SKRINING DAN ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI DARI … · Isolasi metabolit bioaktif dengan menggunakan silica gel mesh 70 – 230 sebagai fase diam dalam kromatografi kolom yang

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRINING DAN ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI DARI ISOLAT AKTINOMISETES

INDIGENUS INDONESIA

SKRIPSI

DYAH MUNDIR SARI NIM. 109102000048

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA OKTOBER 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRINING DAN ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI DARI ISOLAT AKTINOMISETES

INDIGENUS INDONESIA

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

DYAH MUNDIR SARI NIM. 109102000048

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA OKTOBER 2013

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Dyah Mundir Sari

NIM : 109102000048

Tanda Tangan :

Tanggal : 2 Oktober 2013

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING


NIM : 109102000048

Program Studi : Farmasi

Judul : Skrining dan Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri dari Isolat

Aktinomisetes Indigenus Indonesia

Menyetujui,

Pembimbing I

Dr. Andria Agusta NIP : 196908161994031003

Pembimbing II

Lina Elfita, M.Si., Apt NIP : 197312122011012002

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt

v

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Dyah Mundir Sari NIM : 109102000038 Program Studi : Farmasi Judul : Skrining dan Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri dari Isolat


Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Dr. Andria Agusta ( )

Pembimbing II : Lina Elfita, M.Si., Apt ( )

Penguji I : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt ( )

Penguji II : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt ( )

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 2 Oktober 2013

vi

ABSTRAK

Nama : Dyah Mundir Sari Program Studi : Farmasi Judul : Skrining dan Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri dari Isolat


Aktinomisetes merupakan salah satu jenis mikroorganisme yang penting sebagai penghasil metabolit sekunder untuk pengobatan, khususnya antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk penapisan beberapa isolat aktinomisetes sebagai penghasil senyawa antibakteri dan mengisolasi senyawa aktif tersebut, serta menguji potensi aktivitasnya. Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi dengan bakteri uji Gram positif (Staphylococcus aureus) dan Gram negatif (Escherichia coli). Isolasi metabolit bioaktif dengan menggunakan silica gel mesh 70 – 230 sebagai fase diam dalam kromatografi kolom yang dielusi dengan kloroform : etanol (10:1), yang dilanjutkan dengan kolom menggunakan Sephadex dengan fase gerak etanol 96%. Dari hasil skrining menunjukkan bahwa 5 isolat dari 15 isolat yang telah dilakukan skrining, aktif dalam menghambat bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Salah satu isolat yang aktif adalah InaCC A 75, yang telah dilakukan scaling up dalam 2L medium Actino 1. Selanjutnya difraksinasi dan menghasilkan fraksi F4.2 (7,5 mg) sebagai senyawa murni dan fraksi 5.4 (2,4 mg). Kedua senyawa tersebut dilakukan uji antibakteri lebih lanjut untuk mengetahui konsentrasi hambat minimum dengan metode mikrodilusi cair. F4.2 dapat menghambat Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan nilai MIC (Minimum Inhibitory Concentration) yang didapat 64 µg/mL dan ≥ 128 µg/mL, sedangkan nilai MIC F5.4 lebih besar dari 128 µg/mL untuk kedua bakteri. Namun hasil MIC tersebut tidak lebih besar daripada kontrol positif antibiotik kloramfenikol dan eritromisin. Kata Kunci : aktinomisetes, bioautografi, antibakteri, metabolit aktif, MIC

vii

ABSTRACT

Name : Dyah Mundir Sari Program Study : Pharmacy Title : Screening and Isolation of Antibacterial Active Compounds

from Isolates of Actinomycetes Indigenous Indonesia Actinomycetes is one of the important types of microorganisms as producers of secondary metabolites for drug, especially antibacterial. This study aims to screen isolates of actinomycetes which can produce antibacterial compounds, isolate the active compounds, and also test the potential of their activity. A activity assay was performed by using bioautography method against Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus) and Gram-negative (Escherichia coli). Isolation of bioactive metabolites was carried out on silica gel 70 – 230 mesh coloumn chromatography eluted with chloroform : ethanol (10:1), followed by Sephadex LH 20 column eluted with ethanol 96%. The result showed that 5 isolates out of 15 Actinomycetes were active against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. One of the active isolates, InaCC A 75, was scalled up in 2L of actino 1 medium. Furthermore, it was fractionated and resulted in F4.2 (7.5 mg) as pure compound and fraction 5.4 (2,4 mg). Both compounds were tested further in order to determine the antibacterial minimum inhibitory concentrations by microdilution method. F4.2 inhibited growth of Staphylococcus aureus and Escherichia with MIC value of 64 µg/mL and ≥ 128 µg/mL, respectively, MICs value of F5.4 were more than 128 µg/mL for both tested bacteria. However, those MICs value were still smaller than that of positive controls, chloramphenicol and eritromisin. Keywords : actinomycetes, bioautography, antibacterial, active metabolite, MIC

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT atas segala nikmat dan

karunia-Nya sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi

dengan judul Skrining dan Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri dari Isolat

Aktinomisetes Indigenus Indonesia. Shalawat serta salam selalu tercurah kepada

baginda Nabi Muhammad SAW yang membawa petunjuk bagi umat manusia,

semoga kelak kita mendapatkan syafaat beliau.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

sarjana farmasi di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Saya menyadari bahwa keberhasilan penelitian dan penyusunan skripsi ini

tidak lepas dari bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,. Oleh karena itu, pada

kesempatan kali ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Dr. Andria Agusta selaku pembimbing pertama dan Ibu Lina Elfita,

M.Si., Apt selaku pembimbing kedua, yang senantiasa dengan kesabaran

memberikan arahan, dorongan, semangat, saran dan solusi kepada penulis

selama melaksanakan penelitian dan penyusunan skripsi ini.

2. Kementrian Agama RI selaku pemberi beasiswa, sehingga penulis dapat

menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Prof. Dr. (hc) dr. M.K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitar Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

ix

6. Bapak Arif Nurkanto, M.Si, Ibu Dra. Yuliasri Jamal, M.Sc, Ibu Dra.

Praptiwi, Kang Asep, Mas Toni, Teh Dewi Wulansari, Mbak Dewi dan

Kak Mustofa yang membantu dalam proses penelitian.

7. Kedua orang tua yang selalu memberikan kasih sayang, terkhusus ibu

Sumiati yang doanya tidak putus di setiap tengadah tangan dan dukungan

baik moril maupun materil. Tiada apapun didunia ini yang dapat membalas

semua kebaikan, cinta dan kasih sayang yang telah kalian berikan, serta

nenek yang do’anya tiada henti.

8. Tante sebagai teman curhat serta adik – adikku tersayang Muhammad Ali

Fazain, Harmanto Aji Darmawan, Fingkan Churina Sari dan Almas Aditya

Nabil yang memberikan semangat tersendiri melalui cara yang berbeda.

9. Farichah Mansuroh sebagai sahabat serta saudara yang selalu menemani

disaat senang maupun susah, yang bersabar menunggu dan selalu

membantu disaat yang tepat dan Agung Priyanto yang selalu mengerti dan

memberi dukungan.

10. Sahabat-sahabat terbaik Ainul, Nurul, Neneng, Emma, Nuyung, Leli, Fina,

Zaky, Ferry, Yunita, Puput yang selalu menjadi teman terbaik, saudara –

saudara CSS MoRA 2009 (Community Santri Scholar of Ministry of

Religious Affair), teman-teman seperjuangan Farmasi 2009, serta keluarga

dan sahabat D’fushie.

11. Keluarga besar Amanatul Ummah

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak keterbatasan dan

kekurangan. Oleh Karena itu, dengan segala kerendahan hati, saya sangat

mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini.

Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan memberi

sumbangan pengetahuan khususnya di Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu kesehatan, Universtas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta dan pembaca pada umumnya.

Jakarta, 2 Oktober 2013

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta, Saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 109102000048

Program studi : Farmasi

Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK)

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya

ilmiah saya dengan judul

SKRINING DAN ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI DARI

ISOLAT AKTINOMISETES INDIGENUS INDONESIA

untuk dapat diakses melalui Digital Library Perpustakaan Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas

sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Dengan demikian persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal : 2 Oktober 2013

Yang menyatakan,

(Dyah Mundir Sari)

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ v

ABSTRAK ........................................................................................................... vi

ABSTRACT ........................................................................................................ vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................... x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv

BAB 1.PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang . ................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah . ............................................................................ 3 1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................... 3 1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................. 3

BAB 2.TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 4

2.1 Aktinomisetes . .................................................................................... 4 2.1.1 Taksonomi Aktinomisetes . ........................................................ 4 2.1.2 Penyebaran Aktinomisetes . ....................................................... 5 2.1.3 Peran Aktinomisetes . ................................................................. 5

2.2 Metabolit Sekunder ............................................................................ 7 2.3 Bakteri Patogen . ................................................................................. 8

2.3.1 Staphylococcus aureus . ............................................................. 8 2.3.2 Eschericia coli . .......................................................................... 8

2.4 Metode Skrining ................................................................................. 9 2.4.1 Metode Difusi . ........................................................................... 10 2.4.2 Metode Dilusi . ........................................................................... 10 2.4.3 Metode Bioautografi . ................................................................ 11

2.5 Kromatografi .................................................................................... 13

BAB 3.METODE PENELITIAN ...................................................................... 16 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 16 3.2 Alat dan Bahan ................................................................................... 16

3.2.1 Alat . ........................................................................................... 16 3.2.1 Bahan . ........................................................................................ 16

3.3 Prosedur Kerja .................................................................................... 17

Halaman

xii

3.3.1 Peremajaan Isolat Aktinomisetes ............................................. 17 3.3.2 Kultivasi Aktinomisetes ........................................................... 17 3.3.3 Ekstraksi Kultur Aktinomisetes ............................................... 18 3.3.4 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri ......................... 18

3.3.4.1 Persiapan Bioautografi . ............................................... 18 3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri . ...................................... 18 3.3.4.3 Pembuatan Larutan Kloramfenikol . ............................ 19 3.3.4.4 Persiapan Plat KLT . ..................................................... 19 3.3.4.5 Uji Bioautografi Nonelusi Antibakteri . ....................... 19 3.3.4.6 Bioautografi Elusi . ....................................................... 19

3.3.5 Identifikasi Bakteri Uji . ........................................................... 20 3.3.6 Scaling Up InaCC A75 dalam Medium Actino 1 ..................... 20

3.3.6.1 Pembuatan Medium Kultivasi ..................................... 20 3.3.6.2 Kultivasi Aktinomisetes .............................................. 20 3.3.6.3 Ekstraksi Kultur Hasil Scaling Up ................................ 21

3.3.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif Ekstrak InaCC A75 . .... 21 3.3.8 Penentuan Nilai MIC . ............................................................... 21

3.3.8.1 Persiapan Medium . ...................................................... 21 3.3.8.2 Persiapan Sampel Uji ................................................... 22 3.3.8.3 Persiapan Kontrol . ....................................................... 22 3.3.8.4 Pesiapan Suspensi Bakteri . .......................................... 22 3.3.8.5 Pengenceran Suspensi Bakteri . .................................... 23 3.3.8.6 MIC (Minimum Inhibitory Concentration) .................. 23

BAB 4.HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 25

4.1Kultivasi dan Ekstraksi ........................................................................ 25 4.2 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri ................................... 28 4.3 Scaling Up A75 dalam Medium Actino 1 ........................................... 33 4.4 Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif Ekstrak A75 ........................... 35 4.5 Penentuan Nilai MIC........................................................................... 39

BAB 5.KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 41

5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 41 5.2 Saran ................................................................................................... 41

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 42

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Klasifikasi Metode Mikrobiologi ...................................................... 9 Gambar 4.1 KLT Ekstrak Kultur Medium YSB dan Actino 1 ............................. 28 Gambar 4.2 Hasil Skrining Antibakteri ................................................................ 30 Gambar 4.3 Hasil Bioautografi Elusi .................................................................... 33 Gambar 4.4 Hasil KLT Ekstrak A75 .................................................................... 34 Gambar 4.5 Hasil KLT Fraksinasi Ekstrak A75 ................................................... 36 Gambar 4.6 KLT Hasil Fraksinasi F4. .................................................................. 37 Gambar 4.7 Hasil KLT Senyawa F4.2. ................................................................. 38 Gambar 4.8 KLT Hasil Fraksinasi F5. .................................................................. 39

Halaman

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Data Isolat Aktinomisetes ................................................................... 17 Tabel 4.1 Hasil Ekstraksi Kultur Aktnomisetes Medium Actino 1 dan YSB ..... 26 Tabel 4.2 Hasil Skrining Antibakteri Metode Bioautografi . .............................. 31 Tabel 4.3 Hasil Kromatografi Kolom Ekstrak A75 ............................................ 35 Tabel 4.4 Hasil Kromatografi Kolom Fraksi 4 ................................................... 37 Tabel 4.5 Hasil Kromatografi Kolom Fraksi 5 ................................................... 39 Tabel 4.6 Data Hasil MIC (Minimum Inhibitory Concentration) ....................... 39

Halaman

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Alur Penelitian . ........................................................................ 47 Lampiran 2. Uji Bioautografi Antibakteri . ................................................... 48 Lampiran 3. Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri A75 . .................................. 49 Lampiran 4. Isolat Aktinomisetes . ................................................................ 51 Lampiran 5. Hasil Kultivasi Aktinomisetes . ................................................. 52 Lampiran 6. Morfologi Isolat Aktinomisetes ................................................. 54 Lampiran 7. Bakeri Uji................................................................................... 55 Lampiran 8. Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi ................................................... 56 Lampiran 9. Hasil MIC . ................................................................................ 57 Lampiran 10. Perhitungan Konsentrasi Sampel Uji ....................................... 58 Lampiran 11. Perhitungan Pengenceran Suspensi Bakteri ............................ 59 Lampiran 12. Komposisi dan Cara Pembuatan Medium. .............................. 60 Lampiran 13. Alat – alat yang Digunakan. .................................................... 61

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Resistensi bakteri terhadap antibiotik, saat ini merupakan salah satu

permasalahan yang serius terhadap kesehatan masyarakat secara global. Dari Amerika

dilaporkan, bahwa penyebab utama kematian yang disebabkan oleh spesies bakteri multi

resisten, MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus), lebih tinggi dibandingkan

kasus kematian yang disebabkan oleh AIDS (Sosa, et al., 2010). Sekitar dua juta orang

yang mengalami infeksi bakteri di negara tersebut setiap tahunnya, tidak kurang dari 70%

kasus, memperlihatkan resistensi mikroba terhadap satu obat antibiotik tertentu (Cushine

& Lamb, 2005).

