Senyawa Alam Metabolit Sekunder

8/16/2019 Senyawa Alam Metabolit Sekunder

1/121


2/121

ii

SENYAWA ALAM

METABOLIT SEKUNDER

TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN


3/121

iii

UU No 19 Tahun 2002 Tentang Hak Cipta

Fungsi dan Sifat hak Cipta Pasal 21. Hak Cipta merupakan hak eksklusif bagi pencipta atau pemegang Hak

Cipta untuk mengumumkan atau memperbanyak ciptaannya, yangtimbul secara otomatis setelah suatu ciptaan dilahirkan tanpa

mengurangi pembatasan menurut peraturan perundang-undangan yangberlaku.

Hak Terkait Pasal 491. Pelaku memiliki hak eksklusif untuk memberikan izin atau melarang

pihak lain yang tanpa persetujuannya membuat, memperbanyak, ataumenyiarkan rekaman suara dan/atau gambar pertunjukannya.

Sanksi Pelanggaran Pasal 721. Barangsiapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan

sebagaimana dimaksud dalam pasal 2 ayat (1) atau pasal 49 ayat (2)dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu)bulan dan/atau denda paling sedikit Rp 1.000.000,00 (satu juta rupiah),atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda palingbanyak Rp 5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah).

2. Barangsiapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan,atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaranHak Cipta sebagaimana dimaksud dalam ayat (1), dipidana denganpidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyakRp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah)


4/121

iv

Azis Saifudin, Ph.D., Apt.

SENYAWA ALAM

METABOLIT SEKUNDER

TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN


5/121

v

Katalog Dalam Terbitan (KDT)

SAIFUDIN, AzisSenyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik

Pemurnian/oleh Azis Saifudin.--Ed.1, Cet. 1--Yogyakarta:Deepublish, November 2014.

vii, 113 hlm.; 25 cm

ISBN 978-602-280-472-7

1. Senyawa I. Judul

546

Desain cover : Unggul Pebri HastantoPenata letak : Rizky Selvasari

Jl. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, SlemanJl.Kaliurang Km.9,3 – Yogyakarta 55581

Telp/Faks: (0274) 4533427

Hotline: 0838-2316-8088

Website: www.deepublish.co.idE-mail: [email protected]

PENERBIT DEEPUBLISH

(Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA) Anggota IKAPI (076/DIY/2012)

Isi diluar tanggungjawab percetakan

Hak cipta dilindungi undang-undangDilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, ataumemperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini

tanpa izin tertulis dari Penerbit.


6/121

vi

KATA PENGANTAR

Pembelajaran ilmu bahan obat alam atau farmakognosi diperguruan tinggi perlu dipikirkan ulang dan redidesain agar lebih

fundamental secara sains, integratif dengan ilmu terkait dan fleksibel

untuk membekali mahasiswa agar bisa berinteraksi dengan

penemuan terbaru dan berpikir lintas bidang/interdisipliner.

Sedangkan pelajaran fitokimia di farmasi yang selama ini terkesan

“berdiri sendiri” perlu dikembalikan ke induk aslinya yakni

farmakognosi. Dan farmakognosi dipertajam dengan kimia bahan

alam (natural product chemistry ). Buku ini menggunakan jembatanaspek kimia organik sebagai dasar dan bingkai pembahasan

farmakognosi. Di dalam buku ini dipaparkan teori dasar metabolit

sekunder, teknik isolasi dengan interface aspek farmakologi.

Beberapa konsiderasi akan inkonsistensi pola yang lazim dijumpai

pada pekerjaan metabolit ini juga dipaparkan, termasuk beberapa

problematika terkait kontroversi metabolit sekunder.

Semoga buku sederhana ini ikut memberikan bekal dan

menambah dasar keilmuan para mahasiswa yang kelak di masa

depan berpartisipasi mengelola kekayaan alam Indonesia. Penulisberharap buku sederhana ini bermanfaat kepada para peneliti,

mahasiswa tingkat sarjana atau pasca sarjana untuk mendukung riset

bidang senyawa alami, metabolit sekunder. Bagi penulis dan

keluarga semoga menjadi amal kebaikan.

Terima kasih saya ucapkan kepada para guru, senpai dan

kolega yang memberikan bimbingan dan sharing akademik maupun

kehidupan sosial.

Akhirnya terima kasih disampaikan kepada ibu dan bapakpenulis, istri tercinta Anggrek Sekar, wonderful kids Nabilah, Kiki,

dan Ubay yang memberikan inspirasi serta semangat.

Solo, 2014

Penulis


7/121

vii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ................................................................... vi

DAFTAR ISI .............................................................................. vii

BAB I PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN

MOLEKUL OBAT ........................................................... 1

BAB II BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN

METABOLIT SEKUNDER ............................................. 10

BAB III KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DANPEMILIHAN PELARUT .................................................35

BAB IV EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI .................39

BAB V BIOASSAY /UJI BIOAKTIFITAS/UJI

FARMAKOLOGI (BIOASSAY GUIDED

FRACTIONATION ) .....................................................69

BAB VI SKALING UP DAN DEREPLIKASI ..................................74

BAB VII EFEK SINERGISME, KOMPLEMENTER, DAN EFEKPLAUSIBLE ...................................................................76

BAB VIII SENYAWA TARGET BERSIFAT POLAR (SANGAT

LARUT DALAM AIR ATAU METANOL) .......................78

BAB IX PENENTUAN STRUKTUR/ELUSIDASI STRUKTUR .......84

BAB X ELUSIDASI STRUKTUR BEBERAPA SPEKTRA

METABOLIT SEKUNDER ............................................. 91

REFERENSI ............................................................................. 103

GLOSARIUM .......................................................................... 105

INDEKS ................................................................................... 110

BIODATA PENULIS .................................................................. 113


8/121

M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 1

BAB I

PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN MOLEKUL OBAT

Target belajar: Pembaca memahami secara fundamental peran bahan

alam sebagai sumber molekul aktif farmakologis. Memahami posisi

farmakognosi dalam rumpun ilmu kefarmasian. Memahami peran

penting kimia organik sebagai jembatan memahami senyawa aktif

dari bahan alam.

Obat berdasarkan besar molekulnya dibagi menjadi dua yakni

mikromolekul dan makromolekul.

Gambar 1.1. Contoh kisah sukses molekul alam. Senyawa-senyawa

tersebut diresepkan di klinik. Molekul-molekul ini

dimurnikan dari tumbuhan dan mikroba tanpa

modifikasi apapun. Statin adalah golongan obat yang

memiliki share market terbesar di dunia.

N

N

O

OCH3

OH

H3CO

N

N

HO

OH

O

O

OCH3

O

NH

O

OO

O

O

O

O

O

HO

OH

OO

H

OH

Daunorubisin(anti kanker payudara)

Lovastatin /statin(anti kolesterol)

Artemisinin(anti malaria)

Vinblastin (anti leukemia) Taxol (anti berbagai kanker)

O OO

O

O

OH

OH

O

OH

H2N

OH

O

O

O

H H

O

H

HO

O

O

O

O

O

H


9/121

2 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n

Obat Mikromolekul

Berat molekul obat golongan ini antara 100-1000 Dalton.

Molekul kecil ini kebanyakan diformulasikan dalam bentuk tablet,

kapsul, salep, sirup, serbuk, dan sejenisnya yang sangat mudah

dijumpai di apotek atau toko obat. Mikromolekul diperoleh dengan

cara sintesis total atau parsial dan dengan cara pemurnian dari

tumbuhan, bakteri, jamur.

Obat yang dibuat dari mikromolekul selama proses ekstraksi

dari bahan alam atau sintesisnya memerlukan bantuan pelarut

organik yakni metanol, etanol (alkohol), kloroform, heksana, aseton,

dan etanol dan lain-lain. Lebih dari 90% lebih molekul jenis

ini tidak larut air.

Obat Makromolekul

Kebanyakan obat makromolekul berupa protein dan

polisakarida. Produk ini berbagai vaksin dan produk imunologi.

Berat molekul golongan ini mayoritas lebih dari 1000 Dalton dan

memiliki kelarutan dalam buffer air. Kebanyakan protein merupakan

produk bioteknologi yang dihasilkan dengan rekayasa genetika

dengan bantuan mikrobia. Demikian pula produk obat protein dan

vaksin ini disiapkan dan disimpan dalam buffer.

Makromolekul diperoleh dengan cara ekstraksi serum

binatang, fermentasi bakteri atau jamur. Sifat obat makromolekul

larut dalam air atau buffer.

Baik mikromolekul kebanyakan merupakan produk alam.

Sedangkan makromolekul dihasilkan dari proses fermentasi/

bioteknologi.

Sejak kehidupan manusia pertama Nabi Adam AS hingga detik

ini manusia memanfaatkan bahan alam untuk hidup. Untukmendukung kehidupan: kelahiran, pertumbuhan, makan, minum,

pakaian, papan, keindahan, seni, beragama, dan kematian manusia

tidak bisa terlepas dari bahan alam. Kesemua aspek kehidupan

tersebut manusia sangat tergantung dengan zat alami yang dihasilkan

oleh makhluk hidup lain. Dari sisi makhluk produsen, senyawa alami

ada yang digunakan sebagai zat esensial untuk hidup dan ada zat

yang sekedar untuk mendukung kehidupan. Zat esensial untuk hidup


10/121


digunakan untuk dasar-dasar kehidupan: tumbuh, berkembang, dan

bereproduksi. Sedangkan zat pendukung kehidupaan digunakan

sebagai zat pertahanan dari gangguan makhluk lain, menarik

(attractant ) makhluk lain, dan alelopat untuk mendominasi suatu

kawasan, menetralkan racun, dll.

Senyawa alami secara umum adalah molekul kimia berupa

mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder. Secara famili

besar, metabolit primer dan metabolit sekunder adalah senyawa

organik.

Bahan alam dibedakan menjadi dua berdasarkan fungsi

terhadap makhluk hidup pembuatnya yakni:

1.

Metabolit primer2. Metabolit sekunder

Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh

makhluk tumbuhan, mikrobia atau hewan melewati proses

biosintesis yang digunakan untuk menunjang kehidupan namun tidak

vital (jika tidak ada tidak mati) sebagaimana gula, asam amino dan

asam lemak. Metabolit ini memiliki aktifitas farmakologi dan biologi.

Di bidang farmasi secara khusus, metabolit sekunder digunakan dan

dipelajari sebagai kandidat obat atau senyawa penuntun (leadcompound ) untuk melakukan optimasi agar diperoleh senyawa yang

lebih poten dengan toksisitas minimal (hit).

Metabolit Primer

Memiliki ciri:

Esensial untuk hidup: pertumbuhan normal, perkembangan dan

reproduksi. Berupa enzim fisiologis, menghasilkan energi misalnya

karbohidrat.

