Slominska Ewa

7/25/2019 Slominska Ewa

1/47

GDASKI UNIWERSYTET MEDYCZNY

EWA M. SOMISKA

METABOLITY NIKOTYNAMIDU I ICH ROLA

W FIZJOLOGII I PATOLOGII CZOWIEKA

Rozprawa habilitacyjna

Katedra i Zakad BiochemiiKierownik Katedry i Zakadu Biochemii

Prof. dr hab. med. Julian wierczyski

Gdask 2009


2/47

Wydano za zgodSenackiej Komisji Wydawnictw

Gdaskiego Uniwersytetu Medycznego

Wydawca: Gdaski Uniwersytet MedycznyDruk: DziaWydawnictw GUMed

ul. Marii Skodowskiej-Curie 3aZlecenie: KW/151/2009


3/47

Spis treci

Wykaz wybranych publikacji bdcych przedmiotemrozprawy habilitacyjnej

5

Wykaz stosowanych skrtw 6

1. Wstp 7

1.1. Metabolizm nikotynamidu 71.2. Stenia nikotynamidu i jego metabolitw w pynach

biologicznych11

1.3. Rola nikotynamidu i jego metabolitw 151.4. Nowe metabolity przemian nikotynamidu 17

2. Cel bada 20

3. Metody 21

3.1. Opracowanie metody oznaczania stemetabolitwnikotynamidu

21

4. Wyniki 23

4.1. Stenia metabolitw nikotynamidu w osoczu ludzi 234.1.1. Stenia metabolitw nikotynamidu w osoczu chorych

z przewlekniewydolnocinerek23

4.1.2. Zalene od wieku zmiany stenia metabolitw nikotynamiduw osoczu osb zdrowych

25

4.2. Pochodne nikotynamidu inhibitorami polimerazy poli(ADP-rybozy)

27

4.3. Cytoprotekcyjne dziaanie pochodnych nikotynamidu 284.4. Nowe metabolity przemian nikotynamidu 304.4.1. Pochodne nukleotydowe 1--D-rybonukleozydo-4-pirydono-

3-karboksyamidu30

4.4.2. 1--D-rybonukleozydo-4-pirydono-3-karboksyamid 32

5. Podsumowanie 34

6. Wnioski 37

7. Pimiennictwo 38


4/47


5/47

5

Wykaz wybranych publikacji bdcych przedmiotem rozprawy

habilitacyjnej

1. Slominska EM, Adamski P, Lipinski M, Swierczynski J, Smolenski RT. Liquidchromatographic/mass spectrometric procedure for measurement of NAD catabolites inhuman and rat plasma and urine. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2006, 25, 1245-9.

IF/KBN 0,671/10,000

2. Slominska EM, Smolenski RT, Szolkiewicz M, Leaver N, Rutkowski B, Simmonds HA,Swierczynski J. Accumulation of plasma N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide in patients withchronic renal failure. Mol Cell Biochem, 2002, 231, 83-8.

IF/KBN 1,548/10,000

3. Slominska EM, Kowalik K, Smolenski RT, Szolkiewicz M, Rutkowski P, Rutkowski B,Swierczynski J. Accumulation of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors in children withchronic renal failure. Pediatr Nephrol, 2006, 21, 800-6.

IF/KBN 2,007/20,000

4. Slominska EM, Rutkowski P, Smolenski RT, Szutowicz A, Rutkowski B, Swierczynski J. Theage-related increase in N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (NAD catabolite) in humanplasma. Mol Cell Biochem, 2004, 267, 25-30.

IF/KBN 1,714/10,000

5. Slominska EM, Yuen A, Osman L, Gebicki J, Yacoub MH, Smolenski RT.Cytoprotectiveeffects of nicotinamide derivatives in endothelial cells. Nucleosides Nucleotides NucleicAcids, 2008, 27, 863-6.

IF/KBN 0,571/10,000

6. Slominska EM, Carrey EA, Foks H, Orlewska C, Wieczerzak E, Sowinski P, Yacoub MH,Marinaki AM, Simmonds HA, Smolenski RT. A novel nucleotide found in humanerythrocytes, 4-pyridone-3-carboxamide-1-beta-D-ribonucleoside triphosphate. J Biol Chem,2006, 281, 32057-64.

IF/KBN 5,808/24,000

7. Slominska EM, Orlewska C, Yuen A, Osman L, Romaszko P, Sokolowska E, Foks H,Simmonds HA, Yacoub MH, Smolenski RT.Metabolism of 4-Pyridone-3-Carboxamide-1--D- Ribonucleoside Triphosphate and Its Nucleoside Precursor in the Erythrocytes.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2008, 27, 830-4.

IF/KBN 0,571/10,000

Sumaryczny IF/KBN 12,89/94,000

* w tekcie rozprawy habilitacyjnej dane z prac bdcych podstawrozprawy zaznaczonow nawiasie kwadratowym, np. [publikacja 1]


6/47

6

Wykaz stosowanych skrtw

4PYMP monofosforan 4-pirydono-3-karboksyamido-1--D-

rybonukleozydu4PYR, PCNR 1--D-rybonukleozydo-4-pirydono-3-karboksyamid4PYTP trjfosforan 4-pirydono-3-karboksyamido-1--D-rybonukleozyduM2PY, 2PY, Met2PY N-metylo-2-pirydono-5-karboksyamidM4PY, 4PY, Met4PY N-metylo-4-pirydono-3-karboksyamidMNA, MetNA N1-metylonikotynamidNA nikotynamidNAD+ dinukleotyd nikotynamidoadeninowyNADP+ fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowegoNMN mononukleotyd nikotynamiduNNMT metylotransferaza nikotynamidu

PARP polimeraza poli(ADP-rybozy)PNN przewleka choroba nerek (dawniej: przewleka niewydolno

nerek i ta nazwa jest uywana w tekcie rozprawy habilitacyjnej)


7/47


8/47

8

i wewntrzkomrkowej sygnalizacji, transkrypcji, naprawie DNA, regulacji cyklu komrkowego,

mitozie, jak rwnie apoptozie i nekrozie komrek [6,9,10]. Zaburzenia funkcjonowania tych

procesw mogbyprzyczynwielu zjawisk patologicznych.

Poza degradacj NAD+ nikotynamid moe powstawa rwnie w wyniku odwracalnej

reakcji katalizowanej przez fosforylaznukleozydu nikotynamidowego(EC 2.4.2.1) [11] lub przez

fosforybozylotransferaznikotynamidow(NamPRT; EC 2.4.2.12) [12].

Nikotynamid ulega przemianie do N-oksydu nikotynamidu i 6-hydroksynikotynamidu

[13,14], a przy udziale cytoplazmatycznego enzymu - metylotransferazy nikotynamidu (NNMT,

EC 2.1.1.1) do N-metylonikotynamidu (MNA, oznaczanego rwnie symbolem MetNA) [15].

Metabolit ten pod wpywem oksydazy aldehydowej (EC 1.2.3.1) ulega degradacji do: N-metylo-2-

pirydono-5-karboksyamidu (M2PY, oznaczanego rwniesymbolem 2PY, Met2PY) i N-metylo-

4-pirydono-3-karboksyamidu (M4PY, oznaczanego rwnie symbolem 4PY, Met4PY), ktre s

kocowymi produktami degradacji nikotynamidu [16-18]. Nikotynamid jest prekursorem

rybozydu nikotynamidu, a take mononukleotydu nikotynamidu (NMN) [12,19]. Oglny

metabolizm nikotynamidu przedstawiono na rycinie 1. Reakcje katalizowane przez enzymy,

ktrych kody umieszczono na rycinie 1 i szczegowo omwiono w tabeli 1.


9/47

9

Dinukleotyd

nikotynamidoadeninowy

(NAD+)

NIKOTYNAMID

(NA)

Fosforan dinukleotydunikotynamidoadeninowego

(NADP+)Mononukleotyd

nikotynamidu (NMN)

Rybozyd

nikotynamidu

(NR)

N-metylonikotynamid

(Met NA)

N-metylo-2-pirydono-5-karboksyamid

(Met2PY)

N-oksyd

nikotynamidu

6-hydroksynikotynamid

EC 3.2.2.6

EC 2.1.1.1

EC 1.2.3.1

EC 2.4.2.12

EC 2.4.2.1

EC 2.4.2.30

EC 2.4.2.31

EC 3.2.2.5

EC 3.5.1.98

EC 2.7.7.1

EC 2.7.1.22

EC 3.1.3.5

EC 2.7.1.23


(Met4PY)

Rycina 1.Metabolizm nikotynamidu w komrkach u ssakw.

Fosforylaza nukleozydu nikotynamidowego (EC 2.4.2.1), fosforybozylotransferaza nikotynamidowa(NamPRT; EC 2.4.2.12), NAD+ glikohydrolaza/cyklaza ADP-rybozy (EC 3.2.2.5), NADP+glikohydrolaza/cyklaza ADPR-rybozy (EC 3.2.2.6), polimeraza poli(ADP-rybozy) (PARP; EC 2.4.2.30),

mono-ADP-rybozylotransferaza (EC 2.4.2.31), sirtuiny (EC 3.5.1.98), metylotransferaza nikotynamidu(NNMT, EC 2.1.1.1), oksydaza aldehydowa (EC 1.2.3.1), adenylotransferaza mononukleotydunikotynamidu (EC 2.7.7.1), 5- nukleotydaza (EC 3.1.3.5) kinaza rybozylonikotynamidu (EC 2.7.1.22),kinaza NAD+(EC 2.7.1.23).


10/47

10

Tabela 1. Reakcje katalizowane przez enzymy uczestniczce w metabolizmienikotynamidu i jego metabolitw

EC zgodniez IUBMB **

Nazwa enzymuzalecana przez IUBMB

(czsto stosowana)

Katalizowane reakcje

EC 2.4.2.1 Fosforylaza nukleozydwpurynowych*fosforylaza nukleozydunikotynamidowego

Nukleozyd purynowy + fosforan = zasada purynowa+ -D-rybozo-1-fosforan*rybozyd nikotynamidu + fosforan = nikotynamid +-D-rybozo-1-fosforan + H+ [11,20]

EC 2.4.2.12 fosforybozylotransferazanikotynamidu

D-rybonukleotyd nikotynamidu + difosforan =nikotynamid + 5-fosfo--D-rybozo- 1-difosforan

EC 3.2.2.5 NAD+nukleozydaza

(NAD+glikohydrolaza/cyklaza ADPR-rybozy)

NAD++ H2O = ADP-ryboza + nikotynamid

EC 3.2.2.6 NADP+nukleozydaza(NADP+ glikohydrolaza/cyklaza ADPR-rybozy)

NADP++ H2O = ADP-ryboza(P) + nikotynamid

EC 2.4.2.30 NAD+ADP-rybozylo-transferaza (polimerazapoli(ADP-rybozy))

NAD++ (ADP-D-rybozylo)n-akceptor =nikotynamid + (ADP-D-rybozylo)n+1-akceptor + H+

EC 2.4.2.31 NAD+ADP-rybozylo-transferaza reszt argininybiaka (mono-ADP-rybozylotransferaza)

NAD++ L-arginina biaka = nikotynamid +N-(ADP-D-rybozylo)-L-arginina biaka

EC 3.5.1.98 deacetylaza histonw(niektre sirtuiny)

Hydroliza reszty N(6)-acetylolizyny histonwz uwolnieniem deacetylowanych histonw

(nie podano reakcji sumarycznej)EC 2.1.1.1 N-metylotransferaza

nikotynamiduS-adenozylo-L-metionina + nikotynamid =S-adenozylo-L-homocysteina + 1-metylonikotynamid

EC 1.2.3.1 oksydaza aldehydowa aldehyd + H2O + O2= kwas + H2O2

EC 2.7.7.1 adenylotransferazamononukleotydunikotynamidu

ATP + rybonukleotyd nikotynamidu = difosforan +NAD+

EC 3.1.3.5 5- nukleotydaza 5'-rybonukleotyd + H2O = rybonukleozyd + fosforan

EC 2.7.1.23 kinaza NAD+ NAD++ ATP = NADP++ ADP

EC 2.7.1.22 kinazarybozylonikotynamidu

ATP +N-rybozylonikotynamid = ADP +rybonukleotyd nikotynamidu

enzymy nie ujte w spisie IUBMB, a katalizujce reakcje opisane w pimiennictwie

** Rekomendowane przez Komitet Nomenklatury Midzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej dlaNomenklatury i Klasyfikacji Reakcji Katalizowanych przez Enzymy [www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/](ang. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the

Nomenclature and Classification of Enzymes by the Reactions they Catalyse)


11/47

11

1.2.Stenia nikotynamidu i jego metabolitw w pynach biologicznych

Wartoci stenikotynamidu i jego metabolitw (MetNA, Met2PY i Met4PY) w osoczu

i moczu ludzi zdrowych publikowane do tej pory rni si znaczco midzy sob (tabela 2).Wpyw na to moe miewiele czynnikw. Jednym z nich moe by jakoi ilospoywanych

pokarmw. U ludzi wydalanie z moczem MNA oraz Met2PY i Met4PY wzrasta po spoyciu

kwasu nikotynowego lub nikotynamidu [21,22]. Po doustnym podaniu nikotynamidu lub kwasu

nikotynowego zaobserwowano najwyszy wzrost iloci Met2PY (80% podanego zwizku

przeksztacio siw Met2PY) w moczu. Mniejszy wzrost nastpipo podaniu MetNA i kwasu

nikotynurowego, tylko 13%. Stenia metabolitw nikotynamidu w moczu nie wzrastay po

podaniu: kwasu N-metylo-2-pirydono-5-karboksylowego, kwasu chinolowego, trigonelliny, kwasu

6-hydroksy-nikotynowego i 6-hydroksynikotynamidu [23], jak rwnie po podaniu NAD+

i NADH [24]. Dieta pozbawiona kwasu nikotynowego, ale bogata w kwas orotowy powodowaa

obnienie wydalania MNA, Met2PY i Met4PY, gdyjak sugerujautorzy zmniejsza siszybko

przeksztacania tryptofanu do kwasu nikotynowego [25]. Kolejnym czynnikiem mogcym

wpywana rozbienowynikw przedstawionych w tabeli 2 s rnice dobowe w wydalaniu

metabolitw nikotynamidu z moczem. Wydalanie MNA najwiksze jest rano i obnia siw porze

popoudniowej [26]. Stenia Met2PY i Met4PY s wysokie w porze rannej i wzrastaj do

popoudnia, a potem obniajsi. Najmniejsze stenie metabolitw nikotynamidu obserwuje si

wieczorem i w nocy [26]. Nie mona jednak wykluczy, e jest to take zalene od stosowanej

diety, a przede wszystkim od pory dnia, w ktrej spoywane sposiki.

