Propriedades antimicrobianas e anti-biofilme de Lactobacillus

spp contra Candida albicans isolados de microbiota vaginal

Camilla Itapary dos Santos

2016

Camilla Itapary dos Santos

Propriedades antimicrobianas e anti-biofilme de Lactobacillus

spp contra Candida albicans isolados de microbiota vaginal

Dissertação apresentada ao programa de

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

da Universidade CEUMA para obtenção

do título de Mestre em Biologia Parasitária

Área de concentração: Microbiologia

Orientador: Profa. Dra. Cristina de

Andrade Monteiro

Co-Orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro

Neto

São Luís

2016

Nome: Camilla Itapary dos Santos

Título: Propriedades antimicrobianas e antibiofilme de Lactobacillus

spp contra Candida albicans isolados de microbiota vaginal.

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em

Biologia Parasitária da Universidade CEUMA para obtenção do título

de Mestre em Biologia Parasitária.

Aprovado em: ____/____/____

Banca Examinadora

Profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro

Instituição Universidade CEUMA

Assinatura ____________________________________

Profa. Dra. Andrea de Souza Monteiro

Instituição Universidade CEUMA

Assinatura ____________________________________

Prof. Dr. Luís Cláudio Nascimento da Silva

Instituição Universidade CEUMA

Assinatura ____________________________________

Prof. Dr. Rodrigo Assunção de Holanda

Instituição Universidade CEUMA

Assinatura ____________________________________

Santos, C.I. Propriedades antimicrobianas e antibiofilme de

Lactobacillus spp contra Candida albicans isolados de microbiota

vaginal [dissertação]. São Luís. Universidade CEUMA; 2016.

Resumo

Leveduras do gênero Candida são encontradas normalmente na

microbiota vaginal e quando algum fator interfere no equilíbrio

mantido por fatores do hospedeiro e micro-organismos como

lactobacilli, ocorre a manifestação da doença, denominada

candidíase vulvovaginal (CVV), que pode estar relacionada à

capacidade de Candida formar biofilme, podendo levar à resistência

aos antifúngicos utilizados. Este trabalho teve como objetivo avaliar

a atividade antagonista entre Lactobacillus spp e Candida albicans

isolados de mulheres saudáveis e daquelas com sugestivas para

CVV, verificando se Lactobacillus spp interfere no processo de

adesão e formação de biofilme de C. albicans. Para tanto foi

realizado ensaio de antagonismo através da técnica de overlay e

verificada a produção de biossurfactante por Lactobacillus. Os

biossurfactantes foram testados no processo de adesão e formação

de biofilme de C. albicans. O ensaio para avaliar a citotoxicidade dos

biossurfactantes foi feito em queratinócitos humanos através do

teste de Alamar blue. O ensaio de antagonismo mostrou que 15 das

19 amostras de Lactobacillus, incluindo cinco linhagens de

referência, tiveram efeito inibitório contra C. albicans com halos

variando de 9,5 a 28,5 mm, onde a linhagem clínica L. paracasei

LV11 foi capaz de formar a maior zona de inibição, entre os isolados

clínicos. Em relação à produção de biossurfactantes, 7 das 19

amostras testadas foram produtoras, incluindo três linhagens

clínicas. O biossurfactante produzido por L. gasseri LV17, além de

aumentar a formação de biofilme, também aumentou a viabilidade

celular no ensaio de citotoxicidade com queratinócitos humanos.

Este trabalho sugere que as linhagens destacadas possam ter

utilidade probiótica no combate a infecções por C. albicans e

possam ser úteis no tratamento de pele e mucosas.

Palavras-chave: Candida albicans; Lactobacillus spp; antagonismo,

biossurfactante; biofilme.

Santos, C.I. Antimicrobial and anti-biofilm properties of Lactobacillus

spp against Candida albicans isolated from vaginal microbiota. São

Luís, Universidade CEUMA. 2016

Abstract

Candida yeasts are usually found in the vaginal microbiota and when

any factor interferes with the balance maintained by the host factors

and microorganisms such as lactobacilli, manifestation of the disease

known as vulvovaginal candidiasis (VVC) occurs. It may be related to

Candida capacity to form biofilm, which may lead to resistance to

antifungal agents used. This study aimed to evaluate the antagonistic

activity of Lactobacillus spp and Candida albicans isolated from

healthy women and those with suggestive for VVC, checking if

Lactobacillus spp interfere in the adhesion process and biofilm

formation by C. albicans. To verify was, antagonism assay was

performed by overlay technique and verified biosurfactant production

by Lactobacillus. The biosurfactants were tested in the adhesion

process and C. albicans biofilm formation. The test for evaluating the

cytotoxicity of biosurfactants was made in human keratinocytes using

the Alamar Blue test. Antagonism assay showed that 15 of 19

Lactobacillus samples, including five strains of reference, had

inhibitory effect against C. albicans with zones varying from 9.5 to

28.5 mm, where clinical L. paracasei LV11 strain was able to form

the largest zone of inhibition among clinical isolates. In the

production of biosurfactants, 7 of 19 samples were tested producers,

including three clinical strains. The biosurfactant produced by L.

gasseri LV17, increased both biofilm formation and cell viability in the

cytotoxicity assay with human keratinocytes. This work suggests that

strains can be detached probiotic utility in combating infections with

C. albicans and may be useful in the treatment of skin and mucous

membranes.

Key-words: Candida albicans; Lactobacillus spp; antagonism,

biosurfactant; biofilm.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1| Iniciadores utilizados na PCR multiplex para identificação

das espécies de Candida, com suas respectivas sequências e

tamanhos de amplicon. .................................................................... 67

Tabela 2| Identificação dos micro-organismos isolados da microbiota

vaginal de pacientes assintomáticas e sugestivas para CVV,

atendidas em hospital da rede pública na cidade de São Luís – MA.

......................................................................................................... 68

Tabela 3| Ensaio de antagonismo entre Lactobacillus spp e C.

albicans, com valores referentes aos diâmetros dos halos de inibição

seguido do desvio-padrão. ............................................................... 69

LISTA DE FIGURAS

Figura 1| Quantificação da biomassa de biofilme das amostras de C.

albicans, após o período de 48h. ..................................................... 70

Figura 2| Avaliação do crescimento dos Lactobacillus produtores de

biossurfactante por meio de mensuração do peso seco (A), OD de

inóculo diluído 15 vezes (B) e produção de biossurfactante por meio

do teste do diâmetro da gota (C), durante o período de 48h em

intervalos de 12h. ............................................................................. 71

Figura 3| Avaliação da produção de biossurfactante por meio da

atividade emulsificante, mensuradas em após 24h, em dois

solventes: hexano (A) e tolueno (B). ................................................ 72

Figura 4| Ensaio de interferência do biossurfactante na adesão de

Candida albicans. ............................................................................ 73

Figura 5| Ensaio de interferência do biossurfactante no processo de

formação de biofilme, realizado através do experimento de co-

incubação (A) e pré-incubação (B). ................................................. 74

Figura 6| Ensaio utilizando Alamar Blue para verificar a

citotoxicidade dos biossurfactantes produzidos por linhagens de

referência (A) e isolados da cavidade vaginal (B). ........................... 75

Sumário

1. Introdução .................................................................................... 22

2. Material e métodos ...................................................................... 25

2.1. Pacientes e aspectos éticos da pesquisa .............................. 25

2.2. Isolamento e identificação dos micro-organismos ................. 26

2.3. Identificação das espécies de Candida por multiplex PCR .... 27

2.4. Identificação dos isolados de Lactobacillus por MALDI-TOF

MS ................................................................................................ 29

2.5. Identificação dos isolados de Lactobacillus por

sequenciamento parcial do rDNA da subunidade 16S ................. 30

2.6. Micro-organismos utilizados .................................................. 31

2.7. Teste de antagonismo ........................................................... 31

2.8. Seleção dos isolados de C. albicans produtores de biofilme . 32

2.9. Produção de biossurfactante por Lactobacillus spp............... 33

2.10. Interferência do biossurfactante na adesão e formação de

biofilme ......................................................................................... 35

2.11. Citotoxicidade do biossurfactante ........................................ 37

Cultura de células ...................................................................... 37

Ensaio de viabilidade celular (Alamar blue)............................... 38

2.12. Análise estatística ................................................................ 38

3. Resultados ................................................................................... 39

3.1. Isolamento e identificação dos micro-organismos ................. 39

3.2. Teste de antagonismo ........................................................... 39

3.3. Formação de biofilme por C. albicans ................................... 40

3.4. Ensaios para produção do biossurfactante ............................ 41

3.5. Interferência do biossurfactante na adesão de C. albicans ... 42

3.6. Interferência do biossurfactante na formação do biofilme de C.

albicans ........................................................................................ 43