Berdasarkan kasus diatas, penemuan dan aplikasi antibiotik baru dalam

pengobatan infeksi yang disebabkan oleh bakteri, penting dilakukan dalam

menyelesaikan permasalahan tersebut. Meskipun terdapat kemajuan dalam

penemuan antibiotik dan pengembangannya dalam beberapa tahun terakhir,

perkembangan ini sejalan dengan kemampuan bakteri dalam beradaptasi terhadap

antibiotik tersebut. Selain itu, banyak bakteri yang resisten terhadap obat baru

yang dimodifikasi dari antibiotik yang telah ada. Oleh karena itu, sangat penting

untuk mencari senyawa antibiotik baru terutama dari mikroorganisme untuk

memerangi ancaman peningkatan populasi bakteri yang resisten terhadap

antibiotik (Ng & Amsaveni, 2012).

Sejak zaman dahulu, mikroorganisme menjadi sumber yang penting dalam

menghasilkan senyawa antibiotik. Sejak antibiotik penisillin pertama kali

ditemukan pada tahun 1928 yang dihasilkan oleh mikroorganisme Penicillium

notatum, penemuan antibiotik yang bersumber dari mikroorganisme terus

ditemukan, seperti streptomisin dan antibiotik golongan aminoglikosida lainnya

yang dihasilkan oleh mikroorganisme Streptomyces griseus dan antibiotik

vankomisin yang dihasilkan oleh Streptomyces orientalis (Saga & Yamaguchi,

2009). Kloramfenikol turunan dari amfenikol yang dihasilkan dari Streptomyces

venezuelae, tetrasiklin dari Streptomyces aureofaciens, serta turunan makrolida

seperti eritromisin dihasilkan oleh Streptomyces erythreus (Solanki, et al., 2008).

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Aktinomisetes merupakan salah satu jenis mikroorganisme yang penting

sebagai penghasil metabolit bioaktif. Aktinomisetes dikenal sebagai prokariot

yang berguna dalam dunia kedokteran dan industri bioteknologi, karena

kemampuannya dalam memproduksi sejumlah besar senyawa bioaktif, terutama

dari senyawa antibiotik. Menurut Berdy (2005) dari 22.500 senyawa biologis aktif

yang diperoleh dari mikroba, 45% dihasilkan oleh Aktinomisetes, 38% oleh

jamur, dan 17% oleh bakteri uniseluler (Rahman, et al., 2011).

Menurut Okami dan Hotta (1988) serta Balagurunathan (2007) dalam

jurnal Naine, et al (2012) disebutkan bahwa Aktinomisetes adalah bakteri Gram

positif yang bersifat saprofit dan distribusinya tersebar dalam tanah. Metabolit

primer dan sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme ini mempunyai potensi

dalam memberikan aktivitas biologi yang tinggi, dan tetap menjadi sumber yang

potensial dalam penemuan obat baru. Kebanyakan Aktinomisetes menghasilkan

beragam antibiotik termasuk antibiotik aminoglikosida, anthrasiklin, peptida dan

poliena.

Genus Streptomyces merupakan salah satu kelompok Aktinomisetes tanah

dan terkenal dalam memproduksi berbagai metabolit bioaktif termasuk antibiotik,

imunomodulator, antikanker, obat antivirus, herbisida, dan insektisida.

Streptomyces menghasilkan sekitar separuh dari sekian banyak antibiotik yang

diperoleh dari mikroorganisme, bahkan 75% antibiotik yang diproduksi secara

komersial dan berguna dalam medis bersumber dari Streptomyces (Rahman, et al.,

2011).

Menurut Waksman dan Bugie (1943) pencarian metabolit sekunder baru

dari mikroorganisme telah lama dilakukan, dan menunjukan strain yang berbeda

dari spesies yang sama mampu menghasilkan metabolit sekunder yang berbeda

(Mangamuri, 2012). Skrining untuk spesies mikroba merupakan aspek penting

karena terdapat sumber yang luar biasa untuk produksi metabolit sekunder

beragam yang memiliki aktivitas biologis yang relevan dalam bidang farmasi

(Berdy, 2005).

Oleh karena itu dilakukan penelitian dalam skrining beberapa isolat

Aktinomisetes yang mampu menghasilkan metabolit bioaktif antibakteri dan

mengisolasi senyawa aktif tersebut.

3


1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah isolat Aktinomisetes indigenus Indonesia dapat memproduksi

metabolit bioaktif antibakteri ?

2. Apakah aktivitas senyawa hasil isolasi dari Aktinomisetes memiliki prospek

untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai antibiotik?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan skrining isolat

Aktinomisetes yang dapat memproduksi senyawa antibakteri dan mengisolasi

senyawa aktif tersebut.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah dapat memberikan informasi ilmiah

mengenai Aktinomisetes yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri dari

metabolit bioaktif yang dapat dijadikan sebagai landasan ilmiah dalam

pemanfaatannya di bidang industri farmasi.

4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarata

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Aktinomisetes

Aktinomisetes adalah suatu kelompok heterogen dari bakteri filamentosa

yang berhubungan erat dengan corynebacteria dan micobacteria dan secara

superficial mirip jamur. Yang khas, mikroorganisme ini tumbuh sebagai

organisme bercabang. Beberapa Aktinomisetes bersifat tahan asam. Sebagian

besar hidup bebas, khususnya dalam tanah ( Jawetz, et al., 1996).

Menurut Okami dan Hotta (1988) Aktinomisetes merupakan kelompok

bakteri gram positif yang biasanya tumbuh dengan formasi filamen.

Aktinomisetes memiliki G + C tinggi (> 55%) dalam DNA. Aktinomisetes

merupakan sumber umum terbaik antibiotik, dan memberikan sekitar dua pertiga

antibiotik alami, termasuk untuk kepentingan medis (Gurung, et al., 2009).

Aktinomisetes merupakan prokariotik yang dapat memproduksi metabolit kimia

berbeda yang memberikan aktivitas biologi (Gophikrisnan et al, 2012).

Pada penelitian Vimal (2009) sekitar 23.000 metabolit sekunder bioaktif

yang dihasilkan oleh mikroorganisme telah dilaporkan dan lebih dari 10.000

senyawa ini dihasilkan oleh Aktinomisetes, mewakili 45% dari seluruh metabolit

bioaktif mikroba yang ditemukan (Valli, 2012). Dan berdasarkan S Ramesh

(2009) diantara Aktinomisetes, sekitar 7.600 senyawa diproduksi oleh spesies

Streptomyces. Banyak dari metabolit sekunder berpotensi sebagai antibiotik,

sehingga Streptomyces sebagai organisme penghasil antibiotik telah dieksploitasi

oleh industri farmasi (Valli, 2012).

2.1.1 Taksonomi Actinomycetes

Kingdom : Prokariot

Subkingdom : Cyanobacteria

Divisi : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Actinobacteria

Subclass : Actinobacteridae

5

UIN Syarif Hidayatullah Jakarata

Orde : Actinomycetales

Famili : Mycobacteriaceae

Actinomycetaeceae

Streptomyceae

Actinoplanaceae

(Okami & Hotta 1988; Gurung, et al., 2009).

2.1.2 Penyebaran Aktinomisetes

Aktinomisetes yang berasal dari lingkungan tanah yang ada di daratan

lebih bermacam – macam dan unik dengan kemampuan untuk memproduksi

struktur kimia yang berbeda. Pada penelitian Naine, et al (2012) menunjukkan

bahwa Aktinomisetes yang berasal dari hutan Amrithi mempunyai aktivitas

sebagai antibakteri dan antioksidan.

Aktinomisetes juga ditemukan di lingkungan perairan. Aktinomisetes laut

efisien menghasilkan metabolit sekunder baru yang menunjukkan aktivitas biologi

termasuk antibakteri, antifungi, antikanker, insektisida dan enzim inhibitor.

Senyawa bioaktif dari Aktinomisetes laut mempunyai struktur kimia yang berbeda

yang mungkin dapat menjadi dasar sintesis obat baru yang digunakan untuk

melawan patogen yang resisten (Solanki, 2008).

Aktinomisetes terdiri dari 10 % dari total bakteri yang ada di laut. Habitat

laut telah terbukti sebagai sumber inovasi baru dan bioaktif yang diproduksi oleh

mikroorganisme ( Valli et al., 2012).

Menurut Ding et al (2009) Actinomycetes dapat diisolasi dari lingkungan

basa dan asam dan berpotensi untuk memproduksi enzim, enzim inhibitor, dan

antibiotik. Rare Actiomycetes juga dapat diisolasi dari endapan lumpur.

Aktinomisetes baru juga telah diisolasi dari permukaan asam dan logam berat

pada area pertambangan. Aktinomisetes patogen dilaporkan telah diisolasi dari

hewan dan manusia (Khanna, et al., 2011).

2.1.3 Peran Aktinomisetes

Mikroorganisme telah menunjukkan sumber penting sebagai senyawa

alam untuk industri farmasi dan lainnya. Dari ribuan mikroorganisme yang telah

6


ditemukan untuk memproduksi antibiotik, dimana 2/3 diproduksi oleh

Aktinomisetes, dan beberapa Aktinomisetes juga digunakan untuk memproduksi

vitamin, enzim. Aktinomisetes memproduksi produk alam dalam jumlah besar

dengan aktivitas biologis yang berbeda, termasuk antitumor (Kesavan, et al.,

2011).

Produk alami merupakan sumber yang paling penting dari obat – obatan

baru. Diantara sumber – sumber potensial dari produk alami, bakteri yang sangat

penting. Namun kemampuan untuk menghasilkan agen anti infektif terbatas pada

lima dari 53 filum bakteri yang diketahui. Yang paling produktif adalah kelas

Actinobacteria (orde Actinomycetales). Sekitar 7.000 senyawa dilaporkan dalam

kamus natural poduct berasal dari actinobacterial. Karena itu Aktinomisetes

sangat menarik dalam industri karena kemampuannya untuk menghasilkan

metabolit sekunder yang penting. Streptomyces adalah genus penghasil terbesar

antibiotik, telah dilaporkan sekitar 80 % produk alami yang berasal dari

Aktinomisetes ( Jensen, et al., 2005). Sejumlah besar senyawa antitumor berasal

dari produk alam atau derivatnya, sebagian besar diproduksi oleh

mikroorganisme. Aktinomisetes menghasilkan senyawa antitumor yang dapat

berpotensi sebagai obat antikanker ( Kesavan, et al., 2011).

Aktinomisetes memiliki banyak peran dalam lingkungan. Dalam ekologi

tanah, Aktinomisetes aktif dalam bioremediasi, pupuk hayati, biokontrol.

Aktinomisetes memainkan peran penting dalam daur ulang dan mineralisasi

nutrisi dalam tanah. Aktinomisetes dapat membantu dalam daur ulang nutrisi

dengan mendegradasi sejumlah besar bahan organik dalam tanah dan yang

biasanya ditemukan pada kompos. Aktinomisetes juga dapat bertindak sebagai

pendukung pertumbuhan tumbuhan dengan membantu fiksasi nitrogen, kelarutan

nutrisi, imobilisasi nutrisi, kontrol biologi dan pemeliharaan struktur tanah (

Adegboye & Babalola, 2012).

Aktinomisetes merupakan salah satu mikroba tanah dan yang tumbuh erat

dengan organ tumbuhan, serta dapat membentuk benang filamen dalam tanah

yang memberi keuntungan dalam mengkolonisasi rhizosfer secara efektif. Sebagai

rhizobakteria, dapat mempengaruhi pertumbuhan suatu tumbuhan, antagonis

patogen tumbuhan, dan membuat tersedianya nutrisi untuk tumbuhan.

