Elucidarea structurii proteinelor a reprezentat si continua sa reprezinte una din problemele principale ale biochimiei aplicate. Fiecare proteina nativa reprezinta un edificiu tridimensional complex a carui conformatie depinde de dispozitia spatiala a catenelor polipeptidice din care este formata. Orientarea în spatiu a catenelor polipeptidice componente poarta denumirea de conformatie.

Comparativ cu celelalte biomolecule, proteinele prezinta o structura chimica mult mai complexa de care depind în mod direct functiile lor biologice si care se caracterizeaza prin existenta a patru nivele de organizare numite structura primara, secundara, tertiara si respectiv cuaternara.

I.4.1. Structura primara a proteinelor

 Este data de numarul, natura si succesiunea resturilor de aminoacizi în catenele polipeptidice ce intra în structura acestora.

În structura primara, resturile de aminoacizi sunt unite prin legaturi peptidice identice cu cele întâlnite în structura peptidelor:

Studiul peptidelor sintetice cu ajutorul metodei difractiei de raze X prin cristale pure a permis determinarea distantelor interatomice într-o catena polipeptidica, precum si a unghiurilor dintre atomii componenti. Aceste determinari au demonstrat existenta unei perioade de identitate de 7,2Å pentru fiecare doua resturi de aminoacizi. Totodata s-a observat ca distanta interatomica C - N este mai mica, iar distanta C = O este mai mare decât cele normal întâlnite în alti compusi.

Fig.1. Reprezentarea schematica a distantelor  interatomice si unghiurilor de  valenta în catenele polipeptidice

Aceste rezultate indica prezenta unei stari de rezonanta a legaturii peptidice între doua forme limita:

Forma reala va fi deci cea intermediara între cele doua forme limita instabile:

 Aceasta înseamna ca legatura peptidica C - N nu este simpla ci partial dubla, fiind astfel împiedicata rotatia libera a substituentilor. Acest caracter de legatura partial dubla are o importanta deosebita pentru structurile de ordin superior ale proteinelor.

La nivelul legaturilor peptidice se întâlneste izomeria de tip trans, iar rotatia libera este permisa numai la nivelul celorlalte legaturi covalente. Orientarea spatiala a

catenelor polipeptidice este datorata, în principal, acestor rotatii libere în jurul legaturilor mentionate: 13513e48n

Proteinele formate din mai multe catene polipeptidice se numesc proteine oligomere, iar polipeptidele componente se numesc protomeri). Protomerii se unesc într-o molecula oligomera prin legaturi covalente, dar nu de natura peptidica. Cel mai adesea, protomerii se leaga prin punti disulfidice intercatenare, adica realizate de resturi de cisteina localizate în catene polipeptidice diferite.

Prima proteina careia i s-a determinat structura primara (în 1955) a fost insulina care are o masa moleculara de 6.000 Da. Câtiva ani mai târziu s-a stabilit structura primara a ribonucleazei (M = 13.000 Da), iar în prezent sunt cunoscute structurile primare ale multor proteine cu mase moleculare mult mai mari si care sunt formate din sute sau chiar mii de resturi de aminoacizi.

Molecula insulinei contine doua catene polipeptidice: catena A cu 21 resturi de aminoacizi ce contine o punte disulfidica intracatenara formata de resturile Cys6 si Cys11 si catena B alcatuita din 30 resturi de aminoacizi. Cele doua catene polipeptidice sunt legate între ele prin doua punti disulfidice formate de resturile de cisteina A7 - B7 si respectiv A20 - B19:

Puntea disulfidica intracatenara din catena A este deosebit de importanta deoarece secventa aminoacizilor din bucla formata de aceasta reaminteste succesiunea resturilor de aminoacizi din ocitocina si vasopresina. Aminoacizii din pozitiile 8, 9 si 10 ale catenei A (Thr, Ser si Ile) sunt esentiali pentru caracterizarea insulinelor de la diferite specii:

                                     insulina de bou:   ..- Ala - Ser - Val - ..

                                    insulina de oaie:  ..- Ala - Gly - Val - ..

                                    insulina de cal:    ..- Thr - Gly - Ile - ..

                                    insulina de om:   ..- Thr - Ser - Ile - ..

În urma unor experimente cu aminoacizi marcati radioactiv s-a demonstrat ca insulina este sintetizata în insulele Langerhans ale pancreasului sub forma unui precursor cu o masa moleculara mai mare decât cea a insulinei, acesta fiind denumit proinsulina. Molecula proinsulinei este formata dintr-o singura catena polipeptidica ce contine 84 resturi de aminoacizi si are o masa moleculara de 9.000 Da. În aceasta catena se regasesc catenele A si B ale insulinei si un fragment peptidic C care difera de la o specia la alta Pentru insulina umana si cea specifica altor mamifere este cunoscuta structura primara.