Wpyw na wydalanie metabolitw nikotynamidu maj take niektre hormony.

Zaobserwowano, e estrogeny powoduj obnienie wydalania NA, MetNA oraz Met2PY

i Met4PY z moczem, natomiast testosteron pozostaje bez wpywu [27]. Stenie MNA w moczu

wzrasta, gdy stosowany jest hormon wzrostu [28]. Obnia si po podaniu steroidw

(hydrokortyzon) i nie zmienia si, gdy oba hormony stosowane sjednoczenie. Stenie Met2PYulega obnieniu, gdy stosowany jest hormon wzrostu, a nie zmienia si, gdy stosowany jest tylko

hydrokortyzon [28].

Rozbienoci w wartociach stemetabolitw nikotynamidu publikowanych do tej pory

mog wynika take z rnych metod stosowanych do ich oznaczania. Wysokosprawna

chromatografia cieczowa z detekcj UV, stosowana niemal we wszystkich publikowanych

dotychczas pracach, nie pozwala na jednoznaczn identyfikacj analizowanych zwizkw.

Dlatego jednym z celw bada przedstawianych w niniejszej rozprawie habilitacyjnej byo

opracowanie metody pozwalajcej na analizowanie ste nikotynamidu i jego metabolitw


12/47

12

w moczu i osoczu osb zdrowych oraz porwnanie uzyskanych wynikw z danymi

z pimiennictwa.

Z dostpnych danych pimiennictwa oraz badawasnych wynika, e stenia metabolitw

nikotynamidu w osoczu i moczu ulegaj zmianiew rnych stanach patologicznych (tabela 3).

Badanie stenia metabolitw nikotynamidu w osoczu lub moczu moe pozwoli na ledzenie

przebiegu procesw patologicznych, a w niektrych stanach patologicznych peni rol

wskanikw prognostycznych. MNA jest uwaany za wskanik skutecznoci leczenia biaaczki

u pacjentw po zabiegach nawietlania i przeszczepu szpiku kostnego [29]. U pacjentw dobrze

rokujcych, 20 dni po wspomnianych zabiegach, obserwuje si wzrost wydalania MNA, ktry

normalizuje sido 40 dnia [29]. Normalizacji wydalania MNA nie obserwuje siu pacjentw le

rokujcych [29]. Wydalanie wikszych iloci MNA zaobserwowano u wczeniakw w porwnaniu

z dziemi urodzonymi w terminie. Na tej podstawie autorzy sugeruj, e MNA moe by

markerem okooporodowych zmian metabolicznych u dziecka [30]. MNA jest take uwaany za

wskanik zatrucia azotynami, gdyjego stenie w moczu wzrasta gwatownie po ekspozycji na te

zwizki [31].

U chorych z przewlekniewydolnocinerek (PNN) dochodzi do zaburzonego wydalania

metabolitw nikotynamidu. Dlatego te badania dotyczce ich ste, a szczeglnie roli jak

mog odgrywa w przewlekej niewydolnoci nerek, s jednym z celw bada niniejszej

rozprawy.Analiza stenia w osoczu i wydalania z moczem metabolitw nikotynamidu jest interesujca

nie tylko ze wzgldu na moliwo monitorowania poziomu niacyny w organizmie (niacin

nutritional status), katabolizmu NAD+, funkcji nerek czy innych stanw patologicznych.

Metabolizm nikotynamidu zmienia siw rnych stanach fizjologicznych, np. w czasie starzenia.

Ten stan fizjologiczny kojarzony jest ze spowolnieniem funkcji metabolicznych, std potrzeba

sprawdzenia, czy wraz z dugociycia zmieniajsistenia metabolitw nikotynamidu.


13/47

13

Tabela 2. Stenia nikotynamidu i jego metabolitw w osoczu (A) i wydalanie z moczem(B) u ludzi zdrowych.

Metabolit Stenie Pimiennictwo

A)

NA 0,34 mol/l0,026 0,01 mol/l

0,36 0,04 mol/l

[32][33]

(*)

MetNA 0,17 mol/l0,0073-0,85 mol/l0,15 0,01 mol/l

0,0038 mol/l

[34][35][36]

(*)

Met2PY 1,32-3,95 mol/l9 4,5 mol/l

0,83 0,18 mol/l0,39 0,22 mol/l (osoby < 16 r..)1,01 0,5 mol/l (osoby> 60 r..)

[21][37]

[publikacja 2] [38][publikacja 4]

Met4PY 0,34 0,15 mol/l0,26 0,09 mol/l

(*)[publikacja 3] [33]

B)

NA < 3 mol/24h [39]

MetNA 31,1 12,3 mol/24h (11,9 - 66,9 mol/24h)3,65-180 mol/l42 26 mol/24h (zakres 12-108 mol/24h)25,61 10,11 mol/24h36,5 mol/24h (11,1-86,1 mol/24h )

[39][35][40][26][41]

Met2PY 0,658 31,6 mol/l96,6 384,5 mol/24h (u mczyzn)84,1 132 mol/24h (u kobiet)59,8 26,5 mol/24h (18 136 mol/24h)60 mol/24h (16,2 146 mol/24h)

132 mol/24h43,49 11,64 mol/24h132,2 84,9 mol/24h (39,5 337,5 mol/24h)

1,75 0,97 mol/kg/24h (osoby < 16 r..)1,20 0,97 mol/kg/24h (osoby >60 r..)

[13][22]

[39][41]

[42][26][40]

[publikacja 4]

Met4PY 7,1 3,3 mol/24h (zakres 2,4-15,8 mol/24h)30,7-44,9 mol/24h (u kobiet)67,1-157,6 mol/24h (u mczyzn)5,79 2,15 mol/24h

28,9 22 mol/24h

[39][22]

[26]

[publikacja 6]

(*)Wyniki wasne, niepublikowane. Pogrubionczcionkzaznaczono wyniki wasne autora rozprawy.


14/47

14

Tabela 3. Zmiany wydalania metabolitw nikotynamidu z moczem u ludzi (A) i szczurw(B) w rnych stanach patologicznych.

Metabolit i jego

wydalanie

z moczem

Stan patologiczny Pimiennictwo

A)

MetNA i Met2PY

- w marskoci wtroby

- po oparzeniach

- w ciy (ale tylko w trzecim trymestrze)

- w cukrzycy typu 2

[36]

[43]

[44,45]

[46]

Podwyszonypoziom

MetNA

- w stresie wywoanym zimnem

- w nowotworach piersi

- po leczeniu niektrymi lekami, np.

pyrazinamidem

- w chorobie Parkinsona

[26,47]

[48]

[49]

[50-52]

MetNA i Met2PY

- w alkoholowej pelagrze

- w schizofrenii

- we wtrnej depresji

- w niedorozwoju umysowym dzieci

[53,54]

[55]

[56]

[57]

Met2PY - u dzieci z autyzmem [58]

Obnionypoziom

MetNA

- w przewlekym zapaleniu migdakw

- w AIDS (z biegunk)

[59]

[54]

B)

MetNA i Met2PY

- u szczurw po podaniu zwizkw

rakotwrczych

[60-62]

Podwyszon

ypoziom

MetNA

- u szczurw po podaniu zwizkwhepatotoksycznych, np. klofibratu,

dimetylohydrazyny

[63,64]

Obnionypoziom

MetNA

- u szczurw w marskoci wtroby

wywoanej czterochlorkiem wgla

- przy duej utracie masy ciaa

[65]

[64]


15/47

15

1.3. Rola nikotynamidu i jego metabolitw

Badania dotyczce roli nikotynamidu w fizjologii i patologii prowadzone s od

kilkudziesiciu lat a zgromadzona wiedza jest obszerna. Poza rol prekursora NAD(P)+,

nikotynamid uczestniczy w procesach zwizanych z regulacj cyklu komrkowego i napraw

DNA. Liczne badania wykazay, e nikotynamid wykazuje przeciwzapalne waciwoci

wynikajce midzy innymi z hamowania indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) [66],

zdolnoci do usuwania wolnych rodnikw [67], a take hamowania ekspresji genw kodujcych

antygeny MHC klasy II [68] i wewntrzkomrkowego czynnika adhezyjnego ICAM-1

w komrkach rdbonka [69]. Nikotynamid jest rwnie silnym inhibitorem syntezy

prozapalnych cytokin: IL-1 [70,71], IL-6 [70], IL-8 [70], IL-12 [72] i TNF [70,72]. Jego

waciwoci przeciwzapalne prbowano wykorzysta w dermatologii [73-77] i w reumatologii

[78,79]. Wizano z nim take due nadzieje w leczeniu cukrzycy typu I [80,81] i w chorobach

ukadu nerwowego [82-84].

Niektre skutki dziaania NA zwizane s z hamowaniem aktywnoci enzymw

metabolizujcych NAD+[85]. Nikotynamid hamuje polimerazpoli(ADP-rybozy) (PARP) z IC50

43 5,2 M i mono-ADP-rybozylotransferazz IC503400 410 M [86,87]. Niekompetycyjnie

hamuje sirtuiny z Ki 50-150 M [88-91]. Jest on take inhibitorem fosforylazy nukleozydu

nikotynamidowego[92,93], fosfodiesterazy [76] oraz inhibitorem monooksygenaz [94].

Polimeraza poli(ADP-rybozy) jako jeden z waniejszych enzymw zwizanych z przemian

NAD-u odgrywa istotn rol w komrce. PARP jest szczeglnie wan w utrzymaniu

integralnoci genomu komrki [95,96], jest zaangaowana w dekondensacjchromatyny [97,98],

replikacjDNA [99], naprawDNA [100], transkrypcj[101,102], duplikacjcentrosomw [103],

regulacjfunkcji telomerw [104,105], regulacjmitozy [106], nekroz [107], zalenod kaspaz

[108-110] i niezalen od kaspaz apoptoz [111]. Reguluje take aktywno szlakw

metabolicznych i sygnaowych [112]. W rdbonku hiperglikemia, indukujc stres oksydacyjny,aktywuje polimerazpoli(ADP-rybozy), ktra powoduje obnienie stenia NAD+, spowolnienie

glikolizy, hamowanie transportu elektronw i obnienie stenia ATP. W rezultacie proces ten

prowadzi do jego ostrej dysfunkcji [112].

AktywnoPARP odgrywa take istotnrolw patogenezie licznych stanw chorobowych,

takich jak: zawa i wylew krwi w mzgu, zawa minia sercowego, cukrzyca, alergie i inne

choroby zapalne oraz choroby neurodegeneracyjne, wczajc w to chorob Parkinsona

i Alzheimera [78,113]. Z tego tepowodu trwaj intensywne poszukiwania inhibitorw PARP

i sposobw ich podawania, ktre z jednej strony miayby chroniprzed negatywnymi skutkami


16/47

16

nadmiernej aktywnoci PARP (w tym obnieniem stenia NAD+w komrce), a z drugiej nie

upoledzanaprawy uszkodzonego DNA.

Hamowanie aktywnoci polimerazy poli(ADP-rybozy) przez nikotynamid wskazuje na jego

waciwoci cytoprotekcyjne. Chroni komrki przed uszkodzeniami toksycznymi in vitro, jak

rwnie in vivo [114]. W obecnoci nikotynamidu w komrkach wtroby zaobserwowano

mniejsze uszkodzenia po dziaaniu rnych czynnikw toksycznych [115]. W komrkach

miniwki gadkiej naczy[116], kardiomiocytach [117] poddanych dziaaniu peroksynitrytu lub

endotoksyny nikotynamid hamowa aktywno PARP i zapobiega hamowaniu oddychania

mitochondrialnego, a w konsekwencji prowadzi do zachowania stenia ATP w komrkach

[116,117].

Struktura chemiczna wikszoci znanych inhibitorw PARP-1 jest podobna do struktury

nikotynamidu. Ponadto region nikotynamidowy w czsteczce NAD+ jest miejscem wizania do

PARP-1 [118]. Pochodne nikotynamidu, zwaszcza Met2PY i Met4PY sstrukturalnie podobne

do znanych inhibitorw PARP, takich jak 3-aminobenzamid [118,119]. Dodatkowo jeszcze,

wikszo inhibitorw PARP ma karboksyamidow grup (obecn rwnie w metabolitach

nikotynamidu), ktra, jak siokazao, odgrywa kluczowrolw hamowaniu tego enzymu [118].