7


Aktinomisetes diketahui dapat mendegradasi bahan organik kompleks seperti

selulosa, lignin, xylan, kitin, dan polisakarida kompleks lainnya, hal ini

disebabkan karena produksi enzim hidrolitik ( Adegboye & Babalola, 2012).

2.2 Metabolit Sekunder

Metabolit adalah hasil dari metabolisme. Metabolit dibedakan menjadi dua

macam, yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder. Metabolit primer adalah

suatu metabolit atau molekul yang merupakan produk akhir atau produk antara

dalam proses metabolisme makhluk hidup, yang fungsinya sangat esensial bagi

kelangsungan hidup organisme tersebut, serta terbentuk secara intraseluler

(Pratiwi, 2008). Metabolit primer secara umum berada pada semua sistem biologi

antara lain polisakarida, protein, asam nukleat dan lemak (Berdy, 2005).

Mikroorganisme menghasilkan metabolit primer, misalnya etanol dan

metabolit sekunder seperti antibiotik. Metabolit primer diproduksi pada waktu

yang sama dengan pembentukan sel baru, dan kurva produksinya mengikuti kurva

pertumbuhan populasi secara paralel ( Pratiwi, 2008).

Metabolit sekunder adalah suatu molekul atau produk metabolit yang

dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme dimana produk

metabolit tersebut bukan merupakan kebutuhan pokok mikroorganisme untuk

hidup dan tumbuh (Pratiwi, 2008). Metabolit sekunder merupakan molekul rendah

(BM<3000), secara kimia dan taksonomi bermacam – macam senyawa dengan

fungsi yang tidak jelas, sebagian besar karakteristik untuk membedakan tipe

organisme (Berdy, 2005).

Fungsi metabolit sekunder bagi mikroorganisme penghasil itu sendiri

sebagian besar belum diketahui secara jelas. Metabolit sekunder dibuat dan

disimpan secara ekstraseluler. Metabolit sekunder banyak bermanfaat bagi

manusia dan makhluk hidup lain, karena banyak diantaranya bersifat sebagai obat,

pigmen, vitamin, ataupun hormon. Contohnya adalah kloramfenikol yang berasal

dari Streptomyces venezuellae, penisilin dari Penicillium notatum ( Pratiwi, 2008).

Menurut Gonzalez, et al (2003) metabolit sekunder merupakan senyawa

dengan struktur kimia yang bervariasi dan rumit yang diproduksi oleh beberapa

spesies mikroba dan beberapa tumbuhan. Walaupun antibiotik adalah metabolit

8


sekunder yang paling dikenal, terdapat metabolit lainnya dengan berbagai

aktivitas biologi, sehingga dapat berpotensi untuk kepentingan industri.

Karakteristik metabolit sekunder yaitu biasanya metabolit tidak diproduksi

pada saat pertumbuhan sel secara cepat (fase logaritmik), tetapi biasanya disintesis

pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu pada fase stasioner saat populasi sel tetap

karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati (Gonzalez, et

al., 2003; Pratiwi, 2008). Pada fase ini, sel mikroorganisme lebih tahan terhadap

keadaan ekstrim, misalnya suhu yang lebih panas atau dingin, radiasi, bahan –

bahan kimia dan metabolit yang dihasilkannya sendiri (Pratiwi, 2008).

2.3 Bakteri Patogen

2.3.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang dapat

dikultur pada media nutrien normal baik secara aerob maupun anaerob. Jumlah

enzim ekstraseluler dan eksotoksin seperti koagulase, alfatoksin, leujocidin,

exfoliatin, enterotoksin, dan toksin bertanggung jawab pada infeksi yang

disebabkan patogen. S.aureus bersifat patogen yang sering menyebabkan infeksi

nosokomial pada rumah sakit (Kayser, et al., 2005).

S.aureus berbentuk bola atau kokus brkelompok tidak teratur, diameter 0,8

– 1,0 µm tidak membentuk spora dan tidak bergerak, koloni berwarna kuning,

bakteri ini tumbuh cepat pada suhu 370 C. Koloni pada pembenihan padat

berbentuk bulat halus, menonjol, berkilau. Bakteri ini terdapat pada kulit, selaput

lendir, bisul dan luka. Dapat menimbulkan penyakit melalui kemampuannya

berkembang biak dan menyebar luas dalam jaringan (Jawetz, et al., 1996).

2.3.2 Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif. E.coli adalah flora

normal saluran usus manusia dan hewan. Oleh karena itu dianggap organisme

sebagai indikator adanya kontaminasi pada makanan dan minuman. E. coli

merupakan bakteri patogen penyebab infeksi paling sering pada manusia. Infeksi

ekstraintestinal termasuk infeksi saluran kemih, yang terjadi ketika saluran

terhambat atau secara spontan disebabkan oleh UPEC ( uropathogenic E.coli )

9


pathovar. Infeksi yang paling penting lainnya adalah kolesistitis, usus buntu,

peritonitis, infeksi luka pasca operasi, dan sepsis. Dalam infeksi saluran kemih

akut, E.coli merupakan organisme penyebab 70 – 80 % pada kasus kronik, 40 –

50 % penyebab infeksi persisten (Kayser, et al., 2005).

2.4 Metode Skrining

Skrining mikroba merupakan aspek penting karena terdapat sumber yang

luar biasa untuk produksi beragam metabolit sekunder yang relevan dengan

aktivitas biologis ( Berdy, 2005).

Metode skrining yang sering digunakan untuk mendeteksi aktivitas

antimikroba produk alam dibagi menjadi 3 kelompok, metode bioautografi, difusi

dan dilusi. Metode bioautografi dan difusi merupakan teknik secara kualitatif

karena metode ini hanya akan menunjukkan ada atau tidaknya senyawa dengan

aktivitas antimikroba. Di sisi lain, metode dilusi digunakan untuk kuantitatif yang

akan menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) atau Minimum

Inhibitory Concentration (MIC) (Vanden, 1991 ; Valgas, 2007).

Gambar 2.1. Klasifikasi metode skrining aktivitas biologi

Sumber : Choma, 2010

Dilusi agar

Pengenceran

tabung

Klasifikasi metode

mikrobiologi untuk

mendeteksi aktivitas

biologi

Metode difusi

Metode dilusi

Bioautografi

Kontak

Imersi

Cakram

Silinder

Uji lubang plat

Langsung

10


2.4.1 Metode Difusi

Dalam prosedur cakram, kertas cakram (sekitar diameter 6 mm),

mengandung senyawa uji, ditempatkan pada permukaan agar yang sebelumnya

diinokulasi dengan mikroorganisme uji. Agen antimikroba berdifusi ke agar dan

menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang diuji. Cawan petri diinkubasi

dan zona hambatan pertumbuhan diukur (Choma, 2010).

Pada metode silinder, stainless steel atau porcelein silinder ukuran

seragam (biasanya 8mm x 6mm × 10mm) ditempatkan pada permukaan agar yang

diinokulasi pada cawan petri, dan diisi dengan sampel dan standar. Setelah

inkubasi, silinder dipindahkan dan zona hambat diukur (Choma, 2010).

Pada hole-plate assay, lubang berdiameter beberapa milimeter yang

dipotong pada permukaan agar yang diinokulasi dan diisi dengan sampel.

Senyawa uji berdifusi ke medium agar menyebabkan penghambatan pertumbuhan

mikroorganisme. Cawan petri diletakan pada suhu kamar, sebelum inkubasi.

Kemudian, zona hambatan diukur. Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

ditentukan secara visual, karena konsentrasi senyawa uji terendah, yang dapat

menyebabkan zona hambat pertumbuhan dapat dikenali. Namun, metode difusi

kurang cocok untuk menentukan nilai MIC dari pada dilusi, karena tidak mungkin

mengukur jumlah senyawa uji yang berdifusi ke dalam medium agar (Choma,

2010).

2.4.2 Metode Dilusi

Pada metode dilusi agar, medium diinokulasi dengan organisme uji dan

sampel yang diuji dicampur dengan inokulum. Material yang diinokulasi dan

pertumbuhan mikroorganisme dapat terlihat dan dibandingkan dengan kultur

kontrol yang tidak mengandung sampel uji. Pengujian diulang dengan variasi

dilusi sampel uji dalam medium kultur dan menentukan dilusi yang paling tinggi

yang dapat mencegah pertumbuhan mikroorganisme sampel (Rahman, et al.,

2005).

Keuntungan utama dari metode dilusi dapat memperkirakan konsentrasi

senyawa uji dalam medium agar atau suspensi broth, biasanya digunakan untuk

penentuan nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Dalam prosedur dilusi

11


agar, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan nutrient agar. Plat agar

diinokulasi kemudian diinkubasi. Konsentrasi terendah dari senyawa antimikroba,

dimana tidak ada pertumbuhan mikroorganisme terdeteksi, diberikan nilai MIC.

Dalam tabung uji, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan suspensi

bakteri pada beberapa tabung, konsentrasi terendah menyebabkan penghambatan

pertumbuhan mikroorganisme sesuai dengan nilai MIC. Pada uji mikrodilusi cair,

mikroorganisme yang tumbuh di sumur plat, dimana berbagai konsentrasi

senyawa uji ditambahkan. Pertumbuhan mikroorganisme ditunjukkan oleh adanya

kekeruhan dalam sumur (Choma, 2010).

2.4.3 Metode Bioautografi

Bioautografi merupakan metode skrining mikrobiologi yang umum

digunakan untuk mendeteksi aktivitas antimikroba. Skrining dapat didefinisikan

sebagai prosedur pertama, yang diterapkan pada sampel yang dianalisis, dalam

rangka untuk menetapkan ada atau tidak adanya analit yang didapat. Metode

skrining ini memberikan sensitivitas yang lebih tinggi daripada metode lainnya.

Selain itu, sederhana, murah, hemat waktu dan tidak memerlukan peralatan yang

canggih (Choma, 2010).

Prosedur bioautografi untuk skrining aktivitas antimikroba dengan

mengetahui lokasi aktivitas antibakteri pada kromatogram. Agen antimikroba

ditransfer dari lempeng KLT atau kertas kromatogram ke plat agar yang

diinokulasi dengan cara difusi dan menampakkan zona hambat (Rahman, et al.,

2005).

Menurut Choma (2005) Skrining metode bioautografi pada dasarnya untuk

menguji aktivitas biologis, misalnya antibakteri, antijamur, antitumor, dan

antiprotozoa zat uji. Metode deteksi ini dapat berhasil dengan dikombinasikan

dengan teknik kromatografi lapis tipis (Choma, 2010).

Prosedur dalam metode bioautografi hampir sama dengan yang digunakan

dalam metode difusi agar. Perbedaannya adalah senyawa yang diuji berdifusi ke

media agar yang diinokulasi dari lapisan kromatografi, yang merupakan adsorben

atau kertas ( Wagman, 1969; Choma, 2010).

12


Metode bioautografi dibedakan menjadi bioautografi kontak, bioautografi

imersi atau bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung. Dalam

bioautografi kontak, lempeng KLT atau kromatogram kertas ditempatkan pada

permukaan agar diinokulasi selama beberapa menit atau jam untuk

memungkinkan difusi. Selanjutnya, lempeng dipindah dan lapisan agar

diinkubasi. Pertumbuhan zona hambat muncul di mana senyawa antimikroba

berada dalam kontak dengan lapisan agar.

Dalam bioautografi immersion (agar overlay), lempeng pertama kali

dicelupkan di atau ditutup dengan medium agar, setelah agar memadat,

ditambahkan mikroorganisme yang diuji dan kemudian diinkubasi. Agar dapat

berdifusi dengan baik dari senyawa uji ke permukaan agar, lempeng dapat tetap

pada suhu rendah selama beberapa jam sebelum inkubasi. Metode ini merupakan

kombinasi dari bioautografi kontak dan langsung, karena senyawa antimikroba

yang ditransfer dari kromatogram ke media agar, seperti dalam metode kontak,

tetapi lapisan agar tetap pada permukaan kromatogram selama inkubasi dan

visualisasi, sebagai bioautografi langsung (Choma, 2010).

Di antara semua metode bioautografi, yang paling banyak digunakan

adalah bioautografi langsung. Prinsip dari metode ini adalah lempeng KLT

dicelupkan pada suspensi mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu yang tepat

dan kemudian diinkubasi dalam suasana lembab. Permukaan silika dari lempeng

KLT ditutupi dengan media kaldu menjadi sumber nutrisi dan memungkinkan

pertumbuhan mikroorganisme secara langsung di atasnya, daerah di mana terdapat

spot agen antimikroba menunjukan zona penghambatan pertumbuhan

mikroorganisme yang terbentuk. Visualisasi dari zona ini biasanya dilakukan

dengan menggunakan reagen dehidrogenase untuk deteksi aktivitas, yang paling

umum adalah garam tetrazolium. Dehidrogenase mengkonversi mikroorganisme

hidup garam tetrazolium menjadi berwarna. Sehingga, spot krim - putih muncul

dengan latarbelakang ungu pada permukaan lempeng KLT menunjukkan

keberadaan agen antibakteri (Choma, 2010). Reaksi berdasarkan transfer electron

dari NADH, produk dari threonine dehydrogenase (TDH) yang mengkatalis

reaksi. TDH dari bakteri / fungi mengkatalis NAD+ dari threonine menjadi 2-

amino-3-ketobutirat dan NADH. Selama pertumbuhan bakteri aktif, elektron

13


ditransfer dari NADH (yang berwarna pada daerah tampak) ke p-

iodonitrotetrazolium violet menghasilkan pewarna formazan yang berwarna ungu.