3.7. Ensaio de viabilidade celular ................................................. 44

Capítulo 1

Artigo a ser submetido na revista Frontiers in Microbiology

22

Propriedades antimicrobianas e anti-biofilme de Lactobacillus 1

spp contra Candida albicans isolados de microbiota vaginal. 2

3

1. Introdução 4

5

Leveduras do gênero Candida são encontradas normalmente na 6

microbiota vaginal, mas nem sempre levam à manifestação de 7

sintomas (Beigi et al, 2004). Este fato se deve ao equilíbrio gerado 8

por mecanismos de defesa do hospedeiro e outros micro-9

organismos da própria vagina, como lactobacilli (Ferrer, 2000). 10

Quando algum fator interfere nesse equilíbrio, ocorre a manifestação 11

da doença, denominada candidíase vulvovaginal (CVV), cujos 12

principais sintomas são a presença de leucorréia, prurido, 13

dispaurenia, eritema, edema e fissuras (Sobel, 2005). A CVV é uma 14

doença de grande importância para a saúde da mulher, tendo em 15

vista que causa grande desconforto, levando à baixa autoestima, 16

ansiedade, e podendo prejudicar a vida profissional, sexual e afetiva 17

dessas mulheres (Sobel, 2007). CVV também pode aumentar a 18

susceptibilidade à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana 19

(HIV) e se não for tratada pode levar à infertilidade, doença pélvica 20

inflamatória, gravidez ectópica, aborto espontâneo e desordens 21

menstruais (Røttingen et al., 2001; Nwadioha et al., 2010). 22

23

Sabe-se que quadros de CVV podem estar relacionados à 24

capacidade de leveduras do gênero Candida formar biofilme no 25

23

epitélio vaginal e em dispositivos intra-uterinos (DIU) (Chassot et al, 26

2008; Lal et al, 2008; Harriott et al, 2010). A problemática em torno 27

da formação de biofilme consiste no fato de que essas células 28

adquirem características fenotípicas diferentes das células 29

planctônicas, incluindo resistência a agentes antifúngicos (Donlan e 30

Costerton, 2002). Tem sido descrita uma diminuição da 31

susceptibilidade aos antifúngicos fluconazol, miconazol e itraconazol 32

por C. albicans durante o período de 8 anos. Resistência ao 33

antifúngico fluconazol, mais comumente utilizado no tratamento de 34

CVV, aumentou de 2.4% em 2006 para 55.4% em 2012, diminuindo 35

para 8.9% em 2013 (Wang et al, 2016). Adicionalmente, tem sido 36

descrita a pesquisa de novos antifúngicos e novos mecanismos que 37

sejam capazes de impedir a formação de biofilme ou destruir o 38

biofilme já formado, além de agir sobre o crescimento do micro-39

organismo. 40

41

Espécies de Lactobacillus também são consideradas colonizadores 42

normais do corpo humano, fazendo parte da microbiota residente e, 43

portanto, não causam danos ao hospedeiro. Essas bactérias podem 44

inibir a adesão, crescimento e proliferação de outros micro-45

organismos mediante diferentes mecanismos que incluem: formação 46

de biofilme, secreção de ácidos orgânicos, produção de substâncias 47

antimicrobianas (peróxido de hidrogênio, bacteriocinas e 48

biossurfactantes), competição por nutrientes e por receptores de 49

adesão (Lepargneur e Rousseau, 2002). 50

24

51

Os micro-organismos são capazes de sintetizar vários tipos de 52

compostos ativos de superfície (CAS) que podem ser classificados 53

em três grupos: os de baixo peso molecular, comumente 54

denominados de biossurfactantes, os que possuem alto peso 55

molecular com uma região hidrofóbica em uma extremidade da 56

molécula, neste caso a terminologia mais adequada utilizada é 57

“polímeros anfifílicos” e por fim, os polímeros polifílicos são aqueles 58

que possuem regiões hidrofóbicas ao longo de toda a molécula 59

polimérica (Neu, 1996). Biossurfactantes apresentam atividade 60

surfactante e emulsificante e, portanto, possuem a capacidade de 61

diminuir a interface entre duas fases de um sistema heterogêneo 62

(Rodrigues et al, 2006). Entre suas funções pode-se destacar o 63

aumento da área de superfície e disponibilidade de substratos 64

hidrofóbicos insolúveis em água, ligação com metais pesados, 65

formação de biofilme e patogenicidade bacteriana (Singh e 66

Cameotra, 2004). 67

68

Probióticos são micro-organismos vivos que quando administrados 69

na quantidade adequada conferem benefícios à saúde do 70

hospedeiro (FAO/WHO 2002). Vários estudos relatam o potencial 71

uso de biossurfactantes produzidos por bactérias produtoras de 72

ácido lático (LAB) na saúde pública e processamento de alimentos 73

(Velraeds et al. 1996; Heinemann et al. 2000; Rodrigues et al. 2004; 74

Rodrigues et al. 2006, Thavasi et al. 2011; Gudiña et al. 2010; 75

25

Sharma et al. 2014; Sharma et al. 2015). Além disso, probióticos 76

são conhecidos por seu potencial em diminuir adesão e 77

desenvolvimento de biofilme de patógenos em estruturas biológicas 78

(células epiteliais do trato urogenital e intestinal) e inanimadas 79

(processamento de alimentos, superfícies biomédicas e 80

equipamento alimentícios) (Reid et al. 2001; Saharan et al. 2011; 81

Sharma et al. 2015). A interferência de LAB na colonização de 82

patógenos ocorre por meio de diferentes mecanismos e a produção 83

de biossurfactantes parece ser um deles (Santos et al. 2013). 84

Recentemente, esses micro-organismos têm atraído a atenção da 85

comunidade médica principalmente devido ao efeito antagonista 86

contra inúmeros patógenos humanos, fazendo com que sejam vistos 87

como potenciais terapêuticos ou profiláticos para o tratamento contra 88

algumas doenças infecciosas (Chew et al, 2015). Este trabalho teve 89

por objetivo avaliar a atividade antagonista de Lactobacillus spp. 90

sobre Candida albicans isoladas de mulheres saudáveis e daquelas 91

com quadro clínico sugestivo de CVV, verificando também se as 92

diferentes espécies de Lactobacillus interferem no processo de 93

adesão e formação de biofilme de C. albicans. 94

95

2. Material e métodos 96

2.1. Pacientes e aspectos éticos da pesquisa 97

98

O projeto foi previamente aprovado pelo comitê de ética da 99

Universidade CEUMA sob o parecer Nº: 813.402/2014. As amostras 100

26

foram coletadas de 50 pacientes atendidas no Hospital da Mulher, 101

São Luís-MA, para realização de testes preventivos de câncer de 102

colo uterino (colpocitologia-Papanicolau), após a assinatura do 103

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, e mediante 104

questionário com perguntas referentes a hábitos diários, nível de 105

escolaridade e estado civil. O critério de exclusão estabelecido foi a 106

não participação de mulheres que tenham feito uso de medicação 107

antifúngica (oral e/ou vaginal) ou antibióticos nos últimos 30 dias ou 108

que tenham doenças que acometam o sistema imunológico. 109

110

2.2. Isolamento e identificação dos micro-organismos 111

112

A coleta da amostra cervicovaginal foi realizada com swab estéril, 113

mergulhados em três tubos estéreis contendo salina, BHI (Brain 114

Heart Infusion - Difco Laboratories Inc., Detroit, EUA) e MRS (Man, 115

Rogosa and Sharpe broth – Difco Laboratories Inc., Detroit, EUA). 116

As amostras coletadas em salina foram inoculadas imediatamente 117

em SDA (Sabouraud Dextrose Agar - Difco Laboratories Inc., Detroit, 118

EUA) e MRS ágar, enquanto as amostras coletadas em BHI e MRS 119

caldo foram colocadas em estufa a 37 °C por 24h e posteriormente 120

semeadas em meio MRS agar e SDA por 48h. As placas de MRS 121

ágar foram incubadas em atmosfera de anaerobiose para isolamento 122

de Lactobacillus spp. A identificação de C. albicans foi realizada 123

presuntivamente em CHROMagar Candida (Difco Laboratories Inc., 124

Detroit, EUA). Adicionalmente, os isolados foram identificados 125

27

através sistema automatizado VITEK 2 (BioMeriéux, França) e pela 126

técnica de Reação em Cadeia da Polimerase com múltiplos 127

iniciadores específicos (PCR multiplex). 128

129

2.3. Identificação das espécies de Candida por PCR multiplex 130

131

Para a identificação dos isolados de Candida, foi realizada a 132

extração de DNA pelo método proposto por Barros et al. (2015). 133

Colônias isoladas em SDA foram adicionadas em 600 µL de tampão 134

STES (25 mM EDTA 0,5M; 200 mM Tris 2M; 100 mM NaCl 5M; 1% 135

SDS 10%), agitadas em vortex por 2 minutos e aquecidas em 136

banho-maria a 65,5 °C por 10 minutos, sendo esse processo 137

repetido 1 vez. Logo após foram adicionados 500 µL de CIA (24 mL 138

de clorofórmio: 1 mL álcool isoamílico) e amostras centrifugadas a 139

9000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos 140

microtubos aos quais foram adicionados 500 µL de álcool absoluto 141

gelado e incubados a -20 °C por 16h. As amostras foram 142

centrifugadas a 9000 rpm por 5 minutos e todo o álcool foi removido. 143

Foram adicionados 500 µL de álcool 70% gelado e amostras 144

submetidas a centrifugação a 9000 rpm por 5 minutos. Logo após, o 145

álcool foi removido, as amostras deixadas para secar e 146

ressuspendidas em tampão TE (Tris-Cl 1M, pH 7,6; EDTA 0,5M, pH 147

8,0) 148

149

28

A identificação das espécies de Candida foi feita de acordo com 150

protocolo seguido por Luo e Mitchell (2002), com modificações. 151

Inicialmente foi feita a identificação utilizando iniciadores específicos 152

do gênero Candida desenhados à partir da região ITS, chamados de 153

ITS1 e ITS4. A identificação em nível de espécie foi feita com os 154

seguintes iniciadores: CALB1 e CALB2 para C. albicans; CTR1 e 155

CTR2 para Candida tropicalis; CPA2 e CPA3 para Candida 156

parapsilosis; CGL1 e CGL2 para Candida glabrata; CKR2 and CKR3 157

para Candida krusei (Tabela 1). As espécies foram distribuídas em 158

dois painéis de multiplex PCR. O primeiro contendo iniciadores para 159

identificação de C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis, e o 160

segundo com os iniciadores para identificação de C. albicans e C. 161

krusei. Cada mix de reação continha 2 µL (~1 ng) de DNA genômico, 162

20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de 163

cada deoxirribonucleotídeo trifosfato, 0.5 U of Taq DNA polimerase 164

(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.), 0.5 µM primers ITS1 165

e ITS4, 0.7 µM primers CGL1 e CGL2, 0.4 µM primers CTR1 e 166

CTR2, 0.6 µM primers CPA1 e CPA2 e 0.4 µM primers CKR2 e 167

CKR3, totalizando 20 µL de volume de reação. As condições para 168

amplificação por PCR foram 5 min de desnaturação a 96°C, seguido 169

de 40 ciclos de 94°C por 30 s, 58°C por 30 s, e 72°C por 30 s e 170

passo final de extensão a 72°C por 15 min. Uma alíquota de 10 µL 171

do produto final foi utilizada para eletroforese em gel de agarose a 172

2% com brometo de etídeo por 2 a 3h. Bandas de DNA foram 173

visualizadas em transluminador UV. 174

29

175

2.4. Identificação dos isolados de Lactobacillus por MALDI-TOF 176 MS 177

178

A identificação das linhagens de Lactobacillus foi realizada através 179

da técnica de “Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-180

flight mass spectrometry” (MALDI-TOF MS). As bactérias foram 181

cultivadas em MRS agar a 37 °C por 48h, em condições de 182

anaerobiose. Para a análise, colônias isoladas foram selecionadas 183

com auxílio de uma alça descartável e aplicadas a uma placa de aço 184

de 24 pontos (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Após a 185

secagem, as amostras foram cristalizadas com a matriz (1 µL de 186

solução saturada de α-ciano-4-hidroxicinamico matriz ácida (HCCA; 187

Bruker Daltonics, Bremen, Germany) em 50 % acetonitrilo/2,5 % 188

ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Espectro de 189

massa foi adquirido no modo refletor positivo em um sistema 190

MicroFlex LT (Bruker Daltonics) utilizando as recomendações do 191

fabricante. Espectros capturados foram analisados utilizando 192

sistema automatizado MALDI Biotyper e software Bruker Biotyper 193

2.0 softwares (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Os critérios de 194

identificação usados para análise foram: pontuação ≥2.000 195

(identificação a nível de espécie); pontuação de 1.700 a 1.999 196

(identificação a nível de gênero), e pontuação <1.700 (nenhuma 197

identificação bacteriana ou que não se encontra no banco). Para 198

30

análise da espectrometria, a linhagem de referência Escherichia coli 199

ATCC 8739 foi utilizada como controle positivo. 200

201 2.5. Identificação dos isolados de Lactobacillus por 202 sequenciamento parcial do rDNA da subunidade 16S 203

