Struktur, Funktion und Regulation der Plasmamembran V ...nbn:de:gbv:... · Struktur, Funktion und Regulation der ... Einfluß von Ca-ADP, Mg-ADP und Pi auf die Hydrolyse von ATP durch

Struktur, Funktion und Regulation der

Plasmamembran V-ATPase von Manduca sexta

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

des Fachbereiches Biologie/Chemie

an der Universität Osnabrück

Vorgelegt von

Markus Huß

aus Augsburg

Osnabrück, 2001

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Ionentransport-ATPasen und ihre Funktion in der Membran 1

1.2. Die V-ATPase im Mitteldarm von M. sexta 5

1.3. Regulation von V-ATPasen 7

1.4. Die Charakterisierung von ATPasen mit Hilfe von Inhibitoren 10

1.5. Aufgabenstellung 12

2. Material 13

2.1. Chemikalien, Enzyme und sekundäre Antikörper 13

2.2. Puffer und Medien 14

2.3. Versuchstiere 15

3. Methoden 16

3.1. Biochemische Methoden 16

3.1.1. Präparation von angereicherten und hochreinen Gobletzell- Apikalmembranen 16

3.1.2. Reinigung des V1Vo Holoenzyms aus angereicherter GCAM oder aus Mitteldarmrohhomogenat 17

3.1.3. Reinigung des Vo Komplexes aus angereicherter GCAM oder aus Mitteldarmrohhomogenat 18

3.1.4. Reinigung des V1 Komplexes aus Mitteldarm 18 3.1.5. SDS-PAGE 19 3.1.6. Proteinbestimmung 20 3.1.7. Western Blot 21 3.1.8. Reinigung von Antikörpern 21 3.1.9. Immunfärbung 22 3.1.10. Coomassie-Färbung 23 3.1.11. Silber-Färbung 23 3.1.12. Markierung mit 14C-DCCD 23 3.1.13. Markierung mit 125J-Concanamycin A 24 3.1.14. Isoelektrische Fokussierung mit anschließender 2-D Elektrophorese 24 3.1.15. Röntgenkleinwinkelstreuung 25 3.1.16. Matrix unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie

(MALDI-MS) 25 3.1.17. N-terminale Sequenzierung 26 3.1.18. ATPase-Aktivitätstest und Phosphatbestimmung 26 3.1.19. Bestimmung und Entfernung endogener Nukleotide 27 3.1.20. Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen (KI-Stripping) 28 3.1.21. Messung des ATP-getriebenen Protonentransports 28 3.1.22. Rekonstitution des V1Vo Holoenzyms in Liposomen 29

Inhaltsverzeichnis

3.1.23. Messung kapazitiver Ströme am blacklipid Bilayer 29 3.1.24. Auftrennung von Subkomplexen des V1Vo Holoenzyms 30

3.2. Molekularbiologische Methoden 30

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 30 3.2.2. Phenolextraktion und Ethanolfällung 31 3.2.3. Plasmid DNA Präparation 31 3.2.4. Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme 31 3.2.5. Agarosegelelektrophorese von DNA 32 3.2.6. Ligation und Transformation 32 3.2.7. Herstellung kompetenter Zellen 32 3.2.8. Sequenzierung von DNA 33 3.2.9. Klonierung, Expression und Reinigung von rekombinanten Teilen der B

Untereinheit im pMal-c2-System 33 3.2.10. Herstellung der rekombinanten Untereinheit C im pET System 35

4. Ergebnisse 36

4.1. Die Struktur der V-ATPase aus M. sexta 36

4.1.1. Optimierung der V1Vo Holoenzym Präparation 36 4.1.2. Entdeckung der Untereinheit a bei M. sexta 40 4.1.3. Die Untereinheit B und die Identifizierung ihrer putativen Isoform B´ als

Hsp60 42 4.1.4. Identifizierung der Untereinheit D 45 4.1.5. Analyse aller Untereinheiten der V-ATPase durch MALDI-MS 45

4.2. Der V1 Komplex 49

4.2.1. Modifikation der Präparation des V1 Komplexes 49 4.2.2. Die Untereinheitenzusammensetztung des V1 Komplexes in der 2-D

Gelelektrophorese 52 4.2.3. Untersuchung der Untereinheit C im V1 Komplex 53 4.2.4. Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen 59

4.3. Der Vo Komplex 61

4.3.1. Reinigung des Vo Komplexes 61 4.3.2. Identifizierung der 26 kDa Bande des Vo Komplexes 65 4.3.3. Markierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase 66 4.3.4. Die Wirkung neuer Makrolide 73

4.4. Funktion und Regulation des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes 76

4.4.1. Einfluß von Alkoholen und Detergenzien auf die Mg-ATPase Aktivität des V1 Komplexes 76

4.4.2. Einfluß von Methanol auf das V1Vo Holoenzym 78 4.4.3. Abhängigkeit der Ca-abhängigen Hydrolyse-Aktivität des

V1 Komplexes vom verwendeten Nukleosidtriphosphat 79 4.4.4. Einfluß von Ca-ADP, Mg-ADP und Pi auf die Hydrolyse

von ATP durch das V1Vo Holoenzym und den V1 Komplex 80

Inhaltsverzeichnis

4.4.5. Bestimmung der endogen gebundenen Nukleotide des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes 85

4.4.6. Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in vitro 87 4.4.7. Einfluß von DCCD und Concanamycin auf die Mg2+- und Ca2+-

ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms 91 4.4.8. Messung des Protonentransports an GCAM-Vesikeln mit Mg2+-

und Ca2+-ATP als Substrat 93 4.4.9. Messungen kapazitiver Ströme des rekonstituierten V1Vo Holoenzyms 94

5. Diskussion 95

5.1. Die Struktur der V-ATPase aus M. sexta 95

5.1.1. Das V1Vo Holoenzym 95 5.1.2. Der Vo Komplex 96 5.1.3. Der V1 Komplex 99 5.1.4. Die putative Isoform der Untereinheit B gehört zu den Hsp60-Proteinen 100 5.1.5. Gehört die Untereinheit C zum V1 Komplex? 101 5.1.6. Ist die Untereinheit E bei V-ATPasen das funktionelle Homolog zur

Untereinheit γ der F-ATPasen? 102 5.1.7. Die räumliche Struktur des V1 Komplexes 104

5.2. Die Aktivität der V-ATPase 106

5.2.1. Ca2+ ist kein vollwertiger Ersatz für Mg2+ 106 5.2.2. Warum ist der isolierte V1 Komplex inaktiv? 107 5.2.3. Die V-ATPase-Aktivität wird durch ADP gehemmt 109 5.2.4. Mg-ATP spielt eine wichtige Rolle bei der Dissoziation der

V-ATPase in den V1 und den Vo Komplex 110

5.3. Makrolid Antibiotika als Inhibitoren der V-ATPase 112

5.3.1. Die Identifizierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase 112 5.3.2. Gibt es eine gemeinsame Bindestelle für Makrolide in V-ATPasen? 118 5.3.3. Die V-ATPase von M. sexta: Ein Modellsystem für die

Osteoporoseforschung 120

6. Zusammenfassung 122

7. Literaturverzeichnis 124

8. Publikationen 133

9. Abkürzungsverzeichnis 134

10. Lebenslauf 135

11. Danksagung 136

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Ionentransport-ATPasen und ihre Funktion in der Membran

Für die Funktion einer Minimalzelle ist, neben einem grundlegenden Stoffwechselzyklus und

einer replikationsfähigen Matrize, eine Membran erforderlich, welche die ganze Zelle

umschließt und sie gegen ihre Umgebung abgrenzt (T. Ganti, 1971). Diese Membran muß die

Fähigkeit zu einem kontrollierten Austausch von Ionen und Molekülen zwischen dem Cytosol

und dem extrazellulär Medium besitzen. Da der Austausch häufig entgegen einem

elektrochemischen Gradienten erfolgen muß, sind spezielle Proteine in die Membran

integriert, die diese Transportprozesse energetisieren. Ist der Transport direkt an die

Hydrolyse von ATP gekoppelt, nennt man ihn primären Transport, wird er dagegen durch

eine primär erzeugte ionenmotorische Kraft über der Membran angetrieben spricht man von

sekundärem Transport (Harold, 1986). Bei den für den primären Transport zuständigen

Membranproteinen handelt es sich um Ionentransport-ATPasen, die nach Pedersen & Carafoli

(1987) in die drei Klassen der P-, F- und V-ATPasen eingeteilt werden können, wobei die

letzteren beiden sich von einem gemeinsamen Vorfahren ableiten lassen (Nelson & Taiz,

1989).

Bei den P-ATPasen handelt es sich um die am einfachsten gebauten Vertreter der

Ionentransport-ATPasen (Pedersen & Carafoli, 1987). In der Regel bestehen sie aus einer,

manchmal auch aus zwei oder mehr Untereinheiten (Geering, 2000). Sie heißen P-ATPasen,

da sie während der Hydrolyse von ATP ein Aspartyl-Phosphat-Intermediat bilden, also

kurzzeitig phosphoryliert werden; aus diesem Grunde ist eine Hemmung ihrer Enzymaktivität

durch das Phosphatanalogon ortho-Vanadat möglich. Das wohl bekannteste Mitglied dieser

Klasse ist die Na+/K+-ATPase, die in der basolateralen Membran fast jeder tierischen Zelle

vorkommt. Sie energetisiert über den von ihr erzeugten Na+-Gradienten die sekundär-aktive

Aufnahme von Glukose und Aminosäuren, ist an der Regulation des Zellvolumens und an der

elektrischen Erregbarkeit von Nervenzellen beteiligt. Einige weitere Vertreter der P-ATPasen

sind die Ca2+-ATPasen in der Membran des sarcoplasmatischen Retikulums, die H+/K+-

ATPase in der Magenschleimhaut von Wirbeltieren, die H+-ATPasen in der Plasmamembran

von Pflanzen und Pilzen und die Kdp-ATPasen in der Cytoplasmamembran von Eubakterien

(Pedersen & Carafoli, 1987).

Einleitung

2

Die zweite Klasse der Ionentransport-ATPasen sind die F-ATPasen, welche in der inneren

Mitochondrienmembran, in der Thylakoidmembran von Chloroplasten und in der

Plasmamembran von Bakterien vorkommen. Dort fungieren sie als ATP-Synthasen und

nutzen eine durch Elektronentransportketten aufgebaute protonenmotorische Kraft (proton

motive force, pmf) zur Synthese von ATP aus ADP und Phosphat (Mitchell, 1966). Die

bakterielle F-ATPase kann unter anaeroben Bedingungen auch in die entgegengesetzte

Richtung arbeiten und durch ATP-Hydrolyse einen Protonengradienten über der Membran

aufbauen, der zu sekundären Transportprozessen genutzt werden kann. Der Aufbau der F-

ATPasen ist wesentlich komplexer als bei den P-ATPasen. Mit einer Molekularmasse von bis

zu 800 kDa setzen sie sich aus einem peripheren F1 Komplex und einem membranständigen

Fo Komplex zusammen. Vom F1 Komplex leitet sich auch der Name der ganzen Klasse ab, da

er unter der Bezeichnung Faktor 1 erstmals als Bestandteil der ATP-Synthase erkannt und

isoliert wurde (siehe Pedersen & Carafoli, 1987). Der Fo Komplex wiederum erhielt seinen

Namen auf Grund der Sensitivität der mitochondrialen F-ATPase gegenüber dem

Antibiotikum Oligomycin (siehe Pedersen & Carafoli, 1987). Weitere wirksame Inhibitoren

sind unter anderem NaN3 und N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD). Die F-ATPase

besteht, bei einem ihrer am einfachsten gebauten Vertreter aus dem Bakterium E. coli, aus den

F1 Untereinheiten α, β, γ, δ und ε, und den Fo Untereinheiten a, b und c in der Stöchiometrie

α3, β3, γ, δ, ε, a, b2 und c12 (Deckers-Hebestreit & Altendorf, 1996, Fillingame et al., 1998).

Der Fo Komplex der F-ATPasen von Mitochondrien und Chloroplasten ist ungleich

komplexer aufgebaut und besteht aus bis zu 8 verschiedenen Untereinheiten (McCarty, 1992).

