Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

  • View
    145

  • Download
    0

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF. Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW. Warszawa, 16.04.2012. Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas. Podstawowe definicje. Najczęściej stosowane skróty. - PowerPoint PPT Presentation

Text of Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

Prezentacja programu PowerPoint

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF Warszawa, 16.04.2012Kazimierz DbrowskiKatedra Chemii i Technologii PolimerwWydzia Chemiczny PW

RokOdkrycieNazwiska badaczy1911Zbudowanie pierwszego spektrometru masJoseph John Thomson1918Opracowanie rda jonw EIArthur Jeffrey Dempster1930Zastosowanie spektrometrii mas w chemii organicznejR. Conrad1942Pierwszy sprzedany spektrometr masConsolidated Energy Corporation1946Analizator czasu przelotu (TOF)William E. Stephens1953Spektrometr o podwjnym ogniskowaniuE. G. Johnson i A. O. Nier1953Kwadrupolowy analizator masyW. Paul i H. Steinwedel1958Poczenie spektrometru mas z chromatografem gazowym (GC)1966Sekwencjonowanie peptydw przy pomocy spektrometru masK. Biemann, C. Cone, B. R. Webster i B. P. Arsenault1966Jonizacja Chemiczna (CI)B. Munson i F. H. Field1968Jonizacja przez Elektrorozpylanie (ESI)Malcom Dole1981Metoda jonizacji przez bombardowanie szybkimi atomami (FAB)Michael Barber1983Opracowanie metody jonizacji przez desorpcj laserem przy udziale matrycy MALDI (Nagroda Nobla z Chemii w 2002 roku)Koichi Tanaka, Michael Karas i Franz Hillenkamp1984Puapka jonowaG. C. Statford, P. E. Kelly, J. E. P. Syka, W. E. Reynolds i J. F. J. Todd1984Wykorzystanie elektrorozpylania (ESI) do analizy biopolimerw (Nagroda Nobla w 2002 roku)Gall Lydia (ZSRR), John Fenn (USA)Najwaniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas

Spektrometr masowy instrument pozwalajcy na precyzyjny pomiar stosunku masy do adunku (m/z) analizowanych substancji.Rozdzielczo spektrometru warto liczbowa informujca o moliwoci rozrnienia na widmie masowym pikw o zblionych masach. W przypadku pojedynczego piku warto okrelajca dokadno oznaczenia masy czsteczkowej (atomowej) substancji analizowanej.Jeli spektrometr masowy w danym momencie analizy posiada rozdzielczo R=1000 istnieje moliwo rozrnienia pikw o m/z=1000 oraz m/z=1001. Dla izolowanego piku rozdzielczo definiuje jego szeroko powkow, tzn. dla R=1000 i piku o m/z=1000 stosunek jego wysokoci do szerokoci w 0,5 wysokoci wynosi co najmniej 10 (H/L0,5h>=10)Jon molekularny jon obdarzony adunkiem (adunkami) powstajcy w wyniku fragmentacji prbki w rdle jonwJon fragmentacyjny jon powstay w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np. podczas jonizacji metod EI) lub uzyskany technik tandemowej spektrometrii masowej. Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej.Addukt - jon powstay poprzez przyczenie do analizowanej substancji np. jonu sodowegoProteom - PROTEin complement of the genOME (og biaek kodowanych przez genom)Dalton - jednostka masy, dokadnie odpowiada 1,0000 na skali mas atomowychDekonwolucja - uzyskanie rzeczywistej masy substancji z widma pikw wielokrotnie zjonizowanychMatryca - niskoczsteczkowe zwizki organiczne absorbujce promieniowanie lasera.Podstawowe definicje

Najczciej stosowane skrtyEI (Electron Impact) - jonizacja elektronami

MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matryc

ESI (Electrospray Ionization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)

MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowa

TOF (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotu

PSD (Post Source Decay) - rozpad poza rdem jonw

m/z - stosunek wartoci masy do liczby adunkw

DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie

ICP (Inductively Coupled Plasma) - jonizacja plazm wzbudzon indukcyjnie

Idea dziaania spektrometru masrdo jonw urzdzenie, w ktrym nastpuje jonizacja czsteczek przy uyciu rnorodnych technik, z ktrych cz prowadzi do pkania wiza chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziau na mniejsze fragmenty. Inne techniki powoduj tylko naadowanie czsteczek bez ich fragmentacji,analizator w ktrym wczeniej powstae jony ulegaj rozdziaowi na podstawie stosunku ich masy do adunku.detektor urzdzenie "zliczajce" jony napywajce z analizatora.

Jonizacja prbki

Twarda technika jonizacjiJon molekularny typu [M+.]Bogate widmo fragmentacyjneagodna technika jonizacjiPozorny jon molekularny [M+H]+ lub [M-H]-Brak fragmentacji

Jonizacja prbki cd.

