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IL MESOTELIOMA MALIGNO:MARCATORI IMMUNOISTOCHIMICI

Vincenzo Canzonieri 1*, Lara Alessandrini 1, Alessandra Bearz 2,Carmelo Dinoto 3, Emilio Minatel 4, Tiziana Perin 1

* Commissione Regionale dell’Amianto del Friuli Venezia Giulia.

1 Unita di Anatomia Patologica.

2 Unita di Oncologia Medica A.

3 Unita di Medicina del Lavoro, SMA Service e Head-Up Spin Off, Universita di Venezia.

4 Unita di Oncologia Radioterapica, CRO Aviano, Centro Di Riferimento Oncologico, Istituto Nazionale

Tumori - IRCCS - Aviano(PN).

SOMMARIO

Il quadro microscopico del mesotelioma maligno e caratterizzato da marcata varieta morfologica,in contrapposizione al relativo monomorfismo del comportamento clinico e del quadro macrosco-pico. Per la diagnosi di mesotelioma maligno, considerando non solo le implicazioni clinico-tera-peutiche, ma spesso anche quelle medico-legali e/o epidemiologiche, si puo ricorrere a metodidiagnostici accessori che integrano il tradizionale esame al microscopio all’ematossilina-eosina.I marcatori immunoistochimici sono utilizzati nella conferma della derivazione mesoteliale dellaneoplasia, rispetto alla possibilita di una metastasi da carcinoma di altra sede. Linee guida Nazio-nali ed Internazionali raccomandano l’utilizzo di due marcatori positivi per mesotelioma e due ne-gativi. I marcatori immunoistochimici maggiormente utilizzati nel confermare la differenziazionemesoteliale sono: calretinina, WT-1, Citocheratine 5/6, la podoplanina (D2-40) e la mesotelina.Marcatori in genere non espressi dal mesotelio e che, se positivi, confermano la diagnosi di carci-noma sono, invece: mCEA, Ber-EP4, MOC31, CD15. Altri marcatori, specifici per alcuni istotipi dicarcinoma, vengono spesso aggiunti nel pannello: ad. es. TTF1 e napsina per l’adenocarcinomadel polmone, p63 e p40 per il carcinoma spinocellulare, PAX8 e CD10 per il carcinoma renale.L’immunoistochimica interviene, talvolta, anche nella diagnosi differenziale tra processo mesote-liale reattivo e mesotelioma maligno, in particolare nei casi in cui il materiale diagnostico e esiguo(piccole biopsie) e non sono chiaramente evidenziabili i criteri morfologici di malignita, quali l’in-filtrazione dei tessuti molli circostanti o, nel caso di mesotelioma pleurico, del parenchima polmo-nare. Per superare l’elevata resistenza del mesotelioma maligno ai tradizionali chemioterapici, so-no in fase di studio nuovi approcci terapeutici, fondati su terapie specifiche (targeted therapies) edimmunoterapia. La valutazione dell’espressione immunoistochimica di alcuni antigeni (es. meso-telina) consentirebbe di selezionare pazienti che potrebbero beneficiare di terapie specifiche, qua-li ad esempio con SSP1 (immunotossina antimesotelina), che, a livello sperimentale, ha gia mostra-to buoni risultati nel trattamento dei mesoteliomi resistenti alla chemioterapia. Il capitolo descrive iprincipali marcatori immunoistochimici utilizzati nella diagnostica anatomopatologica del mesote-lioma maligno e i nuovi marcatori disponibili con finalita prognostiche e terapeutiche.

Parole chiave: mesotelioma maligno, immunoistochimica, biomarcatori, terapia specifica.

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ABSTRACT

Malignant mesothelioma is characterized by protean histological appearances, comprising manymicroscopic subtypes. Immunohistochemistry (IHC) is a technique used for accurately diagnosingmesothelioma and differentiating them from primary lung cancer and other neoplasms that metas-tasise to pleura. It has been recommended to use at least two positive and two negative markers toconfirm the diagnosis of mesothelioma. The most used immunohistochemical markers that are re-latively specific for mesothelial cells and mesothelioma, include: calretinin, WT-1, CK 5,6, Podo-planin (D2-40) and mesothelin. Other markers, usually negative in mesothelioma, but positivein carcinomas are: mCEA, Ber-Ep4, MOC31, CD15, TTF1, P63, napsin, p40, CD10, PAX8. For somedifferential diagnoses, TTF1 and napsin are positive in lung adenocarcinoma, p63 and p40 are po-sitive, among others, in lung squamous cell carcinoma, CD10 and PAX 8 are positive in renal cellcarcinoma. Sometimes, IHC may be helpful in differentiating reactive pleural processes from ma-lignant ones. Another interesting application of IHC is to explore new markers useful for targetedtherapy of mesothelioma (i.e. mesothelin).The chapter describes the application of IHC in the diagnosis, prognosis and therapy responseprediction of malignant mesothelioma.

Keywords: malignant mesothelioma, immunohistochemistry, biomarkers, targeted therapy

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1. INTRODUZIONE

La diagnosi di mesotelioma maligno (MM) si fonda su risultati ottenuti da una biopsia adegua-ta (meno comunemente da campioni citologici, esfoliativi o da ago aspirati) nel contesto di per-tinenti informazioni cliniche, radiologiche e chirurgiche. La diagnosi istologica di MM necessitanon solo di appropriati criteri morfologici, valutati mediante colorazioni istologiche routinarie,quali l’ematossilina-eosina (EE), ma anche di un adeguato pannello di marcatori immunoistochi-mici. Tali marcatori sono utili principalmente nella conferma della derivazione mesoteliale dellaneoplasia, rispetto alla possibilita di una metastasi da carcinoma di altra sede e possono, inoltre,contribuire a definire meglio la diagnostica differenziale tra MM e processi mesoteliali reattivi.

