SENSIBILITI AUX ANTIBIOTIQUES DES BACTI RIES ANAI ROBIES

Francine Mory a,,, Sebastien Fougnot a, Alain Lozniewski a

R ~ s u m 6

Des m6thodes mieux standardisees (diffusion en milieu gelose avec dlsques, E-test ®, galerie ATB ANA ®) sent actuellement disponibles pour etudier la sensibilite des bacteries anaerobies aux antibiotiques. D, I'echelle du patient, cos methodes permettent d'obtenir des resultats compatibles avec une aide 9. I'antibiotherapie, en particu- Iier pour ce qui concerne los infections dues 9, des bacteries

9, croissance rapide, comme los Bacteroides du groupe fragilis. ,/k I'echelle d'une population, la determination de la sensibilit6 aux antibiotiques des bacteries anaerobies est egalement necessaire

pour detecter des modifications des profils de sensibilite, afin de

s61ectionner le traitement antibacterien empirique optimal.

Bact~r ies a n a ~ r o b i e s - a n t i b i o t i q u e s - ~ t u d e de la sens ib i -

l i t~ - 6p id (~mio log ie .

S u m m a r y

Better standardized methods are now available (agar disk diffu- sion, E-test ®, ATB ANA ® device) for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria. At the patient's level, results obtained using these methods permit to guide the choice of antibiotics for the treatment of infections caused by anaerobic bacteria, especially in the case of infections due to rapidly growing bacteria such as Bacteroides fragilis group strains, At the population's level, antibiotic susceptibility testing of anae- robes is also necessary to detect changes in susceptibility profiles in order to select the optimal empiric antibacterial therapy.

A n a e r o b i c bacter ia - an t ib io t ics - suscept ib i l i t y tes t ing -

e p i d e m i o l o g y .

1. Introduction

L a necessite de d6terminer en routine la sensibilite aux antibiotiques des bact6ries anaerobies a ete Ionguement debattue [25]. En offer,

le delai d'obtention des resultats de cette analyse est souvent long

a Laboratoire de bacteriologie Centre hospitalier universitaire de Nancy H6pital central 29, av. du Marechal-de-Lattre-de-Tassigny 54035 Nancy codex

* Correspondance. f.mery@chu-nancy.fr

article requ et accepte le 23 juin 2003.

© Elsevier France.

et donc peu compatible avec une adaptation de I'antibiotherapie apres 48 9, 72 heures de traitement. La Iongueur de ce d61ai pout 6tre due 9, la croissance lento de certaines especes, 9, la necessite d'isoler cos bacteries en culture pure au sein d'une flore le plus souvent polymorphe et/ou 9, I'utilisation de conditions de culture non optimales. Ainsi, dans I'inter6t du patient, I'etude de la sensibilite aux antibiotiques en rou- tine des bacteries anaerobies 9, croissance lente et/ou impliquees dans des infections mixtes ne se justifie gen~ralement que Iors d'echecs the- rapeutiques ou d'infections necessitant un traitement prolong&

Inversement, lots d'infections monomicrobiennes (la plupart des bac- t6riemies) dues 9, des especes & croissance rapide (Bacteroides du groupe fragilis, Clostridium perfringens...), rutilisation de conditions de culture ad6quates permet d'obtenir des resultats darts un delai com- patible avec ieur prise en consideration Iors de la reevaluation pr6coce de I'antibioth6rapie. Ceci pout s'averer primordial Iorsque le choix de I'antibiotherapie initiale n'a pas pris en compte le risque d'infection 9, bacteries anaerobies. Deux etudes recentes, realisees chez des patients atteints de bacteri6mies 9, bacteries anaerobies, ont ainsi mon- tre que los taux de morbidite et de mortalite etaient significativement plus eleves Iorsque le traitement etait inadapte [20, 23].

2. Dans quelles circonstances doit-on realiser I'etude de la sensibilit aux antibiotiques ?

La determination de la sensibilit6 aux antibiotiques est recommandee en cas d'infections severes (infections du systeme nerveux central, bac- teriemies, endocardites,..) et d'infections necessitant un traitement pro- Ionge (infections osteo-articulaires, infections sur protheses...).