Die Stöchiometrie der Untereinheit c scheint bei den F-ATPasen zwischen verschiedenen

Spezies zu variieren. So wurde für den Fo Komplex aus Chloroplasten 14 Kopien der

Untereinheit c identifiziert (Seelert et al., 2000), für den Fo Komplex aus Hefe jedoch nur 10

(Stock et al., 1999). Weiterhin gibt es Beobachtungen, dass die Stöchiometrie der

Untereinheit c bei E. coli in Abhängigkeit von der angebotenen Kohlenstoffquelle variieren

kann (Schemidt et al., 1998). Die Struktur des F1 Komplexes und von Teilen des Fo

Komplexes ist inzwischen durch Röntgenkristallographie bestimmt worden (Abrahams et al.,

1994, Stock et al., 1999, Gibbons et al., 2000). Die drei α- und die drei β-Untereinheiten sind

alternierend um die zentrale γ-Untereinheit angeordnet, die mit dem Ring der c Untereinheiten

des Fo Komplexes in Verbindung steht. Eine durch die pmf angetriebene Rotation dieses

Rings wird über die asymmetrisch geformte γ-Untereinheit in den F1 Komplex übertragen und

führt dort zu einer zyklischen Konformationsänderung der katalytischen β-Untereinheiten,

Einleitung

3

wie sie zur ATP-Synthese nach dem binding-change Mechanismus erforderlich ist (Boyer,

1989; Junge et al., 1997). Mittlerweile konnte diese Rotation der γ-Untereinheit und des Rings

aus c Untereinheiten experimentell bestätigt werden (Duncan et al., 1995; Sabbert et al.,

1996; Noji et al., 1997, 1999; Pänke et al., 2000; Tsunoda et al., 2000).

Die dritte Klasse der Ionentransport-ATPasen bilden die V-ATPasen. Sie erhielten ihren

Namen aufgrund ihrer erstmaligen Beschreibung in der Vakuolenmembran der Hefe (siehe

Pedersen & Carafoli, 1987) und zeichnen sich durch ihre hohe Empfindlichkeit gegenüber den

Plecomakroliden Bafilomycin und Concanamycin aus, durch die sie bereits im nanomolaren

Bereich gehemmt werden (Überblick in Dröse & Altendorf, 1997). V-ATPasen sind

elektrogene Protonenpumpen, die in bestimmten Endomembranen aller Eukaryonten und in

den Plasmamembranen einer ganzen Reihe tierischer Zellen vorkommen (Gogarten et al.,

1992; Gluck, 1992; Anraku et al., 1992). Auch in der Zellmembran von Prokaryonten wurden

ATPasen vom V-Typ nachgewiesen, allerdings translozieren sie dort Na+-Ionen statt H+-

Ionen (Takase et al., 1993). Im Gegensatz zu den mit ihnen verwandten F-ATPasen arbeiten

V-ATPasen ausschließlich als ATP-abhängige Ionenpumpen. Bei Eukaryonten erfolgt der

Protonentransport immer vom Cytosol in das entsprechende Zellorganell oder den

Extrazellulärraum. Sie generieren dabei eine pmf, welche für die unterschiedlichsten sekundär

aktiven Transportprozesse genutzt wird. In Abhängigkeit von den entsprechenden Antiportern

oder Symportern und dem entsprechenden Gegenion kann sich der pH-Wert des trans-

Kompartiments ins Saure oder Alkalische verschieben oder er bleibt neutral (Harvey, 1992).

Wird kein Gegenion transportiert, entsteht eine Spannung über der Membran. In Endosomen,

Vakuolen und Lysosomen ist eine Ansäuerung jeweils entscheidend für deren Funktion.

Durch die Senkung des pH-Wertes werden in Lysosomen Proteasen aktiviert oder in

Endosomen die Liganden von ihren Rezeptoren dissoziiert (Mellman, 1992). In

Plasmamembranen übernehmen die V-ATPasen ebenfalls die Aufgabe der Protonensekretion,

wie zum Beispiel bei der Regulation des Säure/Base-Haushalts im proximalen und distalen

Tubulus der Säugerniere (Gluck et al., 1992) oder bei der Auflösung der Knochenmatrix

durch Osteoklasten (Blair, 1998). Darüber hinaus nehmen sie in vielen tierischen Epithelien

die bisher weniger bekannte Aufgabe wahr, sekundär aktive Transportprozesse zu

energetisieren. In tierischen Zellen erfolgt dies normalerweise durch das von der Na+/K+-

ATPase generierte Na+-Potential. Sind die Zellen aber einer Na+-armen Umgebung

ausgesetzt, wie z. B. im Mitteldarm von pflanzenfressenden Insekten oder im Epithel der

Froschhaut und den Kiemen von Süßwasserfischen, wird das benötigte Ionen-Potential nicht

Einleitung

4

mit einem Na+-Gradienten erzeugt (Wieczorek et al., 1991; Harvey B. J., 1992; Wieczorek et

al., 1999). In diesen Fällen erzeugt eine V-ATPase ein Protonenpotential.

Wie bereits erwähnt, sind die F- und V-ATPasen miteinander verwandt und haben mehrere

strukturelle Merkmale gemeinsam. So lassen sich auch die V-ATPasen in einen peripheren,

katalytischen und einen membranständigen, protonentranslozierenden Komplex unterteilen,

welche in Analogie zu den F-ATPasen als V1 und Vo Komplex bezeichnet werden. Der V1

Komplex setzt sich aus den Untereinheiten A3, B3, C, D, E1-3, F, G1-3 und H zusammen, wobei

die Stöchiometrie der Untereinheiten E und G (wie durch die Indices angedeutet) noch nicht

geklärt ist (Arai et al., 1988; Supekova et al., 1995; Xie, 1996; siehe auch Abb. 3). Die

Untereinheiten A und B des V1 Komplexes weisen eine mehr als 25%ige Sequenzhomologie

zu den Untereinheiten β und α der F-ATPasen auf (Nelson & Taiz, 1989). Bei der

Untereinheit A handelt es sich um die katalytisch aktive Untereinheit, die ebenso wie die

Untereinheit β der F-ATPasen die Glycin-reiche Nukleotid-bindende Sequenz

GXXXXGKT/S, das sogenannte Walker-Motiv enthält (Walker et al., 1982). Außerdem

enthält sie zwei hochkonservierte Cysteine, wodurch die V-ATPasen sensitiv für SH-Gruppen

modifizierende Substanzen wie zum Beispiel N-Ethylmaleimid (NEM) sind (Moriyama &

Nelson, 1987). Die Untereinheit B wird in Analogie zu ihrem Pendant der α-Untereinheit der

F-ATPasen als regulatorische Untereinheit bezeichnet. Sie besitzt zwar kein Walker-Motiv,

kann aber das ATP-Analogon 3-O-(4-Benzoyl)Benzoyladenosin-5´-triphosphat (BzATP)

binden (Manolson et al., 1985; Vasilyeva & Forgac, 1996). Die restlichen V1-Untereinheiten

C bis H, welche den Stiel der V-ATPase bilden, haben keinerlei Sequenzhomologien zu F-

ATPase Untereinheiten. Auf jeden Fall ist jede der Untereinheiten wichtig für die korrekte

Funktion der V-ATPase, da in Hefe gezeigt wurde, dass sie entweder essentiell für die

Assemblierung und/oder die Aktivität sind (Stevens & Forgac, 1997). Da für die Kopplung

von ATP-Hydrolyse und Protonentranslokation in Analogie zu F-ATPasen auch für V-

ATPasen ein Rotationsmechanismus angenommen wird, interessiert besonders, welche der

Stieluntereinheiten den Part der γ-Untereinheit übernimmt; sowohl für die Untereinheit E als

auch für die Untereinheit D gibt es entsprechende Hinweise (Bowman et al., 1995; Nelson et

al., 1995).

Der Vo Komplex besteht in seiner minimalen Ausstattung aus den Untereinheiten a, d und c,

wobei von der Untereinheit c, welche auch als Proteolipid bezeichnet wird, die Isoformen c´

und c´´ vorkommen können (Arai et al., 1988; Hirata et al., 1997). Die Untereinheit c ist

homolog zur Untereinheit c der F-ATPasen und offensichtlich durch eine Genduplikation aus

einem gemeinsamen Vorfahren entstanden (Mandel et al., 1988). Im Vergleich zu ihrem

Einleitung

5

Pendant bei den F-ATPasen hat sie deshalb eine doppelt so große Molekularmasse, vier statt

zwei Membrandurchgänge und liegt auch nur in sechs Kopien pro Vo Komplex vor (Noumi et

al., 1991; Nelson, 1992). Das Proteolipid ist vermutlich die entscheidende Untereinheit für die

Protonentranslokation über die Membran, da die Bindung von DCCD an ein Glutamat in der

vierten Transmembranhelix diesen komplett unterbindet, wobei nur eine der Untereinheiten c

ein DCCD-Molekül gebunden haben muß (Arai et al., 1988; Forgac, 1998). Außerdem nimmt

man an, dass es sich beim Ring aus den c Untereinheiten, wiederum in Analogie zu den F-

ATPasen, um den membranständigen Teil des Rotors handelt (Forgac, 1998). Die

Untereinheit a wird als mögliche Bindestelle des V-ATPase-Inhibitors Bafilomycin und als

Hauptbestandteil des Stators diskutiert (Zhang et al., 1994; Forgac, 1998). Für die

Untereinheit d gibt es noch keine konkreten Hinweise auf eine spezielle Funktion, es konnte

nur gezeigt werden, dass sie ebenfalls wichtig für die Assemblierung der V-ATPase ist

(Bauerle et al., 1993).

1.2. Die V-ATPase im Mitteldarm von M. sexta

Eine der am besten untersuchten V-ATPasen befindet sich im Mitteldarmepithel der Raupe

des Tabakschwärmers M. sexta, wo das von ihr erzeugte Transmembranpotential für die

Energetisierung aller Transportprozesse verantwortlich ist. Das einschichtige Epithel des

Mitteldarms besteht aus nur zwei differenzierten Zelltypen, den Columnar- oder Säulenzellen

und den Goblet- oder Becherzellen (Abb. 1). Es enthält keine Na+/K+-ATPase (Jungreis &

Vaughan, 1977) und wird durch ein K+-Potential energetisiert (Harvey et al., 1983,

Wieczorek et al., 1986). Die in der Gobletzellapikalmembran (GCAM) lokalisierte "K+-

Pumpe" wurde als ein Zweikomponentensystem aus einer V-ATPase und einem K+/nH+-

Antiporter identifiziert (Schweikl et al., 1989; Wieczorek et al.; 1989). Das Mitteldarmepithel

von M. sexta war damit das erste tierische Epithel, dessen Energetisierung durch eine V-

ATPase nachgewiesen werden konnte (Wieczorek et al., 1991). Die in das Darmlumen

transportierten K+-Ionen erzeugen somit zum einen das K+-Potential, das zur Energetisierung

von Aminosäure/K+-Symporten in die Columnarzellen benötigt wird (Giordana et al., 1989).

Andererseits entzieht der Antiporter wegen seiner Stöchiometrie von 2H+ pro K+ dem

Darmlumen Protonen, was letztlich zu einem extrem hohen alkalischer pH-Wert von bis zu 12

im Lumen des Mitteldarms führt (Azuma et al., 1995). Die Alkalinität des Mitteldarmlumens

verhindert vermutlich eine Vernetzung der durch die pflanzliche Nahrung aufgenommenen

Tannine, welche ansonsten zu einer Inaktivierung von Enzymen führt (Goldstein & Swain,

1965; Berenbaum, 1980).

Einleitung

6

Abb. 1: Energetisierung des Mitteldarmepithels von M. sexta durch die V-ATPase. Der aktive elektrogene K+-Transport erfolgt über die Gobletzellapikalmembran (GCAM) durch den von der V-ATPase (V) energetisierten K+/2H+-Antiporter. Durch das Zusammenspiel von V-ATPase und Antiporter entsteht zum einen der alkalische pH-Wert im Mitteldarmlumen und zum anderen eine Spannung von ≥ 150 mV über dem Epithel. Durch einen Aminosäure/K+-Symporter (S) in der Columnarzellapikalmembran (CCAM) werden Aminosäuren (AS) aufgenommen (modifiziert nach Wieczorek et al., 2000).