Fig. 2. Reprezentarea schematica a punctelor de clivare în catena polipeptidica a proinsulinei, în procesul conversiei acesteea în insulina

Studiile asupra structurii si proprietatilor insulinelor din diferite surse biologice au fost justificate de importanta acestui hormon pentru practica medicala în tratamentul diabetului zaharat.

Un exemplu semnificativ în sprijinul afirmatiei ca structura primara a proteinelor este esentiala pentru asigurarea proprietatilor lor biologice îl constituie hormonul β-lipotrop sau lipotropina. El a fost izolat prima data în 1965 din hipofiza de oaie, dovedindu-se a fi o polipeptida alcatuita din 90 resturi de aminoacizi. Ulterior, s-a izolat

din hipofiza de bou, porc si berbec un hormon de natura polipeptidica ce a fost denumit lipotropina, remarcându-se apoi ca preparatele hormonale izolate din diferite surse nu se deosebesc între ele structural si functional. Structura primara a acestui hormon a fost descifrata în 1968 dupa purificarea sa prin cromatografie pe coloana cu CM-celuloza.

Fig. 3. Reprezentarea schematica a structurii primare a insulinei umane (Kucerenko, N.E. - 1988)

I.4.2. Structura secundara a proteinelor.

Modelul helicoidal. Studiul proteinelor fibrilare din clasa scleroproteinelor prin metoda difractiei razelor X a evidentiat faptul ca acestea se caracterizeaza prin prezenta unor regularitati structurale ale moleculei, prin unitati care se repeta si care sunt dispuse de-a lungul unui ax imaginar al moleculei.

 Aceste regularitati în structura moleculei au fost numite perioade de identitate si ele difera de la o proteina la alta.

În functie de marimea perioadelor lor de identitate, proteinele se împart în 3 grupe:

- grupa α-keratinei, miozinei si fibrinogenului

- grupa α-keratinei si fibroinei

- grupa colagenului

Efectuând experimente pe cristale peptidice, Pauling si Corey au stabilit cu rigurozitate conditiile formarii catenelor polipeptidice si au constituit modele experimentale care sa ilustreze modul în care catenele polipeptidice sunt orientate în spatiu în functie de natura si numarul legaturilor peptidice, precum si de dimensiunile lor. Autorii au stabilit de asemenea, urmatoarele criterii care stau la baza formarii catenelor polipeptidice:

- aminoacizii constituenti trebuie sa prezinte configuratie L si au în structura proteinelor aceeasi valoare, deoarece catenele lor laterale nu influenteaza structura secundara;

- distantele interatomice si unghiurile de valenta trebuie sa prezinte aceleasi valori, indiferent de marimea catenei polipeptidice;

- atomii participanti la legatura peptidica trebuie sa fie coplanari, aceasta asezare fiind favorizata energetic;

- modelul experimental elaborat pe baza datelor de laborator trebuie sa permita formarea unui numar maxim posibil de legaturi de hidrogen.

Pe baza acestor postulate, Pauling si Corey gasesc ca cel mai simplu aranjament corespunzator acestor cerinte este modelul helicoidal sau spiralat, denumit α-helix. Acesta rezulta prin spiralizarea catenei polipeptidice în jurul unui cilindru imaginar.

În functie de directia de spiralizare, α-helixul poate sa apara teoretic sub doua forme:

- α-helixul de dreapta are sensul unui surub cu pasul spre dreapta;

- α-helixul de stânga are sensul unui surub cu pasul spre stânga.

Fig. 4. Reprezentarea schematica a modelului α-helicoidal al structurii secundare a proteinelor (Lentner,C. - 1986)

-helixului si pot interactiona între ele sau cu solventul în care este dizolvata proteina.Catenele laterale ale resturilor de aminoacizi ies în afara corpului propriu-zis al

-helixului.Dintre toti aminoacizii proteinogeni, prolina, hidroxiprolina si chiar glicocolul nu se încadreaza perfect în α-helix, determinând o deranjare a structurii regulate a

Aceasta structura helicoidala a macromoleculelor proteice a fost postulata cu 16 ani înaintea lui Pauling si Corey de catre biochimistul român Haralamb Vasiliu.