W zwizku z powyszym w ramach realizacji rozprawy habilitacyjnej sprawdzono czy

pochodne nikotynamidu posiadajwaciwoci hamujce aktywnoPARP.

W przeciwiestwie do nikotynamidu znaczenie jego pochodnych jest sabo poznane. Poza

monitorowaniem ich ste (w osoczu i moczu) w czasie podawania lub w stanie niedoboru

nikotynamidu lub kwasu nikotynowego nie przypisywano tym zwizkom wikszego znaczenia.

Uzyskane w ostatnich latach dane nakazuj powtrne zdefiniowanie roli tych zwizkw

w fizjologii i patologii czowieka.

Z dostpnych publikacji wynika, e MNA wykazuje waciwoci przeciwzapalne, ktre

prbuje si stosowa w leczeniu niektrych chorb skry i oparzeniach [120-122] oraz

w chorobach ukadu sercowo-naczyniowego [123]. Dziaania te s zwizane ze stymulacj

produkcji prostacykliny w rdbonku [124,125], jednego z najsilniejszych znanych czynnikw

hamujcych wykrzepianie i procesy zapalne. Z dziaaniemzwikszajcym produkcjprostacykliny

zwizany jest wpyw ochronny MNA na luzwkodka [126]. Analiza czynnoci rdbonka

u szczurw z cukrzyc i hipertriglicerydemipotwierdzia cytoprotekcyjny wpyw MNA [127].

W badaniach tych wykazano popraw zalenych od rdbonka mechanizmw regulujcych

przepyw krwi po podaniu MNA. Badania te wykazay rwnie korzystny wpyw MNA na

PARP-1 jest obecnie najlepiej poznanym izoenzymem polimerazy poli(ADP-rybozy). Poszukiwania

specyficznych inhibitorw PARP dotyczgwnie tej izoformy.


17/47

17

patologiczny poziom triglicerydw we krwi. To dziaanie jest obecnie w fazie badaklinicznych

i bymoe MNA bdzie stosowany jako lek hipolipomizujcy.

Przypuszcza si, e MNA moe zapobiega i agodzi rozwj cukrzycy typu I [128],

a jednym z argumentw przemawiajcym za tym ma by spostrzeenie, e u ludzi i zwierzt

z cukrzyc obserwuje si brak lub niedobr MNA [129,130]. MNA zaangaowany jest

w proliferacjkomrek [131-133], moe wpywana ekspresjgenw oraz produkcjhormonu

wzrostu i prolaktyny [134,135]. Stwierdzono, e MNA w orodkowym ukadzie nerwowym jest

czynnikiem neurotoksycznym i neurodegeneracyjnym [136,137], a w chwili obecnej trwaj

badania nad jego rolw chorobie Parkinsona [50,51]. Istniejrwniedane uzyskane w badaniach

in vitrosugerujce neuroprotekcyjne dziaanie MNA[138,139]. MNA hamuje rwnieaktywno

metaloproteinazy-9 we wczesnej fazie przebudowy macierzy pozakomrkowej w mzgu

wywoanych niedokrwieniem oraz aktywuje metaloproteinaz-2 w pnej fazie[140].

W ostatnich latach poszukuje si zwizku MNA z procesami nowotworowymi.

Zaobserwowano nadekspresj genu kodujcego metylotransferaz nikotynamidu (NNMT)

w raku odka [141] oraz komrkach raka brodawkowatego tarczycy [142,143].

W jasnokomrkowym raku nerki stwierdzono korelacj pomidzy nadekspresj genu NNMT

a wielkoci guza [144]. Badania przeprowadzone przez Nakagawa i wsp. [145] wykazay, e

stenie MNA we krwi moe bymarkerem ryzyka rozwoju nowotworw zoliwych. U osb

naraonych na rozwj nowotworw zoliwych po podaniu NA zaobserwowano wzrostaktywnoci NNMT i wysze stenie MNA we krwi [145]. Uwaa si, e MNA moe bytake

wczesnym markerem raka jelita grubego [146].

Klirens MNA jest uwaany za wskanik funkcji kanalikw nerkowych w przewlekych

chorobach nerek [34], a w szczeglnoci za wskanik transportu kationw [147,148]. Inne prace

kwestionujjednak specyficznoMNA w tym aspekcie.

1.4. Nowe metabolity przemian nikotynamidu

W 1979 roku w moczu pacjenta z przewlekbiaaczkmegaloblastyczn zidentyfikowano

zwizek bdcy utlenionym rybozydem nikotynamidu - rybozyd 4PY (1--D-rybonukleozyd-4-

pirydono-3-karboksyamidu, ang. 4-pirydone-3-carboxamid-1--ribonucleoside, 4PYR, PCNR) [149].

Dziesi lat pniej zostaa opublikowana praca opisujca izolacj z moczu izoformy

1--D-rybofuranozylo-2-pirydono-5-karboksyamidu (2PYR, 2-PCNR) [150]. PCNR moe

wystpowaw formie dwch izomerw: i , jednak w moczu znajduje siokoo 10 razy wicej


18/47

18

formy ni. Oprcz 4PYR w moczu zidentyfikowano take jego izomery strukturalne, takie

jak: 2,5-PYR (1-D-rybonukleozyd 2-pirydono-5-karboksyamidu), 2,3-PYR (1-D-rybonukleozyd

2-pirydono-3-karboksy-amidu). Jednoczenie kady z tych izomerw moe wystpowaw formie

lub , co daje cznie (wliczajc 4,3-PYR) a szemoliwych rnych struktur PCNR [151].

W 1989 roku Mills stwierdzi, e w moczu dominujc form jest 4-PYR [150], co kilka lat

pniej potwierdzi Schram [151]. Obaj przeprowadzali analizy moczu pochodzcego od osb

z chorob nowotworow. Zwizkiem o najwyszym steniu w moczu okaza si 4,3-PYR,

zawarto2,5-PYR wynosia okoo 7% 4,3-PYR, a 2,3-PYR tylko 1% 2,5-PYR [150,151]. Jednak

dopiero wykrycie w ostatnich latach rybozydu nikotynamidu rzucio nowe wiato na przemiany

NAD+i stao sipodstawdo dalszych bada[152].

Do niedawna wydawao si, e fizjologiczne nukleotydy s ju dobrze poznane. Tym

bardziej, e odgrywajone znaczc rolw prawie wszystkich procesach zwizanych z funkcj

komrek (przekazywaniem informacji genetycznej, metabolizmem energetycznym i regulacj

procesw). Zmiany w poziomie nukleotydw skluczowe w rnych fazach cyklu komrkowego

i rnicowania, a nukleotydy s stosowane w leczeniu chorb nowotworowych, zapalnych,

imunosupresyjnych i wirusowych [153,154]. Jednak ju 20 lat temu w rozdziaach

chromatograficznych zauwaono w erytrocytach osb z przewlek niewydolnoci nerek

niezidentyfikowane dotychczas zwizki o budowie trjfosforanw nukleotydw obecne w bardzo

duych ilociach [37,155]. Spektrum tych zwizkw w UV byo zblione do pochodnychnikotynamidu. Dlatego te jednym z celw moich bada bya identyfikacja tych nukleotydw

oraz ich prekursorw.

Opisane powyej dane dotyczce nikotynamidu i jego metabolitw wskazuj, eokrelenie

roli tych zwizkw w fizjologii i patologii wymaga jeszcze wielu bada. Ze wzgldu na istniejce

rozbienoci w wartociach stetych zwizkw we krwi i moczu konieczne byo opracowanie

metody pozwalajcej na analizowanie ste nikotynamidu i jego metabolitw w pynach

biologicznych. Stenia te mog pozwoli na ledzenie przebiegu procesw patologicznych,

w niektrych przypadkach mogpenirolwskanikw prognostycznych. Due znaczenie mog

mie u chorych z PNN, w ktrych dochodzi do zaburzonego wydalania metabolitw

nikotynamidu. Dlatego teu tych chorych szczeglnie wane sbadania dotyczce metabolizmu

oraz roli jak te zwizki mog odgrywa w patologii przewlekej niewydolnoci nerek. Jak

wykazano powyej, stenia metabolitw nikotynamidu zmieniaj si nie tylko w stanach

patologicznych, ale take w rnych stanach fizjologicznych, std koniecznosprawdzenia jak

zmieniaj si one u osb zdrowych wraz z wiekiem. Strukturalne podobiestwo metabolitw


19/47

19

nikotynamidu do inhibitorw PARP sugeruje, e jednz ich waciwoci moe by hamowanie

tego enzymu i dziaanie cytoprotekcyjne tych zwizkw.

Szczeglnie interesujce wydaj si pochodne rybozydu nikotynamidu, przede wszystkim

pochodne nukleotydowe. Niezbdna jest identyfikacja ich prekursora, czynnikw regulujcych

jego syntez, okrelenie jego metabolizmu i roli w organizmie tych zwizkw.


20/47

20

2. Cel bada:

1. Opracowanie metody pozwalajcej na analiz (z wykorzystaniemspektrometrii masowej) ste metabolitw nikotynamidu w pynach

biologicznych i tkankach.

2. Oznaczenie ste metabolitw nikotynamidu we krwi i moczu u chorych

z przewlekniewydolnocinerek.

3. Analiza zmian ste metabolitw nikotynamidu w osoczu osb zdrowych

w rnym wieku.

4. Zbadanie in vitro: a) wpywu pochodnych nikotynamidu na aktywno

polimerazy poli(ADP-rybozy), b) cytoprotekcyjnego dziaania pochodnych

nikotynamidu.

5. Zbadanie metabolizmu pochodnych nikotynamidu 4PYR, 4PYTP i 4PYMP.

Oznaczenie stetych zwizkw w osoczu i erytrocytach u ludzi w stanach

fizjologicznych i z PNN.


21/47

21

3. Metody

3.1.Opracowanie metody oznaczania stemetabolitw nikotynamidu

Jednym z celw badaprzedstawianych w niniejszej rozprawie byo opracowanie metody

analizy ste nikotynamidu i jego metabolitw (NA, MetNA, Met2PY, Met4PY, 4PYR)

w osoczu i moczu z wykorzystaniem spektrometrii masowej [publikacja 1]. Analizstewyej

wymienionych zwizkw przeprowadzono przy uyciu detektora masowego Thermo-Finnigan

LCQ Advantage ze rdem jonw typu electrospray (ESI) pracujcego w trybie jonizacji

dodatniej. Praca detektora w trybie single ion monitoring (SIM) umoliwiaa detekcj NA,

MetNA, Met2PY, Met4PY oraz N-oksydu nikotynamidu, a w trybie tandem MS (MS2)

detekcj 4PYR. Rozdziachromatograficzny uzyskano przy uyciu kolumny Synergi Hydro-RP

(4 m, 150 x 2,0 mm). Jako faz ruchom A stosowano wodny roztwr 10 mM kwasu

nonafluoropentanowego (NFPA), za jako faz ruchom B 100% acetonitryl. Analiz

prowadzono przy przepywie 0,2 ml/min i gradiencie od 0% do 60% B w cigu 12 minut.

Procedury ekstrakcji materiau biologicznego (osocza, moczu) polegay na strceniu biaek

z uyciem 10% kwasu trichlorooctowego, a nastpnie ekstrakcji uzyskanego supernatantu eterem.

Alternatywnie stosowano metod ekstrakcji przy uyciu 70% acetonitrylu lub ultrafiltracj

z wykorzystaniem filtrw celulozowych o wielkoci porw zatrzymujcych biaka o masiepowyej 10 kDa. Przy zastosowaniu wymienionych metod ekstrakcji uzyskiwano odzyski dla

badanych zwizkw w granicach 75-95%, co uwzgldniano przy obliczaniu ste.

Opracowana metoda pozwala na oznaczenie steizomerw (Met2PY i Met4PY), a przez

zastosowanie MS2 z wysok czuoci - stenia 4PYR. Dziki tej metodzie moliwe jest

jednoczesne okrelenie stenia wszystkich badanych metabolitw w tych samych warunkach

w cigu 15 minut analizy. Na Rycinie 2 przedstawiono przykadowe chromatogramy jonowe

z rozdziau metabolitw nikotynamidu wedug wasnej metody. Ze wzgldu na zbyt niskie

stenie nie jest moliwe oznaczenie tmetodsteN-oksydu nikotynamidu w osoczu.


22/47

22

Rycina 2. Przykadowe chromatogramy jonowe z rozdziau nikotynamidu i jego metabolitwz wykorzystaniem chromatografii cieczowej z detekcj masow. (A) standardy (B) prbka osocza

pacjenta z PNN. ISTD standard wewntrzny, 5-chloroadenozyna. Po prawej stronie chromatogramw dla kadegoz analizowanych zwizkw zaznaczono warunki analizy sygnau masowego.

czas rozdziau

Int

ensywnos

ygnau[%]

ISTD

NA

MetNA

Met2PYMet4PY

4PYR

A

Intensy

wnos

ygnau[%]

czas rozdziau

ISTD

NA

MetNA

Met2PY Met4PY

4PYR

B


23/47

23

4. Wyniki

4.1. Stenia metabolitw nikotynamidu w osoczu ludzi

4.1.1. Stenia metabolitw nikotynamidu w osoczu chorych z przewlekniewydolnoci

nerek

U dzieci i dorosych z przewlek niewydolnoci nerek leczonych zachowawczo

zaobserwowano wielokrotny wzrost stenia Met2PY w osoczu w porwnaniu do osb

zdrowych. Wydaje si, e ten wzrost jest zwizany bezporednio ze stopniem niewydolnoci

nerek, gdy wykazano pozytywn korelacj pomidzy steniem kreatyniny (markeremdiagnostycznym niewydolnoci nerek) a steniem Met2PY w osoczu [publikacja 2,3] [33].