Terlibat langsung dalam fungsi fisiologis normal: protein dan

enzim

Terdapat di dalam organisme atau sel.

Dikenal dengan istilah metabolit sentral.

Berat molekul (BM) dari kecil dalam bentuk monomer hingga

sangat besar polimer ( > 1500 Dalton).

Contoh: glukosa, asam organik sederhana, asam lemak,

protein, hormon, enzim adalah metabolit primer.


11/121


Metabolit Sekunder

Memiliki ciri:

Tidak terlibat langsung dalam metabolism/kehidupan dasar:pertumbuhan, perkembangan dan reproduksi.

Tidak esensial, ketiadaan jangka pendek tidak berakibat

kematian. Ketiadaan jangka panjang mengakibatkan

kelemahan dalam pertahanan diri, survival, estetika, menarik

serangga.

Golongan metabolit sekunder distribusi hanya pada spesies

pada filogenetik /familia tertentu.

Seringkali berperan di dalam pertahanan terhadap musuh.

Senyawa organik dengan berat molekul 50-1500 Dalton.

Sehingga disebut mikro molekul.

Penggolongan utama: terpenoid, fenil propanoid, poliketida,

dan alkaloid adalah metabolit sekunder.

Pemanfaatan oleh manusia: untuk obat, parfum, aroma,

bumbu, bahan rekreasi dan relaksasi.

Mikroba dan tumbuhan baik darat maupun laut merupakan

salah satu sumber utama bahan obat. Berbagai obat penting yang

diresepkan di dalam terapi klinik seperti antibiotik, statin, vinkristin,

taksol didapatkan dengan pemurnian dari sumber alami yakni

mikroba dan tetumbuhan. Demikian halnya beberapa jenis-jenis

senyawa yang berpotensi sebagai agen promosi kesehatan seperti

katekin, genistein, flavonoid, stilebenoid, dan lain-lain juga diisolasi

dari bahan alam, baik dari mikroba, tumbuhan, jamur maupun

sarang serangga seperti propolis (sarang lebah) atau pun sarang

semut.


12/121


Gambar 1.2. Dari 1355 obat yang digunakan di klinik pada rentangtahun 1981-2010, hanya 4.4% molekul alami langsung

sebagai obat dan 0.4% ekstrak, namun sekitar 48% obat-

obatan lain diperoleh dengan modifikasi molekul alami,

atau berupa vaksin. (Diadaptasi dari Newman et al , 2012

Journal of Natural Products).

Pada rentang tahun 1981-2010, 4.4% dari 1355 buah obat-

obatan yang beredar berasal dari pemurnian bahan alam dan 0.4%

ekstrak da 43% merupakan senyawa alami yang dimodifikasi

(Newman, Cragg, and Snader, 2012). Terkhusus pada area obat

kanker, 74% obat yang digunakan secara klinik berasal dari ekstraksi

senyawa alami atau modifikasi senyawa alami. Jika digabungkan

dengan senyawa tiruan (mimick ), vaksin, ekstrak maka kontribusi

bahan alam dalam penyediaan bahan obat lebih dari 50%. Dengan

demikian tampak sekali peran metabolit sekunder di dalam

penyediaan obat.

Perlu dicatat dengan baik-baik dan ditekankan di sini, bahwa

pemurnian molekul dari bahan alam bukanlah pekerjaan final danlangsung bisa digunakan obat akan tetapi masih dan perlu langkah

lain. Jadi hanya sekitar 5% senyawa yang dihasilkan ekstraksi

langsung bisa digunakan untuk obat, kebanyakan menemukan

senyawa model untuk disintesis atau dimodifikasi lebih lanjut.

Farmakognosi

Farmakognosi berasal dari kata Yunani Pharmakon (obat) dan

gnosis (pengetahuan), yakni pengetahuan tentang bahan obat. Secara

4.4%

22.1%

0.4%

14.9%

5.9%

52.4%

Molekul alam

Modifikasi molekul alam

Fitofarmaka

Peptida

Vaksin

Sintesis


13/121


khusus farmakognosi adalah salah satu rumpun ilmu farmasi yang

mempelajari sumber bahan obat yang berasal dari bahan alami

(tumbuhan, mikroba, sarang, mineral dan hewan). Jadi awal mula

farmakognosi mempelajari bahan mentah obat atau crude drug .

Di waktu lampu (….-1800 M) ketika ilmu kimia organik belum

berkembang farmakognosi berforkus melakukan identifikasi spesies

tanaman, klasifikasi taksonomi, mempelajari morfologi dan

penggunaan bahan-bahan alami untuk pengobatan penyakit.

Tonggak sejarah farmakognosi modern dimulai dengan pemurnian

molekul tunggal dari tanaman.

Gambar 1.2 Morfin senyawa organik pertama dimurnikan oleh Fredrick

Serturner (Merck GmBH) dari kuncup bunga Papversomniverum . Hingga hari ini masih digunakan di klinik

untuk analgetik umum.

Kelahiran farmakognosi modern (farmakognosi kimiawi)

dimulai dengan pemurnian molekul morfin (analgetik) oleh Friedrich

Sertuner pada tahun 1804 dari kuncup bunga (poppy ) Papaver

somniverum dan dikomersialkan oleh pabrik farmasi Jerman, Merck.

Selanjutnya isolasi morfin itu memberikan ide ilmuwan modern lainuntuk melakukan pekerjaan pemurnian molekul-molekul lain dari

bahan alam yang mungkin digunakan untuk obat seperti:

Striknin (pestisida hewan

kecil) Nikotin (stimulant)

Kuinin (anti malaria kuno) Atropin (relaksan otot polos)

Kafein (stimulant) dan Kokain (stimulan penekan

lapar, halusinogen)


14/121


Dengan ribuan spesies hayati tumbuhan tingkat tinggi,

mikroba, jamur, bakteri adalah sumber molekul-molekul penting

untuk kehidupan manusia dan lingkungan. Dengan ditemukan

metode kromatografi dan spektroskopi, farmakognosi memulai

babak baru yakni fokus dengan aspek pemurnian senyawa organik

tunggal. Jadi dalam farmakogos modern, kimiawi organik bukan

sekedar aspek lagi melainkan menjadi paradigma farmakognosi

modern. ScFinder, suatu portal kimia, ratusan ribu senyawa telah

ditemukan hingga kini dan ratusan senyawa baru ditemukan setiap

tahun. Senyawa tersebut diteliti dan dipelajari sebagai kandidat obat.

Jadi di dalam farmasi modern metabolit sekunder merupakan

sumber molekul obat. Pada kimia medisinal, metabolit sekundertersebut dipelajari dan diteliti untuk digunakan sebagai kandidat obat

modern. Di tingkat perguruan tinggi dan pasca sarjana metabolit

sekunder dijadikan sebagai obyek pembelajaran secara khusus karena

beberapa pertimbangan:

1. Aspek farmakologi: keanekaragaman struktur kimia metabolit

sekunder yang tinggi mengindikasikan potensi keragaman efek

farmakologinya dan merupakan sumber kandidat senyawa

obat yang tidak terbatas.

2. Stabilitas: molekul kecil memiliki stabilitas lebih tinggi

dibandingkan makromolekul. Makromolekul baik polisakarida

maupun protein rawan terhadap berbagai reaksi perusak.

Misalnya hidrolisis yang menyebabkan struktur pecah.

3. Aspek kimia medisinal dan teknologi pemisahan: senyawa

metabolit sekunder cenderung bersifat semipolar sehingga lebih

mudah berinteraksi atau melewati barrier/jaringan biologis.

Kimia medisinal secara praksis membangun paradigma berpikir

kompromis antara struktur senyawa obat dan aktifitasfarmakologis, pertimbangan polaritas obat terhadap

kemampuan menembus barrier jaringan dan sel. Dalam

prakteknya, aspek teknologi pemisahan juga menjadi unsur

penting kimia medisinal. Senyawa yang bersifat semi polar

lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan dengan teknologi

kromatografi yang dikembangkan saat ini (silika, ODS,

sephadex).


15/121


4. Aspek farmasetik dan teknologi farmasi: berat molekul yang

kecil memungkinkan takaran dosis yang kecil dan lebih bisa

diterima (acceptable) untuk manusia dan hewan. Berat

molekul kecil lebih fleksibel terkait bentuk sediaan yang akan

diformulasi obat (tablet, kapsul, powder, injeksi), lebih

kompromis dan harmonis dengan pilihan bahan

pengisi/pembantu. Aspek teknologi farmasi: konsekuensi dari

poin 3, bobot molekul yang kecil lebih mudah, efisien dan

ekonomis dalam proses produksi di industri farmasi. Begitu

juga terkait dengan wadah dan pengepak juga lebih

ekonomis.

5.

Aspek struktur: struktur senyawa aktif farmakologis seringkaliberstruktur kompleks dengan cukup banyak kiralitas (orientasi

letak gugus dalam 3 dimensi). Metode sintesis seringkali

menghasilkan campuran rasemis dan memiliki tahapan panjang

dilakukan untuk menghasilkan senyawa berstruktur kompleks.

Sehingga ekstraksi dan pemurnian masih merupakan jalan

paling ekonomis dan efisien terkhusus untuk senyawa

berstruktur rumit tersebut.

Pertanyaan

1. Apa keuntungan metabolit sekunder jika digunakan sebagai

bahan baku obat dibandingkan dengan molekul-molekul

besar?

2. Bandingkan sifat metabolit sekunder pula terhadap senyawa-

senyawa yang sangat mudah larut air? dapatkan Anda

memikirkan kelemahannya?


16/121


Gambar 1.4 diagram Kedudukan farmakognosi di dalam eksplorasimaterial aktif.

Standardisasi dan kontrolkualitas (kimia analisis)

Ekstrak aktif, gubal,

crude drug

Farmakognosi

Farmasetika

Tumbuhan, bakteri, jamur,dan hewan

Farmakologi

Tablet, serbuk, kaplet, sirup dll

Molekul

Molekul semi

alami

Molekul

Sintesis

Kimia Organik (termasuk

Fitokimia)

Kimia medisinal

Kimia sintesis


17/121


BAB II

BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN METABOLIT

SEKUNDER

Target Pembelajaran: Pembaca ditargetkan mampu membedakan

golongan terpenoid, poliketida, fenil propanoid, alkaloid atau

campuran berdasarkan kerangka kimia yang diberikan. Mampu

menyebutkan jalur biosintesis dan tahapan umum di dalam jalur

biosintesis terpenoid, poliketida dan fenil propanoid. Sedangkan

metode klasik dengan reagen tertentu bersifat dekstruktif sehingga

sudah mulai ditinggalkan. Untuk pembaca tingkat master

diharapkan mampu memperkirakan golongan metabolit sekunder

berdasarkan clue spektra NMR).