204

A extração de DNA das bactérias foi realizada à partir de colônias 205

isoladas em meio BHI ágar, seguindo protocolo descrito por Pitcher 206

et al (1989). A concentração e a pureza do produto obtido foram 207

quantificadas em espectrofotômetro NanodropTM 1000 a 260 e 280 208

nm. A amplificação das sequências parciais de rDNA 16S, foi 209

realizada através dos iniciadores universais para bactérias 8F 210

(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) e 907R (5′-211

CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′) (Stackebrandt & Goodfellow, 212

1991). A amplificação foi realizada em termociclador (Applied 213

Biosystems) sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94 214

ºC por 5 minutos, seguido por 21 ciclos com desnaturação a 94 ºC 215

por 1 min, anelamento a 57 ºC por 1 min nos primeiros três ciclos 216

com queda de 1 ºC a cada dois ciclos até uma temperatura de 49 ºC 217

nos dois últimos ciclos e extensão a 72 ºC por 3 min, finalizando com 218

uma extensão final a 72 ºC por 10 min (Marchesi et al., 1998). A 219

concentração e a pureza do produto da amplificação foram 220

quantificadas em espectrofotômetro NanodropTM 1000 a 260 e 280 221

nm e a integridade do fragmento, de aproximadamente 900 pares de 222

bases, analisada por eletroforese em gel de agarose 1%. A reação 223

31

de sequenciamento da região do rDNA 16S foi realizada utilizando 224

BigDye® Terminator v3.1 Ready Reaction Mix (Life Technologies 225

Corporation, Califórnia, USA) e os iniciadores 8F e 907R nas 226

concentrações de 5 µmol/L. O produto da reação foi purificado e 227

ressuspendido em formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems, 228