D'une maniere generale, I'etude de la sensibilite aux antibiotiques devrait etre effectuee pour route bacterie anaerobie isolee d'un site normalement sterile. En I'absence de culture anaerobie initiale, la recherche de bacteries anaerobies (et la determination de leur sen- sibilite aux antibiotiques) dolt faire partie de tout bilan d'echec thera- peutique. Dans ce cas, I'isolement de cos bacteries pout parfois neces- siter le recours 9, une fen6tre therapeutique, qui aurait pu 6tre evitee par la recherche de cos bact6ries Iors du bilan bact6riologique initial.

3. Quels antibiotiques faut-il tester en routine ?

Le choix des agents antibact~riens & tester dolt se porter sur des anti- biotiques actifs sur la plupart des bacteries ana6robies et utilises en therapeutique. La liste standard des antibiotiques preconisee par le Comit~ de I'antibiogramme de la Societe fran?aise de microbiologie (CA-SFM) comprend los antibiotiques suivants : amoxicilline, amoxi- cilline/acide clavulanique, imipeneme, metronidazole, clindamycine, chloramphenicol et vancomycine (pour los bacteries & Gram positif et comme aide & I'identification) [8].

Cette liste n'est cependant pas exhaustive et pout ~tre eomplet6e en fonction des especes isolees, de I'epid6miologie locale, du type d'in-

Revue Fran{2aise des Laboratoires, juin/juillet 2003, N ° 354 2 7

R#sistance aux antibiotiques : aspects 6pid~miologiques

fection et des traitements probabilistes preconises. Ainsi, il peut etre judicieux de tester d'autres ~-Iactamines (ticarciUine, piperacilline, ticar- cilline/acide clavulanique, piperacilline/tazobactam, cefoxitine, cefo- tetan et cefotaxime), la spiramycine (en cas d'infection dentaire), la pris- tinamycine (& ne pas tester cependant vis-&-vis des Bacteroides du groupe fragilis), la colistine (eomme aide & I'identification), la rifampicine et I'ofloxacine (vis-&-vis de Propionibacterium spp. et de Peptostreptococcus spp.).

4. Quelles sont les methodes d'(~tude de la sensibilite aux antibiotiques des bacteries ana6robies ?

Uetude de la sensibilite aux antibiotiques des bacteries anaerobies peut etre realisee par la determination directe des concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques (methodes de dilution en milieu gelose ou en milieu liquide, methode utilisant le E-test ®) ou par d'autres methodes (galerie ATB ANA ®, diffusion en gelose avec disques) per- mettant seulement de classer les souches comme sensibles (S), de sensibilite intermediaire (I) ou resistantes (R) ~. un antibiotique donne. Enfin, pour certaines especes, la recherche de la production d'une ~-Iactamase peut etre realisee de maniere complementaire & I'aide d'un test rapide & la nitrocefine.

Le milieu recommande par la plupart des auteurs pour effectuer cette etude est le milieu Brucella (milieu gelose ou bouillon) supplemente en hemine (5 mg/L), vitamine K1 (1 mg/L), bicarbonate de sodium (1 g/L) (uniquement pour le milieu liquide) et sang de mouton (5 %) [16]. Ce milieu convient & la croissance de la plupart des bacteries anaerobies. Le CA-SFM propose, comme alternative, la gelose Wilkins Chalgren supplementee de la meme maniere que le milieu Brucella [8]. Idealement, des milieux prepares extemporanement devraient etre utilises. A defaut, lee milieux liquides peuvent etre regeneres avant emploi afin d'eviter leur oxygenation. Apres ensemencement, I'incu- bation en atmosphere anaerobie, obtenue dans des jarres ou des chambres anaerobies, & 35 °C, dolt etre realisee sans tarder afin d'evi- ter tout effet toxique de I'oxygene sur les bacteries et de permettre la reduction des 5-nitroimidazoles en produits actifs. Uetude de I'acti- vite in vitro de ces molecules par la technique de microdilution en milieu liquide necessite de preincuber les milieux environ 4 hen anaerobiose avant leur ensemencement [16]. Generalement, une duree minimale d'incubation de 48 hest necessaire. Cette duree est imperative pour I'etude de la clindamycine.