Sehingga zona bening pada kromatogram menunjukkan area inhibisi (zona

dimana tidak terdapat pertumbuhan aktif bakteri) (Angeh, 2006).

Keuntungan dari metode bioautografi adalah sifatnya yang efisien untuk

mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan

walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk

mengisolasi senyawa aktif tersebut ( Pratiwi, 2008).

2.5 Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase

diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Teknik kromatografi telah

berkembang dan telah digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi

berbagai macam komponen yang kompleks, baik komponen organik maupun

komponen anorganik (Gandjar & Rohman, 2007).

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada

pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahan, kromatografi

dibedakan menjadi: kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi

pasangan ion, kromatografi penukar ion, dan kromatografi ekslusi ukuran.

Sedangkan berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas:

kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi dan

kromatografi gas (Gandjar & Rohman, 2007).

Bentuk kromatografi yang paling awal adalah kromatografi kolom yang

digunakan untuk pemisahan sampel dalam jumlah yang besar. Kromatografi gas

(KG) dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik

kromatografi komplementer karena kromatografi gas dapat digunakan untuk

memisahkan komponen – komponen yang mudah menguap, sementara KCKT

dapat digunakan untuk memisahkan komponen yang tidak mudah menguap.

Kedua alat kromatografi ini dapat dikendalikan dengan komputer menggunakan

software yang canggih dan berkemampuan untuk memisahkan sampai 100

komponen dalam campuran yang kompleks (Gandjar & Rohman, 2007).

14


Kromatografi cair adalah tehnik untuk partisi molekul dimana fase gerak

membawa campuran mengandung senyawa yang akan dipisahkan melalui fase

diam yang terdapat dalam kolom. Fase diam mempunyai karakteristik yang

menunda beberapa komponen molekul sampel yang menyebabkan terjadi

pemisahan bersama fase gerak yang turun dari kolom (Anonim, 2004).

Kromatografi fase normal menggunakan fase diam polar seperti silica gel

dan fase gerak nonpolar. Senyawa yang mempunyai kepolaran rendah akan

terelusi terlebih dahulu. Kromatografi fase terbalik, menggunakan fase diam

nonpolar dan dielusi dengan pelarut polar, senyawa dengan polaritas tinggi akan

pertama kali muncul (Talamona, 2005).

Kromatografi berdasarkan ukuran memisahkan senyawa atas dasar

perbedaan ukuran molekul. Molekul kecil yang mampu menembus pori – pori,

sedangkan molekul besar tidak mampu menembus, sedangkan partikel berukuran

sedang sebagian dapat menembus pori – pori. Molekul – molekul besar dapat

terelusi lebih dulu, sedangkan molekul kecil yang dapat menembus pori – pori

tertahan dan terelusi terakhir (Anonim, 2004).

KLT merupakan bentuk kromatografi planar, dimana fase diamnya berupa

lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang dilapiskan pada lempeng

kaca, plat aluminium, atau plat plastik. Prinsip dari kromatografi lapis tipis adalah

suatu analit bergerak naik atau melintasi lapisan fase diam (paling umum

digunakan gel silica), dibawah pengaruh fase gerak (biasanya campuran pelarut

organik), yang bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Jarak pemindahan

oleh analit tersebut ditentukan oleh afinitas relatifnya untuk fase diam dan fase

gerak. Keunggulan dari KLT adalah fleksibel dalam mendeteksi hampir semua

senyawa, bahkan beberapa senyawa anorganik, yang dapat didukung oleh

penggunaan reagen penampak bercak. (Watson, 2010).

Plat KLT yang umum digunakan adalah plat KLT analitik dengan

ketebalan 0,1 - 0,2 mm dengan ukuran 20 x 20 cm yang dilapisi dengan adsorben

silika gel 60 F254 dengan ketebalan 0,2 mm. Plat kemudian ditempatkan ke dalam

bejana dengan fase gerak yang sesuai, dimana ketinggian fase gerak cukup untuk

membasahi bagian bawah plat dan tidak sampai membasahi dimana sampel

15


diaplikasikan. Fase gerak kemudian bermigrasi melewati adsorben dengan gaya

kaliper, dan proses ini dikenal sebagai pengembangan (Sarker, et al., 2006).

KLT digunakan secara luas untuk analisis solut – solut organik terutama

dalam bidang biokimia, farmasi, klinis, forensik, untuk analisa kualitatif dengan

membandingkan nilai Rf solut dengan nilai Rf senyawa baku

(Gandjar & Rohman, 2007).

Nilai Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan :

Rf =

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai

perbandingan distribusi dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti solut

bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf

adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal dipermukaan

fase diam (Gandjar & Rohman, 2007).

Jarak yang ditempuh analit

Jarak yang ditempuh fase gerak


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini mulai dilakukan bulan April 2013 sampai dengan bulan Juli

2013 dan bertempat di Laboratorium Biosain, Bidang Botani Pusat Penelitian

Biologi, LIPI Cibinong, Jawa Barat.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan

analitik ( AND ), rotary evaporator ( heidolp WB 2000 ), Laminar Air Flow (

SPEG AIR TECH ), autoklaf ( HIRAYAMA ), oven ( WTB binder ) , shaker

incubator ( Innova 2100 ), api bunsen, cawan petri, kromatografi kolom, corong (

PYREX ), corong pisah, gelas ukur ( PYREX ), Erlenmeyer ( PYREX ), gelas

beaker ( PYREX), pipet tetes, chamber, pinset, kaca objek, kawat ose , stirrer, UV

cabinet ( CAMAG, UV CABINET II ) , microtiter plate ( IWAKI ), micropipette

( GILSON ), mikroskop.

3.2.2 Bahan

Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium

Actino 1 ( Daigo ), yeast extract ( Bacto ), starch ( MERCK ), agar ( WAKO ),

Mulller Hinton Agar ( Difco ), Brain Heart Infusion ( Difco ), Mueller Hinton

Broth ( CRITERION ), silica gel 70 – 230 mesh ( MERCK ), silica gel 60 230 –

400 mesh ( MERCK ), plat KLT silica gel 60 GF254 ( MERCK ), sephadex LH 20,

DMSO ( Phyto Technology Laboratories ), etil asetat, metanol, kloroform,

diklorometan, aseton, etanol, serium sulfat, larutan p-iodonitrotetrazolium violet

(INT) ( TCI ), alkohol 70 %, kloramfenikol ( SIGMA ), eritromisin ( SIGMA ),

Kristal violet, Iodin, Safranin, Staphylococcus aureus LIPIMC 114, Escherichia

coli LIPIMC 186 dan isolat aktinomisetes yang digunakan dalam penelitian ini

merupakan koleksi dari laboratorium mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi LIPI

Cibinong. Isolat tersebut antara lain pada Tabel 3.1.

17


Tabel 3.1 Data Isolat Aktinomisetes

N0 Isolat Sumber sampel

Asal sampel Identifikasi spesies

1 InaCC A63 Tanah Taman Nasional Alas Purwo, Jawa Timur

Streptomyces sp.


Streptomyces sp.


Streptomyces sp.


Streptomyces sp.

5 InaCC A74 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 6 InaCC A75 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 7 InaCC A78 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 8 InaCC A82 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 9 InaCC A83 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 10 InaCC A85 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 11 InaCC A89 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 12 InaCC A94 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 13 InaCC

A0112 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.

14 InaCC A0114

Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.

15 InaCC A0116

Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Peremajaan Isolat Aktinomisetes

Lima belas isolat Aktinomisetes ditumbuhkan pada medium Yeast Starch

Agar (YSA) yang dibuat dengan cara 0,5 g yeast extract, 2,5 g pati dan 3,75 agar

yang dilarutkan dalam 250 mL aquadest. Medium YSA sebelumnya disterilkan pada

autoklaf 1210 C selama 15 menit.

3.3.2 Kultivasi Aktinomisetes

Pembuatan medium YSB dengan cara melarutkan 1,6 g yeast extract dan 8 g

pati yang dilarutkan dalam 800 mL aquadest. Sedangkan medium Actino 1 dibuat

18


dengan cara melarutkan 6,4 g Actino 1 pada 800 mL aquadest. Masing – masing

medium disterilisasi dengan autoklaf 1210C, selama 15 menit.

Setiap isolat Aktinomisetes dikultivasi dalam 50 mL medium Yeast Starch

Broth ( YSB ) dan Actino 1 pada erlenmeyer 100 mL, kemudian diinkubasi pada

shaker incubator dengan kekuatan 1300 rpm pada suhu 280 C selama 7 hari.

3.3.3 Ekstraksi Kultur Aktinomisetes

Setelah 1 minggu 30 kultur Aktinomisetes serta medium YSB (Yeast Starch

Broth) dan Actino 1 sebagai kontrol diekstraksi 3 kali dengan pelarut etil asetat :

metanol (4:1) dalam corong pisah. Setelah dikocok terbentuk 2 lapisan, lalu lapisan

etil asetat : metanol dipisahkan dan diuapkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang

didapat dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase gerak

diklorometan : metanol (10 : 1). Pola kromatogram yang terbentuk kemudian

dimonitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu

disemprot dengan pereaksi penampak bercak serium sulfat.

3.3.4 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri

3.3.4.1 Persiapan Bioautografi

Alat dan medium yang akan digunakan disterilisasi dengan menggunakan

autoklaf 1210C selama 15 menit. Medium yang digunakan yaitu BHI (Brain Heart

Infusion), aquadest dan alat – alat yang dipersiapkan antara lain cawan petri,

potongan tissue kecil 2 x 2 cm dan dimasukkan dalam cawan petri, spreader.

3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing – masing

diinokulasi pada medium BHI (Brain Heart Infusion) sebanyak 1 ose, lalu diinkubasi

di dalam shaker incubator dengan temperatur 37oC kecepatan 100 rpm selama 20

jam.

19


3.3.4.3 Pembuatan Larutan Kloramfenikol

Kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 1 mg/mL dengan cara menimbang

10 mg kloramfenikol dan dilarutkan dalam 10 mL metanol.

3.3.4.4 Persiapan Plat KLT

Masing – masing ekstrak dengan konsentrasi 10 mg/mL ditotol pada plat KLT

sebanyak 10 µL dengan jarak tiap totolan 1,5 cm. Kemudian plat disimpan dalam

oven suhu 370 C selama 1 jam.

3.3.4.5 Uji Bioautografi Nonelusi Antibakteri

Suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing –

masing diambil sebanyak 5 mL dan dicampur dengan BHI masing – masing 45 mL

dalam petri dish dan diratakan dengan menggunakan spreader.

Plat yang sudah disiapkan dicelupkan selama 5 detik ke dalam media BHI

yang sudah dicampur dengan suspensi bakteri, kemudian disimpan dalam petri dish

yang sudah terdapat tissue yang dibasahi dengan aquadest. Lalu diinkubasi selama 20

jam pada suhu 370 C. Kemudian plat disemprot dengan larutan p-

iodonitrotetrazolium violet (INT), lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC.

Aktivitas antibakteri terlihat dengan terbentuknya zona bening dengan latar belakang

warna ungu pada plat. Pengerjaan bioautorafi dilakukan dalam laminar air flow

(Choma, 2010; Valgas, et al., 2007)

3.3.4.6 Bioautografi Elusi

Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri (isolat A64, A67, A75, A89

dan A94) selanjutnya diuji kembali dengan cara ekstrak konsentrasi 10 mg/mL

ditotolkan pada plat sebanyak 10 µL dengan jarak setiap totolan 1,5 cm dan dielusi

dengan fase gerak Diklorometan : Metanol ( 10:1 ), lalu dilihat dibawah sinar UV 254

nm dan 366 nm dan menandai bercak yang terlihat. Selanjutnya plat disimpan dalam

oven selama 1 jam dengan suhu 370 C. Plat yang telah disimpan dalam oven,

dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi bakteri selama 5 detik, selanjutnya

20


disimpan dalam petri dish dan diletakkan tissue yang dibasahi dengan aquadest. Plat

diinkubasi pada suhu 370 C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan

larutan p-iodonitrotetrazolium violet (INT), dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu

37oC.

3.3.5 Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan cara pewarnaan bakteri. Kaca objek

dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringkan, dibuat preparat sampel diatas kaca

objek dan dikeringkan didekat api. Diteteskan kristal violet di atas preparat,

didiamkan selama 60 detik dan dibilas dengan air mengalir, diteteskan kembali

dengan iodin, didiamkan 60 detik, dibilas dengan air mengalir, selanjutnya preparat

ditetesi dengan alkohol 96% dan langsung dibilas dengan air mengalir, dan yang

terakhir ditetesi menggunakan safranin, didiamkan 60 detik dan dibilas menggunakan

air mengalir. Preparat dikeringkan dan diamati pada mikroskop.