Califórnia, USA) para ser analisada no sequenciador 3730xl DNA 229

Analyzer (Applied Biosystems, Califórnia, USA). As sequências 230

obtidas foram editadas utilizando-se o programa Sequencher 4.1.4 e, 231

quando possível, o produto das reações utilizando os diferentes 232

iniciadores foram alinhados para geração da sequência consenso 233

para então serem comparadas com sequências depositadas no 234

banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 235

através da ferramenta BLASTn. Os isolados foram considerados da 236

mesma espécie da sequência do banco de dados que apresentou 237

maior identidade com a sua, quando este valor foi maior que 97%. 238

239

2.6. Micro-organismos utilizados 240

241

Neste estudo foram utilizados, além dos isolados clínicos, as 242

linhagens de referência: L. debrueckii ATCC 9645, L. rhamnosus 243

ATCC 9595, L. acidophilus ATCC 4356, L. fermentum ATCC 23271, 244

L. paracasei ATCC 335, E. coli ATCC 8739. 245

246

2.7. Teste de antagonismo 247

32

248

O teste de antagonismo foi feito pelo método de overlay, seguindo 249

protocolo de Chew et al (2015) com pequenas modificações. 250

Culturas de Lactobacillus spp. foram incubadas em condições 251

anaeróbicas a 37 °C por 24 h em MRS caldo suplementado com L-252

cisteína 0,25% (Sigma, St Louis, MO). As amostras bacterianas 253

foram padronizadas a 1.0 em OD600 nm e em seguida 10 µL de cada 254

amostra foram depositados em placas contendo MRS agar com L-255

cisteína 0,25% e incubadas novamente nas mesmas condições. 256

Após esse período foi adicionada uma fina camada de SDA (2 mm 257

de altura) e feita a semeadura do inóculo de C. albicans obtido a 258

partir de cultura de 48 h em SDA. Colônias isoladas foram 259

adicionadas em RPMI para crescimento 16 h a 37 °C. As células 260

foram centrifugadas a 3600 rpm por 10 minutos, lavadas 2 vezes 261

com PBS e ressuspendidas em PBS (Phosphate Buffer Saline pH = 262

7.0). A turbidez do inóculo foi ajustada em espectrofotômetro para 263

0.38 (1 x 107 células/mL) a OD520 nm. As placas das culturas foram 264

incubadas a 37°C por 24 h em condições de aerobiose e 265

posteriormente foi realizada a mensuração dos halos de inibição. 266

Todos os ensaios foram realizados em duplicata. 267

2.8. Seleção dos isolados de C. albicans produtores de biofilme 268

269

Para o ensaio de formação de biofilme 200 µL do inóculo 270

padronizado em YNB suplementado com 100 mM de glicose foram 271

33

adicionados a placas de 96 poços de fundo chato. O teste foi feito 272

com oito repetições e como controle foram utilizados poços contendo 273

apenas meio de cultura. As placas foram incubadas por 90 minutos. 274

Após esse período as células foram lavadas com PBS para remoção 275

de células não aderidas, seguido da adição de 200 µL de meio novo 276

e incubação por 48 h a 37 °C, trocando-se o meio a cada 24h. A 277

quantificação do biofilme foi feita pelo método do cristal violeta. 278

Inicialmente foi retirado todo o meio e os poços lavados uma vez 279

com PBS. Logo após, as células foram fixadas com etanol 80% 280

durante 15 minutos e após remoção, as placas foram deixadas secar 281

à temperatura ambiente. Foram adicionados 200 µL de cristal violeta 282

por 20 minutos e após esse período o corante foi removido e a placa 283

lavada uma vez com PBS. Para solubilizar o cristal foram 284

adicionados 200 µL de ácido acético glacial 33%, a solução foi 285

homogeneizada e 150 µL foram transferidos para uma nova placa a 286

fim de realizar a leitura em leitor de Elisa a 550 nm. 287

288

2.9. Produção de biossurfactante por Lactobacillus spp 289

290

Inicialmente foi realizado um cultivo em pequena escala (screening) 291

seguindo metodologia proposta por Gudina et al (2010), com 292

algumas modificações, entre todas as linhagens bacterianas clínicas 293

(n = 15) e as linhagens de referência L. debrueckii ATCC 9645, L. 294

rhamnosus ATCC 9595, L. acidophilus ATCC 4356, L. fermentum 295

34

ATCC 23271, L. paracasei ATCC 335 para determinar as produtoras 296

de biossurfactante. Posteriormente foi feita a produção em larga 297

escala de biossurfactante seguindo a mesma metodologia. Para 298

realização do ensaio uma colônia isolada foi adicionada em 10 mL 299

de MRS suplementado com L-cisteína 0,25% e incubada 16 h a 300

37°C, em condições de anaerobiose (pré-cultura). Uma alíquota de 4 301

mL da pré-cultura foi inoculada em 400 mL de MRS suplementado 302

com L-cisteína 0,25% e incubado por 48 h a 37°C em condições 303

anaeróbicas. Após o período de incubação as amostras foram 304

centrifugadas, lavadas e as células ressuspendidas em PBS (15 mL 305

de PBS para cada 100 mL de cultura). A suspensão de células foi 306

agitada em vortex por 2 minutos e centrifugada (10000 rpm, 15 307

minutos). O sobrenadante foi filtrado utilizando microfiltro 0,22 µm. 308

Durante o período de 48h de incubação foram retiradas alíquotas a 309

cada 12h para mensuração do peso seco, OD640 nm e realização do 310

teste do colapso da gota e atividade emulsificante, descritos a 311

seguir. O peso seco foi avaliado de forma que um microtubo vazio foi 312

pesado e em seguida adicionado 1 mL das amostras. Os microtubos 313

foram centrifugados e as células foram secadas em estufa e 314

pesados novamente. Os valores de peso seco foram obtidos pela 315

equação: ps = Mf – Mi, onde ps (peso seco); Mf (peso final do 316

microtubo); Mi (peso inicial do microtubo). O teste de colapso da 317

gota foi realizado em triplicata e como controle foi utilizado PBS, 318

seguindo recomendações propostas por Tahmourespour et al. 319

(2011). Foram adicionados 10 µL do biossurfactante em uma placa 320

35

de poliestireno e realizada mensuração do diâmetro da gota com o 321

auxílio de papel milimetrado. A atividade emulsificante (E24) do 322

biossurfactante foi verificada de acordo com protocolo descrito por 323

Gudina et al. (2015). Foram adicionados 2 mL de tolueno ou hexano 324

para mesmo volume de amostra e agitado em vortex por 2 minuto. 325

Após 24 h foi realizada a mensuração da camada emulsificante com 326

o auxílio de uma régua milimetrada. O valor da atividade 327

emulsifcante (E24) foi calculado pela porcentagem da altura da 328

camada emulsificante (mm) dividido pela altura da camada total 329

(mm). 330

331

2.10. Interferência do biossurfactante na adesão e formação de 332

biofilme 333

334

Para verificar a interferência do biossurfactante na adesão de C. 335

albicans foi utilizado o procedimento descrito por Sharma et al 336

(2015), no qual 200 µL de biossurfactante foram adicionados a 337

microplacas de 96 poços de fundo chato e incubadas por 16h a 4 °C. 338

Após esse período as placas foram lavadas duas vezes com PBS 339

seguido da adição de 200 µL do inóculo de C. albicans (0.38 em 340

OD550 nm) e incubação por 4 horas a 4 °C. O teste foi realizado em 341

triplicata. Para quantificação da adesão foram realizadas as etapas 342

de lavagem e coloração com cristal violeta de acordo com o subitem 343

2.5. A leitura foi realizada em leitor de microplaca utilizando o 344

comprimento de onda de 550 nm. 345

36

346

O ensaio de inibição do biofilme foi realizado de acordo com 347

Fracchia (2010), com pequenas modificações. O teste foi feito de 348

duas formas: pré-incubação e co-incubação. Para o experimento de 349

pré-incubação foi feita uma sensibilização prévia da microplaca de 350

96-poços de fundo chato adicionando 200 µL do biossurfactante e 351

incubando por 24 h a 37°C. Após esse período as placas foram 352

lavadas duas vezes com PBS para remoção de biossurfactante não 353

aderido. Foram adicionados 200 µL do inóculo de C. albicans. As 354

placas foram incubadas a 37 °C por 3 horas. Após esse período foi 355

realizada lavagem dos poços com PBS, sendo esse processo 356

executado duas vezes, e adição de 200 µL de meio novo. A 357

incubação foi feita por 48h a 37°C, com mudança de meio a cada 358

24h. 359

360

Nos experimentos de co-incubação o inóculo de C. albicans foi 361

colocado junto com o biossurfactante na proporção de 1:1 e 362

incubado nas mesmas condições anteriores. Após esse período o 363

processo de lavagem foi o mesmo, porém os poços foram 364

preenchidos com meio novo e biossurfactante na mesma proporção. 365

As condições de incubação foram mantidas. A produção do biofilme 366

foi quantificada pelo método do cristal violeta descrito no subitem 367

2.5. Para ambos os testes foram feitas 3 réplicas e o controle sem 368

interferência do biossurfactante. 369

370

37

2.11. Citotoxicidade do biossurfactante 371

372

Cultura de células 373

374

O ensaio de citotoxicidade dos biossurfactantes foi avaliado pelo 375

método de cultura de células descrito por Masetti (2016), utilizando 376

uma linhagem de queratinócitos humanos (HaCaT:0341), cedidas 377

pelo Banco de Células do Rio de Janeiro, RJ, Brasil. O cultivo foi 378

feito em meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 379

(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de 380

solução antibiótica e antimicótica (10.000 µg/mL de penicilina G, 381

10.000 µg/mL de estreptomicina e 25 µg/mL de anfotericina), 382

mantido em estufa com 5% de CO2, à temperatura de 37ºC e 383

ambiente com umidade controlada. Células foram cultivadas até 384

atingirem confluência de 90%, lavadas com solução PBS 1X e 385

removidas com solução de tripsina (0,05%)/EDTA (0,53 mmol/L), 386

seguida por centrifugação com 400 x g por 5 minutos. As células 387

foram, posteriormente, ressuspendidas em meio de cultura e 388

replaqueadas. O meio de cultura foi renovado a cada dois dias. A 389

contagem de células foi feita em câmara de Neubauer, adicionando 390

o corante Azul de Tripan, adicionadas na quantidade de 1,0 x 104 391

células/poço em placas estéreis de 96 poços e incubadas em estufa 392

a 37 °C contendo CO2 a 5% por 24 horas. Após este período, foram 393

adicionadas aos poços fatores de diluição dos biossurfactantes, 394

sendo as placas incubadas novamente nas mesmas condições. O 395

38

experimento foi feito com cinco réplicas e como controle negativo foi 396

utilizado somente meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal 397

bovino (SFB) e 1% de solução antibiótica-antimicótica. Seguidas as 398

24 horas, foi realizado o teste de citotoxicidade. 399

400

Ensaio de viabilidade celular (Alamar blue) 401

402

Após 24h de crescimento celular tanto em meio de teste e controle, 403

20 μL de Alamar blue foi adicionado em cada poço. As placas foram 404

incubadas por 4h a 37 °C em 5% CO2. Após o período de incubação 405

o conteúdo de cada poço foi transferido para nova placa e a leitura 406

foi realizada em Fluoroskan Ascent FL (Lab Systems) com um filtro 407

de 544 nm de emissão e 590 nm de transmissão. 408

409

2.12. Análise estatística 410

411

Os dados foram analisados através do programa IBM SPSS 412

Statistics 20 (2011). Inicialmente para se avaliar a associação das 413

espécies de Lactobacillus e Candida presentes na microbiota vaginal 414

de mulheres saudáveis e com CVV foi feito o teste de qui-quadrado 415

de independência (2). Posteriormente, foi feito o teste de 416

normalidade de todas as variáveis numéricas (halo de inibição, 417

biofilme, produção do biossurfactante, biossurfactante na adesão, 418

biossurfactante no biofilme, citotoxicidade e viabilidade celular) 419

através do teste de Shapiro Wilk, seguido dos testes paramétricos 420

39

(ANOVA, Tukey, ANCOVA, Correlação de Pearson). Para se avaliar 421

a citotoxicidade e a viabilidade celular foi feito a Análise de 422

Covariância e depois avaliou-se pela ANOVA o efeito da espécies de 423

Lactobacillus. Em todos os testes o nível de significância (α) foi de 424

5%. 425

426

3. Resultados 427

428

3.1. Isolamento e identificação dos micro-organismos 429

430

Amostras de secreção vaginal foram coletadas de pacientes, com 431

idades entre 18 e 79 anos, atendidas para coleta de colpocitologia, 432

em hospital de rede pública de São Luís-MA. Foram isoladas 16 433

amostras de Candida e 15 de Lactobacillus das pacientes (Tabela 434

2). De algumas pacientes foi possível o isolamento tanto de Candida 435

como de Lactobacillus, a partir da mesma amostra. As espécies 436

mais comumente isoladas foram C. albicans, seguida por C. 437

glabrata. Não foi encontrada diferença entre as espécies de Candida 438

encontradas em pacientes assintomáticas e aquelas com sintomas 439

de (CVV). O mesmo foi observado para as espécies de 440

Lactobacillus, sendo L. gasseri a espécie mais isolada nos grupos de 441

pacientes, de acordo com a identificação feita pelo MALDI-TOF MS. 442

443

3.2. Teste de antagonismo 444

445

40

O ensaio de antagonismo mostrou que 15 das 20 amostras de 446

Lactobacillus, incluindo cinco amostras de referência, tiveram efeito 447

inibitório contra C. albicans com halos variando de 9,5 a 28,5 mm 448

(Tabela 3). Entre as linhagens com capacidade antagonista, L. 449

acidophilus ATCC 4356, L. rhamnosus ATCC 9595 e a amostra 450

clínica L. paracasei LV11, foram capazes de inibir todas as linhagens 451

de Candida. A avaliação por meio do teste estatístico de Tukey 452

mostrou que a capacidade de inibição depende tanto das linhagens 453

de Candida como de Lactobacillus testadas. 454

455

3.3. Formação de biofilme por C. albicans 456

457

A capacidade de formação de biofilme de C. albicans foi avaliada em 458

meio de cultura YNB suplementado com 100 mM de glicose, durante 459

o período de 48h. A quantificação por meio da coloração com cristal 460

violeta revelou que todas as amostras testadas se mostraram boas 461

formadoras de biofilme (Figura 1), entretanto a capacidade de formar 462

biofilme variou de acordo com a linhagem. A amostra com maior 463

capacidade de formação de biofilme neste teste foi a C. albicans 464

CV8, com valor da média de OD550nm igual a 2,823. A linhagem C. 465

albicans CV2 obteve a média de DO mais baixa de biofilme, com 466

valor de 1,523. As amostras C. albicans CV8, C. albicans CV25 e C. 467

albicans CV21 obtiveram os valores mais altos de OD550 nm e, 468

portanto, foram selecionadas para os ensaios de interferência do 469

biossurfactante na adesão e formação de biofilme. 470

41

471

3.4. Ensaios para produção do biossurfactante 472

473

A avaliação da produção de biossurfactante foi feita por meio da 474

atividade emulsificante (E24). As amostras nas quais foram 475

observadas a formação de uma camada emulsificante após 24h, 476