Jika manusia dibekali akal budi dan gerak pindah koordinasi

tubuh, makhluk hidup selain manusia dibekali oleh Allah SWT untuk

menghasilkan senyawa metabolit sebagai “alat” untuk survival

mendukung kehidupan mereka. Misal alkaloid sebagai senyawa

pertahanan dari musuh dan hama, flavonoid senyawa penghias,

senyawa pewarna, terpenoid sebagai atraktan atau penarik, atau

polifenol dalam rangka menetralkan senyawa beracun.

Kenyataannya manusia manusia juga menghasilkan metabolit

kategori alkaloid. Berbagai neurotransmitter adalah alkaloid. Tanpa

alkaloid endogen hidup manusia cacat dan tidak sempurna.

Pembahasan khusus ada di golongan alkaloid.

Sifat-sifat kimiawi metabolit sekunder tersebut umumnya

memiliki berat molekul yang kecil (antara 50-1500 Dalton),

umumnya tidak larut air karena bersifat semi polar, dan strukturkimianya sangat beragam, jika saling bersenyawa jarang membentuk

molekul besar.

Gambar 2.1 Glukosinolat salah satu senyawa untuk senjata pertahanan

tumbuhan dari serangan virus, bakteri dan jamur.


18/121


Selain melakukan biosintesis sekunder, makhluk hidup

melakukan biosintesis primer sebagai proses kimiawi vital untuk

dasar untuk melakukan aktifitas hidup. Biosintesis ini dilakukan untuk

menghasilkan senyawa-senyawa esensial dan dasar reaksi-reaksi

kehidupan misalnya gula (karbohidrat) untuk menghasilkan energi,

asam amino untuk membangun jaringan dan biokatalis, asam lemak

untuk membangun dinding sel dan cadangan energi. Tanpa

metabolit primer ini dasar-dasar hayati tidak ada dan metabolit

sekunder juga tidak bisa diproduksi.

Metabolit primer terdiri dari 3 golongan utama yakni

karbohidrat, protein dan lemak. Glukosa esensial untuk

menghasilkan energi, asam amino vital untuk menghasilkan berbagaihormon dan neuro transmitter, lemak untuk membangun jaringan.

Setiap metabolit primer ini akan bersenyawa membentuk polimer

atau ikatan yang lebih kompleks membentuk jaringan tubuh.

Jaringan otot tersusun dari pensenyawaan kompleks protein, dinding

sel tumbuhan atau cangkang binatang dibentuk dari persenyawaan

antar karbohidrat, jaringan lemak disusun oleh persenyawaan lemak.

Antar metabolit primer ini juga akan saling membentuk

persenyawaan dalam membangun sel-sel dan jaringan kemudian

organ.

Adapun sifat-sifat kimiawi metabolit primer, memiliki berat

molekul kecil mulai dari 80-300 Dalton/amu, larut dalam air (gula

dan asam amino) atau tidak larut air misalnya asam lemak, jika saling

berikatan membentuk senyawa dengan berat molekul sangat besar

(BM >1000-100.000 d). Secara farmakologis, senyawa metabolit

sekunder memiiliki berbagai aktifitas biologis: anti bakteri, anti

infeksi, anti kolesterol, anti kanker, anti diabetes dll.

Pertanyaan: apakah hubungan antara metabolit sekunder denganmetabolit primer ?

Gambar 2.2 Glukosa, adalah metabolit primer untuk bahan energi

kehidupan dan darinya berbagai metabolit sekunder juga

berasal.


19/121


Karena metabolit sekunder berjumlah jutaan di alam dan akan

terus ditemukan ratusan senyawa baru setiap tahun maka tidak

mungkin seseorang bisa menghafalnya, walaupun setiap golongan

struktur. Diperlukan frame work dan metode berpikir yang mampu

mencakup garis besar metabolit sekunder. Untuk itu pemahaman

dasar-dasar biosintesis diperlukan.

Tujuan memahami biosintesis metabolit sekuder:

1. Senyawa di alam berjumlah jutaan dan tidak mungkin dihafal.

Setiap tahun ditemukan ratusan senyawa baru. Bahkan antar

senyawa satu sama lain membentuk senyawa yang lebih

kompleks. Biosintesis digunakan untuk membangun paradigma

berpikir dan meringkas keterhubungan antar senyawa.2. Keteraturan pola struktur. Dengan memahami kerangka dan

jalur asal biosintesis suatu golongan senyawa bisa digunakan

untuk membantu menentukan struktur kimia. Inti kerangka

senyawa-senyawa metabolit sekunder memiliki keteraturan

pola dan memiliki bentuk yang seragam di dalam keragaman

sehingga penentuan struktur (elusidasi struktur) cukup terbantu

dengan pemahaman kerangka biosintesis.

3. Desain obat modern. Dengan memahami jalur biosintesis dan

mekanisme penyakit dimungkinkan desain obat (sintesis obat

dan QSAR (Quantitative-Structure Activity Relationship) atau

HKSA (Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas)) berdasarkan

pola interaksi penyakit dan target obat yang lebih selektif.

4. Aspek selektifitas. Terkait kondisi patologis (biokimiawi

penyakit), biosintesis terkait dengan berbagai mekanisme

penyakit dan pengobatan. Dengan memahami mekanisme dan

jalur biosintesis pembentukan senyawa penyebab penyakit

maka dimungkinkan memilih target, mengeblok ataumeminimalkan senyawa biologis penyebab penyakit. Misalnya

menurunkan jumlah kolesterol, merusakkan kapsul dari virus,

mengeblok protein penyebab diabetes, meminimalkan

pembentukan NO (nitrit) pada penyakit jantung atau

menyebabkan jejas kerusakan jaringan. Berbagai penyakit

masih menjadi misteri dan kini jalur biosintesis, pathway/ dan

jalur komunikasi sel menjadi topik penting di bidang


20/121


kedokteran dan pengobatan karena biosintesis seringkali terkait

dengan pembentukan agen degeneratif di dalam tubuh.

5. Aplikasi bioteknologi untuk produksi. Dengan diketahuinya

jalur biosintesis senyawa tertentu, melalui bioteknologi

kuantitas produk senyawa bermanfaat seperti obat yang

dihasilkan bisa dinaikkan. Jika senyawa kimia hanya bisa

dihasilkan dalam jumlah amat kecil misal taksol atau vinkristin

maka produksinya bisa ditingkatkan melalui potensi rekayasa

genetika atau manipulasi media fermentasi.

Berbagai mekanisme penyakit dan target obat baru ditemukan

dengan biosintesis, misalnya target biosintesis kolesterol, target enzim

pengganggu insulin, target penggangu asetil kolin pada Alzhaemer’s .

Ilmu biosintesis bukanlah ilmu yang mati dan statis namun berbagai

misteri besar kehidupan ada di dalamnya dan akan terus

berkembang dan ditemukan terutama di dunia biologi/kedokteran.

Untuk memahami dasar biosintesis metabolit sekunder maka

terlebih dahulu diperlukan beberapa istilah kunci:

1. Starting material: adalah senyawa sederhana yang biasanya

cukup stabil secara kimiawi dan menjadi bahan baku biosintesis

misalnya asam laktat glukosa, fruktosa, dan senyawa gula lain.2. Prekursor: adalah senyawa yang terbentuk dari starting

material namun bukan produk akhir, seringkali prekursor ini

ditambahkan dari luar untuk meningkatkan produk. Prekursor

kebanyakan merupakan asam amino.

3. Biokatalis: sebagaimana pengertian katalis pada umumnya

namun katalis di dalam biosintesis secara khusus adalah enzim-

enzim pembantu reaksi.

4. Jalur biosintesis atau pathway: adalah rangkaian tahapan reaksi

perubahan starting material menjadi metabolit.

5. Produk: senyawa terakhir yang dihasilkan, yakni senyawa

senyawa poliketida (C2), terpenoid (C5), senyawa fenil

propanoid (C9) sebagai kerangka utama, senyawa alkaloid,

dan senyawa campuran.

Metabolit sekunder berasal dari biosintesis primer. Umumnya

starting material paling awal adalah senyawa metabolit primer

sederhana dan stabil secara kimia dan fisika, yakni gula.


21/121


Penelitian biosintesis di dalam laboratorium:

Media hidup yang digunakan adalah kultur sel tumbuhan, kultur

jamur, kultur bakteri atau tumbuhan utuh.

Gambar 2.3 Alur biosintesis metabolit sekunder. Starting mula-mula

adalah air dan CO2 (fotosintesis) yang menunjukkan bahwafotosintesis adalah proses biokimiawi dasar yang mendasari

kehidupan. Dari fakta ini tampak sekali bahwa air adalah

starting material mula-mula semua makhluk hidup.

Dengan demikian berdasarkan jalur biosintesis, metabolit

sekunder digolongkan menjadi:

Glukosa

Asam mevalonat C5)

Asetil-CoA C2)

Turunan poliketida

Berbagai asam amino

alifatik

Dioksiselulosa C5)

Asam

Sikimat

Turunan asetat

Benzoik dan

fenolik C7)

FOTOSINTESIS

L-fenilalanin,tirosin, triptofan

C9)

Eritrose 4-P

H

2

O +

CO

2

O

2

+


22/121


1. Golongan asetat (C2): poliketida dan asam lemak.

2. Golongan mevalonat dan deoksisilulosa (C5): terpenoid

3. Golongan sikimat: fenil matanoid (C7) dan fenil propanoid

(C9)

4. Golongan alkaloid

5. Golongan campuran: kombinasi antar metabolit sekunder atau

metabolit sekunder dengan metabolit primer.

Golongan senyawa poliketida dan asam lemak C2)

Gambar 2.4 Tetrasiklin adalah antibiotik dihasilkan oleh biosintesis

asetat. Di tahap akhir mengalami aminasi

Senyawa C2 digolongkan menjadi 2 yakni golongan poliketida

dan turunan asam lemak. Asam asetat adalah building block dan

kerangka dasar golongan ini. Sehingga jumlah karbon golongan

metabolit sekunder ini berjumlah 2 dan kelipatannya (C2 x n).

Senyawa ini sangat luas distribusinya. Mulai dari makhluk jasad renik,

tumbuhan dan vertebrata menghasilkan senyawa golongan ini.

Berbagai golongan antibiotik, asam lemak, bahkan aflatoksin

penyebab hepatitis adalah senyawa-senyawa poliketida. C2 jika

membentuk struktur siklik maka ia menjadi poliketida dan jika

membentuk rantai alifatik panjang maka membentuk kerangka asam

lemak. Dengan demikian C2 berkontribusi membentuk metabolitprimer

Ciri-ciri senyawa poliketida adalah:

- Strukturnya tersusun dari rantai karbon dengan kelipatan 2

sehingga disebut C2, karena berasal dari starting material

asetat: nCH3CO2H -[CH2CO]n-. Adapun jumlah karbon

akhir bisa kehilangan 1 atau kelebihan bisa terjadi.