3.3.6 Scaling Up Isolat InaCC A 75 dalam Medium Actino 1

3.3.6.1 Pembuatan Medium Kultivasi

Medium Actino 1 dibuat sebanyak 2 liter dengan komposisi pepton 5 g dan

yeast extract 3 g dalam 1 liter air sumur. Komponen tersebut dihomogenkan dengan

menggunakan stirer, medium tersebut dibagi menjadi 10 erlenmeyer yang masing –

masing diisi dengan 200 mL medium dalam 500 mL. Selanjutnya disterilisasi dengan

autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit.

3.3.6.2 Kultivasi Aktinomisetes

Isolat InaCC A75 diinokulasi ke dalam 200 mL medium Actino 1 sebanyak 1

ose pada 10 erlenmeyer. Kemudian 10 erlenmeyer tersebut diinkubasi pada shaker

incubator dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 280 C selama 2 minggu. Pengerjaan

inokulasi dilakukan di dalam laminar air flow.

21


3.3.6.3 Ektraksi Kultur Hasil Scaling Up

Kultur hasil scaling up InaCC A 75 digabung menjadi satu dalam erlenmeyer

5 L dan diekstraksi menggunakan etil asetat sebanyak 2 L dengan cara dikocok

menggunakan stirrer selama kurang lebih 1 jam, selanjutnya fase etil asetat yang

merupakan lapisan atas dipisahkan dengan menggunakan selang sedangkan lapisan

bawah diekstraksi kembali dengan etil asetat sampai 3 kali. Fase etil asetat dipekatkan

dengan rotary evaporator. Fraksi yang telah pekat dianalisis menggunakan KLT

dengan fase gerak diklorometan : metanol (10:1) dan hasil elusi diamati dibawah

sinar UV 254 nm dan 366 nm serta disemprot menggunakan pereaksi penampak

bercak serium sulfat.

3.3.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif Ekstrak InaCC A75

Ekstrak InaCC A75 (115 mg) dilakukan fraksinasi dengan kromatografi

kolom menggunakan fase diam silica gel (mesh 70 – 230) dan fase gerak kloroform :

etanol (10:1). Fraksi ditampung dalam tabung reaksi, dan setiap fraksi diamati pola

bercak KLT dengan fase gerak kloroform : etanol ( 10:1 ). Fraksi yang menunjukkan

pola bercak yang sama digabung menjadi 1 fraksi sehingga didapatkan 10 fraksi.

Selanjutnyak fraksi yang menunjukkan spot target dilakukan fraksinasi lebih lanjut

menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Sephadex LH 20 dan fase gerak

etanol 96%, dimana kolom yang digunakan mempunyai panjang 100 cm dengan

diameter 0,7 cm. Fraksi ditampung dalam tabung reaksi dan diamati dengan KLT

menggunakan fase gerak kloroform : etanol ( 10:1 ), fraksi yang menunjukkan pola

bercak yang sama digabung menjadi 1 fraksi.

3.3.8 Penentuan Nilai MIC ( Minimum Inhibitory Concentration )

3.3.8.1 Persiapan Medium

Medium yang digunakan dalam uji antibakteri yaitu medium MHB dan MHA.

a. Medium MHB dibuat 2 konsentrasi yang berbeda, MHB 1 dibuat sebanyak 2,1 g

MHB dilarutkan dalam 100 mL aquadest, sedangkan MHB 2 dibuat dengan

konsentrasi 2 kali MHB 1, sebanyak 2,1 g MHB dilarutkan dalam 50 mL

22


aquadest, kemudian dipanaskan agar larut sempurna dan disterilisasi pada

autoklaf suhu 1210 C selama 15 menit.

b. Medium MHA dibuat dengan melarutkan 3,8 g MHA dengan 100 mL aquadest,

kemudian disterilkan pada autoklaf suhu 1210 C selama 15 menit. Setelah itu

dituang pada petri dish yang sudah steril.

3.3.8.2 Persiapan Sampel Uji

Sampel uji yang digunakan yaitu F4.2 yang merupakan spot tunggal dan F5.4.

Sampel uji dibuat dengan konsentrasi 512 µg/mL sebanyak 1 mL menggunakan

DMSO 30 %. F4.2 (7,5 mg) dilarutkan dalam 3,75 mL etanol 96%, diambil 256 µL

kemudian dikeringan dengan nitrogen dan dilarutkan dengan 300 µL DMSO serta

700 µL aquadest. Sedangkan F5.4 (2,4 mg) dilarutkan dalam 2,4 mL etanol 96%,

dipipet 512 µL dan dikeringkan, selanjutnya dilarutkan dalam 300 µL DMSO dan

700 µL aquadest

3.3.8.3 Persiapan Kontrol

Kontrol positif menggunakan antibiotik komersial kloramfenikol dan

eritromisin yang masing – masing dibuat dengan konsentrasi 10 mg/mL yang

dilarutkan dalam etanol 96% sebagai larutan stok, kemudian diencerkan menjadi

konsentrasi 512 µg/mL sebanyak 5 mL, dengan cara menambahkan 4744 µL

aquadest ke dalam 256 µL larutan stok.

Kontrol negatif menggunakan etanol 20 % dan DMSO 30 % yang

dipersiapkan dengan cara 200 µL etanol dicampur dengan 800 µL aquadest dan 300

µL DMSO dilarutkan dengan 700 µL aquadest.

3.3.8.4 Persiapan Suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

Masing – masing bakteri diinokulasi sebanyak 1 ose dalam 20 mL medium MHB dan

diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm suhu 370 C selama 20

jam.

23


Suspensi bakteri yang diperoleh dilakukan pengenceran agar mudah dalam

perhitungan jumlah koloni dengan cara 50 µL suspensi bakteri dimasukan ke dalam

4950 µL aquadest steril sehingga didapat pengenceran 10-2, pengenceran dilakukan

hingga diperoleh pengenceran 10-10. Pada pengenceran 10-6, 10-8, dan 10-10 diambil

100 µL dan masing – masing ditanam pada medium MHA. Selanjutnya diinkubasi

selama 20 jam pada suhu 370 C. Setelah dinkubasi dilakukan perhitungan koloni

bakteri dengan rumus:

Jumlah koloni =

3.3.8.5 Pengenceran Suspensi Bakteri

Jumlah koloni yang diperoleh dilakukan pengenceran hingga menjadi

konsentrasi 105 CFU/mL. Contoh pengenceran : jumlah koloni E.coli = 1,05 x 109

CFU/mL, dipipet 50 µL ke dalam 4950 µL medium MHB ( koloni 1,05 x 107

CFU/mL ), selanjutnya dipipet 20 µL ke dalam 1980 µL medium MHB sehingga

jumlah koloni menjadi 1,05 x 105 CFU/mL.

3.3.8.6 MIC ( Minimum Inhibitory Concentration )

Penentuan nilai MIC menggunakan microtiter plate dengan 12 x 8 kolom.

Pada kolom pertama diisi dengan medium MHB 2 sebanyak 100 µL, kolom 2 sampai

8 diisi dengan 100 µL MHB 1, pada kolom 1 ditambahkan 100 µL sampel uji yang

sudah dipersiapkan dengan konsentrasi 512 µg/mL dan dihomogenkan, kemudian

dilakukan pengenceran berseri dengan cara dari kolom 1 dipipet sebanyak 100 µL

dan dihomogenkan, begitu seterusnya sampai kolom 8, dari kolom 8 dipipet 100 µL

dan dibuang. Dari kolom 1 sampai 8 ditambahkan 100 µL bakteri uji yang sudah

disiapkan. Uji dilakukan 3 kali pengulangan.

Disediakan kolom lain untuk kontrol pertumbuhan ( GC ), kontrol negatif, dan

blangko. Kontrol pertumbuhan berisi media 100 µL MHB 1 dan 100 µL bakteri uji,

kontrol negatif menggunakan DMSO dan etanol, yang berisi 100 µL MHB, 100 µL

DMSO yang dihomogenkan dan dibuang 100 µL kemudian ditambahkan 100 µL

24


bakteri, pada etanol dilakukan hal yang sama. Kemudian microtiter plate diinkubasi

pada suhu 370 C selama 20 jam. Pada setiap kolom ditambahkan 10 µL INT dan

diinkubasi pada suhu 370 C selama 1 jam. Dengan pengamatan visual, ditentukan

konsentrasi terendah kolom yang masih mempertahankan kebeningan sebagai nilai

MIC. Kemudian dibandingkan dengan pengukuran nilai MIC kloramfenikol dan

eritromisin (Agusta, et al., 2010).


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Kultivasi dan Ektraksi

Skrining Aktinomisetes yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri

dilakukan terhadap isolat Aktinomisetes koleksi Laboratorium Mikrobiologi,

Puslit Biologi LIPI yang telah diidentifikasi oleh Arif Nurkanto., M.Si di

Laboratorium Mikrobiologi LIPI. Secara keseluruhan isolat Aktinomisetes

tersebut merupakan genus Streptomyces sp yang diisolasi dari tanah yang berasal

dari Taman Nasional Alas Purwo Jawa Timur dan Raja Ampat Papua.

Streptomyces merupakan genus dari Aktinomisetes yang paling banyak

memproduksi antibiotic dan molekul bioaktif lainnya dibandingkan dengan genus

lain dari Aktinomisetes (Solanki, et al., 2008).

Lima belas isolat aktinomisetes (lampiran 4) dikultivasi pada 2 medium

yang berbeda, yaitu YSB (Yeast Starch Broth) dan Actino 1. Medium YSB terdiri

dari yeast extract yang dapat menghasilkan nitrogen, asam amino, vitamin dan

starch yang dapat sebagai sumber karbon, sedangkan Actino 1 yang terdiri dari

pepton dan yeast extract mengandung nitrogen, vitamin, karbon dan asam amino.

Dari kedua medium tersebut mempunyai komposisi yang berbeda tetapi

kandungan yang sama untuk membantu proses pertumbuhan Aktinomisetes.

Penggunaan 2 medium yang berbeda bertujuan untuk mengetahui medium yang

cocok sebagai pertumbuhan Aktinomisetes yang dapat menghasilkan metabolit

bioaktif secara maksimal. Pada proses kultivasi diletakan diatas shaker incubator

dengan kekuatan 130 rpm yang menyebabkan medium bergolak sehingga terjadi

aerasi yang dapat mempertahankan pertumbuhan dengan adanya oksigen.

Kebanyakan Aktinomisetes memiliki kebutuhan yang lebih tinggi terhadap

oksigen untuk tumbuh dan menghasilkan metabolit secara optimal. Namun, media

mengandung banyak zat organik dan anorganik yang menyebabkan rendahnya

tingkat oksigen terlarut, oleh karena itu adanya shaker mampu menyediakan

oksigen dalam medium (He, 2010; Song, 2012). Pada hari keempat kultur

Aktinomisetes dalam media YSB (Yeast Starch Broth) dan Acino 1 sudah

26


menghasilkan perubahan warna, akan tetapi kultivasi tetap dilanjutkan sampai hari

ke 7 agar dapat menghasilkan metabolit bioaktif lebih maksimal. Dari kedua

medium yang digunakan pigmen yang terbentuk juga berbeda. Produksi pigmen

merupakan salah satu sifat Aktinomisetes, pigmen tersebut tergantung pada

perbedaan komposisi media, kondisi pertumbuhan dan usia kultur. Dengan

demikian produksi pigmen adalah salah satu karakteristik Aktinomisetes yang

mudah dikenali ketika komposisi media dan kondisi kultur diketahui (Attimarad,

et al., 2012). Hasil kultivasi Aktinomisetes pada lampiran 5.

Tiga puluh kultur hasil kultivasi Aktinomisetes pada medium YSB dan

Actino 1 serta 2 medium (YSB dan Actino 1) tanpa isolat Aktinomisetes sebagai

kontrol diekstraksi menggunakan corong pisah dengan pelarut etil asetat : metanol

( 4:1 ) sebanyak 3 kali diharapkan dapat menarik senyawa metabolit sekunder

sebanyak mungkin. Ekstrak kering ditimbang dan diperoleh berat ekstrak pada

Tabel 4.1. Setiap ekstrak dibuat konsentrasi 10 mg/mL dengan dilarutkan dalam

metanol. Selanjutnya dilakukan KLT untuk mengetahui pola pemisahan metabolit

sekunder yang dihasilkan selama proses kultivasi pada kedua medium yang

digunakan. KLT menggunakan fase gerak diklorometan : metanol (10:1) dan fase

diam silica gel 60 F254. Secara umum hasil ekstrak yang diperoleh dari kedua

medium menunjukkan bahwa medium Actino 1 menghasilkan ekstrak yang lebih

banyak dari pada medium YSB (Yeast Starch Broth), hal ini disebabkan

perbedaan komposisi dari kedua medium sehingga menghasilkan metabolit yang

berbeda pula. Pola pemisahan KLT ditunjukkan pada Gambar 4.1.