2. PROLIFERAZIONI MESOTELIALI: DISTINZIONE TRA LESIONI BENIGNEE MALIGNE

Tra i molteplici fattori causali che determinano un’iperplasia mesoteliale reattiva, si annove-rano infezioni, infiammazioni, infarti polmonari, traumi, esiti chirurgici. Le caratteristiche speci-fiche di una proliferazione mesoteliale reattiva, che possono simulare una neoplasia, includonoelevata cellularita, presenza di numerose figure mitotiche, atipie citologiche, presenza di necro-si, formazione di aggregati cellulari a pattern papillare ed intrappolamento di cellule mesotelialinella fibrosi stromale o in tessuto fibroflogistico e di granulazione, con aspetti pseudo-infiltrativi,talora molto difficili da distinguere, all’esame istologico, dalla vera infiltrazione neoplastica. Ineffetti, la dimostrazione dell’invasione stromale, in particolare del tessuto adiposo, e una carat-teristica patognomonica -ma non indispensabile- per la diagnosi di MM. Come si dira dopo, taleaspetto puo essere meglio accertato con l’ausilio dell’immunoistochimica e l’utilizzo di marca-tori specifici. Il punto e che, nonostante alcuni marcatori risultino maggiormente specifici perMM, come, ad esempio, glucose transporter 1 (GLUT-1), p53, epithelial membrane antigen(EMA), insulin-like growth factor II messenger RNA-binding protein 3 (IMP3), ed altri invecesiano piu utili per identificare l’iperplasia mesoteliale (desmina, TERT- telomerase reverse tran-scriptase) (1), non e prudente basare una diagnosi differenziale solo sul pannello immunoisto-chimico. E, invece, necessario valutare contestualmente gli aspetti citomorfologici, per una cor-retta interpretazione, come presupposto indispensabile per la diagnosi istologica (2-4). Recen-temente, e stato riportato che la perdita di espressione proteica della proteina 1 associata aBRCA (BAP1) consente di differenziare il MM dall’iperplasia mesoteliale reattiva (5, 6). Il geneBAP1 presenta mutazioni inattivanti nel 23-61% dei MM: tali mutazioni sono frequentemente as-sociate a perdita di espressione immunoistochimica della proteina BAP1 nei nuclei delle celluledei MM, mentre l’immunopositivita per BAP1 e ritenuta nelle normali cellule mesoteliali iperpla-stiche. Un ulteriore problema di diagnosi differenziale e la distinzione tra la pleurite fibrinosa e ilmesotelioma desmoplastico, per il comune aspetto citostrutturale caratterizzato dalla presenzadi elementi cellulari fusiformi. Pertanto, in un contesto di proliferazione a cellule fusate dellapleura puo essere utile, per poter dirimere eventuali dubbi diagnostici, identificare le seguenticaratteristiche: crescita invasiva, necrosi blanda, aree francamente sarcomatoidi (cioe a morfo-tipo ‘‘maligno’’) e presenza di malattia metastatica, quali elementi orientativi per MM. In caso diulteriori problemi interpretativi, derivati dalla morfologia subdolamente ‘‘benigna’’ delle cellulefusate infiltranti, perche somiglianti a normali fibroblasti, la loro positivita per le pancitochera-tine ne supporterebbe la natura tumorale, in sedi in cui normalmente non dovrebbero esserepresenti e cioe tessuto adiposo, tessuto connettivo o muscolo scheletrico. Anche quando l’iden-tificazione dell’invasione neoplastica nei tessuti adiacenti, in specie adiposi, puo sembrare age-vole con l’ausilio dell’immunoreazione per pancitocheratine, non e raro che si presentino im-portanti difficolta diagnostiche. Churg e coll. (7) hanno recentemente descritto la presenza di

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spazi otticamente vuoti simil-adiposi (fake-fat) nel contesto di polmoniti in organizzazione, pro-babilmente risultato di modifiche artefattuali nel tessuto connettivo denso. In tali aree, la presen-za di cellule pancitocheratina positive, orientate orizzontalmente rispetto agli spazi, non deveessere confusa con il reperto di malignita (da mesotelioma) di cellule pancitocheratina positive,orientate verticalmente ed infiltranti effettivamente il tessuto adiposo. Inoltre, S100, laminina ecollagene IV mostrano solitamente immunopositivita nel vero tessuto adiposo e cio puo aiutarea distinguerlo dal ‘fake-fat’, che e negativo per tutti e tre i marcatori.

3. MARCATORI IMMUNOISTOCHIMICI NEL MM:DIAGNOSI DIFFERENZIALI

Sulla base delle relative proporzioni di cellule epiteliomorfe e cellule fusate, si distinguono tretipi istologici principali di mesotelioma maligno: epitelioide, sarcomatoide (o fibroso) e bifasico(o misto) (Figura 1a, 1b, 1c). Si sono, inoltre, identificati molteplici patterns per ciascuno di talisottotipi, alcuni dei quali sembrano avere anche un valore prognostico.

I marcatori immunoistochimici, scelti di volta in volta, come metodica ancillare alla colorazio-

ne routinaria variano in base al tipo istologico di mesotelioma (epitelioide vs sarcomatoide), alla

sede della neoplasia (pleurica vs peritoneale) e all’istotipo/agli istotipi di tumore considerati nel-

la diagnosi differenziale (carcinoma squamoso, adenocarcinoma, melanoma, ad es.). Si sugge-

Figura 1. Aggregati di cellule mesoteliali maligne (a morfologia epitelioide) nel contesto di unprocesso fibroflogistico (colorazione EE; ingrandimenti: A, B 200x; C 400x).