Ein besonderer experimenteller Vorteil der V-ATPase von M. sexta liegt in der extrem hohen

Dichte in der das Enzym in der GCAM vorliegt (Abb. 2). Schon in ersten elektronen-

mikroskopischen Aufnahmen von Schnitten des Mitteldarms fielen ca. 10 nm große Partikel

auf, welche die Apikalmembran der Gobletzellen bedeckten und als Portasomen bezeichnet

und mit dem Ionentransport in Verbindung gebracht wurden (Harvey et al., 1981). Die

Isolierung dieser Membran ermöglichte die ersten grundlegenden Charakterisierungen des

Ionentransports und die erste Solubilisierung und Reinigung der V-ATPase (Cioffi &

Wolfersberger, 1983; Wieczorek et al., 1986; Schweikl et al., 1989). Bis zu Beginn der

vorliegenden Arbeit gelang es durch die Kombination von molekularbiologischen und

biochemischen Methoden, die Untereinheiten A, B, E, F und G des V1 Komplexes, sowie die

Untereinheiten c und d des Vo Komplexes von M. sexta zu identifizieren (Dow et al., 1992;

Gräf et al., 1992; Novak et al., 1992; Gräf et al., 1994a; Gräf et al., 1994b; Lepier et al.,

1996; Merzendorfer et al., 1997b). Die Untereinheit F konnte dabei erstmals als konstitutive

V-ATPase Untereinheit beschrieben werden und ebenso wie die Untereinheit G erstmals dem

V1 Komplex zugeordnet werden. Für alle anderen dem V1 Komplex zugehörigen

Untereinheiten (C, D und H) gab es, wie aus der SDS-PAGE der gereinigten V-ATPase zu

erkennen war, potentielle Kandidaten in Form von Proteinbanden mit der entsprechenden

Molekularmasse. Bei den dem Vo Komplex zugehörigen Untereinheiten war dies nicht der

Einleitung

7

Fall; so konnte trotz der Verwendung eines ganzen Cocktails von Proteaseinhibitoren die als

proteolytisch sehr anfällig bekannte Untereinheit a nicht nachgewiesen werden, was als

Besonderheit von Insekten-V-ATPasen interpretiert wurde (Wieczorek, 1992; Wieczorek et

al., 2000). Die war insofern interessant, da die gereinigte V-ATPase aus M. sexta sich durch

Bafilomycin hemmen läßt und die Untereinheit a eigentlich als Bafilomycin-bindende

Untereinheit betrachtet wurde (Wieczorek et al., 1991; Zhang et al., 1994).

Abb. 2: Aufnahmen von Vesikeln der Gobletzellapikalmembran von M. sexta. Die Vesikel der gereinigten GCAM aus dem posterioren Mitteldarm wurden von Dr. Michael Radermacher und Dr. Teresa Ruiz (MPI für Biophysik, Frankfurt) wie in Radermacher et al. (1999) beschrieben negativ-kontrastiert und elektronen-mikroskopisch abgebildet. In der Aufsicht ist deutlich die dichte Packung der V-ATPase (ca. 10000/µm 2) und die hexagonale Struktur des V1 Komplexes mit ca. 10 nm Durchmesser zu sehen (a, b). In der Seitenansicht ist die Unterteilung Kopf und Stiel zusehen, wobei Einheit aus Stiel und Kopf ca. 15 nm aus der Membran herausragt (a). (Radermacher, Ruiz, Huss und Wieczorek unpubliziert).

1.3. Regulation von V-ATPasen

Für ein komplexes Enzym wie die V-ATPase, das in verschiedensten Organellen, Organen

und Organismen ganz unterschiedliche Aufgaben erfüllt und dabei große Mengen von

Stoffwechselenergie in Form von ATP verbraucht, erscheinen Kontroll- und Regulations-

mechanismen unbedingt erforderlich. So konsumiert die V-ATPase des Mitteldarmepithels

der Raupe von M. sexta 10% des gesamten ATPs des Tieres (Dow, 1984). Deshalb dürfte es

von großer Bedeutung sein, dass die V-ATPase-Aktivität den jeweiligen Erfordernissen und

Bedingungen angepasst wird, um nicht "unnötig" Energie zu verbrauchen.

Für V-ATPasen sind, unter anderem aus Untersuchungen an M. sexta, bereits einige

Regulationsmöglichkeiten bekannt. Schon die Biosynthese von V-ATPase Untereinheiten

wird auf der Ebene der Transkription reguliert. Ursprünglich wurden V-ATPasen in vielen

Einleitung

8

Organismen aufgrund von G+C-reichen Regionen in den Promotoren der Gene für einzelne

Untereinheiten als konstitutiv exprimierte house-keeping Proteine betrachtet (Wechser &

Bowman, 1995). Allerdings enthalten die Promotoren der Untereinheiten B, G und d von M.

sexta verschiedene Elemente, wie TATA-Boxen, CCAAT-Boxen oder Ecdyson-responsive-

Elemente die auf eine transkriptionelle Regulation hindeuten (Merzendorfer et al., 1997a). In

diesem Zusammenhang konnte mit Northern Blots gezeigt werden, dass die Menge der

mRNA für fast alle V-ATPase-Untereinheiten während der Häutung und bei Hunger abnimmt

und dies mit dem Anstieg des 20-Hydroxyecdyson-Titers (20-HE) in der Hämolymphe

korreliert (Reineke et al., 2001). Weiterhin konnte durch Injektion von 20-HE in die

Hämolymphe der Raupen und durch Reportergenstudien mit den Promotoren der Gene der

Untereinheiten B, G und d ein 20-HE-abhängiges Absinken der Transkriptionsrate für diese

Untereinheiten bestätigt werden (Reineke et al., 2001).

Auch auf posttranskriptioneller Ebene können die Untereinheiten der V-ATPase reguliert

werden. Bei M. sexta wurden erste Hinweise für eine Regulation durch die Transkription von

Antisense-RNA für die Untereinheiten d und H gefunden (Merzendorfer et al., 1997a;

Merzendorfer et al., 1997b; Merzendorfer, Düvel und Wieczorek unpubliziert). Antisense-

RNA kann mit ihrer Sense-mRNA einen Doppelstrang ausbilden, der durch spezifische

Doppelstrang-RNAsen (dsRNAsen) abgebaut wird, wodurch die Translationsrate der

entsprechenden Untereinheit erniedrigt wird (Nellen & Lichtenstein, 1993).

Änderungen des Redoxpotentials in der Zelle könnten ebenfalls eine Möglichkeit darstellen

die Aktivität der V-ATPase zu modulieren. Ein Beispiel hierfür ist die redox-abhängige

Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen zwei konservierten Cysteinresten in der

Untereinheit A der V-ATPase aus Clathrinvesikeln mit der daraus resultierenden Inhibierung

(Taiz et al., 1994; Merzendorfer et al., 1997a; Stevens & Forgac, 1997). Auch die Aktivität

der V-ATPase aus N. crassa wird durch reduzierende bzw. oxidierende Agenzien modifiziert

(Dschida & Bowman, 1995).

Die Aktivität der V-ATPase lässt sich aber auch über die Menge der zur Verfügung stehenden

funktionsfähigen Enzyme in der Membran regulieren. Hierfür wurden bisher zwei

verschiedene Mechanismen entdeckt: Zum einen kann die Anzahl der V-ATPasen durch

Exozytose bzw. Endozytose von V-ATPase-haltigen Vesikeln gesteuert werden. Im distalen

und proximalen Tubulus der Säugerniere oder im Epithel der Krötenharnblase verschmelzen

dicht mit V-ATPase bepackte Vesikel nach Bedarf mit der Plasmamembran oder werden

wieder endozytiert (Gluck et al., 1982; Schwartz & Al-Awqati, 1985; Brown et al., 1987).

Zum anderen kann die Anzahl der aktiven V-ATPasen durch reversible Dissoziation des

Einleitung

9

cytosolischen V1 Komplexes vom membranständigen Vo Komplex gesteuert werden (Abb. 3).

Dieser Mechanismus wurde erstmals für die V-ATPase im Mitteldarm der

Tabakschwärmerraupe von M. sexta entdeckt (Sumner et al., 1995). Nimmt die Raupe keine

Nahrung zu sich, z. B. während der Häutung oder bei Futtermangel, dissoziieren die V1

Komplexe von der Membran ab (Sumner et al., 1995; Gräf et al., 1996). Durch diese

Trennung in V1 und Vo Komplex wird die V-ATPase sehr effektiv ausgeschaltet, da der

cytosolische V1 Komplex in vivo keine Mg-ATPase-Aktivität und der Vo Komplex keine

Protonenleitfähigkeit besitzt (Gräf et al., 1996; Beltran & Nelson, 1992).

Abb. 3: Die V-ATPase und ihre reversible Dissoziation in die beiden Subkomplexe V1 und Vo. In diesem Modell wurden alle bekannten Untereinheiten der V-ATPase von M. sexta und die aktuellen Kenntnisse über deren Topologie und Stöchiometrie berücksichtigt.

Durch die Dissoziation erhöht sich der Anteil von freien V1 Komplexen an cytosolischem

Protein von 1% auf 2% (Gräf et al., 1996). Aus diesem Pool von V1 Komplexen gelang es

erstmals einen nativen V1 Komplex aus den Untereinheiten A, B, E, F und G zu reinigen.

Dieser Komplex hat im Gegensatz zum V1Vo Holoenzym keine Mg-ATPase-Aktivität, kann

aber ebenso wie dieses die Hydrolyse von ATP in Gegenwart von Ca2+ katalysieren (Gräf et

al., 1996). Allerdings kann mit Zugabe von Methanol eine Mg-ATP-Hydrolyse-Aktivität des

V1 Komplexes induziert werden (Gräf et al., 1996). Wenn die Raupen wieder Nahrung zu sich

nehmen, reassoziiert der V1 Komplex wieder an die Membran. Die zur Reassoziation

benötigten V1 Komplexe werden offensichtlich aus dem cytosolischen Pool rekrutiert, da

hierfür keine Proteinneusynthese erforderlich ist (Jäger & Klein, 1996). Deshalb kann man

davon ausgehen, dass die Untereinheiten des Vo Komplexes in der Plasmamembran

Einleitung

10

verbleiben und ebenfalls wiederverwendet werden. Ob der Vo Komplex dabei allerdings als

ganzer intakter Komplex oder in seine Untereinheiten dissoziiert vorliegt, ist noch nicht

geklärt. Auch bei der Hefe S. cerevisiae wurde eine ähnliche reversible Dissoziation der V-

ATPase nachgewiesen (Kane, 1995). Wird den Hefezellen durch einen Wechsel des

Nährmediums Glukose als Kohlenstoffquelle entzogen oder erreichen die Zellen die

stationäre Wachstumsphase, dissoziiert die V-ATPase, wird den Zellen wieder Glukose im

Medium angeboten, reassoziiert die V-ATPase (Kane, 1995; Parra & Kane, 1998). Da die

reversible Dissoziation der V-ATPase bei zwei phylogenetisch weit voneinander entfernten

Organismen entdeckt wurde, kann man auf einen allgemein gültigen Regulations-

mechanismus für V-ATPasen schließen. Die genaue Steuerung der Dissoziation ist

weitgehend unbekannt. Möglicherweise spielt die Untereinheit C eine Rolle, da sie beim

abdissoziierten V1 Komplex aus Hefe nicht und aus M. sexta nur in substöchiometrischen

Mengen vorhanden ist, im reassoziiertem Holoenzym aber wieder auftaucht (Kane, 1995;

Gräf et al., 1996). Glukose spielt bei der Hefe offensichtlich eine entscheidende Rolle, da ihre

Entfernung aus dem Medium bereits nach fünf Minuten die Dissoziation der V-ATPase

bewirkt (Kane, 1995). Auch bei M. sexta sinkt innerhalb von nur 30 min nach Futterentzug

die Glukosekonzentration in der Hämolymphe um mehr als 60% ab und beträgt nach 10 h nur

noch 5% der Ursprungskonzentration (Gies et al., 1988). Bis jetzt konnte aber kein direkter

Zusammenhang zwischen Glukose und der Dissoziation gezeigt werden. Alle

Glukosestoffwechsel- und auch Signaltransduktionsmutanten der Hefe, die bisher untersucht

wurden, zeigten ein vergleichbares Dissoziationsverhalten wie der Wildtyp (Parra & Kane,

1998). Es ist allerdings bekannt, dass die V-ATPase unter dem Einfluß von chaotropen Ionen

und/oder Nukleotiden auch in vitro zu einer Dissoziation in ihren V1 und Vo Komplex neigt

(Moriyama & Nelson, 1989), wodurch die Untersuchung von grundlegenden zur Dissoziation

der V-ATPase führenden Mechanismen am gereinigten V1Vo Holoenzym möglich sein sollte.