Aceasta asezare spatiala, care confera moleculei o arhitectura structurala speciala, este mentinuta datorita formarii unui mare numar de punti de hidrogen intracatenare la care participa oxigenul carbonilic din vecinatatea unei legaturi peptidice si hidrogenul iminic din vecinatatea alteia, situata la o distanta de 4 resturi de aminoacizi. Aceste punti de hidrogen sunt aproape paralele cu axul moleculei, iar într-o spira intra 3,6 resturi de aminoacizi.

Distanta dintre doua spire succesive este de 5,41 Å, iar diametrul lor este de 0,101 Å. Dupa un interval al α-helixului care cuprinde 18 resturi de aminoacizi, adica 27 Å, α-helixul este superpozabil, adica se repeta identic dupa fiecare 5 spire. Acest interval reprezinta asa-numita perioada mare de identitate (perioada mica de identitate fiind reprezentata de secventa - NH - CH - CO -).

Modelul helicoidal a fost apoi confirmat experimental si reprezinta una din variantele structurii secundare a proteinelor. Multe date experimentale demonstreaza însa faptul ca proteinele native nu prezinta o structura secundara total sau perfect spiralata. Cele mai multe proteine prezinta o organizare structurala partial helicoidala, în sensul ca regiuni cu structura de α-helix pot alterna cu regiuni ce prezinta alt tip de structura secundara. Procentul de α-helix în structura proteinelor oscileaza între 0 - 10% în cazeina, actina si α-globulina, între 10 - 20% în ribonucleaza, între 20 - 30% la pepsina si histone, între 30 - 45% la ovalbumina, muramidaza si fibrinogen, între 60 - 80% la mioglobina si hemoglobina si respectiv între 80 - 100% în tropomiozina.

Modelul straturilor pliate. Datorita structurii lor chimice, prolina si hidroxiprolina nu se înscriu în structura α-helicoidala. Acesti doi aminoacizi heterociclici, dar si glicocolul, tind sa confere catenelor polipeptidice un alt tip de structura secundara, denumita α-conformatie, care corespunde modelului straturilor pliate.

Conform acestui model, doua sau mai multe catene polipeptidice, sau fragmente ale aceleiasi catene se orienteaza spatial sub forma pliata, în zig-zag.

Modelul straturilor pliate se poate prezenta în doua variante:

- modelul straturilor pliate paralele (caracteristic de exemplu pentru β-keratina) se întâlneste atunci când la o extremitate a moleculei sunt orientate capetele C-terminale, iar la cealalta capetele N-terminale ale catenelor polipeptidice;

Fig. 5. Reprezentarea schematica a modelului straturilor β-pliate ale structurii secundare a proteinelor

- modelul straturilor pliate antiparalele (întâlnit de exemplu la fibroina) se caracterizeaza prin faptul ca la ambele extremitati ale moleculei capetele C-terminale ale catenelor polipeptidice alterneaza cu cele N-terminale. În mod automat, atunci când structura β-pliata este formata de diferite fragmente ale aceleiasi catene polipeptidice, aceasta va fi de tip antiparalel.

Structura β-pliata este stabilizata de punti de hidrogen care se formeaza în mod similar ca în cazul structurii helicoidale, dar care sunt intercatenare si perpendiculare pe axul moleculei. Daca la α-helix radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi sunt orientati spre exterior, în structura β-pliata ei se orienteaza de o parte si de alta a planului legaturii peptidice, perpendicular pe acesta.

De regula, punctele de trecere de la fragmentele helicoidale la cele pliate si invers sunt reprezentate de resturile de prolina si hidroxiprolina si uneori de cele de glicina.

- Modelul tropocolagenului. Structurile α-helicoidala si β-pliata sunt caracteristice marii majoritati a proteinelor. Exista însa unele proteine, dintre care cea mai importanta este colagenul, care prezinta o structura secundara caracteristica ce a fost denumita modelul structural al colagenului. Studiile de difractie a razelor X indica în colagen o structura secundara cu o perioada de identitate de 2,86 Å, paralela cu axul fibrei.

Ponderea mare a resturilor de prolina si hidroxiprolina (pâna la 25%) din molecula colagenului fac imposibila structura helicoidala sau pliata, acesti aminoacizi formând un numar mic de punti de hidrogen. Molecula colagenului este alcatuita din 3 catene polipeptidice, fiecare având o masa moleculara de 95.000 Da si câte 1.000 resturi de aminoacizi. Cele 3 catene ale colagenului sunt strâns legate între ele prin punti de hidrogen, dând nasteretropocolagenului (fig. 6).

Fig. 6. Reprezentarea schematica a modelului structural al tropocolagenului (Lentner, C. - 1986)