Zaobserwowano take ujemn korelacj pomidzy steniem Met2PY a klirensem kreatyniny

[33].

U dorosych z PNN leczonych zachowawczo stwierdzono te okoo 5-krotny wzrost

stenia Met4PY w osoczu. rednie stenie wynosio 1,59 1,35 mol/l w porwnaniu do

wartoci 0,34 0,15 mol/l w grupie kontrolnej (wyniki wasne niepublikowane, wartoci

rednie SD). U dzieci ten wzrost bynawet 10-krotny. Stenie Met4PY w osoczu wynosio

2,1 2,61 mol/l w porwnaniu z wartociami ste0,259 0,09 mol/l u dzieci zdrowych

[publikacja 3]. Podobnie jak w przypadku Met2PY, wykazano dodatni korelacj pomidzy

steniem Met4PY a steniem kreatyniny oraz ujemnkorelacj pomidzy steniem Met4PY

a klirensem kreatyniny [publikacja 3] [33].

U osb dorosych z PNN nie obserwowano podwyszonego stenia nikotynamidu

w osoczu w porwnaniu z osobami zdrowymi (odpowiednio 0,51 0,27 mol/l i 0,36 0,13

mol/l) (wyniki wasne niepublikowane). Natomiast u dzieci z PNN rednie stenie

nikotynamidu byo wysze niu dzieci zdrowych i wykazywao dodatnikorelacjze steniem

kreatyniny i ujemnz klirensem kreatyniny [publikacja 3].

Przeprowadzono rwnie badania w grupie chorych z przewlek niewydolnoci nerek

poddawanych zabiegowi hemodializy. U pacjentw tych rednie stenie Met2PY w osoczu byo

ponad 20-krotnie wysze niu osb zdrowych. Bezporednio po hemodializie stenie Met2PY

obniao sio poow, podobnie jak kreatynina i wzrastao przed nastpndializ[publikacja 2]

[33,37]. Juw 1964 roku obecnoMet2PY stwierdzono w pynie dializacyjnym [156]. Podobnie

jak Met2PY zmieniao sistenie Met4PY w tej grupie chorych: przed dializwynosio 2,34 2,73 mol/l, a po zabiegu 0,80 0,48 mol/l (wyniki wasne niepublikowane). Na szczegln


24/47

24

uwagzasuguje fakt, e jupo 30 minutach hemodializy stenia obu kocowych metabolitw

nikotynamidu obniyy si o 50% (wyniki wasne niepublikowane). Jednoczenie obnienie

stenia nikotynamidu w czasie hemodializy byo niewielkie, z 0,47 0,25 mol/l do 0,33 0,16

mol/l po 270 minutach zabiegu. Nie zaobserwowano natomiast zmian w steniu MNA

w osoczu tych chorych (wyniki wasne niepublikowane).

Bezporednio po transplantacji nerek stenie Met2PY w osoczu osigao wartoci zblione

do obserwowanych u osb zdrowych (1,64 0,16 umol/l) [publikacja 2] [33]. Potwierdzajto te

inni badacze [33,37].

Przedstawione powyej wyniki wskazuj, e u ludzi produkowane s znaczne iloci

kocowych metabolitw nikotynamidu, szczeglnie Met2PY, ktry jest gwnym metabolitem

nikotynamidu [27,157]. U osb zdrowych zwizki te wydalane s z moczem. Zalenoci

pomidzy stopniem niewydolnoci nerek a steniem Met2PY i Met4PY sugeruj, e

upoledzone wydalanie jest gwn przyczyn wzrostu stenia tych zwizkw w osoczu. Po

transplantacji nerek wartoci te wracajdo normy. Jednak wzrost stenia Met2PY u osb z PNN

jest wyszy nikreatyniny, bo ponad 20-krotny przy 12-krotnym wzrocie markera przewlekej

niewydolnoci nerek. To sugeruje, e niewydolno nerek nie jest jedyn przyczyn wzrostu

stemetabolitw nikotynamidu. Dlatego naley rozway inne czynniki mogce miewpyw

na cakowitpulnikotynamidu np. dieta i masa miniowa a take wzrost produkcji kocowych

metabolitw nikotynamidu w nastpstwie uszkodzenia DNA zwizanego z PNN. Dieta nie manajprawdopodobniej wikszego znaczenia, gdy grupa ludzi zdrowych bya dobierana losowo

i badane osoby rniy sizarwno stosowandietjak i masminiow, a rnice w steniu

Met2PY w osoczu byy maksymalnie dwukrotne. Jest natomiast moliwe, e u chorych z PNN

dochodzi do zwikszonej aktywacji enzymw produkujcych nikotynamid, np. polimerazy

poli(ADP-rybozy). Wprawdzie nie ma danych dotyczcych aktywnoci tego enzymu u pacjentw

z przewlek niewydolnoci nerek, jednak kilka poniszych faktw moe przemawia za t

hipotez. U pacjentw z PNN obserwuje siliczne uszkodzenia DNA [158,159], ktre aktywuj

polimerazpoli(ADP-rybozy), enzym biorcy udziaw naprawie uszkodzonego DNA [160,161].

Aktywacja tego enzymu powoduje przeniesienie reszt ADP-rybozy z NAD+ na biaka jdrowe

z jednoczesnym uwolnieniem nikotynamidu [160]. Jednoczenie zwizanie PARP z uszkodzon

niciDNA powoduje 500-krotnaktywacjtego enzymu [162,163]. U chorych z PNN obserwuje

si jednak tylko niewielki wzrost stenia nikotynamidu w osoczu. Jest to prawdopodobnie

spowodowane natychmiastowdegradacjnikotynamidu do Met2PY i Met4PY. Nie ma danych

na temat aktywnoci metylotransferazy nikotynamidu i oksydazy aldehydowej u chorych z PNN,

ale wiadomo, e procesy transmetylacji su tych osb nasilone, czego dowodem jest zwikszona


25/47

25

produkcja poliamin [164]. Mao prawdopodobna jest inkorporacja nikotynamidu do NAD+

u chorych z PNN. Obserwuje si wprawdzie wzrost stenia ATP, substratu dla

adenylotransferazy mononukleotydu nikotynamidu (NNMAT) w erytrocytach [165], ale nie

obserwuje siwzrostu stenia NAD+[publikacja 6].

Podsumowujc mona stwierdzi, e wysokie stenia Met2PY i Met4PY mog peni

znaczc rol w przebiegu mocznicy [publikacja 2,3][33]. Mog by take czuym, wczesnym

i atwym do oznaczania wskanikiem niewydolnoci nerek. Mogrwniewiadczyo wzrocie

aktywnoci PARP i uszkodzeniach DNA spowodowanych procesem chorobowym [166-168].

4.1.2. Zalene od wieku zmiany stenia metabolitw nikotynamidu w osoczu osb

zdrowych

Z przeprowadzonych badawynika, e stenie Met2PY w osoczu dzieci (poniej 16 roku

ycia) byo nisze (0,39 0,22 mol/l) niu osb powyej 50 roku ycia (1,01 0,5 mol/l).

Wprawdzie stenie kreatyniny take byo wysze u osb starszych, jednak stosunek ste

kreatyniny osb starszych do modszych wynosi 1,6 a Met2PY - 2,6 [publikacja 4]. Rwnie

stenie Met4PY byo wysze w grupie osb starszych. Nie zaobserwowano natomiast rnic

w steniu nikotynamidu pomidzy tymi grupami, ktre wynosio okoo 0,30 mol/l (wynikiwasne niepublikowane). Dzienne wydalanie Met2PY z moczem byo zdecydowanie wysze

u osb starszych. Po przeliczeniu na kg masy ciaa uzyskano wynik wskazujcy na okoo 30%

nisze wydalanie Met2PY u osb starszych [publikacja 4], co jest take zgodne z danymi

z pimiennictwa [52].

Ciekawym spostrzeeniem jest istnienie dodatniej korelacji pomidzy steniem kocowych

metabolitw nikotynamidu, a wiekiem [publikacja 4], co przedstawiono na Rycinie 3 (wyniki

wasne niepublikowane). Aby wykluczywpyw funkcji nerek przebadano gruposb w rnym

wieku, ale o podobnym steniu kreatyniny. W tym przypadku take potwierdzono zaleno

pomidzy steniem Met2PY a wiekiem. To sugeruje, e nie tylko pogorszenie funkcji nerek

zwizane z wiekiem, ale take wiek s niezalenymi czynnikami wpywajcymi na stenie

Met2PY. Potwierdza to wieloczynnikowa analiza korelacji pomidzy zmianami stenia Met2PY

w osoczu a wiekiem i steniem kreatyniny w osoczu. Analiza ta wykazaa, e w przypadku ludzi

zdrowych wiek jest czynnikiem decydujcym o wzrocie stenia Met2PY w osoczu [publikacja

4].


26/47

26

Rycina 3. Stenia nikotynamidu i jego kocowych metabolitw w osoczu u osbzdrowych w zalenoci od wieku.

Wydaje si, e podwyszone stenia Met2PY i Met4PY we krwi [publikacja 4] (rycina 3) mog

by skutkiem wzrostu degradacji NAD+ i/lub obnienia wbudowywania nikotynamidu do puli

NAD+. Jednak na podstawie moich wynikw nie mona tego jednoznacznie stwierdzi.

Wprawdzie analizowane stenia nikotynamidu i NAD+ w wtrobie (gwnym miejscu

metabolizmu NAD+) szczurw modych byy wysze niu starych, to jednak nie byy to rnice

statystycznie znamienne. Dodatkowo byy one odpowiednio 10 i 20 razy wysze ni stenia

Met2PY zmierzone w wtrobach tych zwierzt [publikacja 4]. Ponadto Met2PY i Met4PY mog

powsta tylko z nikotynamidu, a zatem u ludzi starszych produkcja tego zwizku musi by

zwikszona. W komrkach limfocytarnych pochodzcych od stulatkw zaobserwowano wiksz

aktywno poli(ADP-rybozy)lacji [169]. Zaobserwowany wzrost uszkodze DNA zwizany

z wiekiem [170] stymuluje aktywno polimerazy poli(ADP-rybozy) [10,160,161,171].

W ostatnich latach stwierdzono (na razie tylko u organizmw jednokomrkowych), e aktywno

sirtuin, enzymw produkujcych nikotynamid, zwizana jest z dugociycia [172,173]. Wydaje

si take, e zwikszona produkcja Met2PY i Met4PY moe by zwizana bezporednio ze

zwikszon aktywnoci enzymw degradujcych nikotynamid u ludzi starszych. Nie ma

w pimiennictwie danych potwierdzajcych te przypuszczenia. Stwierdzono jedynie bardzo nisk

(poniej 2%) aktywnometylotransferazy nikotynamidu (NNMT, EC 2.1.1.1) w wtrobie podu

szczura, ale ju28 dni po urodzeniu bya taka jak u osobnika dorosego, jednak nie badano, czy

wraz z wiekiem sizwiksza [174]. Podobnie aktywnooksydazy aldehydowej u myszy jest niska

w 1, 7 i 14 dniu, a penaktywnoosiga w 4 tygodniu ycia [175]. Podobne wyniki uzyskano

u dzieci. Zaraz po urodzeniu aktywno oksydazy aldehydowej jest bardzo niska i powoliz wiekiem wzrasta. Dodatkowo wykazano korelacj pomidzy aktywnoci enzymu a wiekiem,

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

mol/l

0_9 10_19 20_29 30_39 40_49 50_59 60_69 70_79 80...

grupy wiekowe [w latach]

NAMet4PY

Met2PY


27/47

27

mas ciaa, powierzchni ciaa oraz wielkoci wtroby. Aktywno obserwowan u osb

dorosych oksydaza aldehydowa osiga okoo 3 roku ycia i przy masie ciaa okoo 15 kg [176].

Proponowana zatem sekwencja: wiek aktywacja enzymw metabolizujcych NAD+

(sirtuin, polimerazy poli(ADP-rybozy)) wzrost produkcji nikotynamidu wzrost stenia

Met2PY i Met4PY jest bardzo prawdopodobna.

4.2. Pochodne nikotynamidu inhibitorami polimerazy poli(ADP-rybozy)

W wyniku przeprowadzonych badastwierdzono, e kocowe metabolity nikotynamidu s

inhibitorami PARP. Najsilniejszym inhibitorem tego enzymu okaza siMet4PY [publikacja 3],

sabszym Met2PY [publikacja 3] [33]. Natomiast wrd pochodnych silne waciwoci hamujce

wykazujizomery nikotynamidu pikolinamid i izonikotynamid (wyniki wasne niepublikowane,

rycina 4). Wrd metabolitw NAD+ najsilniejszym inhibitorem PARP-u jest nikotynamid,

jednak jego stenie w osoczu jest niskie i nie wzrasta znaczco w przewlekej niewydolnoci

nerek (rozdzia 4.1.1). Hamowanie aktywnoci PARP przez Met2PY i Met4PY moe mie

znaczenie dla przebiegu niektrych chorb. O ile u ludzi zdrowych stenia metabolitw

nikotynamidu s bardzo niskie w osoczu o tyle u chorych z przewlek niewydolnoci nerek

wzrastajkilkunastokrotnie, osigajc wartoci zblione do hamujcych PARP in vitro. Co prawdaIC50dla Met2PY wynosi ok. 2 mM, a dla Met4PY ok. 0,2 mM, to jednak trzeba zauwa y, e

wysokie stenia tych zwizkw utrzymujsiprzez cay czas w organizmie chorych [publikacja

3], a ich dziaanie kumuluje si. Co wicej, w komrce stenia kocowych metabolitw

nikotynamidu mogbywysze niw osoczu (ze wzgldu na moliwoaktywnego transportu

i zagszczanie). Niewykluczone, e hamowanie aktywnoci PARP przez gromadzce si

metabolity jest odpowiedzialne za limfopeni[177] i czstszy rozwj nowotworw u niektrych

pacjentw z przewlekniewydolnocinerek [178].