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risce di utilizzare pannelli di anticorpi presunti negativi e presunti positivi, con appropriati con-trolli positivi e negativi e con sensibilita e specificita maggiori dell’80%. Pur in assenza di indi-cazioni precise, le Linee Guida propongono l’utilizzo di almeno 2 marcatori di differenziazionemesoteliale e 2 marcatori attesi positivi nella neoplasia considerata nella diagnosi differenziale(8). Se i risultati sono concordi, il procedimento diagnostico puo considerarsi concluso. Altri-menti, si espande il pannello di marcatori e si rivalutano le espressioni immunoistochimichedei nuovi anticorpi utilizzati.

3.1 Diagnosi differenziale tra mesotelioma epitelioide pleurico e carcinoma

Attualmente, per la caratterizzazione anatomopatologica si ha a disposizione un’ampia varie-ta di marcatori utili nella diagnosi differenziale tra MM e carcinoma metastatico di origine pol-monare o da altri organi a distanza. Posto che nessuno dei marcatori in uso nella distinzione tramesoteliomi epitelioidi pleurici ed adenocarcinomi polmonari e tra mesoteliomi e carcinomisquamosi, puo essere considerato specifico al 100%, l’International Mesothelioma Interest

Group (IMIG) raccomanda che almeno 2 marcatori mesoteliali e 2 marcatori di cellule carcino-matose, oltre alle citocheratine (CK) (utilizzando un anticorpo anti-citocheratina ad ampio spet-tro) siano inclusi in ciascun pannello [8]. Sulla base della loro sensibilita e specificita, calretinina,CK5 o CK5/6, Wilms-tumor antigen 1 (WT-1), mesotelina e D2-40 (podoplanina) sono i migliorimarcatori positivi del mesotelioma (Figura 2a, 2b, 2c, 2d, 2f), mentre MOC- 31 (Epithelial spe-

cific Antigen/Ep-CAM), Ber-EP4, antigene carcinoembrionario (CEA) sono, in generale, i miglio-ri marcatori dei carcinomi (9, 10, 11). Tra i marcatori a maggiore specificita, il fattore di trascri-zione tiroideo-1 (tyroid transcription factor-1; TTF-1) (Figura 2e) e la napsina A hanno un van-taggio rispetto agli altri in quanto possono essere utilizzati per confermarel’ origine polmonaredi un adenocarcinoma. Per contro, MOC-31, Ber-EP4, CEA, p63 e p40 sono considerati i migliorimarcatori per differenziare tramesoteliomi epitelioidi e carcinomi a cellule squamose perche so-no comunemente espressi in quest’ultimi e sono di solito assenti nei primi (12). Rispetto agli altrimarcatori, p63 e p40 presentano un’ulteriore peculiarita: oltre ad essere invariabilmente espressiin maniera intensa e diffusa nei carcinomi a cellule squamose, ed essere completamente assentinei mesoteliomi, puo anche aiutare a distinguere l’istotipo a cellule squamose del carcinoma delpolmone (p63 positivo) dall’istotipo adenocarcinoma (p63 negativo).Poiche WT-1 e espressonella maggior parte dei MM epitelioidi ma e assente nei carcinomi a cellule squamose, anchetale marcatore viene spesso utilizzato come marker positivo del mesotelioma per discriminaretra questi tipi di neoplasia. La calretinina non appare, invece, cosı utile in questo scenario poi-che mostra spesso positivita nei carcinomi a cellule squamose. Altri carcinomi che metastatizza-no alla pleura e che potenzialmente possono essere confusi con il mesotelioma, sono quelli chederivano dal complesso tubo-ovarico, dalla mammella, dal rene e dal tratto gastrointestinale.Poiche la maggior parte dei carcinomi della mammella esprimono i recettori degli estrogeni,la gross cystic disease fluid protein 15 (GCDFP-15), o la mammaglobina l’immunocolorazioneper questi marcatori puo essere molto importante nel distinguere il mesotelioma da un carcino-ma della mammella metastatico. Infine, il pannello di marcatori immunoistochimici di maggiorimpiego, qualora si consideri nella diagnostica differenziale un carcinoma a cellule renali, com-prende calretinina, D2-40 e CK5/6 come marcatori mesoteliali e PAX2 /PAX8 come marcatoridel carcinoma renale, questi ultimi di particolare affidabilita in quanto pressoche sempre espres-si nelle neoplasie renali e virtualmente mai nei MM (13, 149.

Infine, mentre fino qualche tempo fa si considerava la perdita di espressione di BAP1 nellecellule neoplastiche importante per differenziare il MM dai tumori pleurici metastatici, in parti-colare quelli delle piu comuni sedi tumorali primarie (polmone, mammella e stomaco), attual-mente e parrebbe che anche il carcinoma renale a cellule chiare (15), il colangiocarcinoma in-traepatico ed alcuni melanomi possono avere perdita di espressione di BAP-1 (16).

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Due ulteriori marcatori immunoistochimici, di recentissima introduzione ed ancora in fase di stu-

dio, Disabled homolog 2 (DAB2), una fosfoproteina sensibile ai mitogeni, ed Intelectin-1, una lecti-

na legante il galattosio, hanno mostrato elevate sensibilita e specificita, rispettivamente pari a 80% e

97% per DAB2 e a 76% e 100% per Intelectin-1, nella diagnosi differenziale tra mesotelioma epite-

lioide ed adenocarcinoma (179. I dati dell’analisi immunoistochimica sono stati, inoltre, supportati

daanalisidei livellidiespressionedimRNAdellerispettiveproteineedaanalisidiespressionegenica.

