abkhlung nor-malerweise zu einer hohen Keimbildungsrate und somit zurBildung kleinerer Kristalle fhrt.

    Abbildung 2 zeigt ein typisches Gel aus einem Hybridisie-rungsexperiment, bei dem das Verhltnis zwischen denlinearen Oligonucleotiden H und I und den Trisoligonucleo-tidylen H3Y und I3Y variiert wurde. Die Zusammensetzungder in den Bahnen 1 9 aufgetragenen Proben ist in Tabelle 2

    Tabelle 1. Sequenzen und Analysedaten der in Schema 1 gezeigten Trisoligonucleotidyle R3Y.[a]

    R3Y[a] Sequenz X[c] Mber. Mgef.[d] tm [min][e] tr [min][f] Ausb. [nmol][g]

    A3*Y ATT GGC GCCAAT pTA 11 990 11981.7 17.89 17.55 22.50B3Y AATGCC GCCAAT pTC 11 882 11878.3 19.33 16.04 52.00C3Y ATT GGC GGCATT pTC 12 068 12064.4 19.58 17.23 56.45D3*Y AATT GGC GCCAATT pTC 13 827 13833.5 20.15 17.06 34.20E3Y AAATGCC GCCAAAT pTA 13 785 13780.9 20.68 16.51 33.00F3Y ATTT GGC GGCATTT pTA 13 917 13929.6 21.42 17.56 53.75G3*Y ATAAT GGC GCCATTAT pTT 15 679 15700.9 22.50 18.22 13.45H3Y AATCAGCC GCCACAAT pC 15 192 15185.2 22.81 16.63 78.74I3Y ATTGT GGC GGC TGATT pC 15 562 15554.9 23.35 16.62 86.23J3*Y ATT GGACCG CGG TCCAAT pC 17 236 17238.2 17.40 8.20K3Y AATCCT CCG CCG TCCAAT pTA 17 201 17226.3 26.42 17.02 33.10L3Y ATT GGACGG CGG AGG ATT pTA 17 922 17938.1 24.59 17.47 27.45M3*Y ATT GGG ACCG CGG TCCC AAT pC 19 107 19123.2 16.38 10.10N3Y AATCCC T GCC GCC TCCC AAT pTC 18 913 18926.8 29.25 16.94 24.70O3Y ATT GGG AGGC GGCAGGG ATT pTC 19 873 19887.7 29.37 17.89 32.70

    [a] Die Verbindungen wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) unter denaturierenden Bedingungen gereinigt (10 16proz. Acrylamid) unddann auf NAP-Sulen (APB) entsalzt. Die Charakterisierung wurde mit Kapillarelektrophorese (CE), HPLC und Matrixassistierter-Laserdesorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) durchgefhrt. [b] Ein Stern zeigt eine selbstkomplementre Sequenz an. [c] Mit p ist einePhosphodiesterbindung bezeichnet. [d] Durch MALDI-TOF-MS bestimmt (3-Hydroxypicolinsure, Acetonitril/H2O (1:1)). [e] tm ist die durch CEbestimmte Migrationszeit (eCAP-Cartridge, 27 cm, 0.1m Tris/Borat-Puffer, 7m Harnstoff, 10 kV). [f] tr ist die durch HPLC bestimmte Retentionszeit(Lichrocart C-18 (Merck); Eluent A: 0.2m Triethylammoniumacetat, 2proz. Acetonitril, pH 7; Eluent B: Acetonitril ; Gradient: 5 min A, 0!25proz. B in25 min, 25!50proz. B in 3 min. [g] Ausbeute nach Reinigung im 1.3-mmol-Mastab.

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    3516 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 1999 0044-8249/99/11122-3516 $ 17.50+.50/0 Angew. Chem. 1999, 111, Nr. 22

    Abbildung 2. Elektrophorese von Oligonucleotidkomplexen auf einem2proz. Agarosegel (SeaKeam LE; FMC), Frbung mit Ethidiumbromid.Die Topologie der Komplexe wird unter Verwendung der Nomenklatur frKohlenwasserstoffe beschrieben (Einzelheiten siehe Text). Die Zusam-mensetzung der auf den Bahnen 1 9 aufgetragenen Proben ist in Tabelle 2angegeben; alle Proben enthielten 100 mm NaCl, 5 mm MgCl2 und 10 mmPhosphatpuffer, pH 7.5. Die Proben wurden bei 95 8C denaturiert, auf 0 8Cmit einer Geschwindigkeit von 1.8 K s1 abgekhlt und nach 5 min auf eineAnnealingtemperatur von 40 8C erwrmt.[5b] Die Elektrophorese wurdeunter Eiskhlung durchgefhrt.

    angegeben. Wie zu erwarten war, weist der lineare DuplexH*I die hchste Beweglichkeit der doppelstrngigen Kom-plexe auf (Bahn 8). Die 1:3-Komplexe H3Y*3 I und I3Y*3 Hfhren zu einzelnen Banden und haben die gleiche Beweg-lichkeit (Bahnen 6 bzw. 7). Bahn 1 zeigt die Verteilung derKomplexe, die aus einer 1:1-Mischung der Trisoligonucleoti-dyle H3Y und I3Y resultiert. Das Bandenmuster ist in denBahnen 2 5 ebenfalls sichtbar, wo der relative Anteil derlinearen Oligonucleotide H und I ansteigt. Im Prinzip wirdhier eine berlagerung der Bandenmuster der Bahnen 1 und6 8 beobachtet. Die Bande mit der grten Beweglichkeit inBahn 1 luft etwas schneller als die in den Bahnen 6 und 7, wasdeutlich macht, da der zugrundeliegende Komplex einekompaktere Struktur hat als die 1:3-Komplexe. Letztereswurde auch durch Gelpermeationschromatographie (sieheHintergrundinformationen) besttigt. Die oben erwhnteBande ist bei den 14meren Komplexen E3Y und F3Y schwachsichtbar, dominiert aber im Fall der 20mere N3Y und O3Y(siehe Hintergrundinformationen).[5b] Ihre Intensitt hngt