Tabel 4.1 Hasil ekstraksi kultur aktinomisetes medium Actino 1 dan YSB

No Isolat Berat Ekstrak (mg) Actino 1 YSB

1 InaCC A63 17,4 3,9 2 InaCC A64 7,5 5,9 3 InaCC A67 16,6 10,2 4 InaCC A72 8,6 4 5 InaCC A74 9 6,9 6 InaCC A75 11,2 5,6 7 InaCC A78 13,7 4,6 8 InaCC A82 10,8 6,2

27


9 InaCC A83 12,5 4,5 10 InaCC A85 14,5 6,7 11 InaCC A89 10,8 6,8 12 InaCC A94 15,1 6,3 13 InaCC A0112 13,3 3,1 14 InaCC A0114 11,9 5,1 15 InaCC A0116 11,4 2,3 16 - 16,3 3,5

Keterangan:

Ekstrak kultur medium YSB

pada UV panjang gelombang

254 nm

Keterangan:


pada UV panjang gelombang

366 nm

Keterangan:


dengan penampak bercak

serium sulfat

Keterangan:

ekstrak kultur medium actino 1 dilihat pada panjang gelombang 254 nm

28


Gambar 4.1 KLT ekstrak kultur medium YSB dan Actino 1 dengan fase

gerak diklormetan : metanol (10:1)

Keterangan:

No No

4.2 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri

Skrining dilakukan untuk menentukan dan memilih isolat Aktinomisetes

yang mempunyai aktivitas antibakteri. Skrining dilakukan dengan uji

penghambatan terhadap bakteri uji menggunakan metode bioautografi. Bakteri uji

yang digunakan adalah Staphylococcus aureus yang merupakan Gram positif dan

Escherichia coli yang termasuk Gram negatif yang diidentifikasi dengan

pewarnaan Gram. Dari hasil pewarnaan menunjukkan bahwa bakteri uji yang

digunakan merupakan bakteri Gram positif dan negatif yang ditunjukkan dengan

warna ungu pada bakteri Staphylococcus aureus dan merah pada pewarnaan Gram

bakteri Escherichia coli (Lampiran 7).

1. Ekstrak isolat InaCC A63 9. Ekstrak isolat InaCC A83 2. Ekstrak isolat InaCC A64 10. Ekstrak isolat InaCC A85 3. Ekstrak isolat InaCC A67 11. Ekstrak isolat InaCC A89 4. Ekstrak isolat InaCC A72 12. Ekstrak isolat InaCC A94 5. Ekstrak isolat InaCC A74 13. Ekstrak isolat InaCC A0112 6. Ekstrak isolat InaCC A75 14. Ekstrak isolat InaCC A0114 7. Ekstrak isolat InaCC A78 15. Ekstrak isolat InaCC A0116 8. Ekstrak isolat InaCC A82 16 Ekstrak medium YSB/Actino 1

Keterangan:

Ekstrak kultur medium actino 1 dilihat pada panjang gelombang 366 nm

Keterangan:


dengan penampak bercak

serium sulfat

29


Ekstrak yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri ditunjukkan dengan

terbentuknya daerah tidak berwarna atau bening diantara latar belakang ungu pada

plat setelah disemprot dengan larutan INT sebagai indikator. Hal ini disebabkan

karena terbentuknya pewarna formazan berwarna ungu yang dikarenakan adanya

transfer elektron dari NADH ke iodonitrotetrazolium (INT) pada bakteri yang

aktif (Angeh, 2006).

Dari 15 isolat yang sudah dikultivasi pada medium YSB (Yeast Starch

Broth) terdapat 4 isolat yang mampu menghambat Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli, 4 isolat tersebut yaitu InaCC A64, InaCC A67, InaCC A75 dan

InaCC A89 dengan diameter zona penghambatan bakteri Staphylococcus aureus

berturut – turut yaitu 0,6 cm, 0,8 cm, 0,4 cm dan 0,5 cm, sedangkan diameter

penghambatan bakteri Escherichia coli pada isolat InaCC A64, InaCC A75 dan

InaCC A89 mempunyai diameter 0,7 cm dan A67 mempunyai diameter 0,9 cm.

Sedangkan 15 isolat yang telah dikultivasi pada medium Actino 1 terdapat 4 isolat

juga yang mampu menghambat Staphylococcus aureus dan Escherichia coli,

keempat isolat tersebut antara lain InaCC A67, InaCC A75, InaCC A89 dan

InaCC A94 dengan diameter zona penghambatan bakteri Staphylococcus aureus

berturut – turut 0,9 cm, 0,9 cm, 0,6 cm dan 0,9 cm. Pada penghambatan bakteri

Escherichia coli mempunyai diameter 0,9 cm pada InaCC A67 dan InaCC A75,

0,7 cm pada InaCC A89 dan 1 cm pada InaCC A94. Berdasarkan zona hambat

yang terbentuk dari hasil kultivasi medium YSB, InaCC A67 menunjukkan isolat

yang paling besar dalam menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli, tetapi dalam menghambat Staphylococcus aureus lebih besar

dari pada penghambatan terhadap Escherichia coli. Sedangkan hasil kultivasi

medium Actino 1 menunjukkan isolat InaCC A67, InaCC A75 dan InaCC A94

mempunyai zona hambat yang sama besar. Tetapi dari keempat isolat yang

menunjukkan adanya penghambatan bakteri, diameter penghambatan tersebut

tidak lebih besar dari diameter penghambatan antibiotik komersial yakni

kloramfenikol yang mempunyai diameter penghambatan bakteri Staphylococcus

aureus 2,5 cm pada plat yang ditotolkan sebanyak 5 µL dan 3,2 cm dengan

penotolan 10 µL. Sedangkan pada penghambatan bakteri Escherichia coli

diameter yang terbentuk pada penotolan 5 µL dan 10 µL yaitu 2,8 cm dan 3,3 cm.

30


(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

Gambar 4.2 Hasil skrining antibakteri dari ekstrak hasil kultivasi dengan metode

bioautografi (a) hasil kultivasi medium YSB dengan bakteri uji

S.aureus, (b) hasil kultivasi medium YSB dengan bakteri uji E.coli,

(c) hasil kultivasi medium Actino 1 dengan bakteri uji S.aureus, (d)

hasil kultivasi medium Actino 1 dengan bakteri uji E.coli, (e)

kloramfenikol dengan bakteri uji S.aureus, (f) kloramfenikol dengan

bakteri uji E.coli.

Keterangan:

1 Ekstrak isolat InaCC A63 9. Ekstrak isolat InaCC A83 2. Ekstrak isolat InaCC A64 10. Ekstrak isolat InaCC A85 3. Ekstrak isolat InaCC A67 11. Ekstrak isolat InaCC A89 4. Ekstrak isolat InaCC A72 12. Ekstrak isolat InaCC A94 5. Ekstrak isolat InaCC A74 13. Ekstrak isolat InaCC A0112 6. Ekstrak isolat InaCC A75 14. Ekstrak isolat InaCC A0114 7. Ekstrak isolat InaCC A78 15. Ekstrak isolat InaCC A0116 8. Ekstrak isolat InaCC A82 16 Ekstrak medium YSB/Actino 1

No No

31


Tabel 4.2 Hasil skrining antibakteri metode bioautografi

No

Ekstrak isolat

Diameter hambat ( cm)

YSB Actino 1

SA EC SA EC

1 InaCC A63 NA NA NA NA 2 InaCC A64 0,6 0,7 NA NA

3 InaCC A67 0,8 0,9 0,9 0,9

4 InaCC A72 NA NA NA NA


6 InaCC A75 0,4 0,7 0,9 0,9

7 InaCC A78 NA NA NA NA 8 InaCC A82 NA NA NA NA



11 InaCC A89 0,5 0,7 0,6 0,7 12 InaCC A94 NA NA 0,9 1 13 InaCC A0112 NA NA NA NA



16 - NA NA NA NA SA = Staphylococcus aureus ; EC = Escherichia coli ; NA = Non Aktif

Pada hasil bioautografi menunjukkan bahwa kultivasi isolat Aktinomisetes

pada 2 medium berbeda mempunyai aktivitas penghambatan bakteri uji yang tidak

sama. Isolat InaCC A64 yang dikultivasi pada medium YSB mempunyai aktivitas

dalam menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan pada kultivasi medium

Actino 1 tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Sebaliknya isolat

InaCC A94 mampu menghambat pertumbuhan bakteri ketika dikultivasi pada

medium Actino 1.

Sebanyak 5 isolat yang menunjukan aktivitas dalam menghambat

pertumbuhan bakteri selanjutnya dilakukan bioautografi elusi yang bertujuan

untuk mengetahui spot yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Bioautografi

elusi dilakukan menggunakan plat KLT dengan fase gerak diklorometan : metanol

(10:1), yang selanjutnya pola yang terbentuk diamati dibawah lampu UV dengan

panjang gelombang 254 dan 366 nm. Bioautografi elusi ditunjukkan pada Gambar

4.3.

32


(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g) (h) (i)

Keterangan (a) KLT ekstrak kultur medium YSB pada UV 254 nm (b) KLT ekstrak kultur medium YSB pada UV 366 nm (c) Bioautografi ekstrak kultur medium YSB degan bakteri uji S.aureus

Keterangan (d) KLT ekstrak kultur medium YSB pada UV 254 nm (e) KLT ekstrak kultur medium YSB pada UV 366 nm (f) Bioautografi ekstrak kultur medium YSB degan bakteri uji E.coli

Keterangan (g) KLT ekstrak kultur medium Actino 1 pada UV 254 nm (h) KLT ekstrak kultur medium Actino 1 pada UV 366 nm (i) Bioautografi ekstrak kultur medium Actino 1 degan bakteri uji S.aureus

33


(j) (k) (l)

Gambar 4.3 Hasil Bioautografi elusi menggunakan fase gerak diklorometan :

metanol (10:1).

Keterangan :

Berdasarkan zona hambat yang terbentuk dari isolat InaCC A75

(ekstrak no 6) yang dikultivasi pada medium Actino 1 mempunyai daerah

penghambatan bakteri sama besar dengan InaCC A67 dan InaCC A94, namun

berdasarkan pola pemisahan metabolit yang dihasilkan pada KLT menunjukkan

bahwa isolat InaCC A75 mempunyai pola bercak yang mudah dipisahkan bila

dibandingkan dengan ekstrak dari isolat lain. Sehingga isolat InaCC A75 yang

mempunyai aktiitas sebagai antibakteri dilakukan scaling up yang selanjutnya

akan dilakukan isolasi untuk mendapatkan senyawa aktif tersebut.

4.3 Scaling Up Isolat InaCC A75 dalam Medium Actino 1

Isolat InaCC A75 ini diteliti lebih lanjut dengan dikultivasi dalam medium

Actino 1 yang mampu menghasilkan metabolit sekunder yang mempunyai

kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri. Scaling up dilakukan

sebanyak 2 liter yang terbagi dalam 10 erlenmeyer 500 mL dan diinkubasi pada

Keterangan (j) KLT ekstrak kultur medium Actino 1 pada UV 254 nm (k) KLT ekstrak kultur medium Actino 1 pada UV 366 nm (l) Bioautografi ekstrak kultur medium Actino 1 degan bakteri uji E.coli

No

2. Ekstrak isolat InaCC A64 11. Ekstrak isolat InaCC A89 3. Ekstrak isolat InaCC A67 12. Ekstrak isolat InaCC A94 6. Ekstrak isolat InaCC A75

No

34


shaker incubator dengan kekuatan 130 rpm selama 2 minggu, diharapkan dengan

volume kultivasi yang diperbesar dan waktu inkubasi yang diperpanjang mampu

menghasilkan metabolit sekunder lebih maksimal.

Berat ekstrak etil asetat InaCC A75 yang didapat sebanyak 146,3 mg

berwarna coklat kehijauan dengan aroma tanah yang menyengat. Ekstrak etil

asetat InaCC A75 selanjutnya dilihat pola kromatografi lapis tipis dengan

menggunakan fase gerak diklorometan : metanol (10 : 1). Setelah dilakukan uji

KLT, diperoleh dua spot yang menunjukkan nilai Rf yang sama bila dibandingkan

dengan uji bioautografi elusi yang masing – masing memiliki nilai Rf 0,41

dengan warna kuning dan spot berwarna ungu dengan Rf 0,37. Pola KLT

ditunjukkan pada Gambar 4.4.

(a) (b) (c)

Gambar 4.4 Hasil KLT ekstrak A75 dengan fase gerak diklorometan : metanol

(10:1) dengan penampak bercak (a) UV 254 nm, (b) UV 366 nm, (c)

penampak bercak serium sulfat

Optimasi dilakukan untuk mencari fase gerak yang tepat, yang akan

digunakan dalam isolasi ekstrak InaCC A75 untuk mendapatkan spot kuning dan

ungu yang aktif sebagai antibakteri. Optimasi yang dilakukan menggunakan KLT

dengan fase gerak kloroform : etanol (10:1), kloroform : metanol (15:1), dan

heksan : etil asetat (1:1). Berdasarkan hasil optimasi, dipilih fase gerak kloroform

: etanol (10:1) yang digunakan untuk melakukan pemisahan dengan kromatografi

35


kolom, karena spot senyawa yang berwarna kuning terlihat memisah dengan spot

lainnya tetapi masih menempel dengan spot yang berwarna ungu, tetapi lebih baik

bila dibandingkan dengan fase gerak yang lain, pada eluen kloroform : metanol

spot terlihat menumpuk, sedangkan pada eluen heksan : etil asetat spot target tidak

dapat terelusi.