Figura 2. Espressione immunoistochimica positiva di (A) Calretinina (colorazione nucleare ecitoplasmatica), (B) CK5/6, (C) CK7, (D) D2-40, (F) WT-1. Si noti la vera positivita nucleare di WT-1 nellecellule neoplastiche (in alto e a sinistra) e la positivita di membrana aspecifica nelle cellule endotelialidei capillari (a destra). Negativa, come atteso nei MM (vedi testo) l’immunoreazione per TTF-1 (E).Ingrandimenti: A,B,C,E,F 200x, D 400x.

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3.2 Diagnosi differenziale tra mesotelioma epitelioide peritoneale e carcinoma

Mentre in letteratura la maggior parte degli studi si e focalizzata sulla differenziazione del MMperitoneale dal carcinoma sieroso papillare (PSC) ovarico, e disponibile una minor quantita didati in merito al profilo immunoistochimico dell’adenocarcinoma colico, gastrico e pancreaticoin relazione al MM (18). I marcatori utili (Tabella I) nelle pazienti donne includono: calretininae, con minor affidabilita, D2-40 (che puo anche essere positiva in alcuni casi di PSC), come mar-catori positivi nel MM e MOC-31, e, con meno specificita, Ber-EP4, come marcatori positivi negliadenocarcinomi. L’alta frequenza di reattivita per i marcatori del mesotelioma CK5 / 6 e WT-1 inPSC e la meno frequente immunopositivita per CEA nel PSC, limita la capacita di quei marcatorinel dirimere la diagnosi differenziale tra queste entita.Un’espressione immunoistochimica posi-tiva, se intensa e diffusa, per i recettori degli estrogeni e del progesterone, puo essere un utileindicatore di differenziazione carcinomatosa come PSC, in casi difficili. Un marcatore molto pro-mettente per affrontare il problema di tumori di origine mulleriana nelle donne e di origine re-nale in tutti i pazienti e PAX8 (19, 20). PAX8 e un fattore di trascrizione coinvolto nello sviluppodi tiroide, rene edel sistema mulleriano. Sebbene possa esservi una sporadica e poco intensaespressione di PAX8 in un piccolo numero di mesoteliomi, un’alta percentuale di tumori tu-bo-ovarici, endometriali e renali mostrano un’immunoreattivita che e spesso diffusa ed intensa.-Questo marcatore sembra molto affidabile quando diviene parte di un pannello di altri marca-tori per la diagnosi differenziale tra MM e adenocarcinoma.Nei pazienti maschi, WT-1 (colora-zione nucleare) e D2-40 (Figura 2f e 2d, rispettivamente) sono marcatori utili, insieme alla cal-retinina, per confermare una diagnosi di MM, mentre nell’ adenocarcinoma (istotipo non siero-so) MOC31, e Ber-EP4 hanno una elevata sensibilita e specificita.

Tabella I. Marcatori principali e loro utilita nella diagnosi differenziale tra mesotelioma peritoneale maligno (PMM),carcinoma sieroso papillare (PSC) e Adenocarcinoma di origine non ginecologica (AdCa)

Marcatori mesoteliali positivi

Calretinina Utile. Positivita dall’85% al 100% dei casi PMM, ma la reattivitanel 0%-38% dei PSC limita il suo utilizzo come marcatore singolo.

D2-40 Potenzialmente utile. Positivita dal 93% al 96% dei casi PMM,ma ampio spettro di positivita nei PSC dal 13% al 65%;richiede piu dati in questo contesto.

CK5/6 Non utile. Positivita dall 53% al 100% dei casi PMM e positivita dal 22%al 35% dei casi PSC.

WT-1 Non utile. Positivita dal 43% al 93% dei casi PMM,ma l’89%-93% dei PSC sono positivi.

Marcatori di PSC

MOC31 Molto utile. Positivita nel 98% dei PSC e nel 5% dei casi PMM.

PAX8 Molto utile. Positivita nella maggior parte dei carcinomi mulleriani;negativita nei PMM.

BeR-EP4 Utile. Positivita dall’83% al 100% dei PSC e dal 9% al 13% dei casi PMM.

CEA Non utile. Fino al 45% dei PSC (media, 20%) e 0% dei casi PMM,ma la sensibilita in PSC e troppo basso rispetto ad altre scelte.

ER Utile. Dal 60% al 93% nei PSC e negativita o tasso positivo molto basso(0%-8%) nei casi di PMM.

PR Utilita limitata. Minore sensibilita rispetto agli ER, ma uniformementenegativo in PMM. Puo essere prezioso se mostra positivita.

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PMM vs AdCa (biliare, colico, gastrico, pancreatico)

Calretinina Molto utile. Positivita dall’85% al 100% dei casi PMM ma anche positivitanel 10% di AdCa pancreatico, quindi limitata come singolo marcatore.

WT-1 Molto utile. Positivita nel 43-93% dei casi PMM, 3% di AdCa gastrico,negativita nell’AdCa pancreatico.

D2-40 Potenzialmente utile. Positivita dal 93% al 96% dei casi PMM,negativita nell’AdCa pancreatico e gastrico (dati limitati).

CK5/6 Non utile. Positivita dal 53% al 100% dei casi PMM, ma il 38% di AdCapancreatico e positivo.

MOC31 Molto utile. Positivita nel 5% dei casi PMM e dell’87% di AdCa.

CEA Molto utile. Positivita nell’81% di AdCa, negativita in PMM.