1.4. Die Charakterisierung von ATPasen mit Hilfe von Inhibitoren

Wie bei nahezu jeder Proteinfamilie gibt es auch für die V-ATPasen spezifische Inhibitoren.

Diese können zum einen zur Klassifizierung herangezogen werden, zum anderen ermöglichen

sie es, die Funktion und die Struktur des jeweiligen Proteins zu untersuchen. So konnten

beispielsweise mit Hilfe des Phosphatanalogons ortho-Vanadat Teile des Reaktionszyklus der

P-ATPasen aufgeklärt werden (Cantley et al., 1978; Pedersen & Carafoli, 1987). Mit dem

Inhibitor NEM wurde die Untereinheit A als die katalytisch aktive Untereinheit der V-ATPase

bestätigt (Feng & Forgac, 1992). N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD), das sowohl F- als

Einleitung

11

auch V-ATPasen hemmt, bindet bei beiden ATPasen an einen sauren Aminosäurerest in der

membranständigen Untereinheit c des Fo- bzw. Vo-Komplexes, die zueinander homolog sind

(Sebald et al., 1980; Arai et al., 1987).

Auch Plecomakrolide wie die Bafilomycine und die Concanamycine sind gegen mehrere

Klassen von Ionentransport-ATPasen wirksam. Sie hemmen die V-ATPasen in nanomolaren

Konzentrationen, sind aber überraschenderweise gegen die verwandten F-ATPasen

vollkommen wirkungslos, obwohl Bafilomycin mit dem membranständigen Komplex

wechselwirkt, der bei beiden ATPasen zu einem großen Teil aus den zueinander homologen

Untereinheiten c besteht (Hanada et al., 1990; Dröse et al., 1993). Dagegen werden P-

ATPasen, wie die Kdp-ATPase aus E. coli und die Na+/K+-ATPase aus Rind, die ganz

offensichtlich keinerlei Gemeinsamkeiten mit den V-ATPasen haben, in mikromolaren

Konzentrationen gehemmt (Bowman et al., 1988). Auch einige Vertreter der ABC-

Transporter (ATP-Binding-Cassette) erwiesen sich als sensitiv gegenüber Bafilomycin

(Higgins, 1992; Sharom et al., 1995; Hunke et al., 1995). Für keine der drei ATPase-Klassen,

die durch Plecomakrolide gehemmt werden, ist bisher die Bindestelle bekannt. Deshalb war

es von großem Interesse, zunächst für eine der ATPasen, im speziellem der V-ATPase,

welche am sensitivsten auf die Plecomakrolide reagiert, die Bindestelle am Enzym zu

bestimmen.

Weiterhin interessant sind auch Inhibitoren, die innerhalb einer Klasse von ATPasen eine

unterschiedlich starke Wirkung entfalten, da sie zum einen weiteren Aufschluß über den

Wirkungsmechanismus bzw. die Interaktion zwischen Inhibitor und Enzym geben und zum

anderen wichtige Erkenntnisse für die gezielte Veränderung der Inhibitorstruktur für

therapeutische Zwecke liefern können. So sind für Bafilomycin und Concanamycin für V-

ATPasen aus verschiedenen Spezies sehr unterschiedliche IC50-Werte gemessen worden

(Dröse et al., 2001). Auch wurde kürzlich für eine neue Gruppe von Makroliden, die

Benzolactone-Enamide, entdeckt, dass sie unterschiedlich effizient gegenüber V-ATPasen

unterschiedlicher Herkunft sind (Erickson et al.,1997; Reichenbach, 1997; Kunze et al., 1998;

Boyd et al., 2001). Besonders auffällig war dabei die hohe Selektivität, mit der die

Benzolacton-Enamide V-ATPasen aus Säugetieren hemmten, nicht aber V-ATPasen aus

Pilzen (Boyd et al., 2001).

Einleitung

12

1.5. Aufgabenstellung

Durch die hohe Dichte der V-ATPase in der Gobletzellapikalmembran bietet der Mitteldarm

des Tabakschwärmers M. sexta ideale Vorraussetzungen für biochemische und strukturelle

Untersuchungen. Zunächst sollten die Präparationsmethoden für das V1Vo Holoenzym und

den V1 Komplex verbessert werden, um eine deutlich größere Ausbeute, Reinheit und

Stabilität des Holoenzyms und der V1-ATPase zu erhalten. Weiterhin sollte überprüft werden,

ob der Vo Komplex nach Abdissoziation des V1 Komplexes als ganzes in der Membran

erhalten bleibt. Gegebenenfalls sollte dieser native Vo Komplex dann gereinigt werden. Diese

drei gereinigten Komplexe sollten dann als Grundlage für alle weiteren geplanten

Untersuchungen dienen.

• Ein primäres Ziel war die Aufklärung der Untereinheitenzusammensetzung der V-ATPase

und die Identifizierung der Untereinheiten auf Proteinebene, eine Vorraussetzung für

spätere hochauflösende Strukturanalysen. Dazu sollten neben etablierten

gelelektrophoretischen und immunochemischen Methoden auch die N-terminale

Sequenzierung und die MALDI-Massenspektrometrie herangezogen werden. Ein

besonderes Augenmerk sollte dabei der weitgehend unbekannten Struktur des Vo

Komplexes gelten, für den bisher nur die Untereinheiten c und d identifiziert waren.

• Mit einem semisynthetischen Concanamycin A Derivat sollte die im Vo Komplex

lokalisierte Plecomakrolid-bindende Untereinheit der V-ATPase detektiert und wenn

möglich die genaue Bindestelle eingegrenzt werden. Auch sollte die Wirkung einiger

neuer Makrolide auf die Aktivität der V-ATPase charakterisiert werden.

• Der abdissoziierte V1 Komplex hat im Gegensatz zum V1Vo Holoenzym keine Mg-

ATPase-Aktivität, kann aber ebenso wie dieses die Hydrolyse von ATP in Gegenwart von

Ca2+ katalysieren. Durch die Zugabe von Methanol erhält der V1 Komplex die Fähigkeit,

Mg-ATP zu hydrolysieren zurück. Die Ursache dieses Phänomens sollte unter anderem

durch einen Vergleich der Enzymaktivitäten des V1 Komplexes und des V1Vo

Holoenzyms untersucht werden.

• Da der Vorgang der Dissoziation der V-ATPase noch weitgehend unverstanden ist, sollte

er im Rahmen der vorliegenden Arbeit vor allem in Hinblick auf eine mögliche Rolle von

Nukleotiden näher betrachtet werden.

Material

13

2. Material

2.1. Chemikalien, Enzyme und sekundäre Antikörper

Amersham Pharmacia Biotech: 14C-DCCD

Amresco: Acrylamide (40%), Sequenziergelfertigmischung

Biomol: Pefabloc SC

Fluka: Ammoniummolybdat, Bafilomycin B1, Chloroform-Isoamylalkohol (24:1),

Concanamycin A, Dinatrium-Hydrogen-Phosphat, Saccharose, ε-Aminocapronsäure, Na-

EGTA, Essigsäure, Ethanol, Glutaraldehyd, Glycin, Kaliumjodid, Salzsäure (37%),

Isopropanol, Methanol, n-Butanol, MgCl2, MOPS, NaCl, Natriumhydroxid,

Natriumthiosulfat, SDS, Silbernitrat, TCA, TEMED

FMC: Sea Plaque (low melting point) Agarose

Gibco: Agar, Agarose (ultrapure), Hefeextrakt, LB-Broth, NZY-Broth, TB-Broth, Pepton 140

Grüssing: Formaldehyd (37%), Glycerin (87%)

Loewe: IPTG, Tris

Merck: Amidoschwarz, Natriummolybdat, Schwefelsäure (95-98%), Tween 20, Coomassie

Brilliant-blau R-250

New England Biolabs: Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase

Perkin Elmer: Taq Polymerase

Riedel-de Haen: Aceton, CaCl2 x 2 H2O, KCl, Natriumazid,

Serva: APS, BCIP, Bromphenolblau, BSA, Na2-EDTA, Fischgelatine (flüssig),

Natriumacetat, Natriumcarbonat, NBT, SDS

Sigma: ADP (K-Salz), AMP-PNP (Li-Salz), ATP (Na-Salz), ATP (Tris-Salz), alkalische

Phosphatase, Alkalische Phosphatase-konjungierte Anti-Maus-IgG, Alkalische Phosphatase-

konjungierte Anti-Kaninchen IgG, Alkalische Phosphatase-konjungierte Anti-

Meerschweinchen IgG, Ampicillin, Bisacrylamid, β-Mercaptoethanol, C12E10, DCCD, DTT,

EDTA (freie Säure), GTP (K-Salz), Jodacetamid, Malachitgrün, Mannit, Orthovanadat, PEP,

Luciferin/Luciferase, Ponceau S

Stratagene: Restriktionsenzyme, T4-DNA-Polymerase, alkalische Phosphatase

Alle verwendeten Chemikalien hatten, sofern nicht anders erwähnt, p. a. Qualität. Die nicht

aufgeführten Standardchemikalien wurden in der Regel von den Firmen Fluka, Sigma, Merck

Material

14

und Riedel de Haen bezogen. Die für die PCR eingesetzten Oligonukleotide wurden von

Amersham Pharmacia Biotech synthetisiert. Wurden für die Experimente käufliche Kits

eingesetzt ist dies im Text vermerkt.

2.2. Puffer und Medien

Ψb-Medium: Einwaage pro Liter Medium: 5 g Hefeextrakt, 20 g Pepton 140, 5 g MgSO4, pH

mit KOH auf 7,6 eingestellt

Ψa-Medium: entspricht Ψb-Medium plus 14 g Agar

APP-Puffer: 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 9,5

APP-Puffer mit NBT/BCIP: 45 µl NBT und 35 µl BCIP pro 10 ml APP-Puffer

BCIP: 50 mg/ml 5-Bromo-4-Chloroindoxylphosphat in reinem Dimethylformamid

Blockpuffer: 3% Gelatine in TTBSN

Blotpuffer 1: 300 mM Tris (nach dem Ansetzen 1/4 Volumenteil Methanol zugeben)

Blotpuffer 2: 30 mM Tris (nach dem Ansetzen 1/4 Volumenteil Methanol zugeben)

Blotpuffer 3: 30 mM Tris 40 mM ε-Aminocapronsäure (nach dem Ansetzen 1/4 Volumenteil

Methanol zugeben)

ET: 5 mM Na2-EDTA, 5 mM Tris-HCl pH 8,1

HI: 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1

HIM: 9,6 mM β-Mercaptoethanol in HI

HIMC: 0,01% C12E10 in HIM

Luciferin/Luciferase-Puffer: 60 mM Tris-Acetat pH 7,75, 10 mM MgCl2, 1 mM KCl, 1,5

mM EDTA, 2,5 mM β-Mercaptoethanol, 0,4 mg/ml Luciferin/Luciferase (Sigma)

LO: 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1

LOM: 9,6 mM β-Mercaptoethanol in LO

LOMC: 0,01% C12E10 in LOM

MENT: 300 mM Mannit, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 17 mM Tris-HCl pH 8,1

MENTP: 5 mM Pefabloc SC in MENT

NBT: 75 mg/ml Nitroblau Tetrazolium in 70% Dimethylformamid

Pyruvatkinase-Lösung: 70 mM Tris-Acetat pH 7,75, 9 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2 mM

Phosphoenolpyruvat, 2 mM EDTA, 500 U/ml Pyruvatkinase

SET: 250 mM Saccharose in ET

Material

15

SETP: 5 mM Pefabloc SC in SET

TBS: 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,5

TBSN: 0,02% NaN3 in TBS

TE: 0,32 mM EDTA, 16 mM Tris-HCl pH 8,1

TEK: 200 mM KCl in TE

TEM: 9,6 mM β-Mercaptoethanol in TE

TEN: 50 mM NaCl in TE

Tfb-1: 30 mM K-Acetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl2, 15% Glycerin, 50 mM MnCl2, pH 5,8

Tfb-2: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15% Glycerin, pH 6,5

TTBSN: 0,05% Tween 20 in TBSN

Verdünnungspuffer: 1% Gelatine in TTBSN

2.3. Versuchstiere

Bei den für die Präparationen verwendeten Tieren handelt es sich um Raupen des

Tabakschwärmers Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae, Abb. 4), die wenn nicht anders

erwähnt im 5. Larvalstadium waren und ein Gewicht von ca. 6 g hatten. Die Raupen wurden

in einem Laborbrutschrank bei 27°C und 16 h Langtag-Bedingungen gehalten und mit

synthetischem Futter ernährt (Bell & Joachim, 1974). Die Falter wurden in Käfigen mit einem

Volumen von mindestens 1 m3 gehalten (27°C, 16 h Tageslicht), wobei eine 30%ige

Zuckerlösung als Nahrung diente.