28/47

28

0

20

40

60

80

100

120

0 mM 0.03 mM 0.3 mM 3 mM

stenie zwizkw

aktywnop

olimeraz

poli(ADP-ryzozy)[%]

NA

MetNA

Met2PY

Met4PY

PA

IsoNA

Rycina 4. Hamowanie polimerazy poli(ADP-rybozy) przez wybrane pochodnenikotynamidu.NA-nikotynamid, MetNA-N1-metylonikotynamid, Met2PY-N-metylo-2-pirydono-5-karboksyamid,Met4PY-N-metylo-4-pirydono-3-karboksyamidu, PA-pikolinamid, IsoNA izonikotynamid. 100% to

aktywnopolimerazy poli(ADP-rybozy) bez inhibitora.

4.3. Cytoprotekcyjne dziaanie pochodnych nikotynamidu

Z przeprowadzonych bada z pochodnymi nikotynamidu wynika, e niektre z tych

zwizkw majwaciwoci cytoprotekcyjne. Efekty te obserwowano w duych steniach (ok.

0,122 g/l), to jednak w przypadku cukrzycy i chorb neurologicznych stosowane s dawki

nikotynamidu wynoszce okoo 1g/dzie [2,84]. Wrd pochodnych nikotynamidu zwizkami

o najsilniejszych waciwociach cytoprotekcyjnych okazay si: Met2PY, PA, a take 6-OHP

(rycina 5) [publikacja 5]. Wydaje si, e hamowanie PARP-u moe mie znaczenie

w cytoprotekcyjnym dziaaniu tylko w przypadku pikolinamidu (PA). Ani IsoNA, ani tym

bardziej Met4PY nie chroni komrek endotelium poddanych dziaaniu peroksynitrytu przed

obnieniem stenia NAD+ i ATP. Nie ma wic cisej zalenoci pomidzy bezporednim

hamowaniem PARP-u a dziaaniem cytoprotekcyjnym. Zwizkiem, ktry wykazywa

porwnywalne z nikotynamidem waciwoci cytoprotekcyjne, okazasi6-OHP, ale jego izomer3-OHP ju takich waciwoci nie wykazywa. W przypadku zwizkw takich jak 6-OHP


29/47

29

mechanizm dziaania wymaga wyjanienia. Najprawdopodobniej decydujc rol odgrywa

struktura tych zwizkw. Wydaje si, e im bliej azotu (N1) w piercieniu pirydonowym znajduj

sipodstawniki (grupa hydroksylowa lub ketonowa) tym lepsza ochrona przed cytotoksycznym

dziaaniem peroksynitrytu [publikacja 5].

Obserwacje kliniczne sugeruj, e cytoprotekcyjne dziaanie Met2PY u chorych z PNN

najprawdopodobniej nie ma istotnego znaczenia. Bymoe jego stenie w tych warunkach jest

zbyt niskie albo przeduona ekspozycja nie jest skuteczna. Wzrost stenia Met2PY moe mie

natomiast zwizek ze stresem oksydacyjnym. Zaobserwowano bowiem dodatni korelacj

pomidzy steniem malonylodialdehydu (MDA) - markerem stresu oksydacyjnego a steniem

Met2PY oraz Met4PY w osoczu. Zwikszona czsto wystpowania nowotworw u chorych

z PNN, ktra moe by zwizana z hamowaniem procesw naprawy DNA (w ktrych

uczestniczy PARP), sugeruje, e Met2PY i Met4PY mog by toksynami mocznicowymi

[179,180].

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

K K0 NA

Met_

NA

Met-2PY

Met-4PY

4PYR

ISON

A

3-OH

P

6-OH

P PA

6NH2

NA

nmol/m

gbiaka

ATP

NAD

Rycina 5. Cytoprotekcyjne dziaanie pochodnych nikotynamidu.Stenie ATP i NAD+w komrkach rdbonka po ekspozycji na 100 M peroksynitryl. Wyniki stanowi

x SD (n=5). K-kontrola bez peroksynitrytu, K0kontrola z peroksynitrytem, NA- nikotynamid,Met_NAN1-metylonikotynamid, Met2PY-N-metylo-2-pirydono-5-karboksyamid, Met4PY-N-metylo-4-pirydono-3-karboksyamidu, 4PYR- 1--D-rybonukleozyd-4-pirydono-3-karboksyamidu, ISONAizonikotynamid, 3-OHPkwas 3-hydroksypikolinowy, 6-OHPkwas 6-hydroksypikolinowy, PA-pikolinamid, 6NH2NA- 6-aminonikotynamid.


30/47

30

4.4. Nowe metabolity przemian nikotynamidu

4.4.1. Pochodne nukleotydowe 1--D-rybonukleozydo-4-pirydono-3-karboksyamidu

W 2004 roku udao sizidentyfikowanieznany dotychczas nukleozydotrjfosforan. Byo to

moliwe po dokonaniu izolacji tego nukleotydu z ekstraktw erytrocytw chorych z PNN.

Nukleotyd poddano nastpnie degradacji przy uyciu fosfatazy alkalicznej. Uzyskany nukleozyd

zosta uyty do analiz chemicznych. Kilkakrotne oczyszczanie otrzymanego produktu byo

konieczne w celu uzyskania dostatecznej czystoci do dalszej analizy tego zwizku. Identyfikacja

oparta bya o wyniki uzyskane przy pomocy spektroskopii w podczerwieni, magnetycznego

rezonansu jdrowego, chromatografii cieczowej oraz spektrometrii masowej. Uzyskane wyniki

pozwoliy na identyfikacj nieznanego nukleotydu jako trjfosforanu 4-pirydono-3-

karboksyamido-1--D-rybonukleozydu (4PYTP) [publikacja 6].

Rycina 6.Trjfosforan 4-pirydono-3-karboksyamido-1--D-rybonukleozydu (4PYTP).

Ustalono nastpnie, e prekursorem tego nukleotydu w organizmie jest 4PYR, ktry jest

przeksztacany do nukleotydowych pochodnych: mono- i trjfosforanowych (odpowiednio

4PYMP i 4PYTP) [publikacje 6,7]. Przemiana 4PYR do 4PYMP odbywa siprzy udziale kinazy

adenozynowej. Jednoczenie proces ten powoduje znaczne obnienie stenia ATP, nasilenie

katabolizmu nukleotydw adeninowych (wzrost stenia hipoksantyny). Nie wpywa jednak na

P

O

OH

OP

OH

O

HO

O

N

O

OHOH

HH

H

CH2

H

OPO

OH

O

C

O

NH2


31/47

31

zmian stenia NAD+ w komrce [publikacje 6,7]. 5jodotubercydyna, inhibitor kinazy

adenozyny, hamuje wbudowanie 4PYR do puli nukleotydw [publikacja 6]. Podobne wyniki

uzyskano, gdy zamiast 4PYR stosowano 4-pirydono-3-karboksyamid (4PY) [publikacje 6,7].

Dodanie 4PYR do erytrocytw oraz innych komrek powoduje powstanie zdecydowanie

wikszej iloci 4PYMP, ni 4PYTP. Po 3h inkubacji erytrocytw w obecnoci 300 M 4PYR

stenie 4PYTP wzroso w tych komrkach z 16,1 0,6 mol/l erytr. do 74,9 9,17

mol/l erytr., a 4PYMP z 5 mol/l erytr do 254,7 13,9 mol/l erytr. [publikacje 6,7].

Bardzo interesujca jest degradacja nukleotydowych pochodnych 4PYR. Zaobserwowano

zalene od czasu obnienie stenia 4PYMP i wzrost stenia 4PYR. 4PYTP praktycznie nie

ulega degradacji. Powstawanie 4PYR a nie 4PY wskazuje, e to 5nukleotydaza jest

odpowiedzialna za przemian4PYMP do 4PYR [publikacja 7].

Nukleotydy 4PYR sobecne w erytrocytach osb zdrowych, a ich stenia wynosz: 4PYTP

13 4,7 mol/l erytr. [publikacja 6] i 4PYMP 0,8 0,5 mol/l erytr. (wyniki wasne

niepublikowane). U dzieci stenie 4PYTP w erytrocytach jest mniejsze ni u osb dorosych

i wynosi 8,7 4,8 mol/l erytr., za 4PYMP 0,5 0,4 mol/l erytr. (wyniki wasne

niepublikowane). To sugeruje, e wraz z wiekiem stenie nukleotydowych pochodnych 4PYR

wzrasta.Te dane wskazuj rwnie, e w erytrocytach osb zdrowych stenie 4PYTP jest

znaczce, stanowi jednak okoo 2% stenia ATP. W erytrocytach osb z niewydolnocinerek

stenie 4PYTP wielokrotnie wzrasta i stanowi od 10 do 30% stenia ATP komrkowego[publikacja 6]. Szczeglnie duy jest ten wzrost u chorych dializowanych otrzewnowo

[37,155,181]. Z przeprowadzonych analiz wynika, e stenie 4PYTP u chorych z PNN wzrasta

do wartoci 40,9 22,4 mol/l erytr., zastenie 4PYMP do wartoci 3,7 2,04 mol/l erytr.

(wyniki wasne niepublikowane). Zaobserwowano wprawdzie korelacj pomidzy steniem

kreatyniny a steniem 4PYR w osoczu oraz steniem 4PYR w osoczu a steniem 4PYMP

w erytrocytach, ale nie zaobserwowano zalenoci pomidzy steniem kreatyniny w osoczu

a steniem 4PYTP w erytrocytach u chorych z PNN. Wydaje si, e synteza 4PYTP

w erytrocytach chorych z PNN jest zalena od wielu czynnikw. U chorych z PNN

dializowanych, ktrzy regularnie otrzymywali erytropoetyn stenia zarwno 4PYTP, jak

i 4PYMP byy nisze prawie o pooww porwnaniu do grupy chorych, ktra nie dostawaa

erytropoetyny, odpowiednio 4PYTP: 41 23,8 mol/l erytr. i 81,2 36,2 mol/l erytr.

i 4PYMP 3,66 2,27 mol/l erytr. i 6,0 2,53 mol/l erytr. (wyniki wasne niepublikowane).

Jednoczenie bezporednio, po zakoczeniu hemodializy nie obserwowano obnienia ste

nukleotydw 4PYR. U pacjentw po przeszczepie nerki zarwno stenie 4PYTP, jak i 4PYMP

byo wysze (4PYTP: 18,9 7,9 mol/l erytr., 4PYMP: 2,0 1,1 mol/l erytr.) niw grupie


32/47

32

osb zdrowych. Ze wstpnych naszych obserwacji wynika, e stenie nukleotydw 4PYR u osb

po przeszczepie nerki wraca do wartoci obserwowanych u osb zdrowych dopiero po kilku

latach (wyniki wasne niepublikowane). Badania te wymagaj jednak potwierdzenia na wikszej

grupie chorych. Prezentowane wyniki zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4. Stenia 4PYTP i 4PYMP w erytrocytach osb zdrowych i z PNN.

Stenie w erytrocytach

[mol/l RBC]Badana grupa

4PYTP 4PYMP

Dzieci 8,7 4,8 0,5 0,4Osoby

zdrowe Doroli 13,0 4,7 0,8 0,5

leczeni zachowawczo 40,9 22,4 3,7 2,0

- EPO 81,2 36,2 6,0 2,5dializowani

+ EPO 41,0 23,8 3,7 2,3

Osoby

z PNN

po transplantacji 18,9 7,9 2,0 1,1

Liczba osb w grupie badanej nie bya nisza ni12

4.4.2. 1--D-rybonukleozydo-4-pirydono-3-karboksyamid

Identyfikacji 4PYR w osoczu dokonano w wyniku bada przedstawianych w niniejszym

opracowaniu [publikacja 6]. Stenie 4PYR w osoczu osb zdrowych jest bardzo niskie i wynosi

0,013 0,006 mol/l. Znaczny wzrost 4PYR obserwuje si w osoczu chorych z przewlek

niewydolnocinerek, gdzie osiga stenie 0,563 0,321 mol/l [publikacja 6]. Tak znaczcego,

niemal 50-krotnego wzrostu stenia tego zwizku nie mona tumaczyjedynie upoledzeniem

funkcji wydalniczej nerek, gdywzgldny wzrost stenia kreatyniny, pseudourydyny czy kwasu

moczowego u tych chorych by zdecydowanie niszy. W wyniku przeprowadzonych bada

ustalono, e dobowe wydalanie 4PYR w moczu osb zdrowych wynosi 26,7 18,2 mol/24h

[publikacja 6].