Ber-EP4 Utile. Positivita in 98% di AdCa pancreatico e gastrico, dal 9% al 13%dei casi PMM.

CDX-2 Utile. Il 90- 100% del carcinoma del colon, l’80% dell’intestino tenuee il 70% dei carcinomi gastrici sonopositivi; negativita nei PMM.

* ER = recettori degli estrogeni; PR = recettori del progesterone

3.3 Diagnosi differenziale tra mesotelioma sarcomatoide e neoplasie a cellule fusate

Un pannello immunoistochimico per la valutazione iniziale di un tumore morfologicamentesarcomatoide, che coinvolge la pleura, dovrebbe includere citocheratine, calretinina e D2-40. Sisuggerisce l’impiego di anticorpi multipli per le citocheratine, tra cui AE1/AE3, CAM 5.2 (oCK18) e CK7, in quanto l’espressione delle citocheratine nel MM sarcomatoide puo essere fo-cale, debole e /o variabile (21). Altri marcatori positivi utilizzati per la diagnosi di mesoteliomaepitelioide, come WT-1 e CK5/6, al pari dei marcatori usati per confermare la diagnosi di ade-nocarcinoma, come CEA, Ber-EP4 e MOC31, non si rivelano utili in presenza del sottotipo sar-comatoide del MM. Nel contesto della diagnostica del MM sarcomatoide, D2-40 e calretinina so-no stati tra i marcatori immunoistochimici piu studiati e di cui c’e maggior evidenza in letteratura(22). Eventuali falsi positivi possono verificarsi dalla errata interpretazione della reattivita di D2-40 in vasi linfatici intrappolati da fibrosi o in elementi mesoteliali reattivi. Uno studio di Klebe ecoll. (23) ha segnalato la presenza di focale immunoreattivita di calretinina in meno del 10%delle cellule tumorali nel 31% dei mesoteliomi sarcomatoidi. Un tumore sarcomatoide istologi-camente maligno che sia intensamente e diffusamente positivo per le citocheratine restringe, disolito, il campo delle diagnosi differenziali a MM sarcomatoide, carcinoma sarcomatoide e, oc-casionalmente, sarcoma sinoviale o carcinoma renale sarcomatoide metastatico. Sebbene i sar-comi sinoviali della pleura (o sarcomi sinoviali polmonari primari che coinvolgono la pleura) disolito si manifestino come tumori solidi localizzati, a volte possono anche presentarsi con pleuradiffusamente ispessita, in maniera analoga al MM. La diagnosi di sarcoma sinoviale dovrebbeessere presa in considerazione quando vi e una neoplasia ipercellulata, con scarso citoplasmanelle cellule tumorali, con conseguente aspetto di sovrapposizione dei nuclei, presenza di vasisanguigni di aspetto pericitomatoso e limitata espressione di cheratine. La diagnosi puo esserepoi confermata da test molecolari per la traslocazione distintiva t(X; 18), che si puo effettuareanche in situ su tessuto fissato e incluso in paraffina. A meno che non ci sia una positivita con-vincente per calretinina e D2-40, e difficile distinguere, su base morfologica, la componente acellule fusate di un carcinoma sarcomatoide dal mesotelioma sarcomatoide specie quando icampioni tissutali sono solo parzialmente rappresentativi della totalita del tumore. A complicare

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ulteriormente la diagnosi, puo svilupparsi una componente eterologa (di tipo condroide oosteoide) in entrambi i tumori.

Nei casi specifici in cui ci sia difficolta nel distinguere il carcinoma sarcomatoide metastaticodal mesotelioma sarcomatoide si puo, quindi, far ricorso a marcatori di carcinoma quali CEA eTTF-1 (per il polmone) e a GATA 3 per il mesotelioma. La proteina legante GATA 3 (GATA3) eun fattore di trascrizione, inizialmente caratterizzato per la sua funzione nei linfociti T (24), inseguito impiegato come marcatore uroteliale e del carcinoma mammario. Livelli relativamentealti di espressione di GATA3 sia nei mesoteli reattivi che in mesoteliomi maligni (58%) sono statiosservati in un ampio studio di screening dell’espressione di GATA3 nei tumori e nei tessuti nor-mali (25). Al contrario, si sono rilevati tassi di espressione di GATA3 estremamente bassi (da 0%all’8%) nell’ adenocarcinoma e nel carcinoma a cellule squamose del polmone [25]. Uno studiomolto recente ha evidenziato come una forte e diffusa immunopositivita per GATA3 favoriscauna diagnosi di mesotelioma sarcomatoide, cosı come una sua completa assenza sia elementodi esclusione di tale diagnosi (26).

