Upload
aviva
View
185
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF. Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW. Warszawa, 16.04.2012. Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas. Podstawowe definicje. Najczęściej stosowane skróty. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF
Warszawa, 16.04.2012
Kazimierz DąbrowskiKatedra Chemii i Technologii PolimerówWydział Chemiczny PW
Rok Odkrycie Nazwiska badaczy1911 Zbudowanie pierwszego spektrometru mas Joseph John Thomson1918 Opracowanie źródła jonów EI Arthur Jeffrey Dempster1930 Zastosowanie spektrometrii mas w chemii organicznej R. Conrad1942 Pierwszy sprzedany spektrometr mas Consolidated Energy Corporation1946 Analizator czasu przelotu (TOF) William E. Stephens
1953 Spektrometr o podwójnym ogniskowaniu E. G. Johnson i A. O. Nier
1953 Kwadrupolowy analizator masy W. Paul i H. Steinwedel1958 Połączenie spektrometru mas z chromatografem gazowym (GC)
1966 Sekwencjonowanie peptydów przy pomocy spektrometru mas K. Biemann, C. Cone, B. R. Webster i B. P. Arsenault
1966 Jonizacja Chemiczna (CI) B. Munson i F. H. Field1968 Jonizacja przez Elektrorozpylanie (ESI) Malcom Dole1981 Metoda jonizacji przez bombardowanie szybkimi atomami (FAB) Michael Barber
1983 Opracowanie metody jonizacji przez desorpcję laserem przy udziale matrycy – MALDI (Nagroda Nobla z Chemii w 2002 roku)
Koichi Tanaka, Michael Karas i Franz Hillenkamp
1984 Pułapka jonowa G. C. Statford, P. E. Kelly, J. E. P. Syka, W. E. Reynolds i J. F. J. Todd
1984 Wykorzystanie elektrorozpylania (ESI) do analizy biopolimerów (Nagroda Nobla w 2002 roku) Gall Lydia (ZSRR), John Fenn (USA)
Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas
Spektrometr masowy – instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) analizowanych substancji.
Rozdzielczość spektrometru – wartość liczbowa informująca o możliwości rozróżnienia na widmie masowym pików o zbliżonych masach. W przypadku pojedynczego piku wartość określająca dokładność oznaczenia masy cząsteczkowej (atomowej) substancji analizowanej.Jeśli spektrometr masowy w danym momencie analizy posiada rozdzielczość R=1000 istnieje możliwość rozróżnienia pików o m/z=1000 oraz m/z=1001. Dla izolowanego piku rozdzielczość definiuje jego szerokość połówkową, tzn. dla R=1000 i piku o m/z=1000 stosunek jego wysokości do szerokości w 0,5 wysokości wynosi co najmniej 10 (H/L0,5h>=10)
Jon molekularny – jon obdarzony ładunkiem (ładunkami) powstający w wyniku fragmentacji próbki w źródle jonów
Jon fragmentacyjny – jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np. podczas jonizacji metodą EI) lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej. Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej.Addukt - jon powstały poprzez przyłączenie do analizowanej substancji np. jonu sodowego
Proteom - PROTEin complement of the genOME (ogół białek kodowanych przez genom)Dalton - jednostka masy, dokładnie odpowiada 1,0000 na skali mas atomowych
Dekonwolucja - uzyskanie rzeczywistej masy substancji z widma pików wielokrotnie zjonizowanych
Matryca - niskocząsteczkowe związki organiczne absorbujące promieniowanie lasera.
Podstawowe definicje
Najczęściej stosowane skróty
EI (Electron Impact) - jonizacja elektronami
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycą
ESI (Electrospray Ionization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)
MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowa
TOF (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotu
PSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonów
m/z - stosunek wartości masy do liczby ładunków
DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie
ICP (Inductively Coupled Plasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie
Idea działania spektrometru mas
• źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji,
• analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku.
• detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.
Jonizacja próbki
Twarda technika jonizacjiJon molekularny typu [M+.]Bogate widmo fragmentacyjne
Łagodna technika jonizacjiPozorny jon molekularny [M+H]+ lub [M-H]-
Brak fragmentacji
Jonizacja próbki cd.
Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI
Nitrogen laser:pro: well structured energy profilecontra: slow (maximum 50Hz)
Nd:YAG laser:pro: fast (up to 1000Hz)contra: Gaussian energy profile (non-structured)
Smartbeam/Smartbeam II(modified Nd:YAG laser):pro: fast (up to 1000Hz)pro: well structured energy profile
A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)
Matryce
Procesy zachodzące pod wpływem impulsu laserowegoAbsorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy.Odparowanie próbki na głębokość 2-3 l i wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni.Dysocjacja termiczna matrycy.Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+).Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe drogi:- dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion- oderwanie elektronu- oderwanie bądź przyłączenie protonu- przyłączenie kationu bądź anionu
Matryce
Pożądanymi cechami matrycy MALDI są:•dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania próbki;
•rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem;
•kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu;
•obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych;
•stabilność w warunkach wysokiej próżni;
•wspomaganie jonizacji analitu;
•zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).
Matryce
Sinapic acidKwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy
SINAproteiny
Gentisic acidKwas 2-5-dihroksy benzoesowy
DHBpeptydy
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acidKwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy
HABAPeptydy, polimery
Dithranol1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on
DITpolimery
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidKwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy
CHCA, α-CHCAPeptydy, lipidy
2,4,6-Trihydroxyacetophenone2,4,6-trihroksy acetofenon
THAPoligonukleotydy
Tryb liniowy
Tryb liniowy
Jak zwiększyć rozdzielczość?
• Pulsed ion extraction – polepszenie ogniskowania jonów
• Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja
• Użycie reflektronu
Optymalne przygotowanie próbki
Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to:
1. Metoda wysychającej kropli (dried droplet method) – jednowarstwowa:Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe – w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę (0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli kationizującej.Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i powtarzalność oraz intensywność sygnałów.
2. Metoda cienkiej warstwy (thin-layer method) – dwuwarstwowa:Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy.
3. Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospray sample depositon).
4. Metoda mieszania ciał stałych (solid/solid sample preparation):Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych
Epot = zeU Ekin = 1/2mv2
zeU = 1/2mv2 v = (2zeU/m)1/2
t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2
Tryb reflektronu
Tryb reflektronu
Profil izotopowy
Profil izotopowy
C41H69N13O14S[M+H]+: 1000.4880[M+H]+: 1001.1409
C112H164N29O34S2
[M+H]+: 2524.1510[M+H]+: 2525.8196
C253H363N55O75S[M+H]+: 5404.6075[M+H]+: 5407.9984
Masa monoizotopowaMasa średnia
Kalibracja
tof= tdelay + tacc + tdrift
F = E q = M a
tacc = d √(2m/Uze)
d = a/2 tacc2 E = U/d q = z e
tdrift= L √(m/2zeU)
tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU)
tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z)
t = C0+C1√(m/z)
MALDI–ToF/ToF
Ion path in TOF1 region (linear TOF)Ion path in TOF2 region (reflectorTOF)Ion source1 = MALDI ion sourceIon source2 = LIFT re-acceleration cellPCIS = Timed ion gatePLMS = Post LIFT meta stable suppressor
MALDI–ToF/ToF
Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447
Za pomocą MALDI można wyznaczyć następujące parametry polimerów:• Mn, Mw, PD• grupy końcowe polimeru• budowę kopolimeru
MALDI–ToF w badaniach polimerów
A6B4C
A7B3C
A8B2C
A9BC
A10C
A7B4C
A8B3C
A9B2C
A10BC
A11C
A8B4C
A9B3C
A10B2C
A11BC
A11C
A B C
Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren) Polisacharydy, teflon, poliolefiny
mass discrimination effect
Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.
MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylene chloride, THF, and chloroform
• Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7 Torr).• Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę
próbki), lub w większych pojemnikach.• W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol,
polimeru 50 - 200 pmol.• Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym
rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !)• Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku.
Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych.• Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np.
HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd.• Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności
nie powinna zawierać:• nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców,• detergentów !!!,• buforów, zwłaszcza fosforanowych,• substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą),
• W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje.
• Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000
• Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi )
Wskazówki dla PT Klientów
• M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; Analytical Chemistry, 57, 2935-2939 (1985)
• K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2, 151-153 (1988)
• R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989)
• M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journal of Mass Spectrometry, 35, 1-12, (2000)
• R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass Spectrometry Reviews, 17, 337-366 (1998)
• G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ Mass Spectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P. Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.
Polecana literatura
Dziękuję za uwagę…