- Kadang membentuk cincin benzen aromatis


23/121


- Jika cincin benzen biasanya mengandung lebih dari satu gugus

hidroksil (-OH) atau alkoksi (-OR) maka gugu-gugus tersebut

akan berposisi meta satu sama lain.

Gambar 2.5 Posisi meta antara dua gugus alkoksi adalah salah

satu ciri khas dari senyawa golongan poliketida.

- Jika membentuk rantai panjang dan berakhiran dengan gugus

karboksilat maka disebut golongan asam lemak.

- Rantai panjang tersebut kadang mengalami siklisasi

Ciri sekunder:

- Semakin panjang rantai karbon maka semakin larut dalam

pelarut non polar, namun semakin banyak gugus hidroksil

maka kelarutan makin tinggi pada pelarut polar seperti

metanol.

Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang satu atau

kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict rumus C2, C5, C9.

Karena proses di alam oleh reaksi enzimatis.

- Diproduksi oleh hampir semua makhluk hidup, dari makhluk

tingkat rendah bakteri, alga, jamur, tumbuhan dan mamalia

hingga manusia.


24/121


Jalur biosintesis poliketida:

Gambar 2.6 Biosintesis golongan asam lemak dari starting material asam

asetat (C2)

Gambar 2.7 Mekanisme biosintesis golongan poliketida (diadaptasi dariDewick, 2006)


25/121


Identifikasi senyawa poliketida:

Secara kimiawi: dikarenakan beragam strukturnya, maka tidak ada

reagen khusus penciri golongan poliketida. Biasanya identifikasi

didasarkan pada reaksi gugus fungsional kemudian diidentifikasi

perubahan warna yang terjadi atau pergeseran pada panjang

gelombang tertentu. Contohnya jika bergugus fenolik maka potensial

dikopling dengan senyawa pengkelat sehingga larutan lebih gelap.

Sedangkan pencirian fisis dengan menggunakan lampu UV biasanya

akan memberikan pemadaman pada 254 nm dan warna tertentu

pada 366 nm. Jadi tidak terlalu spesifik. Walaupun reagen anilin bisa

mengidentifikasi cincin benzene namun akan bias dengan golongan

fenil propanoid. Untuk identifikasi modern penggunaan reagenkimiawi destruktif era sekarang sudah dihindari

Untuk golongan asam lemak mudah dicirikan berdasarkan sifat fisis

yang meninggalkan noda semi transparan pada kertas. Di bawah

sinar UV asam lemak tidak memberikan pemadaman flouresensi.

Dengan spektra NMR: jika memiliki proton pada gugus aromatis

maka akan memberikan sinyal geseran kimia sekitar δ 6-8 ppm. Jika

mengadung proton rantai panjang karbon ikatan tunggal (-CH2-)

maka akan memberikan sinyal antara δ 1-2,8 ppm, beberapa

diantaranya overlap. Jika mengandung proton dengan ikatan ganda

maka akan menunjukkan peak sekitar δ 5-6,5 ppm.

Latihan:

Jelaskan mengapa senyawa-senyawa berikut disebut poliketida:


26/121


Golongan Senyawa Terpenoid C5)

Gambar 2.8 Artemisinin adalah obat anti malaria yang diekstraksi dari

jamur Artemisinia annua , merupakan senyawa terpenoid.

Artemisinin menghambat pertumbuhan Plamodium

falciparum .

Terpenoid adalah senyawa yang tersusun dari kerangka

isopren (C5), yakni rantai beranggota lima karbon bercabang

(branching) metil pada karbon nomor 2 atau kelipatannya. Senyawa-

senyawa seskuiterpen (Zingiberaceae ), asam ursolat yang terdapat

dalam berbagai tanaman dan bersifat penghambat kanker dan

menurunkan gula darah, asam betulinat yang tekandung dalam

berbagai tatanaman termasuk buah kayu putih yang bersifat

antidiabetes, azadiraktin dari biji mimba (Azadirachta indica ) sebagaipestisida, berbagai macam parfum dan aroma kebanyakan adalah

senyawa-senyawa terpenoid. Karotenoid dalam berbagai tanaman

sebagai pro vitamin A. Skualen suplemen kesehatan, bahkan

kolesterol yang jika kadarnya dalam tubuh berlebihan menyebabkan

penyakit jantung dan stroke adalah merupakan senyawa golongan

terpenoid.

Jalur Biosintesis

Isopentenil piropospat (IPP) atau dimetil alil piropospat

(DMAPP) adalah starting material paling awal dari terpenoid.

Jalur biosintesis terpenoid di mulai dari pembentukan

isopentenil piropospat (IPP) yakni isopren yang mengikat dua

buah pospat kemudian bergabung satu dengan yang lain dari

kepala-ekor membentuk monoterpen, seskuiterpen, diterpen,

triterpen dan seterusnya. Mengapa isoprene dalam reaksi ini

harus mengikat pospat ?.


27/121


Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid: 1 jalur

mevalonat dan 2. deoksiselulosa. Jalur biosintesis

deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru ditemukan.Jalur deoksiselulosa ditandai lazim ada di dalam tumbuhan

atau bakteri, namun jarang terdapat di dalam makhluk

vertebrata termasuk manusia.

Minyak atsiri monoterpen dan seskuiterpen, steroid, kolesterol

merupakan senyawa terpenoid.

Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran ?.

Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesis

makhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup

selektif pada makhluk vertebrata.Mekanisme pembentukan senyawa terpenoid:

Gambar 2.9 Dimetilalil piropospat (DMAPP) dan Isopentenil piropospat

(IPP) adalah starting material terpenoid. Terpenoid tersusun

dari rantai karbon tersebut atau kelipatannya.

Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid makhluk

hidup ada dua, yakni jalur mevalonat dan deoksiselulosa. Jalur

biosintesis deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru

ditemukan. Jalur deoksiselulosa lazim ada di dalam tumbuhan atau

mikroba namun jarang terdapat di dalam makhluk vertebrata

termasuk manusia.

Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesismakhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup selektif

pada makhluk vertebrata. Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran?

Jalur biosintesis terpenoid dimulai dari pembentukan

isopentenil piropospat (IPP) atau dimetilalil piropospat (DMAPP)

yakni isopren yang mengikat dua buah pospat kemudian bergabung

satu dengan yang lain dari kepala-ekor membentuk monoterpen,

seskuiterpen, diterpen, triterpen dan seterusnya. Isoprene adalah unit


28/121


pembangun terpenoid bukan merupkan starting material paling awal

dari terpenoid. Mengapa isoprene dalam reaksi ini harus mengikat

pospat? Meskipun DMAPP dan IPP memiliki ikatan ganda namun

electron namun tidak terlalu reaktif untuk bereaksi dengan molekul

sejenis.

Gambar 2.10 Diagram skematik terbentuknya golongan terpenoid

Ciri-ciri senyawa terpenoid adalah:

1. Jumlah rantai atom karbon di dalam kerangka sebanyak 5 atau

kelipatannya. Sehingga disebut senyawa golongan C5.

2. Seringkali bercabang metil (branching – CH3). Karena starting

material nya memiliki gugus metil maka jelaslah terpenoid yang

dihasilkan mewarisi gugus metil ini.


29/121


3. Kadang mengandung gugus metilen (=CH2) terminal atau -

CH2OH. Disebabkan suatu reaksi pada cabang metil pada poin

2 gugus metil tersebut kadang mengalami modifikasi menjadi

gugus metilen terminal atau metil yang mengikat hidroksi.

4. Seringkali membentuk cincin atau rantai siklik yang unik

Ciri sekunder:

5. Semakin panjang rantai karbon (jumlah karbon) kelarutan

makin larut pada pelarut non polar.

6. Jarang memiliki gugus aromatis.

7. Jika memiliki rantai ikatan ganda umumnya berjumlah

terbatas.

Keberadaan senyawa terpenoid berbobot molekul rendah

berlimpah distribusinya pada tumbuhan dan makhluk tingkat rendah

seperti jamur/fungi, bakteri dengan struktur sangat beragam. Pada

makhluk vertebrata dan manusia jenis senyawa terpenoid didominasi

turunan steroid.

Identifikasi Terpenoid

Secara kimia: Karena terpenoid sangat beraneka ragam strukturnyadan tidak memiliki gugus yang uniform terkait reaktifitas kecuali

ikatan gandanya maka secara kimia terpenoid diidentifikasi dengan

penyemprotan pereaksi vanillin-asam sulfat atau anisaldehida-asam

sulfat yang akan menghasilkan warna-warna ungu, kuning coklat,

hitam pada sinar tampak. Vanillin dan anisaldehida memperpanjang

rantai terkonjugasi dari senyawa target. Atau kadang dilakukan

reaksi oksidasi, yang diperkirakan terlepasnya beberapa hidrogen

meningkatnya jumlah ikatan ganda sehingga terbentuk warna violet

pada cahaya tampak. dengan pereaksi umum serium(IV)sulfat yang

akan menghasilkan warna ungu, biru atau kuning.

Secara fisika: Karena ikatan gandanya terbatas maka identifikasi non

spesifik terpenoid adalah dengan melihat bercak kromatografi lapis

tipis silica gel254 nm di bawah sinar lampu UV 254 akan menghasilkan

bercak warna ungu pemadaman, dengan warna latar lempeng

fluoresensi hijau (lempeng berwarna hijau). Dan di bawah lampu UV

366 mm tidak menghasilkan fuoresensi. Semakin terbatas ikatan


30/121


gandanya tentu intensitas akan lemah. Sehingga senyawa-senyawa

triterpen seperti asam ursolat, asam betulinat, kolesterol sulit tampak

dengan identifikasi fisis. Untuk memvisualkan bercak kromatografi

golongan terpenoid rantai panjang memerlukan derivatisasi dengan

penyemprotan vanillin, anisal dehida, serium sulfat kemudian

dipanaskan beberapa detik sehingga akan timbul warna dari kuning

hingga merah tua. Harap dicatat bahwa reaksi kimia seperti ini

terlalu umum.

Gambar 2.11 Vanilin dan anisaldehida, jika dengan bantuan asam sulfat

dan pemanasan 103 0C merupakan penampak bercak

umum untuk senyawa yang tidak nampak pada UV 254

atau 366 terutama turunan terpenoid: minyak atsiri,

senyawa terprenilasi, saponin bahkan steroidal/triterpen.