Un altro possibile problema diagnostico puo dipendere dalla capacita metastatica alla pleuradi un carcinoma renale sarcomatoide con un pattern di crescita pseudomesoteliomatoso simil-sarcomatoide. Nessun profilo immunoistochimico specifico di positivita per le citocheratine,purche diverse da CK5/6, e stato fino ad oggi segnalato in letteratura. CK5/6 risulta non espressanei carcinomi renali sarcomatoidi, ma il basso livello di sensibilita di tale marcatore di mesote-lioma, specificamente nella forma sarcomatoide, ne limita notevolmente l’utilita diagnostica(27). Nei carcinomi renali sarcomatoidi, l’espressione immunoistochimica della calretinina edi D2-40 non e stata studiata estesamente. Una limitata esperienza su 4 casi di carcinomi renalisarcomatoidi depone per la totale assenza di calretinina in questa neoplasia. In definitiva in tuttiquesti casi a diagnosi incerta e/o difficile, sarebbe prudente includere nel processo diagnosticoanche elementi macroscopici e correlazioni clinico-strumentali (27). Questo e tanto piu vero insituazioni patologiche, oggettivamente, molto rare. Cosı, un tumore istologicamente malignocon morfologia sarcomatoide che sia o negativo o focalmente positivo per le citocheratine do-vrebbe essere interpretato con cautela e una diagnosi di mesotelioma dovrebbe essere ponde-rata molto attentamente, in quanto una focale positivita per le citocheratine e stata riportata an-che in molti tipi differenti di sarcomi. Inoltre, la positivita in isolate cellule, potrebbe semplice-mente evidenziare elementi pleurici mesoteliali benigni intrappolati nel processo proliferativo.Quindi, per quanto concerne il work-up anatomopatologico, in presenza di un dubbio diagno-stico e di minima o assente positivita per citocheratine, si dovrebbero selezionare ulteriori bloc-chetti di tessuto paraffinato, su cui ritestare l’anticorpo, eventualmente variando le metodiche dismascheramento degli antigeni e/o la diluizione dell’anticorpo stesso (18).

Di fronte a tali complessita diagnostiche, in assenza di espressione immunoistochimica con-vincente di citocheratine e nel sospetto fondato di MM sarcomatoide, la positivita isolata di cal-retinina e/o D2-40 non e sufficiente, da sola, a suffragare la differenziazione mesoteliale. Infatti,questi marcatori mostrano positivita variabile in diversi tipi di sarcomi ed altri marcatori immu-noistochimici dovrebbero essere integrati nel pannello iniziale. In tali casi, una diagnosi diffe-renziale ad ampio spettro potrebbe includere altri sarcomi (emangioendotelioma epitelioide/an-giosarcoma, sarcoma sinoviale, liposarcoma, tumori miogenici o neurogenici, tumore fibrososolitario) ma anche melanoma e linfoma. Quindi, Il pannello di marcatori dovrebbe essere am-pliato di conseguenza, per includere anticorpi come CD31, CD34, desmina, mioglobina, S100 eCD45. Va notato che alcuni marcatori muscolari (come l’actina muscolare-specifica e l’actinamuscolare liscia) sono spesso positivi, almeno focalmente, nei mesoteliomi sarcomatoidi (28).Viceversa, a dispetto di quanto accade nelle cellule mesoteliali reattive, la desmina molto rara-mente risulta positiva nei MM sarcomatoidi (28).

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4. NUOVI MARCATORI IMMUNOISTOCHIMICI PROGNOSTICIE PREDITTIVI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA NEL MM

Recentemente, molte nuove molecole sono state oggetto di studi scientifici con finalita di stra-tificazione prognostica dei pazienti affetti da MM ed alcune di esse sembrano essere potenzialimarcatori di risposta a terapie mirate. Di seguito, ne vengono elencate le piu promettenti, sud-divise in base alla loro funzione cellulare.

4.1 Recettori tirosin kinasici ed altre proteine di membrana

Le molecole localizzate sulla superficie della membrana cellulare mediano la sopravvivenza ela proliferazione delle cellule stesse attraverso il legame con i loro ligandi e il cross -talk con ilmicroambiente tumorale, in cui sono compresi i miofibroblasti stromali, le cellule endoteliali ele cellule della risposta immunitaria. Inoltre, esse svolgono un ruolo nei processi di adesione,motilita, invasione e angiogenesi. Molti studi si sono focalizzati su uno dei piu noti membri dellafamiglia dei recettori tirosin-kinasici, il recettore del fattore di crescita epidermico (epidermalgrowth factor receptor- EGFR) e ne hanno indagato il livello di espressione su campioni tissutalidi MM, con metodica immunoistochimica. Se da un lato vi e una stretta correlazione tra espres-sione di EGFR, istotipo epitelioide (associato a prognosi migliore) di MM (29, 30), performance

status elevato ed assenza di dolore toracico (29), tuttavia non sembra esservi una associazionesignificativa tra questo recettore e la sopravvivenza globale (overall survival-OS) dei pazienti(29, 30). Un altro membro della famiglia dei recettori tirosin-kinasici, c-MET, risulta spesso so-vraespresso nei tessuti di alcuni tumori, incluso il MM. Una sua espressione immunoistochimicalocalizzata esclusivamente a livello della membrana cellulare delle cellule tumorali, e risultataassociata a maggiore OS (31), confermando il suo potenziale ruolo di fattore prognostico indi-pendente. Syndecan-1, molecola appartenente alla famiglia dei proteoglicani, e come tale, coin-volta nei processi di adesione, migrazione cellulare, angiogenesi ed organizzazione del cito-scheletro, e risultata significativamente piu espressa nei casi di MM epitelioide, rispetto all’isto-tipo sarcomatoide, ed associata ad una sopravvivenza piu lunga (32).

Un’altra proteina legata alla superficie cellulare tramite glicofosfatidilinositolo, la mesotelina,e normalmente espressa nelle cellule mesoteliali di peritoneo, pleura e pericardio. In vari studi,si e riscontrata una sua elevata e diffusa espressione immunoistochimica in varie neoplasie ma-ligne, tra cui il MM, il carcinoma ovarico, l’adenocarcinoma pancreatico e polmonare. Pur nonrivelandosi, quindi, un marcatore immunoistochimico estremamente specifico, fin dalla sua sco-perta e sembrato utile nella diagnosi precoce di MM (33) e nel monitoraggio della risposta allaterapia convenzionale (34). I livelli sierologici della sua frazione solubile sono, invece, inversa-mente correlati con la OS.