W pimiennictwie istniej doniesienia dotyczce analizy ste 4PYR lub jego izomerw

w moczu chorych z rnym typem nowotworw. Prace te s jednak sprzeczne pod wzgldem

oznaczonych wartoci ste. Nie dokonano take przekonujcej identyfikacji pod wzgldem

budowy chemicznej tych zwizkw, nie wiadomo bowiem czy jest to 4PYR (nazwany w tych

pracach 4-PCNR), czy jego analog 2PYR (2-PCNR). Stenie 2PYR lub 4PYR zostao oznaczone


33/47

33

w moczu u chorych z rnym typem nowotworu (piersi, puc), w wikszoci z zaawansowan

chorobbdstwierdzonymi przerzutami [182,183], z przewlekbiaaczkszpikow [184,185],

ze zoliwym midzyboniakiem [186,187], z rakiem jajnika [188], z rakiem nosowej czci garda

[189]. Autorzy jednej z opublikowanych niedawno prac sugeruj, e stenie 2PYR lub 4PYR

obok innych zmodyfikowanych nukleozydw (pseudourydyny, N2,N2-dimetyloguaniny,

1-metylo-guanozyny, 2-metyloguanozyny i 1-metyloadenozyny) moe by markerem procesu

nowotworowego, pozwalajcym na kontrolterapii tego procesu [190]. W pimiennictwie istniej

rwnie dane dotyczce oznaczania PCNR (zdefiniowanego jako 2PYR) w osoczu u chorych

zakaonych wirusem HIV, w ktrych stwierdzono, e zwizek ten obok pseudourydyny moe

by niezalenym czynnikiem prognostycznym AIDS [191]. Wprawdzie w wikszoci wyej

wymienionych prac podano, e oznaczone stenia dotycz2PYR, jednak wydaje si, e bardziej

prawdopodobne jest to, e faktycznie analizowano stenie 4PYR lub sum ste tych

zwizkw. W powyszych pracach brak jest danych czy jakiejkolwiek dyskusji dotyczcej 4PYR,

a metody analityczne zastosowane w tych badaniach nie pozwalaj na zrnicowanie tych

izomerw.

Szlak powstawania 4PYR jest nieznany. Pojawiy sispekulacje, e 4PYR moe powstawa

z dinukleotydu adeninonikotynamidowego (NAD+) [183,192], czy mononukleotydu

nikotynamidowego (NMN) [22]. Sugerowano take, e 4PYR to zmodyfikowany nukleotyd

pochodzcy z degradacji tRNA [183]. Na obecnym etapie naszych badawydaje si, e rdemtego zwizku moe by rybozyd nikotynamidu [publikacja 6]. Pod wpywem oksydazy

aldehydowej, mgby byprzeksztacony do 4PYR i jego izomerw. Przemawiajza tym wyniki

badau chorych z deficytem kofaktora molibdenowego [37], a aktywnooksydazy aldehydowej

zaley midzy innymi od obecnoci molibdenianu [193,194].

Na temat roli jak4PYR i powstajce z niego nukleotydy mogpeniw komrce w chwili

obecnej nic nie wiadomo. Na podstawie bada [publikacja 6] zasugerowano, e powstajcy

w tkankach obwodowych nukleozyd 4PYR jest zwizkiem toksycznym. Aby zapobiec tej

toksycznoci jest on wychwytywany przez erytrocyty, w ktrych ulega przemianie gwnie do

formy monofosforanowej i bardzo powoli do trjfosforanu. W nerce natomiast zachodziby

proces odwrotny katabolizm 4PYMP do nukleozydu i jego wydalanie z moczem. Powstawanie

4PYTP byoby wic procesem niemajcym fizjologicznego znaczenia, ale ktry zachodzi

intensywnie tylko wtedy, gdy wzronie stenie 4PYMP w komrce. Koncepcja ta pozostaje

jednak hipotez.


34/47

34

5. Podsumowanie

Wyniki bada przedstawione w niniejszej rozprawie habilitacyjnej dostarczyy nowych

informacji o przemianach i roli metabolitw nikotynamidu w stanach fizjologicznychi patologicznych. Identyfikacja nowego metabolitu przemian nikotynamidu - 4PYTP

w erytrocytach, identyfikacja jego prekursora (4PYR) oraz propozycja szlaku przemian tego

zwizku stanowi oryginalne, ciekawe osignicia prezentowane w przedstawionej rozprawie

habilitacyjnej. Identyfikacja tych zwizkw bya moliwa przy zastosowaniu spektroskopii

w podczerwieni, magnetycznego rezonansu jdrowego, chromatografii cieczowej a przede

wszystkim spektrometrii masowej. Przemiana 4PYR do 4PYMP w erytrocytach odbywa siprzy

udziale kinazy adenozyny powodujc obnienie stenia ATP wewntrz krwinki czerwonej,

nasilenie katabolizmu nukleotydw adeninowych oraz zwikszon produkcj hipoksantyny.

Wyniki te majznaczenie poznawcze oraz potencjalne znaczenie praktyczne.

Analiza ste nukleotydw 4PYR w erytrocytach osb zdrowych wykazaa, e stenia

4PYTP s rzdu kilku mikromolowego, natomiast 4PYMP s duo nisze. U pacjentw

z przewlek niewydolnoci nerek obserwuje si kilkudziesiciokrotny wzrost stenia tych

nukleotydw w erytrocytach, szczeglnie widoczny u pacjentw dializowanych. Co ciekawe,

proces hemodializy nie obnia stetych zwizkw u chorych z PNN. Po transplantacji nerek

stenie 4PYTP i 4PYMP we krwi obnia si powoli, ale nie osiaga wartoci obserwowanych

u ludzi zdrowych.

W wietle przedstawionych bada wydaje si uzasadnione uzupenienie schematu

metabolizmu nikotynamidu o szlak przemian 4PYR (rycina 7).


35/47

35

Dinukleotyd

nikotynamidoadeninowy

(NAD)

NIKOTYNAMID

(NA)

Fosforan dinukleotydunikotynamidoadeninowego

(NADP)Mononukleotyd

nikotynamidu (NMN)

Rybozyd

nikotynamidu

(NR)

4PYR

4PYMP

4PYTP

N-metylonikotynamid

(Met NA)N-oksyd

nikotynamidu

6-hydroksynikotynamid

EC 3.2.2.6

EC 2.1.1.1

EC 1.2.3.1

EC 2.4.2.12

EC 2.4.2.1

EC 1.2.3.1

?

EC 2.7.1.20

EC 2.4.2.30EC 2.4.2.31

EC 3.2.2.5

EC 3.5.1.98

EC 2.7.7.1

EC 2.7.1.22

EC 3.1.3.5

EC 3.1.3.5

EC 2.7.1.23


(Met2PY)N-metylo-4-pirydono-3-karboksyamid

(Met4PY)

Rycina 7.Proponowany schemat metabolizmu nikotynamidu u ssakw.

Fosforylaza nukleozydu nikotynamidowego (EC 2.4.2.1), fosforybozylotransferaza nikotynamidowa(NamPRT; EC 2.4.2.12) NAD+ glikohydrolaza/cyklaza ADPR-rybozy (EC 3.2.2.5), NADP+glikohydrolaza (EC 3.2.2.6), polimeraza poli(ADP-rybozy) (PARP; EC 2.4.2.30), mono-ADP-rybozylotransferaza (EC 2.4.2.31), sirtuiny (EC 3.5.1.-), metylotransferaza nikotynamidu (NNMT, EC2.1.1.1), oksydaza aldehydowa (EC 1.2.3.1), adenylotransferaza mononukleotydu nikotynamidu (EC2.7.7.1), 5- nukleotydaza (EC 3.1.3.5) kinaza rybozylonikotynamidu (EC 2.7.1.22), kinaza adenozyny (EC2.7.1.20), kinaza NAD+(EC 2.7.1.23).

Opracowanie procedury analizy ste metabolitw nikotynamidu z zastosowaniem

chromatografii cieczowej z detekcjmasowprzyczynio si take do wzbogacenia moliwoci

metodycznych analizy przemian nikotynamidu. Metoda ta pozwala na analiz stewszystkich

istotnych metabolitw nikotynamidu w jednym rozdziale chromatograficznym. Ponadto moliwy

jest dalszy rozwj metody i jednoczesne oznaczenie innych zwizkw.

Wyniki analiz ste metabolitw nikotynamidu we krwi wykazay, e zarwno stany

patologiczne, takie jak przewleka niewydolnonerek oraz stany fizjologiczne takie jak podeszy

wiek prowadz do wzrostu stenia niektrych metabolitw nikotynamidu we krwi, nie tylko

4PYR, lecz rwnieMet2PY i Met4PY. U ludzi starszych stenia Met2PY i Met4PY w osoczubyy znamiennie statystycznie wysze ni u dzieci. Analiza tych ste wykazaa istnienie


36/47

36

dodatniej korelacji pomidzy steniem kocowych metabolitw nikotynamidu a wiekiem.

Ponadto analiza wieloczynnikowej korelacji pomidzy zmianami stenia Met2PY w osoczu

a wiekiem i steniem kreatyniny w osoczu potwierdzia, e u ludzi zdrowych czynnikiem

odpowiedzialnym za obserwowany wzrost stenia Met2PY w osoczu jest wiek.

U osb z przewlekniewydolnocinerek stenie kocowych metabolitw nikotynamidu

w osoczu byo wielokrotnie wysze ni u osb zdrowych. Stenia zarwno Met2PY, jak

i Met4PY w osoczu wzrastay wraz ze stopniem niewydolnoci nerek. U chorych

hemodializowanych stenia tych zwizkw bezporednio po hemodializie obniay sio poow,

podobnie jak kreatynina, po czym wracay do wartoci obserwowanych przed dializ. Natomiast

transplantacja nerki powodowaa, e stenie Met2PY po tym zabiegu osigao wartoci zblione

do tych obserwowanych u osb zdrowych.

Badania przedstawione w niniejszym opracowaniu wykazay, e pochodne nikotynamidu s

inhibitorami polimerazy poli(ADP-rybozy), a wrd kocowych metabolitw nikotynamidu

najsilniejsze waciwoci hamujce wykazywa Met4PY. Stwierdzono rwnie efekty

cytoprotekcyjne pochodnych nikotynamidu (szczeglnie Met2PY) polegajce na zahamowaniu

obnienia stenia ATP i NAD+w komrkach rdbonka poddanych dziaaniu peroksynitrytu.


37/47

37

6. Wnioski

1. Zastosowanie chromatografii cieczowej z detekcjmasowznaczco zwiksza moliwocianalizy jakociowej i ilociowej pochodnych nikotynamidu.

2. Przewleka niewydolno nerek zwizana jest ze wzrostem ste katabolitw

nikotynamidu we krwi. Wzrost ten jest wynikiem zarwno upoledzonego wydalania jak

i zwikszonej syntezy tych zwizkw.

3. Stenie katabolitw nikotynamidu we krwi wzrasta wraz z wiekiem niezalenie od zmian

funkcji wydalniczej nerek.

4. Pochodne nikotynamidu (takie jak: Met2PY, kwas 6-hydroksypikolinowy i pikolinamid)

wykazuj dziaanie cytoprotekcyjne (zapobiegajc obnieniu stenia ATP i NAD+

w komrkach rdbonka poddanych dziaaniu peroksynitrytu).

5. Katabolity nikotynamidu takie jak Met2PY i Met4PY sinhibitorami PARP-1.

6. 4PYR jest prekursorem nukleotydw 4PYTP i 4PYMP w krwinkach czerwonych

czowieka.

7. W przewlekej niewydolnoci nerek wzrostowi stenia 4PYR w osoczu towarzyszy

wzrost pochodnych nukleotydowych 4PYR w erytrocytach: 4PYMP i 4PYTP. Syntezie

tych nukleotydw in vitrow krwinkach czerwonych towarzyszy obnienie stenia ATP,

wzrost stenia hipoksantyny oraz brak zmian w steniu NAD+

.


38/47

38

7. Pimiennictwo

1. Offermanns, S. The nicotinic acid receptor GPR109A (HM74A or PUMA-G) as a new

therapeutic target, Trends Pharmacol. Sci.2006, 27, 384-390.2. Knip, M., Douek, I. F., Moore, W. P., Gillmor, H. A., McLean, A. E., Bingley, P. J., Gale, E. A.

Safety of high-dose nicotinamide: a review, Diabetologia2000, 43, 1337-1345.3. Jackson, T. M., Rawling, J. M., Roebuck, B. D., Kirkland, J. B. Large supplements of nicotinic

acid and nicotinamide increase tissue NAD+ and poly(ADP-ribose) levels but do not affectdiethylnitrosamine-induced altered hepatic foci in Fischer-344 rats,J. Nutr.1995, 125, 1455-1461.

4. Nagalski, A., Bryla, J. Niacin in therapy, Postepy Hig. Med. Dosw.2007, 61, 288-302.5. Belenky, P., Bogan, K. L., Brenner, C. NAD+ metabolism in health and disease, Trends Biochem.

Sci.2007, 32, 12-19.6. Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in

mammalian cells: where are we today and where are we going?, Microbiol. Mol. Biol. Rev.2006, 70,789-829.

7. Graeff, R., Munshi, C., Aarhus, R., Johns, M., Lee, H. C. A single residue at the active site ofCD38 determines its NAD cyclizing and hydrolyzing activities, J. Biol. Chem. 2001, 276, 12169-12173.