Abb. 4: Der Tabakschwärmer (Manduca sexta). Raupe im 5. Larvenstadium

Methoden

16

3. Methoden

3.1. Biochemische Methoden

3.1.1. Präparation von angereicherten und hochreinen Gobletzell-Apikalmembranen

Zur Anreicherung von Apikalmembranen der Gobletzellen wurde die Methode von Cioffi und

Wolfersberger (1983), modifiziert durch Wieczorek et al. (1990), verwendet. Als Ausgangs-

material dienten posteriore Mitteldärme aus M. sexta Raupen (5. Larvenstadium, 5-7 g). Diese

wurden nach Entfernen der Längsmuskulatur entfaltet, in ca. 2 mm große Stücke geschnitten

und in eiskaltem SET-Puffer gesammelt. Durch Ultraschall (Branson-Sonifier 250, Mikro-

spitze, Ausgangsleistung 2, Arbeitspuls 35%/s, 15-25 Pulse) wurde zunächst der Mikrovilli-

saum der Columnarzellen abgeschert und der Zellinhalt durch dreimaliges Waschen mit SET-

Puffer entfernt. Die Apikalmembran der Gobletzellen wurde durch Triturieren mit einer

Pasteurpipette vom Rest des Zellverbandes gelöst und durch Filtrieren (4 Lagen Gaze)

abgetrennt. Die so gewonnenen Membranen wurden abzentrifugiert, in SET resuspendiert und

in einem gestuften Saccharosedichtegradienten (3 ml 45%, 3 ml 41% und 3 ml 37%

Saccharose in ET w/w) 4 h bzw. über Nacht bei 107.000 x g und 4°C isopyknisch

zentrifugiert (SW 41 Ti Rotor, Beckman). Die an der Grenze von 37% und 41% Saccharose

angereicherten Gobletzell-Apikalmembranen wurden vom Saccharosegradienten

abgenommen, in 4 Schritten (0,5, 1, 1 und 1,5 Volumenteile) langsam mit ET-Puffer 1:5

verdünnt und bei 10.000 x g (30 min, 4°C, Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman)

zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml SET-Puffer resuspendiert, bei 48.000 x g (15 min, 4°C,

Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman) erneut zentrifugiert und entweder direkt weiter

verwendet oder in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei –20°C gelagert.

Die Präparation von reiner GCAM (Wieczorek et al., 1990) erfolgte bis zur Verdünnung der

vom Saccharosedichtegradienten abgenommenen Bande wie oben beschrieben, allerdings

enthielt der Gradient kein EDTA. Die verdünnte Suspension wurde dann auf

Corexzentrifugengläser verteilt (5-6 ml pro Röhrchen), mit 4 Pulsen ultrabeschallt (Branson-

Sonifier 250, Mikrospitze, Ausgangsleistung 2, Arbeitspuls 35%/s) und für 30 min bei 10.000

x g zentrifugiert (4°C, Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman). Dabei lösen sich vor allem

noch an der GCAM anhaftende Mitochondrien. Die Überstände, die reine GCAM enthielten,

wurden in einem Erlenmeyerkolben auf Eis gesammelt, die Pellets in jeweils 3 ml SET

Methoden

17

resuspendiert und erneut, wie vorher beschrieben, beschallt und zentrifugiert. Nach

zweimaliger Wiederholung dieser Prozedur wurden die gesammelten Überstände aus den 4

Zentrifugationsschritten auf Polycarbonatröhrchen verteilt und für 1 h bei 30.000 x g

zentrifugiert. Das durchsichtige Pellet, welches die gereinigte GCAM enthielt, wurde in dem

für die Versuche relevanten Puffer resuspendiert und auf Eis bzw. im Kühlschrank gelagert.

3.1.2. Reinigung des V1Vo Holoenzyms aus angereicherter GCAM oder aus Mitteldarmroh-homogenat

Zur Reinigung von V1Vo Holoenzyms wurden zunächst tiefgefrorene angereicherte

Gobletzell-Apikalmembranen benutzt und direkt wie weiter unten beschrieben solubilisiert

und aufgereinigt (Schweikl et al., 1989). Um eine höhere Ausbeute an V1Vo Holoenzym mit

weniger Aufwand zu erhalten, wurde eine modifizierte Präparation aus Rohhomogenat von

ganzen Mitteldärmen entwickelt. Dazu wurden isolierte Mitteldärme von bis zu 24, für 15 min

auf Eis gekühlten Raupen (5. Larvalstadium) in kaltem Puffer SETP (250 mM Saccharose, 5

mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 5 mM Pefabloc SC, pH 8,1) mit einem Ultraturrax (IKA,

Deutschland) 30 s bei 20500 rpm homogenisiert. Nach einer Zentrifugation von 5 min bei

10.000 x g und 4°C in einem Festwinkelrotor (Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman)

wurde das Pellet in SETP resuspendiert und erneut unter den gleichen Bedingungen

zentrifugiert. Dieses Pellet wurde wieder in SETP aufgenommen und, um das noch

vorhandene Fett effektiv abzutrennen, nun für 30 min bei 200.000 x g und 4°C in einem

Festwinkelrotor (90 Ti, Beckman) zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in TEM mit

0,1% C12E10 bei 4°C solubilisiert, wobei im Falle der tiefgefrorenen angereicherten

Gobletzell-Apikalmembran das Detergens zu Protein Verhältnis dabei 2:1 betrug. Für das

Membranpellet aus dem Rohhomogenat von 24 Raupen wurden standardmäßig 400 ml TEM

mit 0,1% C12E10 verwendet. Nach einer 1-stündigen Zentrifugation (200.000 x g, 4°C, 90 Ti,

Beckman) wurde der Überstand mit den gelösten Proteinen durch eine Membran mit einer

Porengröße von 0,22 µm filtriert und entweder durch Ultrafiltration in einer Rührzelle unter

Druck oder per Zentrifugation in Mikrokonzentratoren ankonzentriert (beide Amicon, 10 kDa

Ausschlußgröße). Das Konzentrat von höchstens 4 Raupen wurde auf je einen

diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet (3 ml 40%, 2 ml 30%, 2 ml 20% und

1,6 ml 10% Saccharose gelöst in TEM mit 0,01% C12E10 und 200 mM KCl) und für 90 min

bei 310.000 x g und 4°C zentrifugiert (Vertikalrotor VTi 65.1, Beckman). Mit der 30%

Fraktion wurde nach einer 4-fachen Verdünnung mit LOMC-Puffer (20 mM Tris-HCl, 9,6

Methoden

18

mM 2-Mercaptoethanol, 0,01% C12E10, pH 8,1, mit 50 mM NaCl) eine Anionenaustauscher

Chromatographie mittels FPLC auf einer Mono Q bzw. Resource Q (beide Säulen und FPLC,

Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) oder mittels HPLC auf einer Hyper D Q Säule

(HPLC Biosys 2000, Beckman; Säule, Biosepra) durchgeführt. Das V1Vo Holoenzym eluierte

in einem linearen Salzgradienten (50 – 400 mM NaCl in LOMC) zwischen 230 und 280 mM

NaCl. Mit Hilfe eines Zentrifugalkonzentrators (Ausschlußgröße 100 kDa) wurde das Eluat

auf 100 µl ankonzentriert. Der letzte Reinigungsschritt erfolgte mittels FPLC über eine

Gelpermeationssäule (Superdex 200 Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) mit dem

Puffer LOMC, der 150 mM NaCl enthielt.

3.1.3. Reinigung des Vo Komplexes aus angereicherter GCAM oder aus Mitteldarmroh-homogenat

Bei den ersten Versuchen, den Vo Komplex der V-ATPase aus dem Mitteldarm von M. sexta

zu reinigen, wurde zunächst die Gobletzell-Apikalmembran aus Raupen im 5. Larvenstadium,

die für 16-20 h gehungert hatten, genau wie für das V1Vo Holoenzym (3.1.1-2) beschrieben

angereichert, solubilisiert und gereinigt. Der Vo Komplex befand sich in der 20% Saccharose

Fraktion des diskontinuierlichen Gradienten, welche dann auch weiter verarbeitet wurde.

Auch hier wurde, um eine höhere Ausbeute zu erzielen, auf das Rohhomogenat von ganzen

Därmen hungernder Tiere als Startmaterial zurückgegriffen. Als weitere Modifikation des

Protokolls wurde das zweite Pellet der Zentrifugation bei 12.000 x g in ETPKI (5 mM EDTA,

5 mM Tris-HCl, 5 mM Pefabloc SC, 0,8 M KI, pH 8,1) resuspendiert und für 30 min auf Eis

inkubiert. Anschließend wurde die Probe mit TEM auf eine KI Konzentration von 40 mM

verdünnt und bei 200.000 x g für 30 min bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in TEM

resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Das letzte Pellet wurde dann genau wie das V1Vo

Holoenzym (3.1.2.) solubilisiert und gereinigt, nur dass, wie schon erwähnt, hierbei die 20%

Saccharose Fraktion nach der zonalen Zentrifugation für die Anionenaustauscher- und die

Gelpermeationschromatographie weiter verwendet wurde.

3.1.4. Reinigung des V1 Komplexes aus Mitteldarm

Der V1 Komplex aus dem Mitteldarm wurde nach der Methode von Gräf et al. (1996) mit

einigen wichtigen Modifikationen durchgeführt. Die Mitteldärme von bis zu 30 eisgekühlten

Methoden

19

Raupen (Ernährungs-, bzw. Entwicklungsstatus versuchsabhängig) wurden in eiskaltem

MENT-Puffer gesammelt, dreimal mit diesem gewaschen und in 5 ml MENTP mit einem

Ultraturrax bei 20500 rpm für 50 s homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 10.000 x g und

4°C in einem Festwinkelrotor (JA-25.50, Beckman) für 5 min, und der daraus resultierende

Überstand 30 min bei 200.000 x g und 4°C in einem Festwinkelrotor (90 Ti, Beckman)

zentrifugiert. Dieser Überstand wurde nach einer Filtration (0,22 µm) langsam mit einem

gleich großen Volumen kalter gesättigter Ammoniumsulfatlösung gemischt und unter Rühren

für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Das Präzipitat wurde durch eine 5-minütige Zentrifugation

bei 10.000 x g und 4°C in einem Festwinkelrotor (JA-25.50, Beckman) pelletiert, in TEN-

Puffer mit 9,6 mM β-Mercaptoethanol resuspendiert, auf einen diskontinuierlichen

Saccharosegradienten (3 ml 40%, 2 ml 30%, 2 ml 20% und 1,6 ml 10% Saccharose in TEN-

Puffer mit 9,6 mM β-Mercaptoethanol, ein Gradient pro 4 Raupenausgangsmaterial)

geschichtet und für 90 min bei 310.000 x g-Max und 4°C zentrifugiert. Die gesamte 30%-

Saccharosefraktion (2 ml) und die untere Hälfte (1 ml) der 20%-Saccharosefraktion wurden

gepoolt, filtriert (0,22 µm) und mittels eines FPLC- oder HPLC-Systems (Pharmacia oder

Beckman) über eine Anionenaustauschersäule (Mono Q, Pharmacia oder Hyper D Q,

Biosepra) weiter aufgereinigt. Der V1-Komplex eluiert in einem linearen Salzgradienten (50 –

400 mM NaCl in LOM) bei ca. 220 mM als einzelner Peak. Dieser wurde durch Ultrafiltration

(100 kDa Ausschlußgröße) auf 100 µl ankonzentriert und über

Gelpermeationschromatographie (FPLC, Superdex 200, Pharmacia) endgültig gereinigt.

3.1.5. SDS-PAGE

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde modifiziert nach Lämmli et al.