CD26, una glicoproteina di membrana implicata nella modulazione della risposta immunita-ria, risulta maggiormente espressa nel mesotelioma, rispetto alla controparte cellulare benigna ,ed associata ad istotipo epitelioide del MM e ad una maggiore sopravvivenza (35). Infine, unostudio ha analizzato l’espressione tissutale di Aquaporina 1, proteina appartenente alla famigliadei canali transmembrana implicati nel trasporto intra ed extracellulare di acqua, mostrando co-me una sua diffusa ed intensa espressione nelle cellule di MM si associasse ad un significativoaumento della sopravvivenza (36).

La transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e un processo biologico altamente conservatoche permette ad una cellula epiteliale morfologicamente polarizzata, che di solito interagiscecon la lamina basale tramite la sua superficie basale, di subire diverse alterazioni biochimicheche le consentono di assumere un fenotipo mesenchimale, con caratteristiche (aumentata capa-cita migratoria, resistenza all’apoptosi e invasivita) che, nei processi neoplastici, favoriscono ladisseminazione a distanza delle neoplasie. Uno studio che ha indagato l’espressione di marca-

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tori di EMT, tra cui caderine e fattori di trascrizione inbitori delle caderine, in MM pleurici e non,ha evidenziato la progressiva perdita di espressione dei marcatori epiteliali a favore di quellimesenchimali nel passaggio tra mesoteliomi epiteliodi a mesoteliomi sarcomatoidi, attraversogli istotipi bifasici (37). Inoltre, un’elevata espressione del marcatore patognomonico di differen-ziazione epiteliale, la E-caderina, si associava a prolungata sopravvivenza (37).

Recentemente, un nuovo oncogene , il gene 1 associato alle metastasi (MTA1) e stato studiatocon metodiche immunoistochimiche e molecolari su differenti campioni tissutali di MM , evi-denziando una correlazione diretta tra la sua overespressione e l’istotipo (bifasico e sarcomatoi-de) di MM, nonche l’elevato stadio di malattia ed una correlazione inversa con l’espressione diE-caderina (38). MTA1 risulterebbe in grado di stimolare la migrazione delle cellule maligne, e,di fatto, la formazione di metastasi a distanza, influenzando la sopravvivenza dei pazienti (38).

4.2 Marcatori di angiogenesi

Le cellule neoplastiche del mesotelioma sono in grado di sintetizzare numerose molecole ecitochine coinvolte nei processi di angiogenesi tumorale. In particolare, la piu diffusa misura dineoangiogenesi, la densita microvascolare, valutabile con anticorpi antiendotelio con metodicaimmunoistochimica, secondo uno studio risulta un parametro prognostico indipendente nel MM(39). Kumar-Singh e coll. hanno valutato l’espressione di diversi fattori di crescita nel MM, tra iquali solo il fattore di crescita fibroblastico 2 (FGF2) risulta correlato con una ridotta sopravvi-venza dei pazienti affetti da MM (40).

4.3 Marcatori coinvolti nel ciclo cellulare(proliferazione, apoptosi, sopravvivenza cellulare)

Le cellule tumorali, comprese quelle del mesotelioma maligno, sono caratterizzate dall’acqui-sizione di un vantaggio di sopravvivenza, svincolato dai normali processi cellulari di controllodella proliferazione e di una resistenza all’apoptosi, la morte cellulare programmata. L’analisidell’espressione immunoistochimica di inibitori del ciclo cellulare, quali p27, p21, p16 e p53,e dell’inibitore di quest’ultimo, MDM2 ha mostrato risultati interessanti nei mesoteliomi. In par-ticolare, uno studio ha segnalato l’associazione tra bassa espressione delle proteine p21 e p27 eridotta sopravvivenza globale (41); dati supportati da altri studi hanno rilevato un’elevataespressione di p27 in pazienti lungo-sopravviventi (>24 mesi) (42) e, al contrario, una ridottasopravvivenza in pazienti che esprimono MDM2 (43). Un’espressione elevata di MDM2, la pre-senza di necrosi e di alto indice di proliferazione sono stati significativamente associati al MMcon istotipo bifasico/sarcomatoide in uno studio del 2015 (44), in cui MDM2 era anche corre-lato, seppur soltanto nelle analisi univariate, con ridotta sopravvivenza libera da malattia.

La combinazione di parametri strettamente morfologici e di pannelli di marcatori immunoisto-chimici ha consentito, ad un gruppo di autori australiani (45) di identificare un sottogruppo dipazienti affetti da MM candidati ad una sopravvivenza nettamente superiore agli altri. Nello spe-cifico, tra i 208 pazienti con MM arruolati nello studio, coloro che avevano un istotipo epitelioideassociato ad immunofenotipo BAP-1 negativo e p16 positivo hanno mostrato una sopravvivenzamedia pari a 31.7 mesi rispetto ai 7.7 mesi di sopravvivenza media dei restanti partecipanti (45).