8. Malavasi, F., Funaro, A., Roggero, S., Horenstein, A., Calosso, L., Mehta, K. Human CD38:a glycoprotein in search of a function, Immunol. Today1994, 15, 95-97.

9. Denu, J. M. The Sir 2 family of protein deacetylases, Curr. Opin. Chem. Biol.2005, 9, 431-440.10. Oliver, F. J., Menissier-de Murcia, J., de Murcia, G. Poly(ADP-ribose) polymerase in the cellular

response to DNA damage, apoptosis, and disease,Am. J. Hum. Genet.1999, 64, 1282-1288.11. Rowen, J. W., Kornberg, A. The phosphorolysis of nicotinamide riboside,J. Biol. Chem.1951, 193,

497-507.12. Elliott, G. C., Ajioka, J., Okada, C. Y. A rapid procedure for assaying nicotinamide

phosphoribosyltransferase,Anal. Biochem.1980, 107, 199-205.

13. Moore, W. P., Bolton, C. H., Downs, L., Gilmor, H. A., Gale, E. A. Measurement of N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide in urine by high performance liquid chromatography, Biomed. Chromatogr.2000, 14, 69-71.

14. Chaykin, S., Bloch, K. The metabolism of nicotinamide-N-oxide, Biochim. Biophys. Acta1959, 31,213-216.

15. Hoshino, J., Schluter, U., Kroger, H. Nicotinamide methylation and its relation to NAD synthesisin rat liver tissue culture. Biochemical basis for the physiological activities of 1-methyl-nicotinamide, Biochim. Biophys. Acta1984, 801, 250-258.

16. Felsted, R. L., Chaykin, S. N1-methylnicotinamide oxidation in a number of mammals, J. Biol.Chem.1967, 242, 1274-1279.

17. Quinn, G. P., Greengard, P. The pathway for the biosynthesis of N 1-methyl-4-pyridone-3-carboxamide,Arch. Biochem. Biophys.1966, 115, 146-152.

18. Stanulovic, M., Chaykin, S. Aldehyde oxidase: catalysis of the oxidation of N1-methyl-nicotinamide and pyridoxal,Arch. Biochem. Biophys.1971, 145, 27-34.

19. Preiss, J., Handler, P. Enzymatic synthesis of nicotinamide mononucleotide,J. Biol. Chem.1957,225, 759-770.

20. Magni, G., Amici, A., Emanuelli, M., Orsomando, G., Raffaelli, N., Ruggieri, S. Enzymology ofNAD+ homeostasis in man, Cell Mol. Life Sci.2004, 61, 19-34.

21. Abelson, D., Boyle, A., Depatie, C., Seligson, H. N'-methyl-2-pyridone-5-carboxamide in humanplasma, Clin. Chim. Acta1963, 8, 603-606.

22. Chang, M. L., Johnson, B. C. N-Methyl-4-pyridone-5-carboxamide as a metabolite of nicotinicacid in man and monkey,J. Biol. Chem.1961, 236, 2096-2098.

23. Walters, C. J., Brown, R. R., Kaihara, M., Price, J. M. The excretion of N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide by man following ingestion of several known or potential precursors,J. Biol. Chem.

1955, 217, 489-495.


39/47

39

24. Kimura, N., Fukuwatari, T., Sasaki, R., Shibata, K. Comparison of metabolic fates ofnicotinamide, NAD+ and NADH administered orally and intraperitoneally; characterization oforal NADH,J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo)2006, 52, 142-148.

25. Fukuwatari, T., Morikawa, Y., Sugimoto, E., Shibata, K. Effects of fatty liver induced by niacin-free diet with orotic acid on the metabolism of tryptophan to niacin in rats, Biosci. Biotechnol.Biochem.2002, 66, 1196-1204.

26. Okamoto, H., Ishikawa, A., Yoshitake, Y., Kodama, N., Nishimuta, M., Fukuwatari, T., Shibata,K. Diurnal variations in human urinary excretion of nicotinamide catabolites: effects of stress onthe metabolism of nicotinamide,Am. J. Clin. Nutr.2003, 77, 406-410.

27. Shibata, K., Toda, S. Effects of sex hormones on the metabolism of tryptophan to niacin and toserotonin in male rats, Biosci. Biotechnol. Biochem.1997, 61, 1200-1202.

28. Sanada, H., Miyazaki, M. Regulation of tryptophan-niacin metabolism by hormones,J. Nutr. Sci.Vitaminol. (Tokyo)1980, 26, 617-627.

29. Tamulevicius, P., Streffer, C. N-methylnicotinamide as a possible prognostic indicator of recoveryfrom leukaemia in patients treated with total-body irradiation and bone marrow transplants,Strahlentherapie.1984, 160, 249-254.

30. Trump, S., Laudi, S., Unruh, N., Goelz, R., Leibfritz, D. 1H-NMR metabolic profiling of humanneonatal urine,MAGMA.2006, 19, 305-312.

31. Jansen, E. H., van den Berg, R. H., Boink, A. B., Hegger, C., Meulenbelt, J. A new physiologicalbiomarker for nitrate exposure in humans, Toxicol. Lett.1995, 77, 265-269.

32. Jacobson, E. L., Dame, A. J., Pyrek, J. S., Jacobson, M. K. Evaluating the role of niacin in humancarcinogenesis, Biochimie1995, 77, 394-398.

33. Rutkowski, B., Slominska, E., Szolkiewicz, M., Smolenski, R. T., Striley, C., Rutkowski, P.,Swierczynski, J. N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide: a novel uremic toxin?, Kidney Int. Suppl2003, S19-S21.

34. Maiza, A., Waldek, S., Ballardie, F. W., Daley-Yates, P. T. Estimation of renal tubular secretion inman, in health and disease, using endogenous N-1-methylnicotinamide,Nephron1992, 60, 12-16.

35. Musfeld, C., Biollaz, J., Belaz, N., Kesselring, U. W., Decosterd, L. A. Validation of an HPLCmethod for the determination of urinary and plasma levels of N1-methylnicotinamide, anendogenous marker of renal cationic transport and plasma flow, J. Pharm. Biomed. Anal.2001, 24,

391-404.36. Pumpo, R., Sarnelli, G., Spinella, A., Budillon, G., Cuomo, R. The metabolism of nicotinamide in

human liver cirrhosis: a study on N-methylnicotinamide and 2-pyridone-5-carboxamideproduction,Am. J. Gastroenterol.2001, 96, 1183-1187.

37. Carrey, E. A., Smolenski, R. T., Edbury, S. M., Laurence, A., Marinaki, A. M., Duley, J. A., Zhu,L., Goldsmith, D. J., Simmonds, H. A. Origin and characteristics of an unusual pyridinenucleotide accumulating in erythrocytes: positive correlation with degree of renal failure, Clin.Chim. Acta2003, 335, 117-129.

38. Rutkowski, B., Swierczynski, J., Slominska, E., Szolkiewicz, M., Smolenski, R. T., Marlewski, M.,Butto, B., Rutkowski, P. Disturbances of purine nucleotide metabolism in uremia, Semin. Nephrol.2004, 24, 479-483.

39. Shibata, K., Matsuo, H. Correlation between niacin equivalent intake and urinary excretion of its

metabolites, N'-methylnicotinamide, N'-methyl-2-pyridone-5-carboxamide, and N'-methyl-4-pyridone-3-carboxamide, in humans consuming a self-selected food, Am. J. Clin. Nutr.1989, 50,114-119.

40. Terry, R. C., Simon, M. Determination of niacin metabolites 1-methyl-5-carboxylamide-2-pyridone and N-1-methylnicotinamide in urine by high-performance liquid chromatography,J. Chromatogr.1982, 232, 261-274.

41. Carter, E. G. Quantitation of urinary niacin metabolites by reversed-phase liquid chromatography,Am. J. Clin. Nutr.1982, 36, 926-930.

42. Price, J. M. The determination of N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide in human urine, J. Biol.Chem.1954, 211, 117-124.

43. Barlow, G. B., Sutton, J. L., Wilkinson, A. W. Metabolism of nicotinic acid in children with burnsand scalds, Clin. Chim. Acta1977, 75, 337-342.

44. Horwitt, M. K., Harper, A. E., Henderson, L. M. Niacin-tryptophan relationships for evaluatingniacin equivalents,Am. J. Clin. Nutr.1981, 34, 423-427.


40/47

40

45. Wertz, A. W., Lojkin, M. E., Bouchard, B. S., Derby, M. B. Tryptophan-niacin relationships inpregnacy,J. Nutr.1958, 64, 339-353.

46. Salek, R. M., Maguire, M. L., Bentley, E., Rubtsov, D. V., Hough, T., Cheeseman, M., Nunez, D.,Sweatman, B. C., Haselden, J. N., Cox, R. D., Connor, S. C., Griffin, J. L. A metabolomiccomparison of urinary changes in type 2 diabetes in mouse, rat, and human, Physiol Genomics2007,29, 99-108.

47. Okamoto, H., Ishikawa, A., Nishimuta, M., Kodama, N., Yoshitake, Y., Fukuwatari, T., Shibata,K. Effects of stress on the urinary excretory pattern of niacin catabolites, the most reliable indexof niacin status, in humans,J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo)2002, 48, 417-419.

48. Poulter, J. M., Dickerson, J. W., White, W. F. Tryptophan metabolism in patients with breastcancer,Acta Vitaminol. Enzymol.1985, 7, 93-97.

49. Shibata, K., Fukuwatari, T., Sugimoto, E. Effects of dietary pyrazinamide, an antituberculosisagent, on the metabolism of tryptophan to niacin and of tryptophan to serotonin in rats, Biosci.Biotechnol. Biochem.2001, 65, 1339-1346.

50. Aoyama, K., Matsubara, K., Kondo, M., Murakawa, Y., Suno, M., Yamashita, K., Yamaguchi, S.,Kobayashi, S. Nicotinamide-N-methyltransferase is higher in the lumbar cerebrospinal fluid ofpatients with Parkinson's disease,Neurosci. Lett.2001, 298, 78-80.

51. Williams, A. C., Pall, H. S., Steventon, G. B., Green, S., Buttrum, S., Molloy, H., Waring, R. H.

N-methylation of pyridines and Parkinson's disease,Adv. Neurol.1993, 60, 194-196.52. Aoyama, K., Matsubara, K., Okada, K., Fukushima, S., Shimizu, K., Yamaguchi, S., Uezono, T.,

Satomi, M., Hayase, N., Ohta, S., Shiono, H., Kobayashi, S. N-methylation ability forazaheterocyclic amines is higher in Parkinson's disease: nicotinamide loading test,J. Neural Transm.2000, 107, 985-995.

53. Vannucchi, H., Mello de Oliveira, J. A., Dutra de Oliveira, J. E. Tryptophan metabolism inalcoholic pellagra patients: measurements of urinary metabolites and histochemical studies ofrelated muscle enzymes,Am. J. Clin. Nutr.1982, 35, 1368-1374.

54. Monteiro, J. P., da Cunha, D. F., Filho, D. C., Silva-Vergara, M. L., dos Santos, V. M., da Costa J.C., Jr., Etchebehere, R. M., Goncalves, J., de Carvalho da Cunha SF, Jordao, A. A., Chiarello, P.G.,Vannucchi, H. Niacin metabolite excretion in alcoholic pellagra and AIDS patients with andwithout diarrhea,Nutrition2004, 20, 778-782.

55. Brown, F. C., White, J. B., Jr., Kennedy, J. K. Urinary excretion of tryptophan metabolites byschizophrenic individuals,Am. J. Psychiatry1960, 117, 63-65.

56. Cazzullo, C. L., Sacchetti, E., Smeraldi, E. N-methylnicotinamide excretion and affectivedisorders, Psychol. Med.1976, 6, 265-270.

57. Lis, E. W., Lis, A. W., DeHackbeil, K. F. Ultraviolet-absorbing components of urine frommentally retarded children. Clin. Chem.1970, 16, 714-721.

58. Lis, A. W., Mclaughlin, I., Mpclaughlin, R. K., Lis, E. W., Stubbs, E. G. Profiles of ultraviolet-absorbing components of urine from autistic children, as obtained by high-resolution ion-exchange chromatography, Clin. Chem.1976, 22, 1528-1532.

59. Aleszczyk, J. Connection between changing the vitamin and immune status and the character ofthe throat microflora in patients with chronic tonsillitis, Otolaryngol. Pol.2003, 57, 221-224.

60. Chu, B. C., Lawley, P. D. Increased urinary excretion of pyrimidine and nicotinamide derivatives

in rats treated with methyl methanesulphonate, Chem. Biol. Interact.1974, 8, 65-73.61. Chu, B. C., Lawley, P. D. Increased urinary excretion of nucleic acid and nicotinamide derivatives

by rats after treatment with alkylating agents, Chem. Biol. Interact.1975, 10, 333-338.62. Ohkubo, M., Shimizu, M., Kubo, A., Fujimura, S. Increased urinary excretion of 1-methyl-2-

pyridone-5-carboxamide in rats administered 2-acetylaminofluorene, Chem. Biol. Interact.1977, 18,101-110.

63. Ishihara, K., Katsutani, N., Aoki, T. A metabonomics study of the hepatotoxicants galactosamine,methylene dianiline and clofibrate in rats, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol.2006, 99, 251-260.

64. Connor, S. C., Wu, W., Sweatman, B. C., Manini, J., Haselden, J. N., Crowther, D. J., Waterfield,C. J. Effects of feeding and body weight loss on the 1H-NMR-based urine metabolic profiles ofmale Wistar Han rats: implications for biomarker discovery, Biomarkers2004, 9, 156-179.