4.4 Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif Ekstrak InaCC A 75

Fraksinasi ekstrak InaCC A75 sebanyak 115 mg dengan kromatografi

kolom menggunakan fase diam silica gel 60 mesh 70 – 230 dan fase gerak

kloroform : etanol ( 10:1 ) didapatkan 77 fraksi yang ditampung dalam tabung

reaksi. Berdasarkan pola KLT dari 77 fraksi didapatkan 10 fraksi gabungan yang

mempunyai pola pemisahan yang sama.

Tabel 4.3 Hasil kromatografi kolom ekstrak InaCC A75

No Fraksi Warna Berat ( mg )

1 1 Kuning 20,4

2 2 Kuning kecoklatan 18,4


4 4 Ungu kekuningan 13,2

5 5 Ungu kekuningan 16,4

6 6 Kuning keunguan 7

7 7 Kuning 1,4

8 8 Kuning 3,3


10 10 Coklat 20,3

Berdasarkan hasil kromatografi lapis tipis pada semua fraksi senyawa

belum terpisah secara sempurna, yang ditunjukan dengan adanya spot lebih dari

satu. Dari hasil KLT yang dibandingkan dengan hasil bioautografi menunjukan

bahwa fraksi 4, fraksi 5, fraksi 6 dan fraksi 7 diduga mempunyai senyawa aktif

sebagai antibakteri paling banyak dimana pada hasil KLT terlihat spot berwarna

kuning terang, sedangkan dibawah sinar UV 366 terlihat berpendar paling terang.

Pola pemisahan KLT fraksinasi ekstrak etil asetat InaCC A 75 ditunjukkan pada

Gambar 4.5.

36


(a) (b)

(c) (d)

Gambar 4.5 KLT hasil fraksinasi ekstrak A75 menggunakan fase gerak

kloroform : etanol ( 10:1) yang dideteksi dengan (a) UV 254 nm,

(b) UV 366 nm, (c) sebelum disemprot pereaksi serium sulfat, (d)

setelah disemprot serium sulfat

Fraksi 4 yang diduga terdapat senyawa aktif antibakteri, dilakukan

pemisahan lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam

Sephadex LH-20 dikarenakan senyawa target sulit dipisahkan dengan

menggunakan silika gel. Fraksi 4 dengan berat 13,2 mg dapat larut sempurna

dalam etanol menghasilkan warna ungu kekuningan, sehingga etanol digunakan

sebagai fase gerak. Sephadex LH-20 digunakan untuk memisahkan senyawa

berdasarkan berat molekul, dimana molekul kecil akan memasuki pori – pori gel

sedangkan molekul besar akan melewati sela – sela gel sehingga lebih cepat turun

dari pada molekul yang melewati pori – pori. Spot kuning mempunyai berat

molekul yang lebih besar dibandingkan dengan spot ungu, hal ini terlihat ketika

kromatografi kolom sedang berlangsung, spot kuning turun terlebih dahulu.

Dari pemisahan fraksi 4 didapatkan 23 fraksi yang ditampung dalam

tabung reaksi, berdasarkan spot pada pola KLT yang dilakukan dengan

37


menggunakan fase gerak kloroform : etanol (10:1), diperoleh 6 fraksi gabungan

yang ditunjukkan pada Gambar 4.6 dan berat fraksi pada Tabel 4.4.

(a) (b) (c)

Gambar 4.6 KLT hasil Fraksinasi F4 meggunakan fase gerak kloroform : etanol

(10:1) pada penampak bercak (a) UV 254 nm, (b) UV 366 nm, (c)

serium sulfat

Tabel 4.4 Hasil kromatografi kolom fraksi 4


1 4.1 Putih 1,4

2 4.2 Kuning 7,5

3 4.3 Kuning 0,7

4 4.4 Kuning keunguan 0,4

5 4.5 Ungu 0,8

6 4.6 Kuning keunguan 0,4

Dari 6 fraksi yang diperoleh hasil fraksinasi F4 menunjukkan adanya spot

tunggal pada F4.2 dengan spot berwarna kuning, dan dapat terlihat pada panjang

gelombang 254 nm, serta berpendar pada panjang gelombang 366 nm. Fraksi 4.2

mempunyai warna kuning dan berat 7,5 mg. F4.2 yang menunjukkan adanya spot

tunggal dilakukan KLT dengan menggunakan fase gerak yang berbeda untuk

membuktikan spot tunggal yang ada. Fase gerak menggunakan kloroform :

metanol dengan perbandingan 5: 1 yang ditunjukkan pada Gambar 4.7.

38


(a) (b) (c)

Gambar 4.7 Hasil KLT senyawa F4.2 dengan menggunakan fase gerak kloroform

: metanol (5:1) mempunyai nilai Rf 0,67 pada penampak (a) UV

254 nm (b) UV 366 nm, (c) serium sulfat.

Berbeda dengan fraksi 4, gabungan fraksi 5 dan 6 tidak larut sempurna

dalam etanol 96%, sehingga pada fraksi 5 dan 6 perlu dilakukan filtrasi untuk

memisahkan fraksi yang larut dalam etanol dan yang tidak larut menggunakan

kapas yang dimasukan dalam pipet tetes. Setelah didapatkan filtrat etanol

selanjutnya dilakukan kromatografi kolom dengan menggunakan fase diam

Sephadex dan fase gerak etanol 96 %. Dari hasil kromatografi kolom didapatkan 4

fraksi gabungan yang ditunjukan pada Gambar 4.8.

(a) (b) (c)

39


Gambar 4.8 KLT hasil fraksinasi F5 menggunakan fase gerak kloroform : etanol

(10:1) dengan penampak bercak (a) UV 254 nm, (b) UV 366 nm, (c)

serium sulfat

Tabel 4.5 Hasil kromatografi kolom fraksi 5


1 5.1 Putih 0,4

2 5.2 Kuning 7,5

3 5.3 Kuning keunguan 2

4 5.4 ungu 2,4

4.5 Penentuan Nilai MIC ( Minimum Inhibitory Concentration )

MIC dilakukan untuk mengetahui konsentrasi minimum dari metabolit

yang diproduksi oleh isolat terpilih dalam menghambat bakteri uji. Hasil

penentuan nilai MIC fraksi 4.2 dan 5.4 yang telah difraksinasi dari ekstrak InaCC

A75 medium actino 1 menunjukan bahwa secara pengamatan visual fraksi 4.2

pada konsentrasi tertentu dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang

ditunjukkan dengan tidak terbentuknya kekeruhan atau tidak terjadinya perubahan

warna menjadi merah setelah ditambahkan INT, sedangkan fraksi 5.4 tidak

menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri. Hasil MIC

ditunjukan pada lampiran 10.

Tabel 4.6 Data nilai MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

No Bakteri uji Konsentrasi minimum penghambatan ( µg/ mL) Senyawa

4.2 Fraksi

5.4 Kloramfenikol Eritromisin

1 Staphylococcus aureus

64 - 4 1

2 Escherichia coli

≥ 128 ≥ 128 8 64

Senyawa F4.2 lebih potensial dalam menghambat bakteri Gram positif

Staphylococcus aureus dengan nilai MIC 64 µg/mL dibandingkan penghambatan

terhadap Escherichia coli. Nilai MIC yang rendah menunjukkan kemampuan

40


antibiotik yang tinggi. Makin rendah MIC, semakin bagus aktivitasnya. Namun

aktivitas antibakteri senyawa F4.2 tidak lebih besar daripada kloramfenikol dan

eritromisin dalam menghambat bakteri Staphylococcus aureus maupun

Escherichia coli.


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari penelitian yang telah dilakukan dalam skrining dan isolasi metabolit

sekunder sebagai antibakteri dari beberapa isolat Aktinomisetes, dapat diambil

kesimpulan sebagai berikut:

1. Dari 15 isolat Aktinomisetes yang telah diskrining, terdapat 5 isolat

Aktinomisetes yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri yaitu isolat

InaCC A64, InaCC A67, InaCC A75, InaCC A89 dan InaCC A94 dengan

diameter penghambatan antara 0,4 – 1 cm.

2. Senyawa F4.2 dari isolat InaCC A 75 mempunyai aktivitas antibakteri yang

lebih peka terhadap Staphylococcus aureus dibandingkan Eschericia coli

3. Secara keseluruhan senyawa F4.2 dari isolat InaCC A 75 memiliki aktivitas

antibakteri yang masih lemah dibandingkan terhadap antibiotik kloramfenikol

dan eritromisin

5.2 Saran

1. Diperlukan analisa lebih lanjut dalam menentukan struktur molekul senyawa

F4.2 yang aktif sebagai antibakteri.

2. Diperlukan penelitian lebih lanjut dalam mengisolasi senyawa antibakteri dari

Aktinomisetes lain, mengingat ada beberapa isolat yang mempunyai aktivitas

antibakteri yang belum dapat diidentifikasi pada penelitian ini.

42


DAFTAR REFERENSI

Adegboye, Mobolaji Felicia and Olubukola Oluranti Babalola. 2012. Taxonomy

and Ecology of Antibiotic Producing Actinomycetes. African Journal of

Agricultural Research 7 (15):2255-2261

Agusta, Andria, Praptiwi, Yuliasri Jamal, Ahmad Fathoni. 2010. Antimicrobial

Metabolite from the Culture of Endophytic Fungus AFK-8 Isolated from Kayu

Kuning [Archangelisia flava (L.) Merr.]. International Seminar Biotechnology

for Enhancement the Tropical Biodiversity

Angeh, J.E. 2006. Isolation and Characterization of Antibacterial Compounds.

Thesis,University of Pretoria

Anonim. 2004. Purification by Liquid Chromatography. Billerica: Millipore

Corporation

Attimarad, Sunil Laxman, Gaviraj N. Ediga, Asif Abdulrahiman Karigar,

Ravindra Karadi, Nagesh Chandrashekhar, Chandrashekar Shivana. 2012.

Screening, Isolation and Purification of Antibacterial Agents from Marine

Actinomycetes. International Curent Pharmaceutical Journal 1(12):394-402

Berdy, Janos. 2005. Bioactive Microbial Metabolites: a personal view Journal of

Antibiotics, 58(1): 1–26, 2005

Choma, Irena M, Edyta M Grzelak. 2010. Bioautography Detection in Thin -

Layer Chromatography. Journal of Chromatography A Chroma-351708

Cushnie, T. P. Tim, Andrew J. Lamb. 2005. Antimicrobial Activity of

Flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents 26(2005) 343-356

43


Gandjar, Ibnu Gholib, Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisa.

Yogyakarta : Pustaka Pelajar

Gonzales J. Barrios, F. J. Fernandez, A. Tomasini. 2003. Microbial Secondary

Metabolites Production and Strain Improvement. Indian Journal of

Biotechnology. 2:322-333

Gopikrishnan,V., Pazhamurugan R, T. Shanmuga Sundaram, M. Radhakrishnan,

R. Balagurunathan. 2012. Bioactive Potential of Actinobacteria Against Drug

Resistant Pathogens. Journal of Applied Pharmaceutical Science 02 (05): 167-

173

Gurung, Tara Devi, Chringma Sherpa, Vishwanath Prasad Agrawal, Binod

Lekhak. 2009. Isolation and Chracterization of Antibacterial Actinomycetes from

Soil Sample of Kalapatthar, Mount Everest Region. Nepal Journal of Science

and Tehnology 10 :173-182

He, Qi Rui. 2010. Studies on Optimization of Fermentation Process of

Streptomyces Lavendulae Xjy Strain and the Control Effect of Tomato Leaf

Mould. Dissertation, Northwest Agriculture and Forestry University

Jawetz, Ernest, Joseph L. Melnick, Edward A. Adelberg, Geo F. Brooks, Janet S

Butel, L Nicholas Ornston. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Alih

bahasa: Edi Nugroho, RF Maulany. Jakarta : EGC

Jensen, P.R., Mincer, T.J., Williams, P.G. and Fenical, W. 2005. Marine

Actinomycete Diversity and Natural Product Discovery. Antonie van

Leeuwenhoek 87: 43-48

Khanna, Monisha, Renu Solanki, and Rup Lal. 2011. Selective Isolation of Rare

Actinomycetes Producing Novel Antimicroba Compounds. International Jurnal

of Advanced Biotechnology and Research. 2( 3):357-375

44


Kayser, Fritz H., Kurt A. Bienz, Johannes Eckert, Rolf M. Zinkernagel, . 2005.