foram consideradas produtoras de biossurfactante. Entre as 20 477

amostras de Lactobacillus testadas, quatro das cinco linhagens de 478

referência se mostraram produtoras e dos 15 isolados clínicos, três 479

foram capazes de produzir biossurfactante. Estas foram produzidas 480

em larga escala e testadas contra formação de biofilme de C. 481

albicans. 482

483

A mensuração do peso seco, feita a partir do auxilio de um 484

microtubo mostrou que todas as amostras tiveram aumento do peso 485

até às 36h, seguido de um declínio, exceto a amostra de L. 486

fermentum ATCC 23271, que começou a declinar após 24h (Figura 487

2A). A quantificação dos valores de DO mostrou que quatro 488

linhagens apresentaram maiores valores nas primeiras 24h, sendo 489

elas, L. crispatus LV1, L. gasseri LV17, L. rhamnosus ATCC 9595 e 490

L. acidophilus ATCC 4356, com início de decréscimo logo depois. No 491

caso da linhagem L. crispatus LV1, os valores se mantiveram 492

praticamente estáveis após as primeiras 24h. As linhagens L. 493

paracasei LV11, L. debrueckii ATCC 9645 e L. fermentum ATCC 494

42

23271 apresentaram maiores valores de DO ao tempo de 36h 495

(Figura 2B). 496

497

O teste do colapso da gota mostrou que após as 48h de cultivo, 498

todas as amostras obtiveram os valores do diâmetro da gota maiores 499

que o controle, no qual foi usada uma gota de PBS. Os maiores 500

valores encontrados foram obtidos em 24h, onde a linhagem L. 501

debrueckii ATCC 9645 apresentou o maior valor (0,7 cm) (Figura 502

2C). 503

504

Em relação à atividade emulsificante as maiores porcentagens foram 505

obtidas com o solvente tolueno (Figura 3) e não apresentaram 506

diferenças estatísticas de acordo com os tempos, somente de 507

acordo com as linhagens, onde L. crispatus LV1 foi diferente de 508

todas as linhagens com exceção de L. rhamnosus ATCC 9595 e L. 509

gasseri LV17. As linhagens se comportaram de maneiras diferentes 510

em relação aos valores de E24, onde apresentaram valores mais 511

altos em diferentes tempos de mensuração, não havendo um padrão 512

para todas as espécies. As únicas variáveis que obtiveram 513

diferenças significativas em relação aos diferentes tempos de 514

mensuração foram peso seco e os valores de OD. 515

516

3.5. Interferência do biossurfactante na adesão de C. albicans 517

518

43

O ensaio para verificar a interferência do biossurfactante na adesão 519

de C. albicans mostrou que todos os biossurfactantes, com exceção 520

do produzido por L. acidophilus ATCC 4356, foram capazes de 521

aumentar significativamente a adesão da linhagem C. albicans 522

CV25. Já em relação à linhagem C. albicans CV21 apenas os 523

biossurfactantes obtidos à partir dos isolados clínicos foram capazes 524

de aumentar a adesão desta. A linhagem C. albicans CV8 teve sua 525

adesão aumentada pelos biossurfactantes produzidos por L. 526

rhamnosus ATCC 9595, L. paracasei LV11 e L. crispatus LV1 527

(Figura 4). 528

529

3.6. Interferência do biossurfactante na formação do biofilme de 530

C. albicans 531

532

No ensaio de pré-incubação, no qual a placa é sensibilizada 533

previamente com o biossurfactante, a amostra produzida por L. 534

gasseri LV17 foi capaz de aumentar a produção de biofilme das 535

linhagens C. albicans CV25 e C. albicans CV8, em 82% e 54%, 536

respectivamente (Figura 5A). 537

538

No experimento de co-incubação, onde o biossurfactante é colocado 539

junto com o inóculo de C. albicans, pode-se perceber que houve um 540

aumento significativo da produção de biofilme pela linhagem C. 541

albicans CV21 quando cultivada na presença de todos os 542

biossurfactantes, com excessão do produzido por L. acidophilus 543

44

ATCC 4356. Em relação à linhagem C. albicans CV8, os 544

biossurfactantes produzidos por L. gasseri LV17 e L. acidophilus 545

ATCC 4356 foram capazes de aumentar e diminuir, 546

respectivamente, a quantidade de biomassa de biofilme produzido. 547

L. acidophilus ATCC 4356 diminuiu em 19,1% o biofilme formado 548

(Figura 5B). 549

550

Pode-se observar também que as linhagens cultivadas com 551

biossurfactante no ensaio de co-incubação apresentaram maiores 552

valores de biomassa quando comparados aos valores obtidos no 553

ensaio de pré-incubação. 554

555

3.7. Ensaio de viabilidade celular 556

557

A fim de determinar se os biossurfactantes apresentam algum efeito 558

citotóxico para as células, foi realizado um ensaio de citotoxicidade 559

utilizando queratinócitos humanos (HaCaT: 0341) com posterior 560

avaliação do metabolismo celular por meio do teste Alamar Blue. 561

562

Apesar de não apresentarem significância estatisticamente, alguns 563

biossurfactantes, quando testados na diluição ½, foram capazes de 564

aumentar a viabilidade celular quando comparados com o controle 565

positivo. Tal fato foi observado em relação aos biossurfactantes 566

produzidos por L. gasseri LV17, L. crispatus LV1, L. acidophilus 567

ATCC 4356 e L. fermentum ATCC 23271 (Figura 6A e 6B). 568

45

569

O ensaio mostrou que apenas o biossurfactante produzido por L. 570

fermentum ATCC 23271 foi considerado citotóxico quando testado 571

nos fatores de diluições de 1/16 e 1/32. Nestas diluições, o 572

biossurfactante foi capaz de diminuir a viabilidade celular em 26% 573

(Figura 6B). 574

575

4. Discussão 576

577

A partir das amostras coletadas no presente trabalho, pode-se 578

perceber que a espécie C. albicans foi a mais isolada, seguida de C. 579

glabrata. Outros estudos realizados no Brasil e em outros países 580

também apontam C. albicans como a espécie fúngica mais 581

frequentemente isolada da cavidade vaginal, seguida de C. glabrata 582

(Ahmad e Khan, 2009; Gamarra et al., 2014; Moreira et al., 2014; 583

Fornari et. al, 2016; Wang et al., 2016). No presente trabalho, L. 584

gasseri foi a espécie com maior frequência, que se encontra entre as 585

espécies mais isoladas, apesar de não ser a mais frequente na 586

maioria dos trabalhos. L. crispatus tem sido relatada como a espécie 587

de Lactobacillus predominante da microbiota vaginal (Martinez et al., 588

2008; Brolazo et al., 2009; Zhou et al., 2009; Mousavi et al. 2016; 589

Lepargneur , 2016). A diferença da microbiota vaginal de mulheres 590

pode estar relacionada com grupos étnicos, além de hábitos e 591

práticas diárias, incluindo higiene pessoal, métodos 592

anticoncepcionais, atividade sexual (Zhou et al., 2007; Schwebke, 593

46

2009; Zhou et al., 2009). A microbiota dominada por outras espécies 594

de Lactobacillus, que não L. crispatus, pode apresentar valores mais 595

altos de pH variando de 4.4 a 5 (Ravel et al., 2011). 596

597

Lactobacillus são responsáveis pela manutenção do ambiente 598

vaginal saudável, fornecendo uma barreira para a colonização de 599

organismos patogênicos e inibindo o crescimento exacerbado de 600

microrganismos comensais (Borges et al, 2014). O teste de 601

antagonismo mostrou que algumas linhagens de Lactobacillus, entre 602

elas linhagens de referência e isolados clínicos, foram capazes de 603

inibir o crescimento de C. albicans. Entre as amostras, L. acidophilus 604

ATCC 4356, L. rhamnosus ATCC 9595 e a amostra clínica L. 605

paracasei LV11, foram capazes de inibir todas as linhagens de C. 606

albicans testadas. Estudos in vitro têm reportado o potencial 607

antimicrobiano de Lactobacillus spp contra Candida (Kassaa et al., 608

2014; Chew et al., 2015; Parolin et al., 2015). Micro-organismos 609

probióticos são capazes de produzir vários compostos 610

antimicrobianos como bacteriocinas, ácidos orgânicos, peróxido de 611

hidrogênio, diacetil, substâncias antimicrobianas de baixo peso 612

molecular e biossurfactantes, que podem prevenir o crescimento de 613

potenciais patógenos (Pascual et al. 2008; Merk et al. 2005; Ceresa 614

et al. 2015). 615

616

Biossurfactantes apresentam potencial para serem utilizados para 617

aplicações industriais, principalmente no campo de recuperação e 618

47

processamento de óleos e médicas, devido à sua capacidade de 619

modificar a hidrofobicidade de uma superfície, dificultando a adesão 620

de micro-organismos, além se sua atividade antimicrobiana (Banat et 621

al., 2010). Biossurfactantes produzidos por Lactobacillus podem ser 622

capazes de reduzir a adesão de micro-organismos a vidro, cateter 623

de silicone, implantes cirúrgicos (Sharma et al, 2015). 624

625

Um dos testes utilizados para determinação da produção de 626

biossurfactante foi o da atividade emulsificante (E24), no qual os 627

valores mais altos foram obtidos para o solvente tolueno. A maioria 628

dos biossurfactantes é específica a um tipo de substrato, 629

apresentando diferentes taxas de solubilização ou emulsificação de 630

diferentes hidrocarbonetos (Ilori e Amund, 2001). Essa 631

especificidade também foi observada por outros autores (Barros et 632

al. 2008; Ilori et al. 2005) 633

634

Os ensaios para verificar o potencial de inibição do biossurfactante 635

na adesão e formação de biofilme mostraram que os mesmos foram 636

capazes de aumentar a adesão das linhagens de C. albicans 637

testadas, destacando-se as linhagens clínicas L. paracasei LV11 e L. 638

crispatus LV1, que aumentaram a adesão de todos isolados de C. 639

albicans. Na formação de biofilme foi constatado aumento da 640

biomassa das linhagens de C. albicans em contato com o 641

biossurfactante produzido por L. gasseri LV1, tanto no experimento 642

de co-incubação como pré-incubação. Já o biossurfactante 643

48

produzido por L. acidophilus ATCC 4356 foi capaz de diminuir o 644

biofilme de C. albicans CV8 durante o experimento de co-incubação. 645

646

A interferência de L. acidophilus ATCC 4356 na formação do biofilme 647

de C. albicans já havia sido demonstrada anteriormente por Vilela et 648

al (2015). Em seu trabalho foi observado que o sobrenadante filtrado 649

como a cultura de células de L. acidophilus ATCC 4356 foi capaz de 650

inibir a formação de biofilme de C. albicans ATCC 18804. Trabalhos 651

sugerem que biossurfactante interfere na formação de biofilme, 652

modulando a interação com a superfície, diminuindo a 653

hidrofobicidade e dificultando o processo de adesão. Ao ser 654

adsorvido a superfícies hidrofóbicas, o surfactante normalmente 655

direciona o grupo hidrofóbico para a superfície e expõe o grupo polar 656

à água. A superfície torna-se hidrofílica e a tensão interfacial entre a 657

superfície e a água é reduzida (Araújo e Freire, 2013). 658

659

O presente estudo mostrou que o ensaio de formação de biofilme 660

feito na forma de co-incubação obteve valores mais altos que no 661

ensaio de pré-incubação. Tal resultado pode ter relação com o fato 662

de que biossurfactantes interagem com a superfície, de forma que 663

as moléculas orgânicas da fase não-sólida são imobilizadas na 664

superfície sólida, formando um filme que altera as propriedades da 665

superfície e pode influenciar a interação com os micro-organismos 666

(Noeb e Neihof, 1975). As propriedades do substrato irão determinar 667

a composição e orientação das moléculas durante a primeira hora de 668

49

exposição. Após 4h é alcançado um certo grau de uniformidade do 669

material adsorvido e este se torna independente do substrato (Noeb 670

e Neihof, 1975; Nakagawa et al., 1984; Little, 1985; Neu e Marshall, 671

1990). Este fato pode sugerir que no experimento de pré-incubação 672

já havia sido concretizada a adsorção do material orgânico, fato que 673

dificultaria a formação do biofilme. 674

675

Bactérias produtoras de ácido lático (LAB) interferem na colonização 676

de patógenos por meio de vários mecanismos, entre eles a produção 677

de biossurfactante, que interferem no processo de adesão. A 678

competição por sítios de aderência juntamente com a secreção de 679

biossurfactantes são mecanismos bem conhecidos para dificultar o 680

estabelecimento de patógenos vaginais (Sharma et al., 2016). A 681

redução da colonização de patógenos por meio de biossurfactantes 682

produzidos por LAB tem sido descrita em várias superfícies incluindo 683

vidro (Velraeds et al., 1996), silicone e próteses de voz (Busscher 684

and Van der Mei, 1997; Velraeds et al., 1998; Van Hoogmoed et al., 685

2006; Rodrigues et al., 2004; Rodrigues et al., 2006) metal 686

(Meylheuc et al. 2006), e outras superfícies (Heinemann et al. 2000; 687

Gudiña et al. 2010; Fracchia et al.2010). Devido à sua estrutura 688

anfipática, biossurfactantes também pode se ligar à membrana e 689

aumentar a permeabilidade celular, levando à lise e destruição 690

celular. 691

692

50

Para avaliar se os biossurfactantes utilizados em nosso trabalho 693

possuíam atividade citotóxica, foi realizado teste de viabilidade 694

celular utilizando queratinócitos humanos (HaCaT:0341). O resultado 695

mostrou que quatro dos sete biossurfactantes foram capazes de 696

aumentar a porcentagem de viabilidade celular. Alguns 697

biossurfactantes, como os soforolipídeos, têm sido utilizados como 698

terapia para tratamento de pele, atuando como agentes de 699

fibrinólise, cura, descamação, de despigmentação, e activação de 700

macrófagos (Maingault, 1999). Ramnolipídeos, outro tipo de 701

biossurfactante, são utilizados em baixas concentrações (0,1%) para 702

o tratamento de úlceras e queimaduras (Piljac, A. et al., 2008; 703

Stipcevic, T. et al. 2006). Os resultados do nosso trabalho sugerem 704

que os biossurfactantes aqui utilizados, possam ter uso semelhante, 705

sendo necessários novos testes para corroborar tal fato. 706

707

Pode-se concluir então, que os Lactobacillus spp utilizados no 708

presente trabalho possuem capacidade de inibir o crescimento de C. 709

albicans, com destaque para a linhagem L. paracasei LV11, que 710

além de apresentar as maiores zonas de inibição do teste de 711

antagonismo, foi capaz de produzir biossurfactante. Entretanto tal 712

capacidade inibitória não pode ser atribuída à produção de 713

biossurfactantes, tendo em vista que os mesmos foram capazes de 714

aumentar a formação de biofilme e a viabilidade celular no ensaio de 715

citotoxicidade com queratinócitos humanos. Este trabalho sugere 716

que a inibição do crescimento de C. albicans pode estar relacionada 717

51

a produção de outros metabólitos, sendo necessários mais estudos 718

para determinar esses compostos. 719

720

721

722

723

724

725

726

727

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DOI: 10.1155/2014/493548 1015