Secara spektroskopi proton NMR: karena terpenoid memiliki gugus

metil, maka jika dibaca pada spektra NMR akan tampak sinyal

tunggal tinggi pada geseran kimia (chemical shift ) antara δ 0.8

sampai sekitar 2 ppm. Atau jika terdapat gugus ekso metilen terminal

(=CH2) maka akan terdapat puncak sinyal tinggi tajam antara 5

sampai 5,6 ppm berupa doublet).

Soal latihan:

a. Sebutkanlah mengapa senyawa-senyawa berikut ini adalah

termasuk terpenoid dan masuk pada golongan tepenoid yang

mana?

O

H

OR

OR

Vanilin/Anisaldehid

Senyawa terpenoid

OH

H

OR

OR

H

Senyawa vanilin terpenoidal

103 0

C, 3 menit


31/121


b. Sebutkanlah mengapa Mengapa senyawa artemisinin obat

malaria dengan struktur ini termasuk terpenoid dan masuk

golongan terpenoid apa?

Arteminisin obat malaria dari Artemisin:

c. Termasuk golongan terpenoid apakah senyawa dengan

struktur berikut ?

O

O

HO OH

OH

O

6. Steviol

OH

CO2H

4. -kariofilen

3. Iridoid1. Citral

5. Heyneanol

7. Amrin

2. p-Cimen

HH

HO


32/121


Andrografolid dalam herba sambiloto:

Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang

satu atau kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict

rumus C2, C5, C9. Karena proses di alam oleh reaksi

enzimatis. Asal ciri utama memenuhi dan sesuai golonganmetabolit.

Golongan fenil propanoid C9) dan fenil metanoid C7)

Gambar 2.12 Podofilotoksin adalah senyawa anti kanker kulit diisolasi

dari spesies tumbuhan Podophyllum spp. Podofilotoksin

bahan baku obat kanker etopsida (Inzet) yang digunakan

untuk kanker paru, testes, limfoma dll.

Senyawa fenilpropanoid adalah senyawa memiliki kerangka

aromatik fenil (C6) dengan rantai samping propanoid (C3) sehingga jumlah total karbonnya adalah 9 dan disebut C9 atau fenil

propanoid dan kelipatannya.

Senyawa fenil propanoid terbentuk dari asam sikimat (Gambar

2.3 dan 2.11). Selain fenil propanoid, jalur asam sikimat

dihipotesiskan membentuk building block C7. Berbagai senyawa

golongan lignin, stilben, kumarin memiliki kerangka C9. Asam galat,

O

OH

OCH3

H3CO

O

O H

H

O

O

O

OO

HO

HO


33/121


struktur benzoik, berbagai polifenol (bukan jalur tunggal) terbentuk

dari struktur C7.

Golongan Fenil propanoid adalah adalah senyawa yang

memiliki aktifitas farmakologi luas seperti antikanker

(podofilotoksin), filantin berefek sebagai hepatoprotektor dan

stimulan kekebalan dalam tanaman meniran (Phyllanthus niruri ),

antiaterosklerosis (stilebenoid, resveratrol), antidiabetes

(sinamaldehide, terkandung dalam kulit kayu manis (Cinnamomum

burmani ), eugenol bahan antiseptik gigi diperoleh dari kuncup bunga

cengkeh (Syzygium aromaticum ). Berbagai bahan parfum atau aroma

aromaterapi merupakan senyawa fenil propanoid. Jadi minyak atsiri

disusun oleh golongan monoterpen, seskuiterpen, danfenilpropanoid.”

Gambar 2.13 Flowchart pembentukan senyawa dengan kerangka C9 dan

C7 atau disebut golongan fenil propanoid dan fenilmetanoid


34/121


Ciri-ciri senyawa fenil propanoid dan fenil metanoid:

1. Selalu memiliki kerangka inti fenil dan propanoid sehingga

disebut C9 dan kelipatannya misalnya 2 x C9, 3 x C9 dst. Jika

C7 maka memiliki kerangka benzil dan 1 rantai karbon

samping

2. Pada kerangka aromatik jika memiliki gugus hidroksil (-OH)

atau alkoksi (-OR) biasanya akan berada pada posisi para

terhadap rantai samping propanoidnya.

3. Jika terdapat lebih dari satu alkoksi (-OR) atau hidroksil (-OH)

maka akan berposisi orto.

Keberadaanya berlimpah pada tumbuhan namun terbatas pada

jamur dan belum ditemukan pada manusia atau vertebrata.

Golongan ini melewati starting material asam amino L-tirosin dan L-

fenilalalin yang merupakan asam amino esensial (manusia tidak

memiliki jalur biosintesis ini). Sehingga potensi toksisitas kecil pada

manusia.

Identifikasi senyawa fenil propanoid:

Secara kimia : reaksi umum untuk identifikasi fenil propanoid

tidak ada reagen khusus untuk identifikasi. Sedangkan keberadaanrantai samping propanoid atau gugus lain tentu tidaklah spesifik.

Tergantung dari berbagai gugus fungsional yang terikat. Jika

mengandung gugus hidroksil maka reagensia pengkopling semacam

FeCl2 yang berakibat warna larutan menjadi gelap.

Secara fisika : Senyawa ini biasanya jika dilihat di bawah sinar

UV 254 nm lempeng KLT silica gel254 akan mengalami pemadaman

fluoresensi (quenching). Khusus untuk golongan kumarin akan

memberikan flouresensi biru terang, sedangkan pada larutan

berflouresensi hijau. Adapun berbagai reagensia penciri gugus kimia

tentu tidak spesifik untuk mencirikan golongan fenilpropanoid.

Secara spektroskopi NMR. Tanda kurung di awal dan diakhir

alinea dibuang.: karena dipastikan memiliki kerangka aromatik,

biasanya proton pada aromatik akan memiliki geseran kimia antara δ

6 sampai 7 ppm. Pola pemecahannya mengikuti sistem ABX misalnya

dd (doublet of doublet ) atau double dengan coupling constant kecil

antara 1-3 Hz yang menunjukkan coupling meta. Diukur pada


35/121


karbon NMR maka akan terdapat sinyal karbon sebanyak enam

buah pada geseran kimia di atas δ 100 ppm. Sedangkan rantai

samping tergantung gugus yang diikat, jika membuat proton fenil

maka akan memberikan sinyal pada geseran kimia antara δ 4,5- 6

ppm, jika berupa proton alifatik maka akan berada di antara δ 1-2

ppm, jika terikat pada karbon yang mengikat oksigen maka akan

berada di antara δ 3-4 ppm.

Tugas: Identifikasilah termasuk golongan senyawa apa golongan

berikut ini!

Golongan alkaloid

Gambar 2.14 “Piculah Adrenalin mu! Adrenalin adalah salah satu

alkaloid yang diproduksi oleh makhluk vertebrata dari

asam amino tirosin. Adrenalin berfungsi mediator pada sel

saraf terkait rasa simpati dan kewaspadaan. Jadi tidaklah

betul alkaloid hanya terdapat pada tumbuhan melainkanhampir semua kingdom termasuk manusia.


36/121


Definisi alkaloid klasik menyatakan

bahwa semua senyawa metabolit sekunder

yang mengandung unsur nitrogen di dalam

kerangkanya. Alkaloid diklasifikasi-kan

berdasarkan asam amino prekursornya

dan di dalam kerangkanya masih memiliki

atom nitrogen.

Adapun senyawa dengan kerangka asetat, terpenoid, shikimat

yang mengalami aminasi (pemasukan atom N) bukanlah alkaloid

secara definisi khusus.

Senyawa alkaloid memiliki peran yang sangat besar di dalam

bidang kedokteran. Senyawa yang pertama kali diisolasi secara murniadalah morfin. Berbagai obat penting terutama obat syaraf adalah

alkaloid. Berbagai doping, bahan obat narkotik, kopi dikonsumsi

sehari-hari oleh manusia mengandung alkaloid yakni kafein, coklat

adalah alkaloid teobromin.

Namun secara dominan alkaloid adalah senyawa metabolit

sekunder yang berasal dari prekursor asam amino. Sehingga untuk

mempelajari alkaloid bisa ditelusuri berdasarkan building block atau

kerangka asam amino asalnya.

Golongan utama alkaloid:

alkaloid turunan ornitin

alkaloid turunan lisin

alkaloid turunan asam nikotinat

alkaloid turunan tirosin

alkaloid triptopan dan asam antranilat

alkaloid turunan histidin

alkaloid karena reaksi aminasi

Keberadaan dan fungsi alkaloid:

Keragaman struktur alkaloid sangat tinggi. Alkaloid berpotensi

sebagai sumber obat yang berlimpah dan berefek farmakologis

beragam. Sifat fisiko-kimia yang bersifat semipolar dan mampu

berinteraksi dengan membran sel. Kontribusi atom N di dalam

struktur memberikan efektifitas interaksi kimiawi dengan reseptor.

N C

O

OH

H

H

H

R


37/121


38/121


- Semua golongan dengan metabolit primer (terutama

monosakarida glukosa, rhamnosa, fruktosa)

- Semua metabolit sekunder juga bisa melakukan reaksi

halogenasi, sulfurasi, dan aminasi.

Soal latihan: (Harap dipahami bahwa jumlah karbon kurang satu

atau kelebihan satu dari rumus umum bisa terjadi)

1. Senyawa kavibetol merupakan senyawa marker pada daun

sirih (Piper bettle ). Merupakan senyawa golongan apakah

kavibetol?

2. Senyawa flavonoid adalah senyawa yang distribusinya sangat

luas pada berbagai familia dan spesies tanaman. Tersusun dari

kerangka apakah senyawa flavonoid?

3. Tetrahidrokanabinoid (THC) adalah senyawa aktif dalam

tanaman ganja (Cannabis sativa ). Senyawa ini berpotensi untuk

mengobati multiple sclerosis. Tersusun dari kerangka apa saja

golongan tersebut?

4. Dounorubisin disari dari jamur Streptomyces peucetius

digunakan untuk mengobati kanker leukemia limfosit dan


39/121


myeloid akut. Termasuk golongan apakah senyawa taxol dan

dounorubisin?

5. Kurkumin adalah bumbu dapur yang berkhasiat untuk

mencegah keganasan (malignansi) kanker. Termasuk golongan

apakah kurkumin?

6. Lunamarin adalah senyawa yang terdapat pada daun maitan

atau sanrego (Lunasia amara Blanco). Termasuk senyawa

apakah senyawa lunamarin dan tersusun dari building block

apa saja?

7. Jeruk purut atau Citrus hystrix kaya dengan kumarin salah

satunya ada eupecindatin. Termasuk building block apakah

senyawa tersebut?

8. Saponin terdistribusi pada bererapa spesies. Digoksin

merupakan saponin. Lerak untuk mencuci kain batik tulis juga


40/121


merupakan saponin. Tersusun dari kerangka apa sajakah

senyawa saponin dengan struktur di bawah ini?