4.1. M e t h o d e s perrnet tant la de te rmina t ion des C M I

4.1.1. Mdthode de dilution en mil ieu g~los~

Comme pour les autres especes bacteriennes, la methode de dilution en milieu gelose est actuellement consideree comme la methode de reference pour I'etude de la sensibilite aux antibiotiques des bacte- ries anaerobies par le National committee for clinical laboratory stan- dards (NCCLS) [19]. Dane cette methode, I'inoculum bacterien est depose sous forme d'un spot [10 ~ unites formant colonies (UFC)] & I'aide d'un ensemenceur & tiges multiples (inoculateur de Steers) & la surface de geloses contenant des concentrations d'antibiotiques s'echelonnant de 0,06 & 128 mg/L.

La concentration d'antibiotique la plus faible entrafnant I'inhibition de toute croissance bacterienne visible ou un changement marque de croissance, apres 48 h d'incubation, correspond & la CMI. Cette methode Iourde et coGteuse permet de tester un nombre important de souches. EIle est utilisee par lee laboratoires de reference qui rea- lisent une surveillance de la sensibilite des bacteries anaerobies aux antibiotiques ou qui souhaitent evaluer I'activite in vitro de nouveaux

28

antibiotiques. Elle ne convient cependant pas pour I'etude d'un petit nombre de souches et n'est donc pas applicable en pratique courante.

4.1.2. M~thodes de dilution en mil ieu l iquide

La determination des CMI peut etre egalement realisee a I'aide d'une methode de dilution en milieu liquide, soit en tubes (macrodilution), soit en microplaques (microdilution). Son principe est comparable & celui de la methode de dilution en milieu gelose. Des dilutions d'antibiotiques de raison geometrique 2, preparees dans du bouillon Brucella supple- mente, sont distribuees dane des tubes ou dans les puits d'une micro- plaque. L'utilisation des microplaques permet, pour chaque souche, I'etude simultanee de 8 antibiotiques & 11 concentrations (96 puits). Lee microplaques contenant lee solutions d'antibiotiques peuvent etre pre- parees ~. I'avance et conservees 4 & 6 mois a -?0 °C. II existe des micro- plaques pretes & I'emploi contenant les antibiotiquee sous forme conge- lee ou lyophilisee, mais& notre connaissance, elles ne sont plus commercialisees actuellement en France.

I'inoculum bacterien (105-106 UFC/mL) est ensuite ajoute manuelle- ment ou automatiquement (uniquement pour la methode par microdi- lution). La CMI correspond & la concentration d'antibiotique la plus faible qui inhibe toute croissance visible ou qui reduit cette croissance de maniere significative (microdilution). La lecture peut etre parfois difficile en raison d'un << effet de trainee >> apparaissant avec certaines combi- naisons antibiotiques/micro-organismes. Les valeurs des CMI obtenues avec ces methodes sont souvent inferieures d'une dilution & celles obte- nues avec la methode de dilution en milieu gelose [25]. Ces methodes presentent un interet pour tester les organismes qui envahissent les milieux geloses, tels que certaines especes de Clostridium.

La methode par microdilution a ete validee par le NCCLS pour la deter- mination des CMI de six antibiotiques (ampicilline/sulbactam, pipera- cilline, cefoxitine, clindamycine, metronidazole et trovafloxacine) vis-a.-vis des Bacteroides du groupe fragilis [19]. La methode par macro- dilution permet en outre d'explorer le pouvoir bactericide des antibio- tiques par la determination des concentrations minimales bactericides (CMB) qui peut etre indiquee dane certaines situations cliniques (endo- cardites par exemple) [16]. Comme toutes les techniques realisees en milieu liquide, ces methodes presentent neanmoins une plus grande sen- sibilite aux variations de I'inoculum et une moindre reproductibilite par rapport aux methodes realisees en milieu solide [17]. La methode par macrodilution est une methode fastidieuse et co0teuse, car elle neces- site rutilisation d'un tube par concentration d'antibiotique et par souche. Elle n'est donc pas utilisable en pratique courante.

4.1.3. M~thode utilisant un ensemenceur en spirale (<, spiral gradient endpoint method ,,)

Le principe de cette methode repose sur le fait qu'une quantite deter- minee d'un antibiotique donne est deposee & la surface d'une gelose sous forme d'une spirale & I'aide d'un ensemenceur adequat (Spiral Systems Instruments). Ce mode de depet cree un gradient de concen- tration decroissante de I'antibiotique, du centre vers la peripherie de ta bo~te. Trois & quatre heures awes le depet (periode necessaire & la diffusion de I'antibiotique), les souches & etudier (inoculum ajuste au point 0,5 de I'echelle de Mac Farland) sont deposees & la surface de la gelose de maniere radiale, au moyen d'un inoculateur automa- tique ou manuellement.