    entscheidend von der Gegenwart von Magnesiumionen(5 mm) whrend der Hybridisierung ab (siehe Hintergrund-informationen).[5b] In jedem Fall stehen die Mobilittsdatenmit der Annahme eines bimolekularen Komplexes in Ein-klang. Ein derartiger bimolekularer Komplex kann ein, zweioder drei doppelstrngige Verknpfungspunkte enthalten(Abbildung 3). Um zwischen den verschiedenen Bindungs-situationen zu unterscheiden, wurden Abbauexperimente mit

    Abbildung 3. Mgliche Topologien eines bimolekularen Komplexes auszwei komplementren Trisoligonucleotidylen. Jeder DNA-Doppelstrangist als kovalente C-C-Bindung, jedes ungepaarte Oligonucleotid alsungepaartes Elektron dargestellt.

    5'-Exonuclease aus Mungbohnen durchgefhrt (siehe Hinter-grundinformationen).[5b] Unter Bedingungen, bei denen so-wohl einzelstrngige Oligonucleotide I als auch das Trisoli-gonucleotidyl H3Y vollstndig enzymatisch abgebaut wurden,wurde fr das Bandenmuster in Bahn 1 keinerlei nderungenbeobachtet, selbst bei doppelt so langen Reaktionszeiten undder zweifachen Enzymkonzentration.[5b] Dies lt daraufschlieen, da alle Strukturen, die den Banden in Bahn 1zugrundeliegen (Abbildung 3), eine vollstndige Basenpaa-rung aufweisen. Damit scheiden die Mglichkeiten a und b frdie Struktur des 1:1-Komplexes aus, die in Abbildung 3gezeigt sind. Eine weiterer Hinweis auf eine vollstndigePaarung wurde aus Abfang-Experimenten abgeleitet (sieheHintergrundinformationen). Bei Zugabe von entweder Hoder I zu der Mischung aus H3Y und I3Y nach der An-nealingprozedur bei 10 8C konnte keine nderung desBandenmusters in Bahn 1 (Abbildung 2) beobachtet werden,d.h., da keine einzelstrngigen Komponenten in den Kom-plexen enthalten sind.[5b]

    Zur Vereinfachung mchten wir hier eine einfache Schreib-weise fr die diskutierten Strukturen einfhren. Wir fassenein einzelstrngiges Oligonucleotid als ein freies (ungepaar-tes) Elektron auf und ein doppelstrngiges Oligonucleotid alseine C-C-Bindung. Die in Abbildung 3 gezeigten Komplexeknnen dann mit Ethan-1,1,2,2-tetrayl (a), Ethen-1,2-diyl (b)und Acetylen (c) bezeichnet werden. Komplementre Tris-oligonucleotidyle fhren immer zu einer Serie von Banden,deren Beweglichkeit mit dem Logarithmus der Molekularittdes Komplexes linear abnimmt, wenn sie nach dem obenerwhnten Annealingverfahren behandelt werden.[5b] Wennalso die Bande hchster Beweglichkeit Nano-Acetylen zuge-

    Tabelle 2. Zusammensetzung der in Bahn 1 9 aufgetragenen Proben(Abbildung 2).

    Bahn H3Y [mm] I3Y [mm] H [mm] I [mm]

    1 3.33 3.33 2 3.12 3.12 0.625 0.6253 3.00 3.00 1.75 1.754 2.75 2.75 1.75 1.755 2.50 2.50 2.50 2.506 3.33 10.00 7 3.33 10.008 10.00 10.009[a]

    [a] Molekulargewichtsstandard: GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus(MBI Fermentas).

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    Angew. Chem. 1999, 111, Nr. 22 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 1999 0044-8249/99/11122-3517 $ 17.50+.50/0 3517

    ordnet wird, dann entspricht die nchste Bande Nano-Cyclobutadien. Bei der dritten Bande beginnend gibt es nichtmehr nur eine Mglichkeit fr die Zuordnung der vollstndiggepaarten Komplexe. So knnen z. B. 3:3-Komplexe entwederdie Topologie von Nano-Benzol, von Nano-Dewar-Benzoloder von beiden annehmen. Noch mehr Mglichkeiten gibt esfr hhere Komplexe wie 4:4-Komplexe, unter denen Nano-Cuban und Nano-Cyclooctatetraen vorkommen knnten. Aufjeden Fall sind die ersten beiden Mitglieder der Serien relativsicher zuzuordnen und werden in Abbildung 4 dargestellt.Molecular-Modeling-Untersuchungen am Komplex H3Y*I3Ylegen zumindest nahe, da die Existenz eines Nano-Acetylensmglich ist, sowohl unter geometrischen als auch unter energe-tischen Gesichtspunkten (siehe Hintergrundinformationen).

    Abbildung 4. Modelle von komplementren Trisoligonucleotidylen(links), Nano-Acetylen (Mitte) und Nano-Cyclobutadien (rechts).

    Das Gel mit den selbstkomplementren Trisoligonucleoti-dylen zeigt ein alternierendes Muster von Bandenintensitten(Abbildung 5). Offensichtlich sind die aus einer geraden Zahlvon Moleklen bestehenden Komplexe hher populiert alssolche aus einer ungeraden. Wen...

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