65. Egashira, Y., Isagawa, A., Komine, T., Yamada, E., Ohta, T., Shibata, K., Sanada, H. Tryptophan-

niacin metabolism in liver cirrhosis rat caused by carbon tetrachloride, J. Nutr. Sci. Vitaminol.(Tokyo)1999, 45, 459-469.


41/47

41

66. Andersen, H. U., Jorgensen, K. H., Egeberg, J., Mandrup-Poulsen, T., Nerup, J. Nicotinamideprevents interleukin-1 effects on accumulated insulin release and nitric oxide production in ratislets of Langerhans, Diabetes1994, 43, 770-777.

67. Burkart, V., Koike, T., Brenner, H. H., Kolb, H. Oxygen radicals generated by the enzymexanthine oxidase lyse rat pancreatic islet cells in vitro, Diabetologia1992, 35, 1028-1034.

68. Otsuka, A., Hanafusa, T., Miyagawa, J., Kono, N., Tarui, S. Nicotinamide and 3-aminobenzamide

reduce interferon-gamma-induced class II MHC (HLA -DR and -DP) molecule expression oncultured human endothelial cells and fibroblasts, Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1991, 13, 263-280.

69. Hiromatsu, Y., Sato, M., Tanaka, K., Ishisaka, N., Kamachi, J., Nonaka, K. Inhibitory effects ofnicotinamide on intercellular adhesion molecule-1 expression on cultured human thyroid cells,Immunology1993, 80, 330-332.

70. Ungerstedt, J. S., Blomback, M., Soderstrom, T. Nicotinamide is a potent inhibitor ofproinflammatory cytokines, Clin. Exp. Immunol.2003, 131, 48-52.

71. Kolb, H., Burkart, V. Nicotinamide in type 1 diabetes. Mechanism of action revisited, DiabetesCare1999, 22 Suppl 2, B16-B20.

72. Kretowski, A., Mysliwiec, J., Szelachowska, M., Kinalski, M., Kinalska, I. Nicotinamide inhibitsenhanced in vitro production of interleukin-12 and tumour necrosis factor-alpha in peripheral

whole blood of people at high risk of developing type 1 diabetes and people with newly diagnosedtype 1 diabetes, Diabetes Res. Clin. Pract.2000, 47, 81-86.

73. Chaidemenos, G. C. Tetracycline and niacinamide in the treatment of blistering skin diseases,Clin. Dermatol.2001, 19, 781-785.

74. Fivenson, D. P., Breneman, D. L., Rosen, G. B., Hersh, C. S., Cardone, S., Mutasim, D.Nicotinamide and tetracycline therapy of bullous pemphigoid,Arch. Dermatol.1994, 130, 753-758.

75. Shalita, A. R., Smith, J. G., Parish, L. C., Sofman, M. S., Chalker, D. K. Topical nicotinamidecompared with clindamycin gel in the treatment of inflammatory acne vulgaris, Int. J. Dermatol.1995, 34, 434-437.

76. Namazi, M. R. Nicotinamide: a potential addition to the anti-psoriatic weaponry, FASEB J.2003,17, 1377-1379.

77. Namazi, M. R. Nicotinamide as a potential addition to the anti-atopic dermatitis armamentarium,

Int. Immunopharmacol.2004, 4, 709-712.78. Virag, L., Szabo, C. The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors,

Pharmacol. Rev.2002, 54, 375-429.79. Kroger, H., Miesel, R., Dietrich, A., Ohde, M., Rajnavolgyi, E., Ockenfels, H. Synergistic effects

of thalidomide and poly (ADP-ribose) polymerase inhibition on type II collagen-induced arthritisin mice, Inflammation1996, 20, 203-215.

80. Cabrera-Rode, E., Molina, G., Arranz, C., Vera, M., Gonzalez, P., Suarez, R., Prieto, M., Padron,S., Leon, R., Tillan, J., Garcia, I., Tiberti, C., Rodriguez, O. M., Gutierrez, A., Fernandez, T.,Govea, A., Hernandez, J., Chiong, D., Dominguez, E., Di Mario, U., Diaz-Diaz, O., Diaz-Horta,O. Effect of standard nicotinamide in the prevention of type 1 diabetes in first degree relatives ofpersons with type 1 diabetes,Autoimmunity2006, 39, 333-340.

81. Gale, E. A., Bingley, P. J., Emmett, C. L., Collier, T. European Nicotinamide Diabetes

Intervention Trial (ENDIT): a randomised controlled trial of intervention before the onset oftype 1 diabetes, Lancet2004, 363, 925-931.

82. Koppen, A., Klein, J., Holler, T., Loffelholz, K. Synergistic effect of nicotinamide and cholineadministration on extracellular choline levels in the brain,J. Pharmacol. Exp. Ther.1993, 266, 720-725.

83. Vargas, H. M., Jenden, D. J. Elevation of cerebrospinal fluid choline levels by nicotinamideinvolves the enzymatic formation of N1-methylnicotinamide in brain tissue, Life Sci. 1996, 58,1995-2002.

84. Maiese, K., Chong, Z. Z. Nicotinamide: necessary nutrient emerges as a novel cytoprotectant forthe brain, Trends Pharmacol. Sci.2003, 24, 228-232.

85. Yang, J., Klaidman, L. K., Adams, J. D. Medicinal chemistry of nicotinamide in the treatment ofischemia and reperfusion,Mini. Rev. Med Chem.2002, 2, 125-134.

86. Okazaki, I. J., Moss, J. Characterization of glycosylphosphatidylinositiol-anchored, secreted, andintracellular vertebrate mono-ADP-ribosyltransferases,Annu. Rev. Nutr.1999, 19, 485-509.


42/47

42

87. Banasik, M., Komura, H., Shimoyama, M., Ueda, K. Specific inhibitors of poly(ADP-ribose)synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase,J. Biol. Chem.1992, 267, 1569-1575.

88. Bitterman, K. J., Anderson, R. M., Cohen, H. Y., Latorre-Esteves, M., Sinclair, D. A. Inhibition ofsilencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 andhuman SIRT1,J. Biol. Chem.2002, 277, 45099-45107.

89. Landry, J., Slama, J. T., Sternglanz, R. Role of NAD(+) in the deacetylase activity of the SIR2-like

proteins, Biochem. Biophys. Res. Commun.2000, 278, 685-690.90. Sauve, A. A., Schramm, V. L. Sir2 regulation by nicotinamide results from switching between base

exchange and deacetylation chemistry, Biochemistry2003, 42, 9249-9256.91. Sauve, A. A., Wolberger, C., Schramm, V. L., and Boeke, J. D. The biochemistry of sirtuins,Annu.

Rev. Biochem.2006, 75, 435-465.92. Grossman, L., Kaplan, N. O. Nicotinamide riboside phosphorylase from human erythrocytes.

I. Phosphorolytic activity,J. Biol. Chem.1958, 231, 717-726.93. Grossman, L., Kaplan, N. O. Nicotinamide riboside phosphorylase from human erythrocytes.

II. Nicotinamide sensitivity,J. Biol. Chem.1958, 231, 727-740.94. Gaudineau, C., Auclair, K. Inhibition of human P450 enzymes by nicotinic acid and nicotinamide,

Biochem. Biophys. Res. Commun.2004, 317, 950-956.95. Jeggo, P. A. DNA repair: PARP-another guardian angel?, Curr. Biol.1998, 8, R49-R51.

96. Burkle, A. Poly(APD-ribosyl)ation, a DNA damage-driven protein modification and regulator ofgenomic instability, Cancer Lett.2001, 163, 1-5.

97. de Murcia, G., Huletsky, A., Poirier, G. G. Modulation of chromatin structure by poly(ADP-ribosyl)ation, Biochem. Cell Biol.1988, 66, 626-635.

98. de Murcia G., Huletsky, A., Lamarre, D., Gaudreau, A., Pouyet, J., Daune, M., Poirier, G. G.Modulation of chromatin superstructure induced by poly(ADP-ribose) synthesis and degradation,J. Biol. Chem.1986, 261, 7011-7017.

99. Eki, T. Poly (ADP-ribose) polymerase inhibits DNA replication by human replicative DNApolymerase alpha, delta and epsilon in vitro, FEBS Lett.1994, 356, 261-266.

100. Satoh, M. S., Poirier, G. G., Lindahl, T. Dual function for poly(ADP-ribose) synthesis in responseto DNA strand breakage, Biochemistry1994, 33, 7099-7106.

101. Hassa, P. O., Hottiger, M. O. A role of poly(ADP-ribose) polymerase in NF-kappaB

transcriptional activation, Biol. Chem.1999, 380, 953-959.102. Ziegler, M., Oei, S. L. A cellular survival switch: poly(ADP-ribosyl)ation stimulates DNA repair

and silences transcription, Bioessays2001, 23, 543-548.103. Kanai, M., Tong, W. M., Sugihara, E., Wang, Z. Q., Fukasawa, K., Miwa, M. Involvement of

poly(ADP-Ribose) polymerase 1 and poly(ADP-Ribosyl)ation in regulation of centrosomefunction,Mol. Cell Biol.2003, 23, 2451-2462.

104. Smith, S., Giriat, I., Schmitt, A., de Lange, T. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase athuman telomeres, Science1998, 282, 1484-1487.

105. Smith, S., de Lange T. Tankyrase promotes telomere elongation in human cells, Curr. Biol.2000,10, 1299-1302.

106. Dynek, J. N., Smith, S. Resolution of sister telomere association is required for progressionthrough mitosis, Science2004, 304, 97-100.

107. Szabo, C. Role of poly(ADP-ribose)synthetase in inflammation,Eur. J. Pharmacol.1998, 350, 1-19.108. Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Ottaviano, Y., Davidson, N. E., Poirier, G. G. Specific

proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-inducedapoptosis, Cancer Res.1993, 53, 3976-3985.

109. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage ofpoly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE, Nature 1994, 371, 346-347.

110. Germain, M., Affar, E. B., D'Amours, D., Dixit, V. M., Salvesen, G. S., Poirier, G. G. Cleavage ofautomodified poly(ADP-ribose) polymerase during apoptosis. Evidence for involvement ofcaspase-7,J. Biol. Chem.1999, 274, 28379-28384.

111. Yu, S. W., Wang, H., Poitras, M. F., Coombs, C., Bowers, W. J., Federoff, H. J., Poirier, G. G.,Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cell

death by apoptosis-inducing factor, Science2002, 297, 259-263.


43/47

43

112. Kiss, L., Szabo, C. The pathogenesis of diabetic complications: the role of DNA injury andpoly(ADP-ribose) polymerase activation in peroxynitrite-mediated cytotoxicity,Mem. Inst. OswaldoCruz2005, 100 Suppl 1, 29-37.

113. de la Lastra, C. A., Villegas, I., Sanchez-Fidalgo, S. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: newpharmacological functions and potential clinical implications, Curr. Pharm. Des2007, 13, 933-962.

114. Szabo, C., Dawson, V. L. Role of poly(ADP-ribose) synthetase in inflammation and ischaemia-

reperfusion, Trends Pharmacol. Sci.1998, 19, 287-298.115. Kroger, H., Ehrlich, W., Klewer, M., Gratz, R., Dietrich, A., Miesel, R. The influence of

antagonists of poly(ADP-ribose) metabolism on acetaminophen hepatotoxicity, Gen. Pharmacol.1996, 27, 167-170.

116. Szabo, C., Zingarelli, B., Salzman, A. L. Role of poly-ADP ribosyltransferase activation in thevascular contractile and energetic failure elicited by exogenous and endogenous nitric oxide andperoxynitrite, Circ. Res.1996, 78, 1051-1063.

117. Bowes, J., McDonald, M. C., Piper, J., Thiemermann, C. Inhibitors of poly (ADP-ribose)synthetase protect rat cardiomyocytes against oxidant stress, Cardiovasc. Res.1999, 41, 126-134.

118. Ruf, A., de Murcia, G., Schulz, G. E. Inhibitor and NAD+ binding to poly(ADP-ribose)polymerase as derived from crystal structures and homology modeling, Biochemistry1998, 37, 3893-3900.

119. Virag, L., Szabo, C. Purines inhibit poly(ADP-ribose) polymerase activation and modulateoxidant-induced cell death, FASEB J.2001, 15, 99-107.

120. Wozniacka, A., Wieczorkowska, M., Gebicki, J., Sysa-Jedrzejowska, A. Topical application of1-methylnicotinamide in the treatment of rosacea: a pilot study, Clin. Exp. Dermatol.2005, 30, 632-635.

121. Gebicki, J., Sysa-Jedrzejowska, A., Adamus, J., Wozniacka, A., Rybak, M., Zielonka, J.1-Methylnicotinamide: a potent anti-inflammatory agent of vitamin origin, Pol. J. Pharmacol.2003,55, 109-112.

122. Bryniarski, K., Biedron, R., Jakubowski, A., Chlopicki, S., Marcinkiewicz, J. Anti-inflammatoryeffect of 1-methylnicotinamide in contact hypersensitivity to oxazolone in mice; involvement ofprostacyclin,Eur. J. Pharmacol.2008, 578, 332-338.

123. Chlopicki, S., Swies, J., Mogielnicki, A., Buczko, W., Bartus, M., Lomnicka, M., Adamus, J.,

Gebicki, J. 1-Methylnicotinamide (MNA), a primary metabolite of

Documents

Slominska Ewa