Apres 48 h d'incubation, la distance comprise entre le centre de la bofte et le point d'arret de croissance est mesuree. Un programme informatique transforme alors cette valeur en CMI [25]. Uarret de la croissance bacterienne est parfois difficilement visible. Neanmoins, une bonne correlation avec la methode de reference a ete observee dane une etude multicentrique [26].

Cette methode presente lee avantages de la methode de dilution en milieu gelose (bonne croissance des bacteries exigeantes) tout en

Revue Fran~aise des Laboratoires, juin/juitlet 2003, N ° 354

etant moins fastidieuse, car elle dispense de la preparation des boftes contenant les dilutions d'antibiotiques. Toutefois, I'equipement neces- saire & sa realisation est tres coeteux.

4.1.4, Epsilom~tre ou E-test ® (AB Biodisk)

Le E-test ® permet de determiner la CMI gr&ce & I'utilisation de ban- delettes impregnees sur une face d'un gradient exponentiel continu de I'antibiotique & tester et comportant sur I'autre face une echelle de lecture correspondant aux concentrations de cet antibiotique. Apres ensemencement d'un milieu gelose par ecouvillonnage (methode de Kirby-Bauer ; inoculum ajuste au point 1 de I'echelle de Mac Farland) et sechage (15 min), chaque bandelette est deposee au contact de la gelose.

Apres une duree d'incubation de 24 ~. 72 h, I'inhibition de la croissance bacterienne se traduit par la presence d'une ellipse d'inhibition dent les points d'intersection avec la bandelette definissent la CMI. Lorsque Pintersection se produit entre deux graduations, il est recommande de prendre en compte la valeur la plus elevee. Selon plusieurs auteurs, les CMI mesurees par le E-test ® ont tendance & 6tre inferieures & celles determinees par la methode de reference [7, 24, 27]. Une meilleure correlation du E-test ® avec la methode de reference est obtenue apres 48 h d'incubation [22, 27]. Cette duree d'incubation est imperative pour la clindamycine [5]. Les discordances les plus frequemment observees concernent la clindamycine (Bacteroides du groupe fragilis et Clostridium spp.), la cefoxitine (Bacteroides du groupe fragilis) et le metronidazole [22, 24, 27]. La methode utilisant le E-test ® est de realisation simple et rapide et represente, en pratique quotidienne, une alternative acceptable a la methode de reference. Toutefois, elle devient rapidement onereuse si ron souhaite determiner la sensibilite d'une souche & plusieurs antibiotiques (co0t du milieu gelose et des ban- delettes).

4.2. Aut res m e t h o d e s

4.2.1. Galerie ATB ANA ® (bioM~rieux)

La galerie ATB ANA ® permet d'etudier la sensibilit6 des bacteries anaerobies & 13 antibiotiques. Chaque antibiotique, dispose dans des cupules, est present & deux, voire, pour certains d'entre eux, & trois concentrations choisies d'apres les concentrations critiques recommandees par le NCCLS et le CA-SFM. L'inoculum est pre- pare & partir d'une culture obtenue en bouillon ou sur un milieu gelose. L'inoculum final, realise en milieu ATB-S, est distribue manuellement ou automatiquement dans chaque cupule. La lecture visuelle ou automatique est effectuee des qu'une croissance bac- terienne suffisante est observee dans les cupules temoins ne conte- nant pas d'antibiotique. Les resultats sent exprimes en souches sen- sibles, intermediaires ou resistantes selon les concentrations critiques definies par ie CA-SFM ou par le NCCLS. Concernant I'in- terpretation, il est recommande d'utiliser les concentrations critiques fran(~aises (CA-SFM) pour le metronidazole (_< 4 - > 16 mg/L), I'as- sociation amoxicilline/acide clavulanique (_< 4/2 - > 16/2 mg/L), pour I'ensemble des bacteries anaerobies. Les m~mes recom- mandations s'appliquent & I'amoxicilline (_< 4 - > 16 mg/L) pour les bacteries anaerebies & Gram positif. En terme de categorisation clinique, la concordance des resultats obtenus avec cette methode et la methode de reference est voisine de 94 % Iorsque les concentrations critiques fran~aises (CA-SFM) ou americaines (NCCLS) sent utilisees [12].