4.4 Marcatori di risposta immunitaria

La glicoproteina mesotelina (di cui si e gia accennato precedentemente), e intensamenteespressa nelle cellule neoplastiche del MM e molto meno nel mesotelio normale, risultando,quindi, un target ideale per l’immunoterapia. Sono in fase di studio diversi approcci che sfrut-tano la mesotelina come target: immunotossina ricombinante, anticorpi monoclonali chimerici,anticorpi coniugati con farmaci, vaccini. Il gruppo di Raffit Hassan del National Cancer Institute

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ha riportato i dati del vaccino CRS-207 che utilizza la Listeria viva attenuata ingegnerizzata peresprimere mesotelina: pazienti a cui non era stata somministrata chemioterapia hanno ricevuto2 dosi del vaccino e quindi 6 cicli di cisplatino + pemetrexed e i pazienti clinicamente stabilihanno proseguito con vaccino di mantenimento. I risultati di questo studio sono stati promet-tenti. Un solo paziente ha avuto progressione di malattia, mentre 9 pazienti hanno risposto altrattamento con significativa riduzione di malattia e 4 hanno mostrato malattia stabile (46).Un altro approccio diretto su mesotelina e stato perseguito sempre al National Cancer Institute

utilizzando un’immunotossina SS1P, che consiste nel frammento variabile di un anticorpo mu-rino diretto contro mesotelina coniugato con una porzione troncata dell’esotossina A delloPseudomonas. In uno studio clinico iniziale i pazienti sviluppavano precocemente anticorpineutralizzanti. Nello studio successivo e stato implementato un programma terapeutico con im-munosoppressivi che ha consentito di somministrare diverse dosi registrando nella coorte di pa-zienti trattati risposte piuttosto nette e favorevoli (46).

Su altri fronti, l’interferenza terapeutica sul sistema immunitario mira a contrastare i molteplicimeccanismi che i tumori hanno sviluppato per eludere la loro distruzione da parte, tanto dellarisposta immune innata che di quella adattativa. Ed in effetti, la crescita neoplastica utilizza deimeccanismi di fuga dal controllo del sistema immunitario, facendo sı che le cellule T non sianoin grado di sfruttare la loro attivita citotossica antitumorale. Uno dei meccanismi grazie ai quali itumori sono in grado di sfuggire dal sistema immunitario e l’espressione di ligandi in grado diinibire l’espressione delle cellule T, come il CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), il PD-L1(programmed death 1 ligand) e il PD-1 (programmed death 1 receptor). Il MM e considerato untumore ‘‘infiammatorio’’, poiche e molto spesso caratterizzato da pattern di espressione infiam-matorio, con un’importante infiltrazione linfocitaria, a prevalenza T, e macrofagica. Il permaneredi una risposta infiammatoria di lunga durata a livello delle cellule mesoteliali favorisce le fasiiniziali di trasformazione e quindi la progressione di queste cellule sane in cellule tumorali. Allostesso modo i meccanismi di fuga rispetto al sistema immunitario consentono alla neoplasia dievitare la risposta immunitaria dell’ospite. Il pathway molecolare PD-1/PD-L1, regola la mortecellulare programmata e gioca un ruolo critico nel limitare l’attivita delle cellule T nei tessuti pe-riferici, durante una risposta infiammatoria alle infezioni, e nel contrastare l’autoimmunita. Que-sto pathway e implicato nella capacita del tumore di sfuggire al controllo del sistema immuni-tario attraverso un meccanismo che prevede l’interazione tra il recettore per PD-1 come rego-latore negativo dei linfociti , il suo ligando PD-L1, quale mediatore predominante nell’immuno-soppressione nel senso che e il legame tra PD-L1 del tumore ed il suo recettore PD-1 nei linfocitiad inibire la proliferazione di cellule T attivate nei tessuti periferici.

I dati sulla prevalenza ed il ruolo prognostico dell’espressione di PD-L1 nel mesoteliomapleurico maligno sono, al momento, limitati. L’espressione di PD-L1 nel MM sembrerebbe cor-relata con una maggiore estensione della malattia al momento della presentazione, con una ri-dotta sopravvivenza e con una maggiore incidenza dell’istotipo sarcomatoide [47] . Questa po-trebbe essere una spiegazione plausibile della prognosi particolarmente infausta osservata inquesti pazienti. Tuttavia, la valutazione immunoistochimica di PD-L1 e gravata da diverse pro-blematiche che, fortunatamente, si stanno via via risolvendo: la numerosita dei cloni anticorpaliin commercio, i differenti cut-offs di percentuale di positivita nei vari studi affinche un campionesia definito, appunto, positivo, il pattern di espressione (membrana o membrana e citoplasma),l’inclusione, nella valutazione, solo delle cellule neoplastiche o anche di quelle infiammatorie.

4.5 Marcatori predittivi di risposta alla chemioterapia convenzionale

L’approccio terapeutico del MM e alquanto eterogeneo in rapporto allo stadio di malattia ed eassociato ad evoluzioni cliniche di notevole variabilita nella risposta terapeutica e qualita di vitadei pazienti. Dalla ricerca preclinica sono stati, nel passato, identificati marcatori con significato

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diagnostico (ad es. calretinina) e prognostico (ad es. mesotelina), mentre sono, allo stato attuale,molto esigui i risultati di studi su biomarcatori predittivi di risposta terapeutica. Alcuni dati pre-liminari indicano che alti livelli di espressione di molecole bersaglio di farmaci antifolati, quali latimidilato sintasi (TS) sono correlati con scarsa risposta a terapie con tali agenti (ad es. pemetre-xed) , ridotta sopravvivenza globale e libera da malattia (48, 49). Altri bersagli di agenti chemio-terapici includono i geni del riparo di DNA (ERCC1, MLH1, MSH2, MSH6, RRM1, NER, etc) per iderivati del pt, altro farmaco utilizzato per la terapia sistemica del MM. Tali molecole potrebberoessere espresse in associazione con i danni al DNA indotti dall’asbesto ed i loro livelli di espres-sione potrebbero interferire con la risposta a specifici protocolli chemioterapici. Ting e coll. han-no correlato la positivita immunoistochimica di MSH6 su tessuto di mesotelioma pre-trattamento,alla progressione di malattia durante il trattamento chemioterapico, mentre l’espressione diMLH1 e ERCC1 era correlata con ridotta sopravvivenza globale e libera da malattia (50).

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