1016

64

Sharma, D., Saharan, B. S., Chauhan, N., Procha, S., and Lal, S. 1017

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biosurfactant produced by Enterococcus faecium. SpringerPlus, 4(1), 1019

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Singh, P., and Cameotra, S. S. (2004). Potential applications of 1022

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Tahmourespour, A., Salehi, R., & Kermanshahi, R. K. (2011). 1036

Lactobacillus acidophilus-derived biosurfactant effect on gtfB and 1037

gtfC expression level in Streptococcus mutans biofilm cells. Brazilian 1038

Journal of Microbiology, 42(1), 330-339. 1039

1040

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Thavasi, R., Jayalakshmi, S., & Banat, I. M. (2011). Application of 1041

biosurfactant produced from peanut oil cake by Lactobacillus 1042

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Van Hoogmoed, C. G., Dijkstra, R. J. B., Van der Mei, H. C., & 1046

Busscher, H. J. (2006). Influence of biosurfactant on interactive 1047

forces between mutans streptococci and enamel measured by 1048

atomic force microscopy. Journal of dental research, 85(1), 54-58. 1049

DOI: 10.1177/154405910608500109 1050

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Velraeds, M. M., Van de Belt-Gritter, B., Van der Mei, H. C., Reid, G., 1052

& Busscher, H. J. (1998). Interference in initial adhesion of 1053

uropathogenic bacteria and yeasts to silicone rubber by a 1054

Lactobacillus acidophilus biosurfactant. Journal of medical 1055

microbiology, 47(12), 1081-1085. DOI: 10.1099/00222615-47-12-1081 1056

1057

Velraeds, M. M., Van der Mei, H. C., Reid, G., & Busscher, H. J. 1058

(1996). Inhibition of initial adhesion of uropathogenic Enterococcus 1059

faecalis by biosurfactants from Lactobacillus isolates. Applied and 1060

environmental microbiology, 62(6), 1958-1963. 1061

1062

Vilela, S. F., Barbosa, J. O., Rossoni, R. D., Santos, J. D., Prata, M. 1063

C., Anbinder, A. L., Jorge, A. O. C. and Junqueira, J. C. (2015). 1064

66

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 inhibits biofilm formation by C. 1065

albicans and attenuates the experimental candidiasis in Galleria 1066

mellonella. Virulence, 6(1), 29-39. DOI: 1067

10.4161/21505594.2014.981486 1068

1069

Wang, F. J., Zhang, D., Liu, Z. H., Wu, W. X., Bai, H. H., and Dong, 1070

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Susceptibility of Vulvovaginal Candida Isolates in China. Chinese 1072

medical journal, 129(10), 1161. DOI: 10.4103/0366-6999.181964 1073

1074

Zhou, X., Brown, C. J., Abdo, Z., Davis, C. C., Hansmann, M. A., 1075

Joyce, P., Foster, J.A. & Forney, L. J. (2007). Differences in the 1076

composition of vaginal microbial communities found in healthy 1077

Caucasian and black women. The ISME journal, 1(2), 121-133. 1078

DOI:10.1038/ismej.2007.12 1079

1080

Zhou, X., Westman, R., Hickey, R., Hansmann, M. A., Kennedy, C., 1081

Osborn, T. W., and Forney, L. J. (2009). Vaginal microbiota of 1082

women with frequent vulvovaginal candidiasis. Infection and 1083

immunity, 77(9), 4130-4135. DOI: 10.1128/IAI.00436-09 1084

1085

1086

1087

1088

67

Tabela 1| Iniciadores utilizados na PCR multiplex para identificação 1089

das espécies de Candida, com suas respectivas sequências e 1090

tamanhos de amplicon. 1091

1092

Iniciadores Sequência Amplicon Referências

Gênero Candida

F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ R: 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’

Variável (500 – 874 pb)

Luo e Mitchell, 2002

CALB ½

F: 5’-TTTATCAACTTGTCACACCAGA-3’ R: 5’-ATCCCGCCTTACCACTACCG-3’

274 pb Luo e Mitchell, 2002

CGL ½

F: 5’-TTATCACACGACTCGACACT-3’ R: 5’-CCCACATACTGATATGGCCTACAA-3’

430 pb Luo e Mitchell, 2002

CPAR 3/2

F: 5’-GCCAGAGATTAAACTCAACCAA-3’ R: 5’-CCTATCCATTAGTTTATACTCCGC-3’

297 pb Luo e Mitchell, 2002

CTR ½

F: 5’-CAATCCTACCGCCAGAGGTTAT-3’ R: 5’-TGGCCACTAGCAAAATAAGCGT-3’

355 pb Luo e Mitchell, 2002

CKR 2/3

F: 5’-ACTACACTGCGTGAGCGGAA-3’ R: 5’-AAAAAGTCTAGTTCGCTCGG-3’

360 pb Bougnoux, 1999

1093

1094

1095

1096

1097

1098

1099

68

Tabela 2| Identificação dos micro-organismos isolados da microbiota vaginal de pacientes assintomáticas e 1100

sugestivas para CVV, atendidas em hospital da rede pública na cidade de São Luís – MA. 1101

AMOSTRA SITUAÇÃO

IDENTIFICAÇÃO

SITUAÇÃO CHROMagar

MULTIPLEX PCR

VITEK MALDI-TOF MS

SEQUENCIAMENTO (% identidade)

CVV C.C. CVV C. parap/glab C. glabrata C. glabrata

F.J.F. CVV C. parap/glab C. glabrata C. albicans

M.R.S.M. CVV C. albicans C. albicans C. albicans L. gasseri L. gasseri (100%)

C.M.L.S. CVV C. glabrata C. glabrata C. glabrata

E.O.S. CVV C. albicans C. albicans C. albicans

F.C.S.O. CVV C. glabrata C. glabrata C. glabrata

V.L.A.G. CVV C. albicans C. albicans C. albicans

C.A.S. CVV C. albicans C. albicans C. albicans

S.S. CVV L. gasseri NI

M.A.M. CVV L. gasseri NI

C.F.D.S. CVV C. glabrata C. glabrata C. glabrata L. vaginalis e

L. gasseri L. vaginalis (99%) e NI

J.P.A. CVV C. albicans C. albicans C. glabrata L. vaginalis L. vaginalis (100%)

M.R.S. CVV L. crispatus L. crispatus (100%)

A.G.V. CVV L. crispatus L. paracasei/L. casei

(99%)

ASSÍNTOMÁTICAS M.L.B.P. SAUDÁVEL L. crispatus NI

M.J.N.O.P. SAUDÁVEL C. parap/glab C. glabrata C. glabrata L. gasseri L. paracasei/L. casei

(100%)

E.J.L.M. SAUDÁVEL L. vaginalis L. vaginalis (99%)

V.L.F.A.c SAUDÁVEL C. albicans C. albicans C. albicans L. rhamnosus L. rhamnosus (100%)

M.P.D.O. SAUDÁVEL L. paracasei L. paracasei/L. casei

(100%)

N.M.M. SAUDÁVEL C. albicans C. albicans C. albicans

M.M.F.A. SAUDÁVEL L. gasseri L. gasseri (100%)

G.J.F.D. SAUDÁVEL C. glabrata C. krusei C. krusei

R.C.L. SAUDÁVEL C. glabrata C. parapsilosis C. parapsilosis

N.S.C. SAUDÁVEL L. gasseri NI

L.M.S. SAUDÁVEL C. albicans C. albicans C. albicans

Legenda: CVV – Sugestivo para candidíase vulvovaginal; NI – não identificado 1102

69

Tabela 3| Ensaio de antagonismo entre Lactobacillus spp e C. albicans, com valores referentes aos diâmetros dos 1103

halos de inibição seguido do desvio-padrão. 1104

Lactobacillus Amostras de Candida albicans

CV2a CV 25

c CV8

bc CV14

bc CV12

bc CV9

c CV13

abc CV21

ab

L. acidophilus ATCC 4356abc

21,5 ± 2,12 19,5 ± 0,70 16 ± 0 15,5 ± 6,36 21,5 ± 2,12 13 ± 1,41 17 ± 2,82 15,5 ± 0,70

L. debrueckii ATCC 9645d - 11,5 ± 0,70 - 13 ± 1,41 - - - -

L. fermentum ATCC 23271cd

17 ± 1,41 14,5 ± 3,53 16 ± 1,41 12 ± 1,41 - 13 ± 0 15 ± 4,24 12,5 ± 0,70

L. rhamnosus ATCC 9595a 22,5 ± 0,70 19,5 ± 0,70 20 ± 0 19,5 ± 0,70 21 ± 4,24 18,5 ± 0,70 20 ± 0 25 ± 7,07

L. paracasei ATCC 335abc

28,5 ± 2,12 16 ± 1,41 17,5 ± 0,70 17,5 ± 3,53 - 15 ± 5,65 17,5 ± 0,70 15,5 ± 0,70

L. vaginalis LV21bcd

18,5 ± 2,12 14,5 ± 2,12 - 15,5 ± 2,12 12,5 ± 0,70 13,5 ± 3,53 15,5 ± 0,70 15,5 ± 0,70

L. paracasei LV11ab

26 ± 1,41 16 ± 1,41 19,5 ± 0,70 21,5 ± 4,94 13,5 ± 3,53 18,5 ± 2,12 17 ± 8,48 19,5 ± 2,12

L. crispatus LV1d 15,5 ± 0,70 - - 14 ± 1,41 10,5 ± 0,70 - - -

L. crispatus LV23d - 11 ± 0 13 ± 1,41 - - 11,5 ± 0,70 - -

L. paracasei LV24bcd

9,5 ± 0,70 11 ± 0 13 ± 1,41 13,5 ± 0,70 15 ± 0 11 ± 1,41 - -

L. gasseri LV16abc

- 11,5 ± 0,70 15,5 ± 0,70 13,5 ± 0,70 - - 20,5 ± 2,12 16 ± 0

L. vaginalis CV7cd

- 16,5 ± 4,94 16 ± 1,41 20 ± 0 19,5 ± 2,12 16 ± 0 22,5 ± 3,53 17 ± 1,41

L. paracasei LV4d - 13,5 ± 0,70 12,5 ± 0,70 14 ± 1,41 - 16 ± 1,41 14 ± 1,41 -

L. gasseri LV22d - - - - - - 12,5 ± 0,70 -

L. vaginalis LV191d 10 ± 0 - 12 ± 1,41 - - 12,5 ± 0,70 11 ± 0 -

L. gasseri LV192 - - - - - - - -

L. gasseri LV17d - - - - 13 ± 0 - - -

a,b,c,d Letras diferentes significa p < 0,05 1105

70

CV8

CV25

CV21

CV13

CV9

CV12

CV14

CV2

0

1

2

3

4

***

Amostras de Candida albicans

O.D

.5

50

nm

Figura 1| Quantificação da biomassa de biofilme das amostras de C.

albicans, após o período de 48h.