9. Kapsisin adalah senyawa yang terkandung di dalam buah cabai

(Capsicum sp), selain bermanfaat untuk memberikan rasapedas pada sambal, kapsisin berefek sebagai pengurang nyeri

(analgetik). Merupakan senyawa apakah dan tersusun dari

kerangka apa senyawa kapsisin tersebut?

Penggolongan metode lain:

Sebagian ilmuwan lain mengklasifikasikan metabolit sekunder

berdasarkan keluasan distribusinya dan kelimpahannya di alam.

Penggolongan ini biasanya memiliki tujuan pragmatis namun tidak

terlalu spesifik untuk melakukan kuantifikasi dan digunakan untuk

melakukan estimasi kasar golongan senyawa yang kemungkinan

bertanggung jawab secara farmakologis. Golongan senyawa itu

adalah:

1.

Gol. Fenolik2. Gol. Flavonoid

3. Gol. Saponin

4. Gol. Minyak atsiri

5. Gol. Tannin

6. Gol. Alkaloid (terbatas pada beberapa genus)

7. Gol. Steroid


41/121


Namun dengan kemajuan kimia organik selama 30 tahun ini,

pembagian golongan umum ini sudah tidak terlalu relevan. Seorang

peneliti akan cukup mudah menelusuri pustaka terakit golongan

metabolit sekunder yang dikandung oleh suatu tanaman dan

menegasikan golongan yang tidak perlu dianalisis. Jika ditelusuri

ketujuh metabolit sekunder tersebut sudah tercakup dari kerangka

molekul C2, C5, C7, C9, alkaloid, atau kombinasi.

Pertanyaan:

1. Termasuk golongan metabolit sekunder apakah senyawa

fenolik, flavonoid, dan golongan tannin?. Bagaimana

hubungan kekerabatan mereka?2. Bagaimana hubungan kekerabatan antara saponin dengan

senyawa steroid?

3. Sebutkan komponen metabolit sekunder yang menyusun

golongan minyak atsiri?

4. Jelaskan kedudukan ketujuh golongan tersebut di dalam

khazanah metabolit sekunder?


42/121


BAB III

KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DAN

PEMILIHAN PELARUT

Target Pembelajaran: Pembaca diharapkan mampu memahami sifat

dasar metabolit sekunder dan memberikan overview pelarut yang

sesuai di dalam upaya ekstraksi.

Penggolongan metabolit sekunder berdasarkan kepolaran

secara tegas tidaklah tepat. Penggolongan metabolit sekunderberdasarkan polaritas sangatlah kaku sehingga tidak mutlak bisa

diterapkan. Sifat polaritas antar golongan metabolit sekunder

kebanyakan tidaklah berbeda secara dramatis. Untuk mengisolasi

dan memurnikan metabolit sekunder harus dipahami sifat dasar

molekul metabolit sekunder. Mayoritas metabolit sekunder bersifat

semi polar sehingga larut dalam pelarut organik. Metanol dan

asetonitril adalah pelarut organik paling polar. Heksana, benzana,

dan petroleum eter bersifat non polar. Hanya sebagian saja dari

metabolit sekunder bersifat polar dan larut dalam metanol atau air.

Kebanyakan metabolit yang larut metanol adalah senyawa glikosida

yang mengikat satu atau lebih molekul gula heksosa/pentosa.

Adapun kebanyakan golongan terpenoid bersifat non polar sehingga

larut ke dalam pelarut non polar dan semi polar. Namun untuk

monoterpen dan seskuiterpen masih mampu larut dalam metanol.

Metode kromatografi baik fase normal atau terbalik yang saat

ini diterapkan dan berkembang kebanyakan kompatibel dengan

senyawa semi polar. Sehingga senyawa yang sangat polar atau nonpolar tidak kompatibel dengan metode pemisahan kromatografi.

Begitu juga metabolit primer polisakarida, lemak, dan protein

tunggal dari bahan alam tidaklah tepat menggunakan metode

kromatografi konvensional. Demikian juga senyawa yang larut air

dan sangat larut metanol atau yang sangat non polar sangat sulit

memurnikan dan mengkarakterisasinya.


43/121


44/121


Solven Konstanta

dielektrik

ε)

Penggunaan

Kloroform 4,81 Untuk partisi terhadap air. Dicampur

metanol kadar rendah (5-20 %) untukfase gerak KLT fase normal. Selalu larut

dengan metanol berapa pun kadarnya.

Cukup toksik. Direkomendasikandiganti dengan diklorometan untuk

kromatografi kolom adapun KLT tidakmasalah. Dalam bentuk terdeutronasi

pelarut yang bersih untuk kebanyakan

senyawa semi polar-non polar.

Eter (dimetil

eter)

5,0 Toksik dan anestetik. Jika terpaksa

digunakan dengan rasio 1-4 terhadap

heksana digunakan sebagai fase gerakuntuk pemurnian dan pemisahan

dengan KLT. Dilakukan di lemari asam.

Etil asetat 6,02 Untuk partisi cair-cair dengan air.

Dilakukan setelah heksana. Dicampur

dengan heksana (0-100%) untuk fase

gerak kromatografi kolom. Dicampur

dengan kloroform atau diklorometana

untuk kromatografi kolom senyawa-senyawa non polar. Dilakukan sebelum

campuran heksana-etil asetat.

Asam asetat 6,15 Sedikit mengasamkan fase gerak pada

KLT pemisahan halus

Diklorometana 8,93 Untuk partisi cair-cair menggantikankloroform. Dicampur metanol kadar

rendah (5-20 %) untuk fase gerak KLT

fase normal.

n -butanol 17,8 Untuk partisi terhadap air setelah etil

asetat. Kadang dicampur sedikit asam

asetat atau asam lemah lain dan

dijenuhkan dengan air untuk analisis

KLT glikosida. Ditutup rapat. Baumengganggu pernapasan.

n -propanol 20,1 partisi cair-cair dengan air jika perlu

lebih halus ketika fraksi air setelah

dipartisi dengan n-butanol

Aseton 20,7 Ekstraksi senyawa semi polar. Kadang

dicoba dengan sedikit metanol untuk

KLT. Dalam bentuk terdeutronasi

sebagai pelarut semi polar NMR.

Etanol 25,3 Untuk ekstraksi awal simplisia baik

sendiri atau dicampur dengan air kadar


45/121


Solven Konstanta

dielektrik

ε)

Penggunaan

< 30%.

Metanol 33 Pelarut utama untuk ekstraksi simplisia.Campuran dengan aseton atau

asetonitril untuk fase gerak fase terbalik.

Rasio sangat kecil terhadap klorofomatau diklorometana untuk fase gerak

KLT fase normal.

Asetonitril 36,6 Dalam bentuk campuran dengan air

untuk fase gerak KLT fase terbalik dan

HPLC

DMSO 47,2 Pelarut untuk bioassay. Dalam bentuk

terdeutronasi sebagai pelarut NMR

Air 80 Pengekstraksi polar, membuat infusa,

membuat dekokta. Dalam bentuk

terdeutron sebagai pelarut NMR

Gambar 3.1 Diagram alur proses ekstraksi hingga diperoleh senyawa

aktif. Pengujian efek farmakologi harus dilakukan setiap

tahap. Sampel yang aktif yang diteruskan. Itulah inti dari

bioassay guided gractionation .


46/121


BAB IV

EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI

Target Pembelajaran: Pembaca mampu memahami alur pemurnian

mulai dari proses ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi. Mampu memilih

fase diam dan fase gerak dalam setiap tahap serta menentukan bobot

minimal yang harus dimiliki pada setiap proses.

Ekstraksi

Metode ekstraksi paling sederhana dan menjadi pilihan adalah

maserasi (perendaman). Yakni merendam material di dalam pelarut.

Maserasi (merendam dalam pelarut) adalah metode ekstraksi pilihan

pada tahap pendahuluan ataupun ekstraksi perbanyakan. Selain

karena simple juga tidak banyak gangguan fisis.

Adapun metode dasar yang lain seperti perkolasi, Shoxleat, gas

superkritikal, counter current chromatography, microwave dll

digunakan menyari bahan yang targetnya sudah jelas.

Tahapan ekstraksi melewati dua mekanisme dasar yakni:

Disolusi : proses terendamnya senyawa target oleh solven.Difusi : proses terbawanya senyawa-senyawa oleh solven keluar

sel atau matriks alami.

Agar solven bisa menjangkau tempat senyawa di dalam sel

atau ruang antar sel maka penyerbukan harus dilakukan. Serbuk yang

terlalu halus menyebabkan larutan keruh atau terbentuk dispersi

yang mengganggu kedua proses itu. Pembatas proses difusi adalah

gradien difusi yang mendekati ~1. Artinya kadar senyawa di dalam

pelarut dan di dalam material alami sama. Biasanya setelah 1 malamdiganti pelarut baru.

Pada pekerjaan skrining seringkali hanya dibutuhkan 1-10 gram

serbuk bahan untuk diekstraksi. Barulah jika setelah bioassay

diketahui sampel yang paling poten maka yang diperbanyak.

Bioassay secara in vitro modern hanya membutuhkan bobot ekstrak

sekitar 1 mg. Untuk mempercepat ekstraksi seringkali dikombinasi

dengan sonikasi 1 jam, menaikkan suhu 30-400C. Tidak perlu dalam

jumlah besar.


47/121


Polarisasi dan Depolarisasi

Konsep interaksi kimiawi pada ekstraksi, fraksinasi kasar, dan

sub fraksinasi berdasarkan derajat polaritas pelarut-pelarut. Di sisi

lain harus dimengerti bahwa tidaklah tepat mengandalkan konsep

kelarutan “like dissolves like ” belaka. Seseorang harus memiliki

pemahaman yang cukup dengan prinsip ikatan kimia dan batas

kelarutan. Tidaklah benar bahwa senyawa polar hanya larut di

dalam pelarut polar atau sebaliknya. Pada batas tertentu sekelompok

metabolit sekunder dapat mengalami polarisasi atau depolarisasi

pada suatu kuantitas pelarut berlebih sehingga terjadi peristiwa “like

dissolves unlike ”. Contohnya etanol dalam jumlah besar mampu

melarutkan glikosida (polarisasi ). Heksana yang bersifat non polardalam jumlah besar juga mampu menarik polifenol karena fenomena

depolarisasi. Untuk itulah pekerjaan pengawalemakan (defatting )

bukanlah pekerjaan yang dianjurkan karena menyebabkan cukup

banyak metabolit terlarut hilang. Contohnya senyawa xanton

(ksanton) kadar akan berkurang dari ekstrak jika heksana digunakan

untuk pengawalemakan ekstrak kulit manggis.