(1970) in vertikalen Gelkammern unterschiedlicher Fabrikate durchgeführt (BIORAD,

Hoefer, Biometra). Die Proteinproben wurden mit einer 5-fach Stammlösung

Probenauftragspuffer auf eine Endkonzentration von 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 5%

Saccharose, 2% SDS, 0,005% Bromphenolblau und 2% β-Mercaptoethanol gebracht, für 45 s

bzw. 3 min bei 95°C erhitzt und auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden entweder direkt auf

ein Gel geladen oder bei -20°C bis zur Verwendung gelagert. Waren die

Proteinkonzentrationen sehr niedrig, wurden die Proben mit Trichloressigsäure (10%

Endkonzentration) für 30 min auf Eis gefällt. Zweimal mit eiskaltem Aceton gewaschen und

für je 10 min zentrifugiert (20.000 x g 10, 4°C, Festwinkelrotor). Anschließend wurden die

Methoden

20

Proben in einem angemessenen Volumen einfach konzentriertem Probenauftragspuffer

resuspendiert und wie oben weiter behandelt.

Falls nicht anderweitig beschrieben, bestanden die Sammelgele aus 5,4% T/ 2,3% C Acryl-

amid in 125 mM Tris-HCl pH 6,8 und 0,2% SDS. Für die Trenngele wurde entweder 17% T/

0,4% C oder 12% T/ 0,4% C in 330 mM Tris-HCl pH 8,7, 01% SDS verwendet. Der

Laufpuffer enthielt 100 mM Tris, 100 mM Glycin, 0,1% SDS und pH 8,8. Die Elektophorese

wurde in der Regel mit einer konstanten Stromstärke von 15 mA/Gel gestartet. Nachdem die

Probe vollständig ins Sammelgel eingelaufen war wurde die Stromstärke auf 30 mA/Gel

erhöht.

Alternativ wurde außerdem die Tricine-SDS-PAGE nach Schägger & Jagow (1987) in einer

Hoefer SE 600 Kammer (Pharmacia) verwendet. Die Gele setzten sich aus einem Trenngel

(16,5% T, 3% C), Spacergel (10% T, 3% C) und einem Sammelgel (4% T, 3% C) zusammen.

Die Proben wurden mit 3-fach Probenauftragspuffer (Endkonzentration: 4% SDS, 12%

Glycerin, 2% β-Mercaptoethanol, 0,01% Serva blue G 50 mM Tris-HCl pH 6,8) versetzt und

entweder für 45 s bei 95°C erhitzt oder für 30 min bei 40°C inkubiert. Die Elektrophorese

wurde mit 35 V gestartet, und, nachdem die gesamte Probe ins Gel eingewandert war (ca. 1h),

bei 90 V für 16 h durchgeführt (Anodenpuffer, 200 mM Tris-HCl pH 8,9; Kathodenpuffer,

100 mM Tris, 100 mM Tricine, 0,1% SDS pH 8,25).

Für die mit J-Concanolid A markierten Proben wurden teilweise auch Gradientengele mit 10-

15% T und 3,3% C verwendet (Ratajczak, 1994).

3.1.6. Proteinbestimmung

Die photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration mit Amidoschwarz erfolgte nach

Wieczorek et al. (1990) modifiziert nach Popov et al. (1975). Der Test beruht auf der

Bindung des Farbstoffes Amidoschwarz an basische Aminosäuren und hat den Vorteil, dass

er bei hoher Sensitivität relativ unempfindlich gegen Detergenzien, Reduktionsmittel und

viele bei anderen Proteinnachweisen störende Substanzen ist. Die Proteinproben wurden mit

jeweils 300 µl der Amidoschwarzlösung versetzt und 5 min bei RT inkubiert. Anschließend

wurde bei 14000 rpm (Eppendorf-Tischzentrifuge) 4 min zentrifugiert, der Überstand

abgesaugt, das Pellet zweimal mit 500 µl Essigsäure/Methanol (1:10) gewaschen und für je 3

min zentrifugiert. Dann wurde das Pellet in 350 µl 0,1 N NaOH gelöst, die Extinktion bei 615

Methoden

21

nm gemessen und die Proteinmenge mit einer parallel erstellten Eichreihe aus BSA-

Standardlösungen (2, 4 und 6 µg BSA) bestimmt.

3.1.7. Western Blot

Um die aufgetrennten Proteine nach einer Gelelektrophorese auf eine PVDF- oder

Nitrocellulosemembran zu übertragen, wurden Western-Blots nach Towbin et al. (1979) im

Semidry-Verfahren (Trans-Blot SD, BIO-RAD) durchgeführt. Das benutzte dreiteilige

Puffersystem nach Khyse-Anderson (1984) wurde durch Zugabe von 20% Methanol zu den

Blotpuffern modifiziert. Der Transfer war in der Regel nach 60 min bei 1 mA/cm2 Gelfläche

quantitativ abgeschlossen, was durch reversibles Färben der Blotmembran mit 0,02% Ponceau

S und Anfärben des Gels mit Coomassie Blau R-250 überprüft wurde.

3.1.8. Reinigung von Antikörpern

Die verwendeten Antikörper aus Blutseren bzw. Hybridomazellkulturüberständen wurden per

Affinitätschromatographie über Protein A- bzw. Protein G-gekoppelten Sepharosesäulen

(Pharmacia und Sigma) gereinigt. Entsprechend dem für die Produktion von Antikörpern

verwendeten Wirtsorganismus wurde das Säulenmaterial mit der jeweils höheren Affinität

ausgewählt. Zunächst wurden die Proben mit TBS (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,6)

5-fach verdünnt, sterilfiltriert (0,22 µm) und auf die Säule aufgetragen. Anschließend wurde

mit TBS gewaschen und die gebundenen Antikörper mit Elutionspuffer (0,1 M Glycin-HCl

pH 2,7) eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden durch vorgelegten Neutralisationspuffer

(1 M Tris-HCl pH 8,0) neutralisiert. Mit Hilfe von Dotblots wurden die Fraktionen, welche

Antikörper enthielten, bestimmt, gepoolt und gefriergetrocknet.

Bei den Antiseren gegen Fusionsproteine mit maltosebindendem Protein (MBP) wurden die

spezifischen Antikörper gegen MBP mittels Affinitätschromatographie im Batch-Verfahren

entfernt. Hierzu wurde 1 mg MBP (New England Biolabs) an 60 mg Cyanbromid-aktivierte

Sepharose 4B (Sigma) gekoppelt, mit 100 mM Glycin-HCl (pH 2,7) gewaschen und mit 2 ml

TBS-Puffer äquilibriert. Dann wurden zu 500 µl Aliquots der Immunseren 125 ml 5x TBS-

Puffer gegeben, filtriert (0,45 µm) und mit der MBP-Sepharose vermischt. Nach 1,5 h

Inkubation bei Raumtemperatur wurde die MBP-Sepharose bei 2000 x g (5 min, RT)

pelletiert und der Serumüberstand abgenommen. Anschließend wurden die MBP-Antikörper

Methoden

22

mit 100 mM Glycin-HCl (pH 2,7) von der MBP-Sepharose eluiert und mit (1 M Tris-HCl pH

8,0) neutralisiert. Die MBP-Sepharose wurde mit TBS-Puffer regeneriert und

wiederverwendet. Die Abreicherung der MBP-Antikörper aus dem Serum wurde mit Dotblots

kontrolliert und mit dem Serumüberstand wiederholt, bis das Eluat der MBP-Sepharose keine

Antikörper gegen MBP mehr enthielt.

3.1.9. Immunfärbung

Um unspezifische Markierungen zu verhindern, wurde die Blotmembran zunächst für bis zu

60 min in Blockpuffer und anschließend mit einer Verdünnung des primären Antikörpers in

Verdünnungspuffer für eine weitere Stunde inkubiert (siehe Tab. 1). Nachdem die Blot-

membran durch 3 x 5 min waschen mit TTBSN von überschüssigen primären Antikörpern

befreit war, erfolgte eine einstündige Inkubation mit den entsprechenden sekundären

Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase gekoppelt waren (Verdünnungen siehe Tab.1).

Nicht gebundene Antikörper wurden durch 3-maliges Waschen mit TTBSN (je 5 min)

entfernt, die Membran mit destilliertem Wasser gespült und die spezifisch immunmarkierten

Proteinbanden durch Zugabe des APP-Puffers mit NBT/BCIP sichtbar gemacht.

Tab.1: Übersicht der verwendeten Antikörper. Die monoklonalen Antikörper in Mäusen und die polyklonalen Antikörper in Kaninchen wurden in unserem Labor hergestellt. Die polyklonalen Antikörper aus Meerschweinchen wurden durch die Firma Charles River (Deutschland) hergestellt. Antikörper Antigen: Hergestellt in: Verdünnung

90-7 E Untereinheit Maus, monoklonal 1:100

47-5 E und G Untereinheit Maus, monoklonal 1:100

221-9 A Untereinheit Maus, monoklonal 1:10-100

224-3 B und e Untereinheit Maus, monoklonal 1:10-100

488-1,2 C Untereinheit Meerschweinchen, polyklonal 1:1000

C23 B Untereinheit (AS 243-428) Meerschweinchen, polyklonal 1:1000

C34 B Untereinheit (AS 475-494) Meerschweinchen, polyklonal 1:100

M40 d Untereinheit Meerschweinchen, polyklonal 1:1000

353-1,2,4 V1 Komplex Meerschweinchen, polyklonal 1:10000

373-3 a Untereinheit aus Rind M115 Kaninchen, polyklonal 1:100

K2 Holoenzym Kaninchen, polyklonal 1:10000

Methoden

23

3.1.10. Coomassie-Färbung

Die Gele wurden im Anschluß an die Elektrophorese für mindestens 30 min mit Coomassie-

Lösung (0,25% Coomassie Brilliant-Blue R-250 w/v, 50% Methanol und 10% Essigsäure)

fixiert und gefärbt (Bollag & Edelstein, 1991). Zur Entfärbung wurden die Gele entweder für

15 min in 200 ml H2O/Gel in einer Haushaltsmikrowelle (600 W) gekocht oder mit einem

zweiteiligen Puffersystem für 30 min in Entfärber I (25% Isopropanol, 10% Essigsäure) und

danach für 60 min Entfärber II (7,5% Methanol, 10% Essigsäure) entfärbt.

3.1.11. Silber-Färbung

Wenn es nötig war geringe Proteinmengen, besonders membranständiger Untereinheiten auf

den Gelen zu visualisieren, wurde die Methode der Silberfärbung nach Heukeshoven &

Dernick (1988) benutzt. Dafür wurden die Gele zuerst für 30 min fixiert (40% Ethanol, 10%

Essigsäure) und anschließend für 30 min sensitiviert (30% Ethanol, 0,125% Glutaraldehyd

(w/v), 0,2% Thiosulfat (w/v) und 6,8% Natriumacetat (w/v)). Nach 3-maligem Waschen mit

H2O (5 min) wurde für 20 min die eigentliche Silberreaktion durchgeführt (0,25% Silbernitrat

(w/v) und 0,015% Formaldehyd(w/v)). Die Entwicklung, sprich die Reduktion der

Silberionen erfolgte in einer Lösung aus 2,5% Natriumcarbonat (w/v) und 0,0075%

Formaldehyd (w/v). Durch Waschen mit 1,5% Na-EDTA (w/v) wurde die Entwicklung

gestoppt. Um ein Zerspringen der Gele bei der Trocknung zu vermeiden, wurden sie für

mindestens 30 min in 30% Ethanol mit 4% Glycerin inkubiert.

3.1.12. Markierung mit 14C-DCCD

Die Markierung und Identifizierung des Proteolipids, der Untereinheit c der V-ATPase durch 14C-N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (14C-DCCD) erfolgte in Anlehnung an Lepier et al.

(1996). Dazu wurde zunächst 6 µg Protein in 500 µl DCCD-Labellingpuffer (50 mm Tris-

MOPS pH 8,1, 1 mM MgCl2, 1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 10 µM 14C-DCCD

(0,3 µCi)) für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Probe wurde, wie unter (3.1.7.) beschrieben, mit

TCA gefällt und für die SDS-PAGE vorbereitet, wobei sie allerdings nicht auf 95°C erhitzt,

sondern 1 h bei 37°C inkubiert wurde, um ein Aggregieren des Proteolipids zu verhindern.

Nach der Gelelektrophorese, dem Färben mit Coomassie Brilliant-Blue 250-R und dem

Methoden

24

Entfärben wurde das Gel, vor dem Trocknen auf Whatmanpapier für je 30 min in

ENHANCE-Lösung (DuPont) und in kaltem H2O inkubiert. Für die Autoradiographie der mit 14C-DCCD markierten Banden wurde das getrocknete Gel entweder auf einen Kodak XAR 5

Röntgenfilm ohne Verstärkerscreen oder auf einen Phosphoscreen für mehrere Tage aufgelegt

und anschließend entwickelt bzw. mit einem Phosphoimager ausgewertet.