Medical Microbioly. New York : Thieme Stuttgart

Kesavan, S Sudha, S.Vijayalakshmi, S.Usha Nandhini, M.Bhavani Latha,

M.Masilamani Selvan. 2011. Application of Brine Shrimp Bioassay for

Screening Cytotoxic Actinomycetes. International Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Science Research

Mangamuri, Usha Kiranmayi, Vijayalaksmi Muvva, Sudhakar Poda,

Sreenivasulu Kamma. 2012. Isolation, Identification and Molecular

Characterization of Rare Actinomycetes from Mangrove Ecosystem of

Nizampatnam. Malaysian Journal of Microbiology, 8(2):83-91

Naine, Jemimah, Nasimunislam N., Vaishnavi B., Mohanasrinivasan V.,

Subathra Devi C. 2012. Isolation of Soil Actinomycetes Inhabiting Amrithi

Forest for The Potential Source of Bioactive Compounds. Asian Journal of

Pharmaceutical and Clinical Research 5( 2),2012

Ng, Zoe Yi dan Selvaraj Amsanevi. 2012. Isolation, Screening and

Characteristion of Antibiotic Producing Actinomycetes from Rhizosphere Region

of Different Plants from a Farm of Sungai Ramal Luar, Malaysia. J of Advanced

Biomedical & Pathology 2(3):96-107

Okami, Y, K Hotta. 1988. Search and Discovery of New Antibiotics. In:

Actinomycetes in Biotechnology (Eds. M Good Fellow, S T Williams and

Mordarski) Academic press, London

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga

Rahman, Atta ur, M.Iqbal Choudhary, William J.Thomsen, 2005. Bioassay

Techniques for Drug Development. Harwood academic publishers (hal :14)

45


Rahman, Md Ajijur, Md Mohamad Zahidul Islam, Md.Anwar U.I. Islam. 2011.

Antibacterial Activities of Actinomcete Isolates Collected from Soils of

Rajshahi, Bangladesh. Biotechnology Research International 2011, Article ID

857925

S, Ramesh, Rajesh M., Mathiavanan N. 2009. Characteristic of a Thermostable

Alkaline Protease Produced by Marine Streptomyces fungicides. Bioprocess

Biosyst Eng 2009;32:791-800

Saga, Tomoo, Keizo Yamaguchi. 2009. History of Antimicrobial Agents and

Resistant. Research and Reviews. JMAJ 52(2): 103-108

Sarker, Satyajit D, Zahid Latif, Alexander I Gray. 2006. Natural Product

Isolation, Second Edition. Totowa, New Jersey : Humana Press

Solanki, Renu, Monisha Khanna, Rup Lal. 2008. Bioactive Compounds from

Marine Actinomycetes. Indian Journal Microbial. (December 2008) 48:410-431

Song, Qin, Yun Huang, Hui Yang. 2012. Optimization of Fermentation

Conditions for Antibiotic Production by Actinomycetes YJ1 Strain against

Sclerotinia scleritiorum. Journal of Agricultural Science;Vol.4,No.7

Sosa, Anibal de J, Denis K Byarugaba, Carlos F Amabile Cuevas, Po Ren Hsueh,

Samuel Kariuki, Iruka N Okeke. 2010. Antimicrobial Resistance in Developing

Countries. New York : Springer

Talamona, Angelo. 2005. Laboratory Chromatography Guide. Switzerland :

Buchi Labortechnik

Valli, Suvanthi Sugasini S., Aysha O.S., Nirmala P., Vinoth Kumar P, Reena A.

2012. Antimicrobial Potential of Actinomycetes Species Isolated from Marine

Envvironment. Asian Pasific Journal of Tropical Biomedicine (2012) 469-473

46


Vimal V, Rajan B.M., Kannabiran K. 2009. Antimicrobial Activity of Marine

Actinomycetes, Nocardiopsis sp. Asian Journal Medical Science 2009; 1(2):57-

63

Valgas, Cleidson, Simone Machado de Souza, Elza F A Smania, Artur Smania Jr.

2006. Screening Method to Deterrmine Antibacterial Activity of Natural

Products. Brazilian Journal Microbiologi 38:369-380, 2007

Vanden Berghe, D.A, Vlietink, A.J. 1991. Screening Methods for Antibacterial

and Antiviral Agents from Higher Plants. In : Dey, P.M.,Harbone, J.D (eds),

Methods in Plant Biochemistry. Academic Press. London

Watson D. G. 2010. Analisis farmasi Edisi 2. Jakarta: EGC

47


Lampiran 1. Alur Kerja

15 isolat aktinomisetes

Peremajaan medium YSA

Kultivasi medium YSB

Kultivasi medium Actino 1

Ekstraksi dengan pelarut etil asetat : metanol (4 :1 )

KLT dan Skrining antibakteri

Scaling up isolat yang aktif (A75) medium Actino 1

Ekstraksi pelarut etil asetat

Kromatografi kolom

Purifikasi

Penentuan nilai MIC

48


Lampiran 2. Uji Bioautografi Antibakteri

Pembuatan media BHI dan sterilisasi alat yang digunakan

Pembuatan suspensi bakteri uji dengan media BHI

Pembuatan media bioautografi dengan BHI

45 mL + suspensi bakteri 5 mL

Inkubasi pada sheker incubator 100 rpm 370 C

selama 20 jam

Masing – masing ekstrak dan kloramfenikol ditotol

pada plat KLT

Diinkubasi ± 1 jam pada suhu 370 C

Plat dicelupkan dalam media ± 5 detik dan diletakan pada petri

yang terdapat tissue yang dibasahi dengan aquadet steril

Inkubasi pada suhu 370 C selama 20 jam

Disemprot dengan INT, dan diinkubasi pada suhu

370 C selama 1 jam

Pengamatan

49


Lampiran 3. Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri A75

Ekstrak etil asetat A75 (115 mg)

Kromatografi kolom dengan fase diam silica dan fase gerak kloroform : etanol (10:1)

F1 F3 F5 F7 F9

F2 F4 F6 F8 F10

Kromatografi kolom dengan fase diam sephadex dan fase gerak etanol 96 %

F4.1 F4.3 F4.5

F4.2 F4.4 F4.6

F5

Penentuan nilai MIC

50


( Lanjutan )

F5

Filtrasi

Larut etanol Tidak larut etanol

Kromatografi kolom fase diam sephadex dan fase gerak etanol 96 %

F5.1 F5.2 F5.3 F5.4

Penentuan nilai MIC

51


Lampiran 4. Isolat Aktinomisetes

InaCC A63

InaCC A64

InaCC A67

InaCC A72

InaCC A74

InaCC A75

InaCC A78

InaCC A82

InaCC A83

InaCC A85

InaCC A89

InaCC A94

InaCC A0112

InaCC A0114

InaCC A0116

52


Lampiran 5. Hasil Kultivasi

Medium YSB Medium Actino 1 Medium YSB Medium Actino 1

InaCC A63

InaCC A74

InaCC A64

InaCC A75

InaCC A67

InaCC A78

InaCC A72

InaCC A82

53


( Lanjutan )

Medium YSB Medium Actino 1 Medium YSB Medium Actino 1

InaCC A83

InaCC A0112

InaCC A85

InaCC A0114

InaCC A89

InaCC A0116

InaCC A94

Medium

54


Lampiran 6. Morfologi isolat Aktinomisetes

InaCC A63

InaCC A64

InaCC A67

InaCC A72

InaCC A74

InaCC A75

InaCC A78

InaCC A82

InaCC A83

InaCC A85

InaCC A89

InaCC A94

InaCC A0112

InaCC A0114

InaCC A0116

55


Lampiran 7. Bakteri Uji

Staphylococcus aureus Eschericia coli

Pewarnaan bakteri Pewarnaan bakteri Staphylococcus aureus Eschericia coli

56


Lampiran 8. Hasil ekstraksi dan fraksinasi

Ekstrak isolat Aktinomisetes medium YSB

Ekstrak isolat Aktinomisetes medium actino 1

Fraksinasi ekstrak isolat A75

Fraksinasi F4 (ekstrak isolat A75)

Fraksinasi F5 ( ekstrak isolat A75)

57


Lampiran 9. Hasil MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

Bakteri Uji Staphylococcus aureus

Bakteri Uji Eschericia coli

128 µg/mL

64 µg/mL

32 µg/mL

16 µg/mL

8 µg/mL

4 µg/mL

2 µg/mL

1 µg/mL

MHB 2

MHB 1

MHB 1 + bakteri

MHB 1 + DMSO + bakteri

MHB 1 + etanol + bakteri

F 4.2 F 5.4 Kloramfenikol Eritromisin

128 µg/mL

64 µg/mL

32 µg/mL

16 µg/mL

8 µg/mL

4 µg/mL

2 µg/mL

1 µg/mL

MHB 2

MHB 1

MHB 1 + bakteri

MHB 1 + DMSO + bakteri

MHB 1 + etanol + bakteri

F 4.2 F 5.4 Kloramfenikol Eritromisin

58


Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi sampel uji

Berat F4.2 = 7,5 mg dibuat konsentrasi 2 mg/mL

=

= x mL

3,75 mL = x Dari 7,5 mg/3,75 mL, diambil sebanyak 512 µg

=

x = 0,256 mL = 256 µL

Berat F5.4 = 2,4 mg dibuat konsentrasi 1 mg/mL

=

= x mL

2,4 mL = x

Dari 2,4 mg/2,4 mL, diambil sebanyak 512 µg

=

x = 0,512 mL = 512 µL

59


Lampiran 11. Perhitungan pengenceran suspensi bakteri

1. Bakteri Staphylococcus aureus Koloni yang muncul = 65 Faktor pengenceran = 108

Jumlah koloni =

Jumlah koloni =

Jumlah koloni = 65 x 109 CFU/mL = 6,5 x 1010 CFU/mL Dilakukan pengenceran sehingga didapatkan jumlah koloni 6,5 x 105 CFU/mL

2. Bakteri Eschericia coli Koloni yang muncul = 105 Faktor pengenceran = 106

Jumlah koloni =

Jumlah koloni =

Jumlah koloni = 105 x 107 CFU/mL = 1,05 x 109 CFU/mL

Dilakukan pengenceran sehingga didapatkan jumlah koloni 1,05 x 105 CFU/mL

Koloni 109

50 µL 200 µL

4950 µL MHB

19800 µL

MHB

Koloni 107 Koloni 105

Suspensi

bakteri

Koloni 1010 Koloni 109 Koloni 107 Koloni 105

500 µL 50 µL 200 µL

Suspensi

bakteri

4500 µL

MHB

4950 µL

MHB 19800 µL

MHB

60


Lampiran 12. Komposisi dan cara pembuatan medium

No.

Medium Komposisi Cara pembuatan

1. YSB (Yeast Starch Broth)

Yeast extract 2 g Starch 10 g Air 1 L

12 g YSB dilarutkan dalam 1 L air dengan cara dipanaskan, sterilisasi pada autoklaf 1210C selama 15 menit

2. YSA (Yeast Starch Agar)

Yeast extract 2 g Starch 10 g Agar 15 g Air 1 L

27 g YSA dilarutkan dalam 1 L air dengan cara dipanaskan, sterilisasi pada autoklaf 1210C selama 15 menit

3. Actino 1 Polypepton 5 g Yeast extract 3 g Air 1 L

8 g Actino 1 dilarutkan dalm 1 L air dengan cara dilakukan stirrer, sterilisasi pada autoklaf 1210C selama 15 menit

4. BHI (Brain Heart Infusion)

Brain heart infusion 6 g Peptic digest of animal tissue 6g NaCl 5g Dextrose 3g Pancreatic digest of gelatin 14,5 g Disodium phosphate 2,5g

36 g BHI dilarutkan dalam 1 L air dengan cara dipanaskan, sterilisasi pada autoklaf 1210C selama 15 menit

5. MHA (Mueller Hinton Agar)

Beef extract 2 g Acid hydrolysate of casein 17,5 g Starch 1,5 g Agar 17 g Air 1 L

38 g MHA dilarutkan dalam 1 L air, dan dipanaskan agar larut sempurna, sterilisasi pada autoklaf 1210C selama 15 menit

6. MHB (Mueller Hinton Broth)

Beef extract 2 g Acid hydrolysate of casein 17,5 g Starch 1,5 g Air 1 L

21 g MHB dilarutkan dalam 1 L air, dan dipanaskan agar larut sempurna, sterilisasi pada autoklaf 1210C selama 15 menit

61


Lampiran 13. Alat – alat yang digunakan

Gambar Keterangan Gambar Keterangan

Rotary evaporator (Heidolp WB 2000 )

Inkubator (WTC Binder)

Kromatografi kolom D = 2 cm, t= 60 cm Fase diam silica gel 70 – 230 mesh Fase gerak kloroform : etanol (10:1)

Kromatografi kolom D = 0,5 cm, t = 100 cm Fase diam Sephadex LH 20 Fase gerak etanol 96%

Autoklaf (HIRAYAMA)

Shaker incubator (innova 2100)

Lemari asam

Laminar air flow (SPEG AIR TECH )

62


( Lanjutan )

Gambar Keterangan Gambar Keterangan

UV cabinet ( CAMAG )

Timbangan analitik (AND)

Shaker incubator (KOTTERMANN )

Microtiter plate (GILSON)

Documents

SKRINING DAN ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI DARI … · Isolasi metabolit bioaktif dengan menggunakan silica gel mesh 70 – 230 sebagai fase diam dalam kromatografi kolom yang