Interaksi Kimiawi

Konsep yang harus dikuasai adalah pada fase pemisahan halus

adalah interaksi antara fase diam, pelarut, dan analit. Pada fase diam

normal interaksi kimiawi yang paling penting adalah ikatan hidrogen

antara tiga komponen.

Untuk menghasilkan senyawa aktif secara farmakologis

diperlukan kerja yang sistematik dengan melakukan pendekatan

bioaktifitas. Untuk itu diperlukan target biologis yang sesuai sebagai

representai penyakit tertentu. Demikian pula pemilihan bahan hayati

dilakukan secara random (acak) dengan jumlah jenis sampel (spesies)banyak. Semakin banyak spesies yang diuji semakin besar peluang

untuk memperoleh bahan aktif yakni jumlah spesiesnya Untuk

pemilihan sampel secara random, sampel tidak harus pernah

dilaporkan untuk penyakit yang ingin diteliti. Di industri, sampel

random ini dilakukan secara HTS (high throughput screening) , yakni

penapisan dengan uji farmakologis secara cepat dengan jumlah stok

sampel sangat kecil (


48/121


penggunaan tradisional untuk penyakit yang sesuai

(etnofarmakologi) dari pengamatan empiris, data empiris dari

record , daftar obat tradisional atau dari publikasi, dan laporan

ilmiah. Bahkan bisa dari buku resep tradisional atau pustaka lokal

yang bisa dipertanggung jawabkan artinya tidak hanya 1-2 buku

resep saja.

Untuk isolasi skala proyek penelitian uji aktifitas in vitro lebih

sesuai karena akan menyesuaian jumlah fraksi yang dihasilkan.

Namun demikian harus selalu dipikirkan penyesuaian bobot sampel

yang tersedia jika ingin dilakukan uji secara in vivo / in vitro.

Dengan setiap langkah ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi

semua material selalu dipantau dengan pengujian aktifitasfarmakologis. Paradigma kerja ini disebut bioassay-guided

fractionation . Pendekatan ini menjadi standard dalam penemuan

obat baik dari bahan alam maupun sintesis.

Secara kuantitas ada tiga macam metabolit sekunder yakni

yang ditemukan sebagai senyawa utama (major compound ),

senyawa minor (minor compound ), dan senyawa kelumit (trace

compound )*.

Adapun perinciannya adalah sebagai berikut:

- Senyawa utama jika ditemukan dalam prosentasi lebih besar

dari 0,01 % dari berat simplisia(>100 mg/kg simplisia.

- Senyawa minor jika ditemukan dalam prosentase kurang dari

0,01-0,0001 % (75-20** mg/kg simplisia)

- Senyawa kelumit jika ditemukan dalam prosentasi kurang dari

0,0001 % (5-0,5 mg/kg simplisia)

* Berdasarkan limit of identification dengan NMR 400 MHz.

** Angka-angka ANTARA tidak eksak karena mempertimbangkan

kehilangan selama proses ekstraksi.

Pentingnya Dokumentasi

Pemastian spesies atau disebut otentikasi dengan

mengkonsultasikan kepada taksonomis jika merupakan spesies yang

bukan merupakan domain umum. Namun jika sudah jelas dan

merupakan public domain misalnya pohon jati (Tectona grandis ),


49/121


bawang merah (Alium cepa ), melinjo (Gnetum gnemon) tentu

mudah menentukan spesiesnya. Voucher atau contoh bagian

tanaman atau tanaman utuh (herba) wajib disimpan untuk

dokumentasi jika sewaktu-waktu untuk konfirmasi atau penelusuran

kembali demikian deskripsi tempat pengambilan sampel. Teknologi

dokumentasi elektronik pribadi juga bisa digunakan, misalnya

menyimpan dalam bentuk fotonya. Tanpa dokumentasi dan

otentikasi yang baik bisa menimbulkan keraguan hasil atau kesulitan

untuk memperoleh hasil yang sama.

Bahan Simplisia Crude Drug)

Untuk mendapatkan ekstrak yang poten dilakukan berdasarkan:1. Pendekatan data empiris: mengamati bahan yang secara

empiris memberikan efek positif pada penderita penyakit

tertentu.

2. Sampling random: sampel diseleksi dari berpuluh-puluh

(hingga ratusan) bahan hayati. Skrining haruslah dilakukan

sehemat dan seefisien mungkin. Era sekarang bioassay

didasarkan pada target molekul in vitro atau kultur sel yang

membutuhkan jumlah bahan uji sangat sedikit. Cukup

disediakan 1-10 gram bahan mentah. Semuanya dimaserasi

hingga didapatkan 1-10 mg ekstrak. Kemudian diuji pada dosis

tunggal misalnya mengacu 25 µ g/mL (replikasi atau triplikasi).

Sampel yang menunjukkan efek poten lalu ditentukan ED50

atau IC50-nya. Setelah diperoleh ekstrak paling poten maka

simplisia ekstrak yang paling poten tersebut diperbanyak

setidaknya 1 kg.

Saran: Untuk mahasiswa tingkat skripsi sebaiknya bekerja dalam

rangka untuk membuktikan data empiris atau dari 10 sampel

random. Untuk tesis sekitar 25 sampel agar lebih mungkin untuk

mendapatkan bahan poten. Adapun untuk tingkat desertasi

seharusnya menghasilkan karya yang sangat berbobot temuan baru

baik senyawa baru atau senyawa sangat poten untuk itu tingkat

disertasi diperlukan jumlah sampel yang jauh lebih banyak.


50/121


Ekstraksi dan Uji Farmakologi Pendahuluan

Untuk melakukan isolasi dan pemurnian metabolit sekunder

terlebih dahulu perlu diketahui apakah suatu ekstrak memiliki

aktifitas biologis yang menjanjikan. Untuk itu perlu dilakukan

farmakologis pendahuluan. Hal itu tidak terlepas dari model

penyakit yang diteliti atau dijadikan sasaran pengobatan. Sebagai

ketentuan umum ekstrak dikatakan memiliki aktifitas farmakologi

yang menjanjikan jika memiliki kemampuan hambat atau dosis

efektif lebih dari 75% populasi pada kadar 25 μ g/mL terhadap

aktifitas molekul (enzim/protein) penyebab penyebab penyakit, sel

kanker, bakteri atau jamur dengan Semakin kecil dosis efektif maka

semakin poten dan promising. Biasanya jika dosis efektif terlalu besarmaka tidak dilanjutkan. Beberapa peneliti melakukan eksepsi tetap

melakukan pemurnian pada spesies-spesies yang belum diketahui

kandungan metabolit sekundernya.

Gambar 4.1 Maserasi dilakukan 10 bagian pelarut: 1 bagian simplisia.

Misal 1 kg bahan dalam 10 L metanol.

Pada era sekarang, pada dasarnya isolasi senyawa dari bahan

alam tidaklah sulit terlebih jika targetnya adalah major compound

(senyawa utama). Akan tetapi untuk melakukan isolasi terlebih

dahulu perlu dipahami sifat-sifat bahan secara umum. Biasanya

bahan yang berasal dari ekstrak daun adalah paling sulit untuk


51/121


mendapatkan senyawa dikarenakan matriks nabati dan kompleksnya

jaringan. Material yang berupa ekstrak dari biji atau rimpang-

rimpangan tentu lebih sederhana dan jauh lebih mudah untuk

mendapatkan senyawa. Demikian bahan dari kayu memiliki jaringan

dan kerumitan kandungan metabolit yang lebih sederhana

dibandingkan organ daun. Sehingga beberapa peneliti ada yang

secara pragmatis menghindari penggunaan daun.

Berikut ini adalah sifat-sifat bahan secara umum:

(Adapun pertimbangan utama pemilihan harus didasarkan

pada sejauh mana potensi sampel terhadap target).

Organ Keuntungan Kerugian

Daun Biasanya organ daun memiliki

ketersediaan material yangtinggi.

Keragaman golongan meta-bolit sekunder di dalam daun

bermacam-macam mulai dari

yang non polar seperti

steroid,triterpene. Semipolar

seperti flavonoid hingga se-nyawa polar seperti polifenol

dan glikosida atau terpenoid

terhidroksilasi.

Kompleksitas jaringan dan

matriks nabati paling kom-pleks dan kandungan kimia

sangat beragam sehinggamempersulit pemisahan.

Kandungan asam lemak

tinggi sehingga paling sulit

dalam preparasi.

Defatting dengan pelarutheksan atau petroleum eter

bisa dilakukan namun perlu

diwaspadai kehilangan se-

nyawa yg larut pada solventersebut (depolarisasi).

Cukup sulit mendapatkan

isolat metabolit sekunder

dalam jumlah banyak dan

beragam.

Jika isolasi metabolit se-

kunder maka harus berhati-hati adanya positif palsu

yang disebabkan oleh asam

lemak.

Buah Matriks nabati dan jaringan

sel tidak terlalu kompleks.Target metabolit semi polarmudah lebih mudah di-

pisahkan.

Pembuatan simplisia ribet

karena harus diiris dirajangdan butuh waktu penge-ringan lebih lama.

Kandungan metabolit se-

kunder lebih rendah. Butuhbobot simplisia banyak.


52/121



Kebanyakan berisi metabolit

primer (karbohidrat) bersi-

fat polar larut metanol atauair. Kromatografi fase

normal atau terbalik tidak

terlalu kompatibel dan bisadiaplikasikan.

Keberadaan asam lemakkadang mengakibatkan po-

sitif palsu pada beberapa uji

farmakologi yang bertarget

protein/enzim

Kayu Jaringan lebih sederhana dari

daunMudah mendapatkan senya-

wa semipolar seperti senyawa

golongan fenil propanoid dan

modifikasinya yaknia lignan

dan juga terpenoid kompleks.

Tergantung spesies dan

familinya jaringan kayumengandung alkaloid.

Biasanya adsorben untuk

pemisahan dengan kolom

silika dengan sistem solven

kombinasi antara heksana

dengan etil asetat.

Kulit buah Jaringan lebih sederhana dari

daun.