Des discordances tres majeures (souche ,, resistante ,, repondue ,, sen- sible ,,) ont cependant ere observees, surtout pour ce qui concerne les Bacteroides du groupe fragilis et les assoc~iations amoxicilline/acide clavulanique et ticarcilline/acide clavulanique.

Cette methode est par ailleurs peu adaptee pour etudier la sensibi- lite aux antibiotiques des bacteries & croissance lente. En effet, cer-

taines d'entre-elles, appartenant en particulier aux genres Peptostreptococcus et Eubacterium, ne se developpent pas darts le milieu ATB-S. De plus, il est souvent tres difficile d'obtenir pour ces bacteries I'inoculum recommande par le fabricant. II paraft judicieux de rechercher systematiquement la production de J3-1actamase par une methede chromogenique (voir chap#re 4.2.3) chez les souches appar- tenant aux genres Fusobacterium et Prevotella et apparaissant sen- sibles & I'amoxicilline. En effet, la concentration inferieure utilisee dans la galerie ATB ANA ® (2 mg/L) ne permet pas de detecter les souches productrices de JS-lactamase et pour lesquelles la CMI de cet anti- biotique est inferieure a 2 mg/L.

4.2,2. M~thode de diffusion en milieu g~los~

Cette methode consiste & deposer des disques (ou des comprimes) charges d'une quantite determinee d'antibiotique sur un milieu gelose prealablement ensemence par ecouvillonnage (methode de Kirby- Bauer ; inoculum ajuste au point 1 de I'echelle de Mac Farland). Eu egard aux recommandations du CA-SFM, tousles antibiotiques peu- vent 6tre testes en utilisant des disques, & I'exception du metroni- dazole, dent I'activite est etudiee au moyen de comprimes Neosensitabs ® (Rosco) charges & 16 #g. En effet, pour cet anti- biotique, la charge des disques commercialises (4 #g) est inferieure & celle recommandee par le CA-SFM (16 #g). Apres 48 h d'incu- bation, le diametre de la zone d'inhibition est compare aux diametres critiques definis par le CA-SFM. II s'agit d'une methode simple, rapide et d'un cot3t moder&

La categorisation clinique (S, I, R) est basee sur la concordance entre ces diametres et les CMI. Si une bonne correlation entre les resultats obtenus par la methode de diffusion (diametre d'inhibition) et la methode de reference (CMI) a ere observ#e pour les especes & croissance rapide (Bacteroides du groupe fragilis, Clostridium perfringens...) et certains antibiotiques, le coefficient de correlation peut s'averer insuffisant, en particulier pour les especes & croissance lente [2, 15].

La methode de diffusion en milieu gelose ne permet donc pas de classer toutes les souches de bacteries anaerobies dans les categories cliniques. Cependant, pour certaines especes, en particulier les Bacteroides du groupe fragilis, cette methode permet de distinguer les souches sauvages des souches ayant acquis une resistance & certains antibiotiques (associations ~-Iactamine- inhibiteur de 13-1actamase, imipeneme, clindamycine et metronidazole) [11].

4.2.3. Recherche de la production de ~-Iactamase par le test ~ la nitroc~fine

Le test & la nitrocefine Gefinase ® (Becton Dickinson) est un test simple et rapide qui peut ~tre ufilis6 pour rechercher la production de I~-Iac- tamase chez les bacteries anaerobies. Un disque impregn6 d'une cephalosporine chromogene, la nitrocefine, est depose sur une lame de verre ou dans une bofte de Petri. II est humidifie au moyen d'une goutte d'eau sterile. ~, I'aide d'une 5se sterile, plusieurs colonies de la souche & tester sent prelevees et etalees sur le disque. La production d'enzyme se traduit par I'apparition d'une coloration rouge generale- ment apres 5 & 10 min de contact, mais il peut 6tre necessaire de pro- longer le temps de contact jusqu'& 30 min & 37 °C. II n'est pas sou- haitable de prolonger I'incubation au-del& de ce delai, car une degradation non specifique du substrat peut conduire & un resultat faussement positif [16].