Jonizacja prbki lasery uywane w technice MALDINitrogen laser:pro: well structured energy profilecontra: slow (maximum 50Hz)Nd:YAG laser:pro: fast (up to 1000Hz)contra: Gaussian energy profile (non-structured)Smartbeam/Smartbeam II(modified Nd:YAG laser):pro: fast (up to 1000Hz)pro: well structured energy profileA. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Hhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)

Matryce

Procesy zachodzce pod wpywem impulsu laserowegoAbsorpcja promieniowania gwnie przez materia matrycy.Odparowanie prbki na gboko 2-3 l i wyrzucenie strumienia gazw prostopadle do jej powierzchni.Dysocjacja termiczna matrycy.Tworzenie jonw (gwnie H+, Na+, K+).Reakcje jonw z badan substancj i matryc. Moliwe drogi:- dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion- oderwanie elektronu- oderwanie bd przyczenie protonu- przyczenie kationu bd anionu

MatrycePodanymi cechami matrycy MALDI s:do niska masa czsteczkowa, co sprzyja atwemu odparowaniu, ale wystarczajco dua, by odparowanie nie nastpio przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania prbki;

rozpuszczalno w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem;

kwasowo, by uatwi protonowanie czsteczek analitu;

obecno grup polarnych (hydrofilowych) w czsteczce, co umoliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych;

stabilno w warunkach wysokiej prni;

wspomaganie jonizacji analitu;

zdolno intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymg ten spenia zwizek, posiadajcy ukad sprzonych wiza podwjnych C=C (dlatego czsto matrycami s pochodne aromatycznych kwasw karboksylowych, czsto nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).

Matryce

Sinapic acidKwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowySINAproteinyGentisic acidKwas 2-5-dihroksy benzoesowyDHBpeptydy2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acidKwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowyHABAPeptydy, polimeryDithranol1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-onDITpolimery-Cyano-4-hydroxycinnamic acidKwas -Cyano-4-hroksy cynamonowyCHCA, -CHCAPeptydy, lipidy2,4,6-Trihydroxyacetophenone2,4,6-trihroksy acetofenonTHAPoligonukleotydy

Tryb liniowy

Tryb liniowy

Jak zwikszy rozdzielczo?

Pulsed ion extraction polepszenie ogniskowania jonw

Optymalizacja przygotowania prbki homogenizacja

Uycie reflektronu

Optymalne przygotowanie prbki

Najczciej stosowane metody nanoszenia prbki (analitu i matrycy) to:Metoda wysychajcej kropli (dried droplet method) jednowarstwowa:Przyrzdza si osobno roztwr prbki i roztwr matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub jeli to niemoliwe w dwch kompatybilnych; niekiedy jeszcze uywa si trzeciego roztworu - rodka kationizujcego, np. soli metalu (moliwe s rne rozpuszczalniki i stenie). Wszystkie roztwory miesza si, a uzyskan mieszanin (0,51 l) umieszcza na pytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnicia na powietrzu. Wad tej metody jest powolne wysychanie prbki, co moe prowadzi do rozdzielenia krysztaw matrycy prbki i soli kationizujcej.Modyfikacjami tej metody s: zastosowanie odparowywania prniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje si drobniejsze krysztay, lepsz rozdzielczo i powtarzalno oraz intensywno sygnaw. Metoda cienkiej warstwy (thin-layer method) dwuwarstwowa:Roztwr matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA roztwr nasycony w acetonie) nanosi si na pytk MALDI i pozwala mu si wyschn, otrzymujc cienk warstw matrycy. Nastpnie 1 l roztworu analitu nanosi si na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy.

Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody s: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospray sample depositon).

Metoda mieszania cia staych (solid/solid sample preparation):Metoda polega na bardzo dokadnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i prbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu caoci w pastylk. Stosuje si j dla niektrych poliamidw, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych

Epot = zeU Ekin = 1/2mv2zeU = 1/2mv2 v = (2zeU/m)1/2 t = L(1/2eU)1/2(m/z)1/2

Tryb reflektronu

Tryb reflektronu

Profil izotopowy

Profil izotopowyC41H69N13O14S[M+H]+: 1000.4880[M+H]+: 1001.1409C112H164N29O34S2[M+H]+: 2524.1510[M+H]+: 2525.8196C253H363N55O75S[M+H]+: 5404.6075[M+H]+: 5407.9984Masa monoizotopowaMasa rednia

Kalibracjatof= tdelay + tacc + tdriftF = E q = M atacc = d (2m/Uze)d = a/2 tacc2E = U/d q = z etdrift= L (m/2zeU)tof=tdelay + d (2m/Uze) + L (m/2zeU)tof=tdelay + (d (2/Ue)+L (1/2Ue)) (m/z)t = C0+C1(m/z)

MALDIToF/ToF

Ion path in TOF1 region (linear TOF)Ion path in TOF2 region (reflectorTOF)Ion source1 = MALDI ion sourceIon source2 = LIFT re-acceleration cellPCIS = Timed ion gatePLMS = Post LIFT meta stable suppressor

MALDIToF/ToF

Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447Za pomoc MALDI mona wyznaczy nastpujce parametry polimerw:Mn, Mw, PDgrupy kocowe polimerubudow kopolimeru

MALDIToF w badaniach polimerw

A6B4CA7B3CA8B2CA9BCA10CA7B4CA8B3CA9B2CA10BCA11CA8B4CA9B3CA10B2CA11BCA11C

ABC

Polimery polarne: poliwglany, politlenki olefinPolikwasy, poliestry, polimery sabo polarne (np. polistyren) Polisacharydy, teflon, poliolefiny

mass discrimination effect

Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylene chloride, THF, and chloroform

Badane mog by zwizki stae, ewentualnie c