3.1.13. Markierung mit 125J-Concanamycin A

20-30 µg der Proben wurden in einem Volumen von 30-40 µl mit 0,01-100 µM 9-O-[p-

(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-concanolid A (J-Con-

canolid A) für 1 h auf Eis oder 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf Eis

für 3-5 min UV bestrahlt (366 nm, 2 x 6 W). Die Proben für die Schutzversuche wurden

zusätzlich mit 1 µM, 10 µM, 100 µM und 300 µM Concanamycin A bzw. mit 10 µM und 100

µM der anderen Substanzen für 1 h auf Eis vor Zugabe des J-Concanolid A vorinkubiert. Alle

Makrolide wurden in DMSO gelöst, die Konzentration anhand ihres Extinktionskoeffizienten

in Methanol photometrisch bestimmt, aliquotiert, bei -70°C gelagert und nur einmal direkt vor

dem entsprechenden Versuch aufgetaut. Nach der Bestrahlung wurden 7,5 –10 µl 5-fach SDS-

Probenpuffer hinzugefügt, die Proben für 45 s auf 95°C erhitzt oder für 30 min bei 40°C

inkubiert, auf Eis abgekühlt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Die Gele wurden entweder mit

Coomassie gefärbt und nach dem Entfärben auf Whatmanpapier getrocknet oder mit Zn2+-

gefärbt und in Folie eingeschweißt. Anschließend wurden sie für bis zu 72 h auf einem

Phosphoscreen exponiert. Die Auswertung erfolgte mit einem Phosphoimager (Molecular

Probes). Nach der Exposition wurden die Zn2+-gefärbten Gele mit Coomassie nachgefärbt und

gegebenenfalls die Untereinheit c für MALDI-MS-Analysen bzw. die Messung der

gebundenen Radioaktivität in einem Gamma-Counter (Philips, PW 4800) ausgeschnitten.

3.1.14. Isoelektrische Fokussierung mit anschließender 2-D Elektrophorese

Für die isoelekrische Fokussierung der Proteinkomplexe wurde das DryStrip-System von

Pharmacia benutzt. Dazu wurden die Drystrips in 240 µl Rehydrierungslösung (8 M

Harnstoff, 2% Chaps, 2% IPG-Puffer, 0,3% DTT und 0,01% Bromphenolblau) über Nacht

rehydriert und dann auf einer Multiphor II in der "Drystripwanne" positioniert. Die Proben

wurden mit Probenauftragspuffer versetzt (9,8 M Harnstoff, 2% β-Mercaptoethanol, 2% IPG-

Puffer, 0,5% Triton X-100) und mittels Probenauftragsbechern kathodisch aufgetragen. Die

Elektrophorese erfolgte zunächst für 4,5 h bei 300 V und dann für 11,5 h bei 2000 V.

Methoden

25

Anschließend wurden die Drystrips entweder sofort weiter verwendet oder bei -70°C gelagert.

Für die zweite Dimension wurden die Drystrips zuerst 10 min in Äquilibrierungslösung I (100

mM Tris-HCl pH 6,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 1% SDS, 1% DTT) und dann 10 min in

Äquilibrierungslösung II (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 1% SDS,

200 mM Jodacetamid und 0,01% Bromphenolblau) inkubiert und auf ein vertikales SDS-Gel

(Sammelgel ohne Taschen) in einer Biometra-Kammer aufgelegt. Die Elektrophorese erfolgte

wie unter (3.1.7.) beschrieben.

3.1.15. Röntgenkleinwinkelstreuung

Die Röntgenkleinwinkelstreuungsexperimente wurden zusammen mit Dr. Gerhard Grüber

(Osnabrück) und Dr. Michel Koch (EMBL, Hamburg) in der Hamburg Outstation des EMBL

wie in Svergun et al. (1998) für den V1 Komplex beschrieben durchgeführt.

3.1.16. Matrix-unterstützte Laserdesorptions Ionisations Massenspektroskopie (MALDI-MS)

Die massenspektrometrischen Untersuchungen der Untereinheiten der V-ATPase wurden von

Dr. Simone König im Proteomik-Labor der Zentralen Projektgruppe "Integrierte Funktionelle

Genomik" des Interdisziplinären Klinischen Forschungszentrum der Medizinischen Fakultät

der Universität Münster durchgeführt. Nach der SDS-PAGE wurden die mit Coomassie

gefärbten Proteinbanden mit einer modifizierten Methode nach Shevchenko et al. (1996) und

Zhang et al. (1998) für die Massenspektrometrie vorbereitet. Die Banden wurden

ausgeschnitten und mit 25 mM NH4HCO3 in 50% Methanol entfärbt. Das Gelstück wurde

zunächst mit Eisessig/Methanol/Wasser (10/45/45, v/v/v) 30 min und anschließend mit

Wasser 30 min gewaschen. Danach wurde es mit Acetonitril geschrumpft, getrocknet und in

20 µl 50 mM NH4HCO3 mit 400 ng Trypsin oder Chymotrypsin rehydriert. Überschüssige

Proteaselösung wurde entfernt und das Gelstück mit Puffer überschichtet. Der Verdau (37°C,

über Nacht) wurde durch Zugabe von 5-10 ml Eisessig gestoppt und der Überstand in ein

neues Eppendorfreaktionsgefäß transferiert. Das Gelstück wurde zweimal mit 70 µl

Acetonitril extrahiert und die Überstände vereinigt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in

7 µl 0,1% wässriger TFA gelöst, mit ZipTips (Millipore, Bedford, MA, USA) gereinigt und

die Peptide mit 7 µl 70% Acetonitril eluiert. Für die Matrix wurden 10 mg a-cyano-4-

hydroxycinnamic Säure mit Aceton gewaschen und in 1 ml Acetonitril/Ethanol (50/50, v/v)

mit 1% 0,1% wässriger TFA aufgenommen. Davon wurden 0,7 µl und 0,7 µl Probe auf den

Probenträger aufgebracht und sofort gemischt. Für die MALDI wurde ein TofSpec-2E Gerät

Methoden

26

(Micromass Ltd., Manchester, UK) benutzt. Die Proben wurden im positive ion reflectron

mode mit einer Matrix-Unterdrückung von 500 gemessen. Die Massen-Kalibrierung erfolgte

extern und wurde entweder mit der lock mass Option oder den Trypsin Autolyse Peaks intern

korrigiert.

3.1.17. N-terminale Sequenzierung

Für die N-terminalen Sequenzierungen wurde das V1Vo Holoenzym, der V1 Komplex oder der

Vo Komplex wie beschrieben gereinigt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-

Membran geblottet. Anschließend wurden die Proteine mit Amidoschwarz- oder Coomassie-

Färbung sichtbar gemacht und die entsprechenden Banden ausgeschnitten. Die Sequenzierung

der Proben erfolgte durch Dr. Roland Schmid (Universität Osnabrück) bzw. durch Dr.

Barbara Schedding (Universität Münster) entweder in einem Applied Biosystems Sequencer

Modell 473A oder Modell 492-01.

3.1.18. ATPase-Aktivitätstest und Phosphatbestimmung

Um die spezifische ATPase-Aktivität der verschieden Proben zu ermitteln, wurde das bei der

Hydrolyse von ATP entstehende anorganische Phosphat photometrisch bestimmt (Wieczorek

et al., 1990). Der Vorteil dieser verwendeten Methode gegenüber anderen Pi-Bestimmungen

liegt in ihrer hohen Sensitivität (Extinktion 0,3 ? 4 ng Pi) und in ihrer Linearität bis zu einer

Extinktion von über 2. Der Standardansatz mit einem Endvolumen von 160 µl enthielt 50 mM

Tris-MOPS (pH 8,1), 20 mM KCl, 1 mM Tris-ATP, 3 mM β-Mercaptoethanol und 1 mM

MgCl2 bzw. 3 mM CaCl2. Nach einer 5-10 minütigen Vorinkubation ohne Substrat im

Wasserbad bei 30°C wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von ATP gestartet, nach Ablauf

der gewählten Reaktionszeit durch Tiefgefrieren in flüssigem Stickstoff gestoppt und die

Probe danach bei -20°C gelagert.

Die Quantifizierung des freigesetzten anorganischen Phosphats erfolgte photometrisch als

Malachitgrün-Phosphomolybdat-Komplex. Zu den 160 µl der tiefgefrorenen Probe des

Aktivitätstests wurden 50 µl 20% Trichloressigsäure pipettiert und das Ganze im Wasserbad

bei 70°C aufgetaut. Das ausgefallene Protein wurde durch Zentrifugation pelletiert (1 min,

13200 rpm, Eppendorf-Tischzentrifuge 5415D). Exakt 3,5 min nach der TCA-Zugabe wurden

60 µl des Überstandes mit 100 µl saurem Molybdat (2,4% H2SO4, 60 mM Na-Molybdat)

vermischt. Nach weiteren 15 s wurden 30 µl Malachitgrünlösung (7,4% in gesättigtem,

filtriertem Polyvinylalkohol) zupipettiert. Nach insgesamt 5 min 45 s wurde nicht

Methoden

27

komplexiertes Malachitgrün mit 200 µl 7,8% H2SO4 zerstört. Die Extinktion der

resultierenden Lösung bei 625 nm wurde nach 70-100 min photometrisch bestimmt

(SpektraMax Plus, Molecular Devices) und der Phosphatgehalt an Hand von mitgeführten

Phosphatstandardwerten (0, 10 und 25 nmol) errechnet.

3.1.19. Bestimmung und Entfernung endogener Nukleotide

Der Nachweis und die Quantifizierung der im Enzym fest gebundenen Nukleotide erfolgte

mit der leicht modifizierten Luciferin/Luciferase-Methode nach Senior et al. (1992). Die

Proben wurden in einem Volumen von 100-200 µl (Proteinkonzentration zwischen 0,5 und 2

µg/µl; Puffer für den V1 Komplex 150 mM NaCl, 9,6 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris-

HCl pH 8,1 und für das V1Vo Holoenzym zusätzlich 0,01% C12E10) für 5 min bei 100°C

denaturiert, auf Eis abgekühlt und das denaturierte Protein 5 min bei 4°C abzentrifugiert

(20.000 x g, Beckman-Tischzentrifuge). Der Überstand wurde abgenommen, bei -20°C

eingefroren und dort bis zur Bestimmung des Nukleotidgehalts gelagert.

Um das freigesetzte ATP zu messen, wurden zu 10 oder 20 µl des Überstandes zu 500 µl

Luciferin/Luciferase-Puffer (60 mM Tris-Acetat pH 7,75, 10 mM MgCl2, 1 mM KCl, 1,5 mM

EDTA, 2,5 mM β-Mercaptoethanol und 0,4 mg/ml Luciferin/Luciferase (Sigma)) gegeben.

Nach 30 s Vorinkubation wurde in einem Luminometer (Lumat LB 9507, EG &G Berthold)

die Lichtemission für 60 s gemessen. Zur Quantifizierung des ATP-Gehaltes wurde jeweils

parallel zu den Proben eine Eichreihe (0,1 pmol-1 nmol ATP) und eine nur Puffer enthaltende

Kontrolle mitgeführt. Die Eichung ergab jeweils eine lineare Beziehung zwischen der Menge

an eingesetztem Nukleotid und der gemessenen Lichtemission.

Zur Bestimmung des freigesetzten ADPs wurden zu 10 oder 20 µl des Überstandes 90 µl

Luciferin/Luciferase-Puffer (ohne Luciferin/Luciferase) und 10 µl Pyruvatkinase-Lösung (70

mM Tris-Acetat pH 7,75, 9 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2 mM Phosphoenolpyruvat, 2 mM

EDTA und 500 U/ml Pyruvatkinase) gegeben und das Ganze für 40 min bei 30°C inkubiert.

Anschließend wurde die Probe mit 400 µl Luciferin/Luciferase-Puffer vermischt und die

Lichtemission nach Ablauf von 30 s für 1 min gemessen. Auch hier wurde jeweils parallel

eine ADP-Eichreihe (0,1 pmol-1 nmol ADP), welche ebenfalls eine gerade Eichkurve ergab,

und eine Pufferkontrolle mitgeführt.