Cet examen dolt 6tre realise chez les organismes appartenant aux genres Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas et & certaines especes d e Clostridium susceptibles de produire une [3-1actamase, & savoir C. butyricum, C. clostridioforme et C. ramosum. La pig- mentation des colonies de certaines especes de Prevotella et de Porphyromonas peut cependant rendre la lecture de ce test impos- sible. La grande majorite des Bacteroides du groupe fragilis pro-

Revue Frangaise des Laboratoires, juin/juillet 2003, N ° 354 29

R#s is tance aux an t i b io t i ques : aspec ts # p i d ~ m i o l o g i q u e s

, , ~ ~!~ ~

1977 1987 1989 1992

~ L ~ !!'L ¸ m

~{(~!| I L-'I Amoxici l l ine-acide olavulanique

l i Cefoxitine

Cefotetan

Imipeneme

P

1_ ° 1997-98 2000

Nombre de souches test6es en : - 1977 : 94.

- 1987 : 261 (amoxicilline-acide clavulanique) ; 749 (cefoxitine) ; 171 (cefot6tan, imipen~me). - 1989 : 660 (amoxicilline-acide clavulanique) ; 240 (imipeneme) ; 150 (cefoxitine, c6fot6tan). - 1992 : 61 (c~fotetan) ; 283 (amoxicilline-acide clavulanique, cefoxitine, imipeneme). - 1997-98 : 228 sauf cefoxitine (non test6e). - 2 0 0 0 : 359.

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1977 1987 1989 1992 1997-98 2000

Nombre de souches testees en fonction des annees : 94 (1977), 571 (1987), 150 (1989), 283 (1992), 228 (1997-1998), 359 (2000).

[ ] Cl indamycine

[ ] Metronidazole

30 Revue Fran?aise des Laboratoires, juin/juillet 2003, N ° 354

duisent une cephalosporinase naturelle. II n'est donc pas necessaire d'effectuer la recherche de la production de [3-1actamase chez ces bacteries en pratique courante.

Une souche productrice de ~-Iactamase doit 6tre consideree comme resistante & la penicilline Get aux aminopenicillines [19]. La production de JS-lactamase detectee par cette methode confere en outre la resis- tance aux carboxy- et ureido-penicillines chez Fusobacterium spp., aux cephalosporines de premiere generation, au cefuroxime et aux cepha- Iosporines de troisieme generation orales chez Prevotella spp.. L'activite des ~-Iactamines est restauree Iors de I'association avec un inhibiteur de ~-Iactamase. En revanche, parmi les especes de Clostridium productrices de I~-Iactamase, seule la I~-Iactamase de C. butyricum est inhibee, aux concentrations therapeutiques, par les inhi- biteurs de J]-Iactamase [8].

Le test & la nitrocefine est un examen complementaire permettant une detection rapide de la production de I~-Iactamase chez certaines especes de bacteries anaerobies, mais il ne dispense pas de realiser I'etude de la sensibilite aux antibiotiques par les methodes conventionnelles, afin d'evaluer I'activite des autres anti- biotiques.

Par ailleurs, la resistance aux JS-lactamines chez les bacteries anae- robies n'est pas obligatoirement de nature enzymatique. D'autres mecanismes (modifications des PLP ou de la permeabilite membra- naire) peuvent 6tre impliques [19]. Ainsi, I'obtention d'un resultat nega- tif avec ce test n'implique pas necessairement la sensibilite de la souche & cette classe d'antibiotiques.

5. Quelles sont les m~thodes d'~tude utilisables en pratique quotidienne ?

La methode de diffusion en milieu gelose avec disques est sans doute la methode la plus simple d'utilisation pour les laboratoires isolant rarement des bacteries anaerobies. Le milieu recommande pour sa realisation convient & la croissance de la plupart des bac- teries anaerobies. Cette methode autorise une libert6 dans le choix des antibiotiques a. tester. Toutefois, cette methode, standardisee pour les bacteries anaerobies & croissance rapide, n'est pas vrai- ment satisfaisante pour les bacteries anaerobies & croissance lente. Son inter6t majeur reside dans la detection de resistances inhabi- tuelles aux antibiotiques (associations j[~-Iactamines-inhibiteurs de ~-Iactamase, imipeneme, metronidazole et Bactereides du groupe fragilis ; penicilline G e t Clostridiurn spp.) [11]. Mais en cas de doute sur les resultats obtenus, le CA-SFM recommande de determiner la CMI des antibiotiques concernes par la methode de reference ou par toute autre methode ayant montre des performances equi- valentes.