Mudah mendapatkan senya-

wa semi polar seperti xanton,

polifenol dan terpenoid

Biji Jaringan termasuk paling

sederhana

Meskipun jaringan biji seringmengandung karbohidrat danasam lemak. Dengan peng-

ekstraksi etanol atau etilasetat atau diklorometana

(CH2Cl2) karbohidrat akan

minimal.


wa golongan terpenoid,lignan


53/121



Bunga Mudah mendapatkan senya-

wa golongan pilifenol,

flavonoid dan modifikasinya

Negatif palsu, hati-hati

dengan senyawa berwarna

yang menggangu ujibioassay dengan metode

kolorimetri

Rimpang Matriks tidak kompleks

dengan karbohidrat rendah


wa golongan fenil propanoid,terpenoid seperti seskuiterpen

atau diterpen dan polifenol

glikosida

Propolis,

sarang

serangga,

bekatul,

dan

metabolit

binatang

Matriks dan residu nabati

tidak kompleks

Kandungan kimia bervariasi

tergantung geografi. Konse-kuensinya bisa berbeda

potensi aktifitas farma-

kologisnya.

dll

Ekstraksi

Ekstrak/sari adalah material hasil penarikan oleh pelarut air

atau pelarut organik dari bahan kering (dikeringkan). Hasil penyarian

tersebut kemudian pelarutnya dihilangkan dengan cara penguapan

dengan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental jika

pelarutnya pelarut organik. Jika pelarutnya air, pada tahap akhir

dilakukan penghilangan total dengan cara liofilisasi menggunakan

alat freeze dryer . Hasil liofilisasi akan berupa serbuk. Akan tetapi

teknologi liofilisasi di Indonesia tergolong komersial dan sangat

mahal serta terbatas dimiliki institusi ilmiah di Indonesia. Untuk itu,

cara lain bisa ditempuh dengan pengentalan dengan waterbathdengan temperature kurang dari 60 0C.

Metanol, etanol 70 %, dan etanol 96% adalah pelarut pilihan

utama untuk mengekstraksi metabolit sekunder yang belum diketahui

strukturnya dan untuk tujuan skrining. Ketiga pelarut ini memiliki

extracting power (daya ekstraksi) yang luas sehingga semua

metabolit sekunder tersari dalam tiga kali maserasi. Jika tujuannya

mengisolasi dan memurnikan senyawa target sudah jelas bisa

menggunakan pelarut organik lain (butanol, etil asetat, kloroform,


54/121


aseton, atau heksana) yang memiliki sifat ekstraksi terbaik (melalui

trial and error dan dipantau dengan plat KLT atau HPLC atau

densitometer dengan detektor UV/Vis). Tujuan pemurnian tertarget

tersebut dinamakan dereplikasi.

Biasanya ekstraksi dilakukan dengan maserasi atau perendaman

bahan dengan pelarut terpilih karena maserasi merupakan cara

ekstraksi yang paling mudah dengan rendemen ekstraksi tinggi.

Seringkali maserasi dikombinasi dengan digesti dan refluk selama 1-2

jam dengan suhu 40-60 0C untuk untuk meningkatkan efisiensi

penyarian. Biasanya ekstraksi dilakukan 2-3 kali atau sampai material

tidak mengandung senyawa terlarut lagi (dicek dengan KLT dan

lampu UV 254/366 nm). Jika penggunaan tradisional, masyarakatsecara turun temurun menggunakan bahan dengan cara direbus atau

dekok maka pelarut yang digunakan adalah air dengan cara merebus

atau mendekoktasi. Namun jika uji pendahuluan dilakukan secara

skrining pada berbagai material maka ekstraksi menggunakan pelarut

metanol atau etanol 70 % atau etanol 96 % (dalam air). Bobot

simplisia yang digunakan untuk skrining farmakologis sebanyak 10-

100 gram. Berdasarkan penelitian, ketiga jenis solven itu memiliki

ekstraktabiliti terbaik. Hampir semua metabolit sekunder akan

terlarut sempurna oleh ketiga solven tersebut dengan maserasi tiga

kali. Metode ekstraksi lain seperti perkolasi, perkolasi

berkesinambungan, gas superkritis dll bukanlah metode terpilih

untuk ekstraksi pendahuluan. Metode-metode ekstraksi tersebut

lebih tepat menjadi topik pembahasan untuk aplikasi industri atau

perbanyakan rendeman atau scaling up .

Adapun pelarut organik etil asetat, butanol,

diklorometan/kloroform, dan heksana lazim digunakan untuk tahap

fraksinasi dengan metode partisi cair-cair atau enap tuang (padat-cair). Penggunaan langsung salah satu jenis pelarut organik itu juga

tidak bisa disalahkan asal cukupnya pertimbangan pustaka.

Jika skrining telah dilakukan dan menunjukkan salah satu

sampel aktifitas poten maka dilakukan pekerjaan isolasi. Untuk

tujuan isolasi direkomendasikan bobot bahan simplisia awal

sebaiknya minimal 1 kg agar peluang mendapatkan senyawa aktif

farmakologis secara secara kualitatif maupun kuantitatif lebih tinggi.


55/121


Seringkali (hampir selalu) tahap fraksinasi belum mendapatkan

senyawa tunggal. Fraksinasi tahap II biasanya dilakukan dengan cara

kromatografi kolom. Kromatografi kolom pilihan utama adalah fase

normal. Kemudian jika masih belum mencapai target dilakukan

fraksinasi tahap ke III dengan fase terbalik. Kromatografi permeasi

dengan fase diam polisakarida sering dilakukan setelah fraksinasi

tahap II.

Fraksinasi Kasar

Fraksinasi dengan Partisi

Ekstrak (metanol, etanol 70%, atau etanol 96%) yang

diperoleh masih kasar dan sangat kompeks isinya. Untuk itu perludilakukan fraksinasi cair-cair atau partisi.

Lazimnya untuk ekstrak metanol atau etanol 70% dilarutkan

ke dalam air hingga tepat larut. Kemudian dipartisi bertingkat mulai

dari:

1. Butanol

2. Etilasetat

3. Kloroform/diklorometana

4. Heksan

Sebaiknya heksana digunakan terakhir untuk mencegah

pengambilan metabolit sekunder yang kurang selektif.

Untuk semua pelarut organik akan berada fase atas kecuali

kloroform akan berada di bawah air.

Masing-masing fraksi kental harus diperoleh setidaknya 10 gram agar

bisa dilakukan tahap fraksinasi lanjut. Selain itu semua fraksi partisi

tersebut juga harus segera diuji kembali aktifitasnya.

Catatan: Gunakan corong pisah yang berbentuk buah pear/lebih

bulat untuk mempartisi dua pelarut yang tetapan dieliktrikumnya

sangat berbeda (polaritasnya sangat beda misal air dengan heksana).

Corong pisah yang berbentuk lebih memanjang digunakan untuk dua

pelarut yang polaritasnya berdekatan misalnya air dengan butanol


56/121


Gambar 4.2 Diagram partisi cair-cair. Ekstrak kering dari metanol atauetanol berair dilarutkan terlebih dahulu dalam air. Heksana,

kloroform, etil asetat, dan butanol adalah yang digunakan

untuk mempartisi. Selain kloroform pelarut organik selalu

di lapisan atas air.

Setelah mendapatkan ekstrak kental atau ekstrak kering maka

dilakukan pemisahan kasar dari ekstrak berdasarkan tingkat

polaritasnya yakni mulai dari non polar, semi polar dan polar.Fraksinasi biasanya dilakukan untuk ekstrak pola: air, metanol atau

etanol 70%.

Fraksinasi ekstrak air bisa dilakukan dengan cara partisi atau

pelarutan pada solven organik. Jika fraksinasi dilakukan secara

partisi, ekstrak air dilarutkan kembali dengan air pada volume tepat

larut kemudian dilakukan partisi secara berturutan dengan butanol,

etil asetat, diklorometana atau heksana jika perlu. Partisi

menggunakan alat corong pisah (separatory funnel ). Jika fraksinasi

dilakukan dengan cara pelarutan maka ekstrak air dilarutkan secara

berturutan dengan metanol, etilasetat dan diklorometan atau

heksana. Pelarutan cukup dilakukan dengan menggunakan alat

berbahan gelas, bahan yang larut dipisahkan dan prosedur diulangi

2-3 kali. Semua fraksi yang dihasilan dipantau potensinya dengan uji

farmakologi.


57/121


Kasus yang sama bisa dilakukan untuk ekstrak metanol dan

ekstrak etanol 70%. Partisi untuk ekstrak metanol sebaiknya

ditambahkan air 1-2% untuk meningkatkan efektifitas pemisahan.

Jika ekstraksi dilakukan secara langsung dengan menggunakan

kloroform atau diklorometana atau heksana biasanya tidak

dilakukan fraksinasi karena pelarut-pelarut ini biasa digunakan untuk

mengekstraksi kayu dan kulit buah. Pada sampel tersebut lemak

pengganggu atau sakarida tidak terlalu banyak. Sehingga setelah

kering bisa langsung dilakukan kromatografi kolom. Meskipun

metanol seringkali juga digunakan untuk mengekstraksi bahan-bahan

tersebut.

Mengapa fraksinasi pada ekstrak air penggunaan pelarutdiklorometan atau heksana jika perlu saja?.

Tidak semua fraksi yang diperoleh harus dilanjutkan untuk

purifikasi. Hanya fraksi yang prospektif saja yakni memiliki aktifitas

farmakologi cukup tinggi saja yang dilanjutkan. Misal jika kita telah

memperoleh berbagai fraksi metanol, fraksi etil asetat, fraksi

diklorometan, fraksi heksana dan residu, untuk itu wajib dipantau

aktifitas biologisnya. Untuk itu, uji farmakologi wajib dilakukan

untuk memandu/memilih bahan mana yang layak untuk dilanjutkan.

Selain itu juga harus memperhatikan bobot fraksi kering yang ada.

Pengentalan/Pengeringan:

Pada dasarnya pengeringan dilakukan setelah tiap tahap

ekstraksi, fraksinasi, dan pemurnian. Ada beberapa metode

pengeringan:

1. Diuapkan di atas water bath (penguapan): Baik sistem terbuka

maupun tertutup. Sistem tertutup mencegah solven meracuni

ke mana-mana2. Diuapkan dengan rotaroy evaporator : Digunakan untuk semua

pelarut organik. Tidak cocok untuk bahan berair. Air

membutuhkan waktu penguapan yang sangat lama. Saat ini

beredar multirotaroty evaporator . Lebih efisien karena enam

sampel dikeringkan bersamaan.

3. Liofilisasi (freeze dryer ): Digunakan untuk bahan yang berair

tidak untuk pelarut organik.


58/121


4. Dialiri dengan gas N2: Untuk bahan yang termolabil, harga

mahal, jumlah rendemen kecil.

Pada tahap ekstraksi, fraksinasi, atau sub fraksinasi dengankromatografi kolom akan dihasilkan sekitar 50 botol dengan volume

sekitar 100 ml fraksi, kemudian dipekatkan dengan cara evaporasi.

Pekerjaan pada tahap ini sangat ribet karena jumlah sampel yang

sangat banyak. Untuk mempermudah pekerjaan beberapa peneliti

membiarkan sampel-sampel di dalam fume hood (lemari asam)

sampai beberapa hari, ada yang mengeringkan dengan suatu

rotatory evaporator berhari-hari. Alat terbaru untuk meringkas

pekerjaan adalah dengan multi evapora

Documents

Senyawa Alam Metabolit Sekunder