71

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020L. gasseri LV17

L. paracasei LV11

L. crispatus LV1

L. acidophilus ATCC 4356

L. debrueckii ATCC 9645

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

12h 24h 36h 48h

Tempo

Peso

seco

(g

)

0

5

10

15L. gasseri LV17

L. paracasei LV11

L. crispatus LV1

L. acidophilus ATCC 4356

L. debrueckii ATCC 9645

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

12h 24h 36h 48h

Tempo

OD

64

0n

m

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8L. gasseri LV17

L. paracasei LV11

L. crispatus LV1

L. acidophilus ATCC 4356

L. debrueckii ATCC 9645

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

12h 24h 36h 48h

Tempo

Diâ

metr

o d

a g

ota

(m

m)

(A)

(B)

(C)

Figura 2| Avaliação do crescimento dos Lactobacillus produtores de

biossurfactante por meio de mensuração do peso seco (A), OD de

inóculo diluído 15 vezes (B) e produção de biossurfactante por meio

do teste do diâmetro da gota (C), durante o período de 48h em

intervalos de 12h.

72

L. gas

seri L

V17

L. par

acas

ei L

V11

L. crisp

atus

LV1

L. aci

dophilus

ATC

C 4

356

L. deb

ruec

kii A

TCC 9

645

L. rham

nosus

ATC

C 9

595

L. fer

men

tum

ATC

C 2

3271

0

10

20

30

40

50

60

70 12h

24h

36h

48h

Biossurfactantes

E24 (

%)

L. gas

seri L

V17

L. par

acas

ei L

V11

L. crisp

atus

LV1

L. aci

dophilus

ATC

C 4

356

L. deb

ruec

kii A

TCC 9

645

L. rham

nosus

ATC

C 9

595

L. fer

men

tum

ATC

C 2

3271

0

10

20

30

40

50

60

70 12h

24h

36h

48h

Biossurfactantes

E24 (

%)

(B)

(A)

Figura 3| Avaliação da produção de biossurfactante por meio da

atividade emulsificante, mensuradas em após 24h, em dois

solventes: hexano (A) e tolueno (B).

73

CV25

CV21

CV8

0

1

2

3L. acidophilus ATCC 4356

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

L. debrueckii ATCC 9645

L. gasseri LV17

L. crispatus LV1

L. paracasei LV11

S/BS

*

**

Linhagens de Candida albicans

O.D

.5

50

nm

*

Figura 4| Ensaio de interferência do biossurfactante na adesão de

Candida albicans.

74

CV25

CV21

CV8

0

1

2

3

4L. acidophilus ATCC 4356

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

L. debrueckii ATCC 9645

L. gasseri LV17

L. crispatus LV1

L. paracasei LV11

S/BS

* *

Linhagens de Candida albicans

O.D

.5

50

nm

CV25

CV21

CV8

0

2

4

6L. acidophilus ATCC 4356

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

L. debrueckii ATCC 9645

L. gasseri LV17

L. crispatus LV1

L. paracasei LV11

S/BS

*

*

*

Linhagens de Candida albicans

O.D

.5

50

nm

(A)

(B)

Figura 5| Ensaio de interferência do biossurfactante no processo de

formação de biofilme, realizado através do experimento de co-

incubação (A) e pré-incubação (B).

75

C-

C+

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

0

50

100

150

200L. acidophilus ATCC 4356

L. debrueckii ATCC 9645

L. rhamnosus ATCC 9595

L. fermentum ATCC 23271

* *

*

Fatores de diluição

Via

bil

idad

e c

elu

lar

(%)

C-

C+

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

0

50

100

150

200L. gasseri LV17

L. crispatus LV1

L. paracasei LV11

*

Fatores de diluição

Via

bil

idad

e c

elu

lar

(%)

(A)

(B)

Figura 6| Ensaio utilizando Alamar Blue para verificar a

citotoxicidade dos biossurfactantes produzidos por linhagens de

referência (A) e isolados da cavidade vaginal (B).

Anexos

Regras para publicação na revista: Frontiers in Microbiology

Title

The title is written in title case, centered, and in 16 point bold Times

New Roman font at the top of page.

The title should be concise, omitting terms that are implicit and,

where possible, be a statement of the main result or conclusion

presented in the manuscript. Abbreviations should be avoided within

the title.

Witty or creative titles are welcome, but only if relevant and within

measure. Consider if a title meant to be thought-provoking might be

misinterpreted as offensive or alarming. In extreme cases, the

editorial office may veto a title and propose an alternative.

Authors should try to avoid, if possible:

Titles that are a mere question without giving the answer.

Unambitious titles, for example starting with "Towards", "A

description of", "A characterization of", "Preliminary study on".

Vague titles, for example starting with "Role of...", "Link between...",

"Effect of..." that do not specify the role, link, or effect.

Include terms that are out of place, for example the taxonomic

affiliation apart from species name.

Authors and Affiliations

All names are listed together and separated by commas. Provide

exact and correct author names as these will be indexed in official

archives. Affiliations should be keyed to the author's name with

superscript numbers and be listed as follows: Laboratory, Institute,

Department, Organization, City, State abbreviation (USA, Canada,

Australia), and Country (without detailed address information such as

city zip codes or street names).

Example: Max Maximus, Department of Excellence, International

University of Science, New York, NY, USA.

The Corresponding Author(s) should be marked with an asterisk.

Provide the exact contact email address of the corresponding

author(s) in a separate section.

Correspondence:

Max Maximus

maximus@gmail.com

If any authors wish to include a change of address, list the present

address(es) below the correspondence details using a unique

superscript symbol keyed to the author(s) in the author list.

Headings and Sub-headings

Except for special names (e.g. GABAergic), capitalize only the first

letter of headings and subheadings. Headings and subheadings

need to be defined in Times New Roman, 12, bold. You may insert

up to 5 heading levels into your manuscript (not more than for

example: 3.2.2.1.2 Heading title).

Abstract

As a primary goal, the abstract should render the general

significance and conceptual advance of the work clearly accessible

to a broad readership. In the abstract, minimize the use of

abbreviations and do not cite references. The text of the abstract

section should be in 12 point normal Times New Roman. See

Summary Table for abstract requirement and length according to

article type.

For Clinical Trial article types, please include the Unique Identifier

and the URL of the publicly accessible website on which the trial is

registered.

Keywords

All article types: you may provide up to 8 keywords; at least 5 are

mandatory.

Text

The body text is in 12 point normal Times New Roman. New

paragraphs will be separated with a single empty line. The entire

document should be single-spaced and should contain page and line

numbers in order to facilitate the review process. Your manuscript

should be written using either LaTeX or MS-Word.

Nomenclature

The use of abbreviations should be kept to a minimum. Non-standard

abbreviations should be avoided unless they appear at least four

times, and defined upon first use in the main text. Consider also

giving a list of non-standard abbreviations at the end, immediately

before the Acknowledgments.

Equations should be inserted in editable format from the equation

editor.

Gene symbols should be italicized; protein products are not italicized.

Chemical compounds and biomolecules should be referred to using

systematic nomenclature, preferably using the recommendations by

IUPAC.

We encourage the use of Standard International Units in all

manuscripts.

Life Science Identifiers (LSIDs) for ZOOBANK registered names or

nomenclatural acts should be listed in the manuscript before the

keywords. An LSID is represented as a uniform resource name

(URN) with the following format:

urn:lsid:::[:]

For more information on LSIDs please see Inclusion of Zoological

Nomenclature section

Sections

Your manuscript is organized by headings and subheadings. For

Original Research Articles, Clinical Trial Articles, and Technology

Reports the section headings should be those appropriate for your

field and the research itself.

For Original Research Articles, it is recommended to organize your

manuscript in the following sections or their equivalents for your field:

Introduction

Succinct, with no subheadings.

Material and Methods

This section may be divided by subheadings. This section should

contain sufficient detail so that when read in conjunction with cited

references, all procedures can be repeated. For experiments

reporting results on animal or human subject research, an ethics

approval statement should be included in this section (for further

information, see here)

Results

This section may be divided by subheadings. Footnotes should not

be used and have to be transferred into the main text.

Discussion

This section may be divided by subheadings. Discussions should

cover the key findings of the study: discuss any prior art related to

the subject so to place the novelty of the discovery in the appropriate

context; discuss the potential short-comings and limitations on their

interpretations; discuss their integration into the current

understanding of the problem and how this advances the current

views; speculate on the future direction of the research and freely

postulate theories that could be tested in the future.

For further information, please see Additional Requirements for

specific article types including Focused Reviews, General

Commentaries, Case Reports and Data Reports amongst others or

you can check the descriptions defined in the journal’s "Article

Types", which can be seen from the "For Authors" menu on any

Frontiers journal page.

Conflict of Interest Statement

Frontiers follows the recommendations by the International

Committee of Medical Journal Editors

(http://www.icmje.org/recommendations/browse/roles-and-

responsibilities/author-responsibilities--conflicts-of-interest.html)

which require that all financial, commercial or other relationships that

might be perceived by the academic community as representing a

potential conflict of interest must be disclosed. If no such relationship

exists, authors will be asked to declare that the research was

conducted in the absence of any commercial or financial

relationships that could be construed as a potential conflict of

interest. When disclosing the potential conflict of interest, the authors

need to address the following points:

Did you or your institution at any time receive payment or services

from a third party for any aspect of the submitted work?

Please declare financial relationships with entities that could be

perceived to influence, or that give the appearance of potentially

influencing, what you wrote in the submitted work.

Please declare patents and copyrights, whether pending, issued,

licensed and/or receiving royalties relevant to the work.

Please state other relationships or activities that readers could

perceive to have influenced, or that give the appearance of

potentially influencing, what you wrote in the submitted work.

References

All citations in the text, figures or tables must be in the reference list

and vice-versa. The references should only include articles that are

published or accepted. Data sets that have been deposited to an

online repository should be included in the reference list, include the

version and unique identifier when available. For accepted but

unpublished works use "in press" instead of page numbers.