Le E-test ® est de realisation facile. II presente les m¢mes avantages que la methode de diffusion en milieu gelose avec disques quant aux performances du milieu preconise et au choix des antibiotiques & tes- ter. II permet une determination directe de la CMI, en particulier de celle de I'amoxicilline pour certaines especes de Prevotella et de Porphyromenas dent la pigmentation des colonies rend la lecture du test & la nitrocefine impossible. Le principal inconvenient de cette methode reside dans son coat eleve, afortiori Iorsque plusieurs anti- biotiques sent testes.

La galerie ATB ANA ® se caracterise egalement par sa simplicite d'uti- lisation et par son cot3t moindre. Comme le E-test ®, elle represente une bonne methode alternative pour la determination de la sensibilite aux antibiotiques des bacteries anaerobies. Toutefois, le choix des anti- biotiques est preetabli. Seules deux cupules libres permettent de tes- ter un antibiotique supplementaire.

6. F:volution et ~tat actuel de la sensibilite aux antibiotiques des bacteries anaerobies

La plupart des travaux relatifs & la surveillance de la sensibilite aux anti- biotiques des bacteries anaerobies ont porte sur les Bacteroides du groupe fragilis. En effet, ces bacteries sent tres frequemment impli- quees en pathologie et appartiennent aux especes les plus resistantes aux antibiotiques. Toutefois, la comparaison entre les resultats publies n'est pas toujours aisee, eu egard aux variations des conditions tech- niques utilisees. Dans les chapitres suivants, nous traiterons de I'etat de la resistance aux antibiotiques des bacteries anaerobies en France.

6.1. Bacteroides du g r o u p e fragilis

La resistance & I'association amoxicilline/acide clavulanique, apparue en 1987, a progresse jusqu'en 1998 pour atteindre 10 % des souches isolees (figure 1) [3, 10, 13, 14]. Depuis, elle semble avoir diminue (5,6 % des souches en 2000), mais ceci reste & ~tre confirme par des etudes ulterieures. En ce qui concerne les cephamycines (cefoxitine, cefotetan), une progression reguliere de la resistance a ete observee. Ainsi, en 2000, 13 % et 44 % des souches etaient respectivement resistantes a la cefoxitine et au cefotetan. Les premieres souches de Baeteroides resistantes a. I'imipeneme ont ete detectees en 1987 [6]. Une legere progression de cette resistance a ete observee jusqu'en 1998 mais en 2000, celle-ci ne concernait qu'environ 1% des souches isol6es. Une augmentation importante du taux de resistance & la clin- damycine a 6te observee entre 1977 et 1987 (figure 2).

Apres une relative stabilite jusqu'en 1992, ce taux a ensuite augmente de maniere significative pour atteindre 33 % en 2000. La resistance au metronidazole s'exprime le plus souvent A has niveau (CMI com- prises entre 4 et 16 mg/L). Les premieres souches de Bacteroides resistantes & bas niveau aux 5mitroimidazoles ont ete decrites en France dans les annees 1980 [9]. La frequence d'isolement de ces souches etait de 2,3 % en 1987-1988 [6] eta ensuite legerement aug- mente pour atteindre 4,6 % en 1994 [4].

Depuis, ce phenomene est reste relativement stable puisque environ 4,5 % des souches isolees en 2000 presentaient un has niveau de resistance aux 5-nitroimidazoles [3]. Des souches resistantes & haut niveau aux imidazoles (CMI du metronidazole > 32 mg/L) ont ete decrites de maniere exceptionnelle.

La resistance & I'imipeneme et aux 5-nitroimidazoles ne concerne que Bacteroides fragilis, alors que les autres especes appartenant au groupe fragilis apparaissent plus resistantes aux autres antibiotiques, en particulier au cefotetan et & la clindamycine [3].

6.2. Au t res bac i l les a G r a m nega t i f

Parmi les autres bacilles & Gram negatif anaerobies, la production de ]]-Iactamase concerne principalement Prevotella spp. et, & un degr6 moindre, Fusobacterium spp.. ,/~ ce jour, aucune souche de Porphyromonas spp. productrice de ]}-Iactamase n'a ete rapportee. Une nette augmentation de la frequence d'isolement des souches de Prevotella spp. productrices de ~}-Iactamase a ete observee entre 1994 (27 %) et 2000 (65 %) [3, 4].

