SEPARAREA

CELULELOR

CRITERII DE SEPARAREProprietati fizice:Dimensiuni (filtrare, centrifugare)Densitate (centrifugare in gradient de densitate)Dispersia luminii (citometrie de flux)

Proprietati biochimice:Markeri de suprafata specificiMarkeri citoplasmatici

SEPARAREA CELULELORPurificarea unor celule de interesSelectie negativa:~ DepletieIndepartarea celulelor nedoriteSelectie pozitiva:~ PurificarePastrarea celulelor dorite

CONDITII DE FIABILITATEPastreaza integritatea celulelorNu altereaza statusul de activitate al celulelorRapida (evitarea leziunii celulare)Eficienta

PROPRIETATIYield = (numar de celule dorite din solutia rezultata) / (numar de celule dorite din proba initiala)

Puritate = (numar de celule dorite din solutia rezultata) / (numar total de celule din solutia rezultata)

PROPRIETATINin = CDin + CNinNout = CDout + CNoutYield = CDout / CDinPuritate = CDout / NoutSepararea celulelorInOut

METODE DE SEPARAREPe baza diferentelor de densitate:Separarea mononuclearelor prin sedimentare libera in mediu cu DextranSepararea mononuclearelor pe gradient de densitatePe baza proprietatilor biologice:Separarea mononuclearelor pe baza aderentei la suprafete de plasticPe baza markerilor de suprafata specifici:Sortarea cu citometrul de flux

DIFERENTE DE DENSITATEUtilizate frecvent pentru celule sanguine (hematii, PMN-uri, celule moarte) deplasare mai rapida in camp gravitational (limfocite, monocite) deplasare mai lentaMetode diferite:Acceleratia gravitationala / centrifugaSedimentare libera / gradient de densitate

SEDIMENTARE LIBERA IN MEDIU CU DEXTRANSange heparinat : Dextran 50% = 3:1Se incubeaza 1 ora la 37C2 straturi:Superior: mononucleare (limfocite, monocite)Inferior: eritrociteSe recolteaza stratul superior cu o pipetaDezavantaje:Separare grosieraPuritate micaAvantaje:Ieftina

SEPARAREA PE GRADIENT DE DENSITATEGradient de densitate = mediu cu masa moleculara mare, care functioneaza ca un separator permite trecerea particulelor mici si grele (nu si a celor mari si usoare)Ficoll-Hypaque Ficoll-OdistonSepcel

SEPARAREA PE GRADIENT DE DENSITATESe introduce gradientul intr-un tub de centrifugaSangele heparinat se prelinge in tubSe centrifugheaza4 straturi:Plasma + trombociteMononucleare - limfocite (buffy coat)GradientHematii, PMN-uri, celule moarte

FICOLL-HYPAQUESangeFicoll-HypaquePlasma + trombociteLimfociteFicoll-HypaqueHematii, PMN-uriHematii, PMN-uriLimfociteFicoll-Hypaque

FICOLL-HYPAQUE

MARKERII DE SUPRAFATARozetarea: Suspensia de mononucleare obtinuta in gradient de densitate + hematii de oaie agregate de LT care cuplau hematiile de oaie prin CD2Dezavantaje:Lipsa de stabilitate a rozetelor (se desfac la centrifugare)Numar mic de celule

SORTAREA CELULELORSepararea unei (sub)populaii celulare dintr-un amestec:MrimeGranularitateAntigene de suprafaCelule (in suspensie) + AcM (specifici unui marker de suprafata si marcati fluorecent)

ETAPEMarcarea cu AcM+fluorocromiIdentificarea celulei e de interes?ncrcare cu sarcini pozitive/negative/frCmp magnetic deflectare spre tuburi colectoareCentrifugare (aducere la concentratia dorita)

SORTAREA CELULELORLASER 488 nm-Plci ncrcatemagneticTuburi de colectareSenzor FSDetector de fluorescen

APLICATIIIndepartarea celulelor tumorale in transplantul autolog de celule stemIndepartarea fibroblastilor care contamineaza o biopsie de cartilajSelectia de hepatociteSelectia de celule hematopoetice CD34+

TRANSPLANTUL ALOGEN DE CELULE STEM

TESTUL DE PROLIFERARE LIMFOCITARAActivarea limfocitara = proces fiziologic care survine in urma contactului dintre un limfocit si Ag specificBlastogeneza = limfocite limfoblastiSinteza de fosfolipidePermeabilitate la cationii divalentiActivarea adenilat ciclazei AMPc intracelularSinteza de ADN, ARN, proteine

ACTIVAREA LIMFOCITARATest in vitroMasoara capacitatea functionala a LB si LT de a raspunde la stimularea AgStabilirea imunitatii in:ImunodeficienteSindroame autoimuneBoli infectioaseTumori

MITOGENI SI ANTIGENEMitogen = substanta care activeaza nespecific o paleta larga de clone limfocitareMai frecvent mitogeni:Raspuns rapid, intens, usor de cuantificatFitohemaglutinina, pockweed mitogen, proteina A stafilococica, streptolizina SAntigene:Activeaza doar limfocitele specificePPD, Ag Candida, streptokinaza, toxoid tetanic, virus Vaccinia, virus Herpes simplex

ACTIVAREA LIMFOCITARASe recolteaza buffy coatSe aduce la 106 celule/mlSe adauga mitogen/antigenSe incubeaza2 eprubete in paralel: 1 stimulat, 1 nestimulat

CUANTIFICAREA PROLIFERARII LIMFOCITAREProportia blastilor in populatia de limfociteFazele ciclului celular:G0: faza de repaus, ADN ~ 2nG1: faza de activare, ADN ~ 2nS: faza de sinteza, ADN ~ 2n 4nG2: faza premergatoare mitozei, ADN ~ 4nM: mitoza ADN ~ 4nStare de repaus ADN ~ 2nStare activata ADN ~ 4n

CUANTIFICAREA PROLIFERARII LIMFOCITARESe lizeaza membrana celulara suspensie de nucleiADN + propidium iodid (fluorocrom)Se analizeaza proba la citometrul de fluxGraficIndicele de proliferare (IP)S + G2/MG0/G1 + S + G2/MIP =X 100

ANALIZA ADNG2MG0G1s0 200 400 600 8001000sCantitatea de ADNEvenimente

ANALIZA ADN0 200 400 600 8001000Fluorescen PE2N4NEvenimente