Unpublished data, submitted manuscripts, or personal

communications should be cited within the text only, for the article

types that allow such inclusions. Personal communications should be

documented by a letter of permission. Website urls should be

included as footnotes. Any inclusion of verbatim text must be

contained in quotation marks and clearly reference the original

source.

The following formatting styles are meant as a guide, as long as the

full citation is complete and clear, Frontiers referencing style will be

applied during typesetting.

SCIENCE, ENGINEERING, and HUMANITIES: For articles

submitted in the domains of SCIENCE, ENGINEERING and

HUMANITIES please apply Author-Year system for in-text citations.

Reference list: provide the names of the first six authors followed by

et al and doi when available.

In-text citations should be called according to the surname of the first

author, followed by the year. For works by 2 authors include both

surnames, followed by the year. For works by more than 2 authors

include only the surname of the first author, followed by et al.,

followed by the year. For Humanities and Social Sciences articles

please include page numbers in the in-text citations.

Article in a print journal:

Sondheimer, N., and Lindquist, S. (2000). Rnq1: an epigenetic

modifier of protein function in yeast. Mol. Cell. 5, 163-172.

Article in an online journal:

Tahimic, C.G.T., Wang, Y., Bikle, D.D. (2013). Anabolic effects of

IGF-1 signaling on the skeleton. Front. Endocrinol. 4:6. doi:

10.3389/fendo.2013.00006

Article or chapter in a book:

Sorenson, P. W., and Caprio, J. C. (1998). "Chemoreception," in The

Physiology of Fishes, ed. D. H. Evans (Boca Raton, FL: CRC Press),

375-405.

Book:

Cowan, W. M., Jessell, T. M., and Zipursky, S. L. (1997). Molecular

and Cellular Approaches to Neural Development. New York: Oxford

University Press.

Abstract:

Hendricks, J., Applebaum, R., and Kunkel, S. (2010). A world apart?

Bridging the gap between theory and applied social gerontology.

Gerontologist 50, 284-293. Abstract retrieved from Abstracts in

Social Gerontology database. (Accession No. 50360869)

Patent:

Marshall, S. P. (2000). Method and apparatus for eye tracking and

monitoring pupil dilation to evaluate cognitive activity. U.S. Patent No

6,090,051. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

Data:

Perdiguero P, Venturas M, Cervera MT, Gil L, Collada C. Data from:

Massive sequencing of Ulms minor's transcriptome provides new

molecular tools for a genus under the constant threat of Dutch elm

disease. Dryad Digital Repository. (2015)

http://dx.doi.org/10.5061/dryad.ps837

Theses and Dissertations:

Smith, J. (2008) Post-structuralist discourse relative to

phenomological pursuits in the deconstructivist arena.

[dissertation/master’s thesis]. [Chicago (IL)]: University of Chicago

For examples of citing other documents and general questions

regarding reference style, please refer to the Chicago Manual of

Style.

Frontiers Science Endnote Style

Frontiers Science, Engineering and Humanities Bibstyle

HEALTH, PHYSICS AND MATHEMATICS: For articles submitted in

the domain of HEALTH or the journal Frontiers in Physics and

Frontiers in Applied Mathematics and Statistics please apply the

Vancouver system for in-text citations.

Reference list: provide the names of the first six authors followed by

et al and doi when available.

In-text citations should be numbered consecutively in order of

appearance in the text – identified by Arabic numerals in the

parenthesis for Health articles, and in square brackets for Physics

and Mathematics articles.

Article in a print journal:

Sondheimer N, Lindquist S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein

function in yeast. Mol Cell (2000) 5:163-72.

Article in an online journal:

Tahimic CGT, Wang Y, Bikle DD. Anabolic effects of IGF-1 signaling

on the skeleton. Front Endocrinol (2013) 4:6. doi:

10.3389/fendo.2013.00006

Article or chapter in a book:

Sorenson PW, Caprio JC. "Chemoreception,". In: Evans DH, editor.

The Physiology of Fishes. Boca Raton, FL: CRC Press (1998). p.

375-405.

Book:

Cowan WM, Jessell TM, Zipursky SL. Molecular and Cellular

Approaches to Neural Development. New York: Oxford University

Press (1997). 345 p.

Abstract:

Christensen S, Oppacher F. An analysis of Koza's computational

effort statistic for genetic programming. In: Foster JA, editor. Genetic

Programming. EuroGP 2002: Proceedings of the 5th European

Conference on Genetic Programming; 2002 Apr 3–5; Kinsdale,

Ireland. Berlin: Springer (2002). p. 182–91.

Patent:

Pagedas AC, inventor; Ancel Surgical R&D Inc., assignee. Flexible

Endoscopic Grasping and Cutting Device and Positioning Tool

Assembly. United States patent US 20020103498 (2002).

Data:

Perdiguero P, Venturas M, Cervera MT, Gil L, Collada C. Data from:

Massive sequencing of Ulms minor's transcriptome provides new

molecular tools for a genus under the constant threat of Dutch elm

disease. Dryad Digital Repository. (2015)

http://dx.doi.org/10.5061/dryad.ps837

Theses and Dissertations:

Smith, J. (2008) Post-structuralist discourse relative to

phenomological pursuits in the deconstructivist arena.

[dissertation/master’s thesis]. [Chicago (IL)]: University of Chicago

For examples of citing other documents and general questions

regarding reference style, please refer to Citing Medicine.

Frontiers Health Endnote Style

Frontiers Health and Physics Bibstyle

Supplementary Material

Frontiers journals do not support pushing important results and

information into supplementary sections. However, data that are not

of primary importance to the text, or which cannot be included in the

article because it is too large or the current format does not permit it

(such as movies, raw data traces, power point presentations, etc.)

can be uploaded during the submission procedure and will be

displayed along with the published article.

The Supplementary Material can be uploaded as Data Sheet (word,

excel, csv, cdx, fasta, pdf or zip files), Presentation (power point, pdf

or zip files), Supplementary Image (cdx, eps, jpeg, pdf, png or tif),

Supplementary Table (word, excel, csv or pdf), Audio (mp3, wav or

wma) or Video (avi, divx, flv, mov, mp4, mpeg, mpg or wmv).

Supplementary material is not typeset so please ensure that all

information is clearly presented, the appropriate caption is included in

the file and not in the manuscript, and that the style conforms to the

rest of the article. For Supplementary Material templates (LaTex and

Word) see Supplementary Material for Frontiers.

Studies involving human subjects

Frontiers endorses the Helsinki declaration and the guidelines of the

International Committee of Medical Journal Editors. Studies involving

human participants must be performed in accordance with relevant

institutional and national guidelines, with the appropriate institutional

ethics committee's approval and informed written consent from all

human subjects involved in the study. For manuscripts reporting

studies involving human subjects, authors must clearly state the

relevant ethics committee approving the study and confirm that study

subjects have granted their written informed consent. Manuscripts

reporting clinical trial data need to include the name of the public

registry under which the clinical trial has been registered, and the

number of the trial. For most article types, the information should

appear in the Materials and Methods section.

For example: This study was carried out in accordance with the

recommendations of 'name of guidelines, name of committee' with

written informed consent from all subjects. All subjects gave written

informed consent in accordance with the Declaration of Helsinki.

Should the study be exempt from this requirement, authors need to

clearly state the reasons in the cover letter and manuscript. For

incompetent patients (e.g. young children, unconscious patients)

some form of consent, such as from family members, is needed.

4. Figure and Table Guidelines

General Style Guidelines for Figures

The maximum number of figures and tables for all article types are

shown in the Summary Table. Frontiers requires figures to be

submitted individually, in the same order as they are referred to in the

manuscript, the figures will then be automatically embedded at the

end of the submitted manuscript. Kindly ensure that each table and

figure is mentioned in the text and in numerical order.

For graphs, there must be a self-explanatory label (including units)

along each axis. For figures with more than one panel, panels should

be clearly indicated using labels (A), (B), (C), (D), etc. However, do

not embed the part labels over any part of the image, these labels

will be added during typesetting according to Frontiers journal style.

Please note that figures which are not according to the guidelines will

cause substantial delay during the production process.

Permission must be obtained for use of copyrighted material from

other sources (including re-published/adapted/modified/partial figures

and images from the internet). It is the responsibility of the authors to

acquire the licenses, to follow any citation instructions requested by

third-party rights holders, and cover any supplementary charges.

Frontiers takes concerns regarding image manipulation seriously. We

request that no individual features within an image are modified (eg.

enhanced, obscured, moved, removed or added). Where images are

grouped together, for example, parts of gels are lined up, this must

be clearly explained in the figure or in the figure text. Any change in

brightness, contrast or color balance must be applied to every pixel in

the image and the changes should not alter the information illustrated

in the figure. Any concerns raised will be investigated and the

authors will be asked to provide the original images.

General Style Guidelines for Tables

Tables should be inserted at the end of the manuscript. If you use a

word processor, build your table in word. If you use a LaTeX

processor, build your table in LaTeX. An empty line should be left

before and after the table.

Please note that large tables covering several pages cannot be

included in the final PDF for formatting reasons. These tables will be

published as supplementary material on the online article abstract

page at the time of acceptance. The author will notified during the

typesetting of the final article if this is the case. A link in the final PDF

will direct to the online material.

Figure and Table Legends

Figure and table legends are required to have the same font as the

main text (12 point normal Times New Roman, single spaced).

Legends should be preceded by the appropriate label, for example

"Figure 1" or "Table 4". Figure legends should be placed at the end

of the manuscript (for supplementary images you must include the

caption with the figure, uploaded as a separate file). Table legends

must be placed immediately before the table. Please use only a

single paragraph for the legend. Figure panels are referred to by bold

capital letters in brackets: (A), (B), (C), (D), etc.

Image Size

Figure images should be prepared with the PDF layout in mind,

individual figures should not be longer than one page and with a

width that corresponds to 1 column or 2 columns.

All articles are prepared using the 2 column layout: 2 column articles

can contain images 85 mm or 180 mm wide.

Format

The following formats are accepted:

TIFF (.tif) TIFF files should be saved using LZW compression or any

other non-lossy compression method.

JPEG (.jpg)

EPS (.eps) EPS files can be uploaded upon acceptance

Color Image Mode

Images must be submitted in the color mode RGB.

Resolution Requirements

All images must be uploaded separately in the submission procedure

and have a resolution of 300 dpi at final size. Check the resolution of

your figure by enlarging it to 150%. If the resolution is too low, the

image will appear blurry, jagged or have a stair-stepped effect.

Please note saving a figure directly as an image file (JPEG, TIF) can

greatly affect the resolution of your image. To avoid this, one option

is to export the file as PDF, then convert into TIFF or EPS using a

graphics software. EPS files can be uploaded upon acceptance.