Au cours de cette m#me annee, la production de I~-Iactamase a ete raise en evidence chez 13 O/o des souches de Fusobacterium spp. [3]. Rappelons que toutes ces souches restent sensibles aux asso- ciations J3-1actamine-inhibiteur de ~-Iactamase, ainsi qu'aux cepha- mycines et & I'imipeneme. La resistance & la clindamycine concerne environ 5 o/0 des souches de Prevotella spp. et de Fusobacterium spp. [3, 18].

Enfin, la majorite des bacilles & Gram negatif anaerobies reste sen- sible au metronidazole, & I'exception de rares souches de Prevotella

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R~sistance aux antibiotiques : aspects ~pid~miologiques

spp. et de Porphyromonas spp. presentant un bas niveau de resistance aux 5-ni t roimidazoles [3, 14].

6 .3 . Clos t r i d i um spp.

AIors que Clostridium perfringens reste tres sensible aux lS-lactamines act ives sur lee bacter ies anaerobies ainsi qu'& la c l indamycine et au metronidazole, la sensibi l i te aux ant ib iot iques des autres esp4~ces appar tenant au genre Clostridium varie selon les especes. Ainsi, si toutes les souches de Clostridium difficile isolees en France demeu- rent sensibles aux g lycopept ides, et en part icul ier & la vancomycine, une diminut ion de la sensibi l i te au metronidazole a ete observee chez environ 3 % des isolats [1]. Cependant, ce phenomene concerne sur- tout des souches non toxinogenes.

Pour ce qui concerne les autres Clostridium spp., une nette augmen- tation de la resistance aux cephamycines a ete observee au cours de ces derni~res annees [13, 18]. Celle-ci est plus marquee pour le cefo- tetan que pour la cefoxitine. Le taux de resistance des Clostridium spp. & la c l indamycine a egalement augmente (10 % en 1992 ; environ 34 % en 1998) [13, 14]. ,&, ce jour, aucune souche resistante aux 5- ni troimidazoles n'a ete rapportee.

6 .4 . B a c i l l e s a G r a m p o s i t i f n o n s p o r u l e s e t c o c c i

La resistance au metronidazole concerne I'ensemble des Actinomyces et des Propionibacterium, la plupart des souches de Bifidobacterium, et plus rarement lee souches appartenant au genre Eubacterium [13]. Tous les cocci anaerobies restent sensibles &cet antibiotique [13, 14, 18].

Une etude realisee en 1996 a montre que lee bacilles #. Gram positif non sporules etaient sensibles aux ~-Iactamines actives sur les bacte-

ries anaerobies & Gram positif, & rexclusion du cefotetan, pour lequel environ 33 % des souches etaient resistantes [18]. Parmi les Veillonella, des souches non productrices de ~-Iactamase et de sensibilite diminuee & la penicill ine G e t& la ticarcill ine (seule ou associee & I'acide clavu- lanique) ont 6te decrites [21 ]. Ces souches ont ete detectees en France et representaient 12 % des souches de Veillonella incluses dans une etude multicentrique fran(~aise realisee en 1998 [13]. Dane cette meme etude, la resistance & la cl indamycine concernait 23 % des bacilles & Gram positif non sporules et 20 % des cocci & Gram positif.

6. Conclusion

A I'heure actuelle, I 'etude de la sensibil ite des bacteries anaerobies aux ant ib iot iques peut ~tre realisee d 'une maniere plus aisee

grace & une meilleure standardisation des methodes util isables en rou- tine (methode de diffusion en milieu gelos6 avec disques, E-test ®, gale- rie ATB ANA®). Ceci permet desormais au microbio logiste d 'obteni r des resultats plus f iables et compat ib les avec une aide & I'antibio- therapie. La determinat ion de la sensibil i te aux ant ibiot iques des bac- teries anaerobies est egalement pr imordiale pour la survei l lance 6pi- demio log ique de la resistance de ces micro-organismes aux ant ibiot iques. Cet te survei l lance est indispensable pour le choix pro- babi l iste de I 'ant ibiotherapie et permet egalement de mettre en evi- dence de nouveaux phenotypes de resistance.

Elle a notamment permis d 'object iver une augmentat ion signif icative de la resistance de nombreuses especes de bacter ies anaerobies aux cephamycines, ant ib iot iques f requemment util ises en antibio- prophylaxie.

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