Zur Entfernung von Nukleotiden aus dem V1 Komplex wurde im Anschluß an die

Standardreinigung (3.1.4.) eine zusätzliche Gelpermeationschromatographie auf einer

Superdex 200 Säule (Pharmacia) durchgeführt, wobei dem Laufpuffer (150 mM NaCl, 20 mm

Methoden

28

Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-Mercaptoethanol) entweder a) nichts (Kontrolle), b) 25%

Methanol, c) 5 mM EDTA oder d) 0,01% C12E10 zugesetzt wurden.

Außerdem wurde noch ein nach Senior et al., (1992) adaptiertes Verfahren mit einer

Sephadex G-50 Säule (1,6 cm x 100 cm, Flußrate 0,03 ml/min, RT) und einem Säulenpuffer

aus 100 mM Tris-SO4 pH=8,0, 4 mM EDTA, 50% Glycerin verwendet. Zur Kontrolle wurde

ein entsprechendes Aliquot parallel bei RT inkubiert.

Letztlich wurde auch versucht, Nukleotide durch Behandlung des V1 Komplexes mit

alkalischer Phophatase (APP) zu entfernen (Digel et al., 1996). Hierzu wurden 460 µg V1

Komplex in 110 µl Puffer (150 mM NaCl, 20 mm Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-

Mercaptoethanol) mit 57 U APP (Stratagene, Nr. 6000015) für 18 h bei 25°C in einem

Eppendorfschüttler (300 rpm) inkubiert. Zur Kontrolle wurde parallel je ein Aliquot mit V1

Komplex ohne APP und ein Aliquot ohne V1 Komplex mit APP inkubiert. Anschließend

wurde die APP mittels FPLC auf einer Superdex 200 Säule (Pharmacia) quantitativ vom V1

Komplex abgetrennt, was mit Hilfe der NBT/BCIP-Reaktion in einem Titerplattentest der

Fraktionen überprüft wurde.

3.1.20. Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen (KI-Stripping)

Der V1 Komplex wurde in 0,8 M KI, 150 mm NaCl, 20 mm Tris-HCl und 9,6 mM 2-

Mercaptoethanol bei pH 8,1 für 45 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde mit der Probe

eine Gelpermeationschromatographie auf einer Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia) mittels

FPLC bei einer Flußrate von 0,5 ml/min im gleichen Puffer ohne KI durchgeführt.

3.1.21. Messung des ATP-getriebenen Protonentransports

Der ATP-getriebene Protonentransport wurde an GCAM-Vesikeln nach Wieczorek et al.

(1991) gemessen. Dazu wurden die Membranpellets in THTCl resuspendiert und ein

Standardansatz von 790 µl (pH=8,1) vorbereitet, der sich folgendermaßen zusammensetzte:

20 µl 40 mM Tris-ATP in 200 mM Tris, 10 µl 75 µM Acridinorange, 10 µl THTCl-Vesikel, 8

µl 50 mM NaN3 in THTCl, 8 µl 10 mM Na3VO4 in THTCl und 734 µl THTCl; wenn mehr

als 10 µl THTCl-Vesikel verwendet wurden, verringerte sich das THTCl-Volumen

entsprechend. Die Reaktion wurde mit 10 µl 80 mM MgCl2 gestartet, so dass sich bei einem

Endvolumen von 800 µl die Konzentrationen von 1 mM ATP, 0,9 µM Acridinorange, 0,5

mM NaN3, 0,1 mM Na3VO4 und 1 mM MgCl2 in THTCl ergaben. Die Ansäuerung des

Vesikelinneren durch die V-ATPase wurde fluorometrisch gemessen (Fluorometer: LS 50 B,

Methoden

29

Perkin Elmer) und aufgezeichnet. Die Rückstellung der Fluoreszenz erfolgte durch Zerstörung

des Protonengradienten mit 10 µl 1,6 M KCl bzw. 10 µl 1,6 M NH4Cl (Endkonzentration

jeweils 20 mM).

3.1.22. Rekonstitution des V1Vo Holoenzyms in Liposomen

Für die Messungen von kapazitiven Strömen am blacklipid Bilayer wurde das V1Vo

Holoenzym nach der Methode von Fendler et al. (1996) in Liposomen rekonstituiert. Dazu

wurden zunächst 2,5 mg in Chloroform gelöste Phospholipide im Rotationsverdampfer unter

Stickstoffbegasung für ca. 90 min getrocknet und anschließend in 250 µl LOM mit 1% C12E10

resuspendiert. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Suspension bis zur

Opaleszenz im Eisbad beschallt. Für die Rekonstitution des V1Vo Holoenzyms wurde ein

Protein-Lipid-Verhältnis von 1:20 (w/w) gewählt und 250 µl der vorgeformten Liposomen

mit 0,25 mg Protein (in 275 µl 1% C12E10, 9,6 mM β-Mercaptoethanol, 150 mM NaCl und 20

mM Tris-HCl pH 8,1) gemischt und für 15 min auf Eis inkubiert. Das Detergenz wurde durch

Zugabe von Biobeads (Biorad) entfernt, zunächst wurde ca. 1/3 Volumen Beads zugegeben

und die Suspension unter sanftem Schütteln über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden

mittels Filtration durch Glaswolle entfernt und durch ca. 1/4 Volumen frische Beads ersetzt,

welche nach 45 min sanftem Schütteln bei Raumtemperatur ebenfalls abfiltriert wurden. Nach

5 min Zentrifugation bei 13000 x g, um evtl. unlösliche Bestandteile zu entfernen, wurden die

Proteoliposomen direkt für die Messungen eingesetzt.

3.1.23. Messung kapazitiver Ströme am blacklipid Bilayer

Die Messungen an sogenannten "schwarzen" Lipid-Doppelschichten (Blacklipid Bilayer)

erfolgten bei Dr. Klaus Fendler (MPI für Biophysik, Frankfurt). Dazu wurden 0,01-0,02 cm2

große optisch schwarze Lipid-Doppelschichten in einer temperierten Teflonzelle (24°C)

hergestellt (Fendler et al., 1985; Borlinghaus et al., 1987). Die Lipid-Doppelschicht wurde

aus einer Lösung mit 1,5% (w/v) Diphytanoylphosphatidylcholin und 0,025% (w/v)

Octadecylamin gelöst in n-Decan gebildet. Die beiden Kammern der Zelle waren mit je 1,3

ml Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 3 mM DTT, 150 mM NaCl) gefüllt und über

Polyacrylamid Salzbrücken und Ag/AgCl Elektroden mit einem externen Meßkreis

verbunden, wobei das Meßsignal verstärkt, gefiltert (Cutoff, 500 Hz) und mit einem digitalen

Oszilloscop aufgezeichnet wurde. Für eine Meßreihe wurden zwischen 10 und 50 µl

Proteoliposomen in eine der Kammern pipettiert und für 30 min gerührt. Die Konzentrationen

Methoden

30

von caged ATP (P3-[1-(2-nitrophenyl)ethyl]adenosin 5 -́triphosphat, Fendler et al. 1985)),

MgCl2, CaCl2 und Concanamycin A konnte durch Zugabe aus diversen Stammlösungen

variiert werden.

Die Photolyse des caged ATP wurde durch einen 10 ns langen Laserpuls (308 nm, 12 mm dm

Blende, Energie zwischen 10,7 und 11,7 mJ) der auf die Lipid-Doppelschicht fokusiert war

bewirkt. Dabei wurden zwischen 15% und 30% des caged ATP im Laserfokus freigesetzt.

Zwischen den einzelnen Laserblitzen wurde für 10 min gerührt um das freigesetzte ATP zu

verdünnen bzw. die Hydrolyse durch die V-ATPase der nicht an die Lipid-Doppelschicht

adsorbierten Proteoliposomen zu ermöglichen.

3.1.24. Auftrennung von Subkomplexen des V1Vo Holoenzyms

Das V1Vo Holoenzym wurde in 70 µl Aliquots (100 µg Protein, 150 mM NaCl, 9,6 mM β-

Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl pH 8,1) für 10 min bei 30°C im Wasserbad vorinkubiert

und dann mit 10 µl des Test-Nukleotids versetzt und entsprechend der gewählten Zeit bis zu 1

h weiter inkubiert. Im Anschluß an diese Behandlung wurde der V1 und Vo Komplex durch

Zentrifugation in einem Saccharosestufengradienten getrennt. Hierfür wurden 920 µl Puffer

(5% Saccharose in TEK, 0,01% C12E10, 9,6 mM β-Mercaptoethanol, RT) zur fertig

inkubierten Probe gemischt und auf den Dichtegradienten geschichtet (2 ml 40%, 1 ml 35%, 1

ml 30%, 1 ml 25%, 1 ml 20%,1 ml 15%,1 ml 10% Saccharose in TEK, 0,01% C12E10, 9,6 mM

β-Mercaptoethanol). Die Zentrifugation erfolgte für 90 min bei 310.000 x g und 25°C in

einem Vertikalrotor (VTi 65.1, Beckman). Die Gradienten wurden anschließend mit einer

Peristaltikpumpe und Glaskapillare beginnend mit der 40% Saccharosestufe von unten in 500

µl große Aliquots fraktioniert (Benennung der Fraktionen: 40/1, 40/2, 40/3, 40/4, 35/1, 35/2,

30/1, 30/2, 25/1 usw.).

3.2. Molekularbiologische Methoden

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Für die Polymerase-Kettenreaktionen wurde ein GeneATAQ-Controller (Amersham

Pharmacia Biotech) verwendet. Ein Standardansatz (25 µl) enthielt 50 mM KCl, 10 mM Tris-

HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, je 200µM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, je

0,75 µM der beiden Primer, bis zu 250 ng Template-DNA und 0,625 U Taq Polymerase. Als

Verdunstungsschutz wurden die Ansätze mit 2 Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Reaktion

Methoden

31

wurde wie folgt durchgeführt: 1 x 2 min 93°C, 35 x ( 30 s 93°C, 40 s Annealing-Temperatur,

60 s/1 kb 73°C), wobei die Annealing-Temperatur nach der Formel 4°C x (G + C) + 2° C x

(A + T) - 3°C (Lion & Haas, 1990) berechnet und die niedrigere Temperatur des Primerpaars

verwendet wurde.

3.2.2. Phenolextraktion und Ethanolfällung

Die Aufreinigung von DNA aus den PCR-Ansätzen erfolgte mittels einer Phenolextraktion.

Hierzu wurde zu der jeweiligen DNA-Lösung ein Volumenanteil Phenol:Chloroform:

Isoamylalkohol (25:24:1) gegeben, durch Vortexen gemischt und 1 min zentrifugiert (13.000

x g). Aus dem wässrigen Überstand wurde das restliche Phenol mit 1 Volumen

Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) und erneutem Zentrifugieren entfernt. Anschließend wurde

die wässrige Phase mit 1/10 Volumenteil 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumenteilen -20°C

kaltem Ethanol versetzt und für 30 min bei 14000 x g und 4°C zentrifugiert. Nachdem das

Pellet noch einmal mit 70% -20°C kaltem Ethanol gewaschen und für 5 min bei 14000 x g

zentrifugiert worden war, wurde es in einer Speedvac getrocknet und bei -20°C gelagert.

3.2.3. Plasmid DNA Präparation

Für die Plasmidpräparationen wurde entweder die "klassische" Methode der alkalischen Lyse

nach Sambrook et al. (1989) oder ein QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen benutzt.

Erstere wurde vor allem für die Sequenzierungsreaktionen benutzt, da sie in der Regel wegen

höherer Reinheit bessere Ergebnisse liefert.

3.2.4. Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme

Die enzymatische Spaltung der DNA wurde normalerweise in einem Volumen von 20 µl und

mit bis zu 3 µg DNA und 3-5 U Restriktionsenzym durchgeführt. Sowohl die

Pufferzusammensetzung als auch die Inkubationstemperatur richtete sich nach den Angaben

der Hersteller der einzelnen Restriktionsenzyme. Nach einer Inkubation von 2 h wurde der

Verdau durch Einfrieren gestoppt und das Ergebnis durch die Elektrophorese in einem 1%

Agarosegel überprüft.

Methoden

32

3.2.5. Agarosegelelektrophorese von DNA

Für die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden Flachbett-

Minigelkammern, 1%ige Agarosegele und das TAE-Puffersystem (40 mm Tris-Acetat pH

8,3, 1 mM Na-EDTA) verwendet. Die Elektrophorese wurde bei 7-10 V/cm durchgeführt. Zur

Visualisierung der Fragmente wurden die Gele nach dem Lauf für bis zu 60 min mit

Ethidiumbromid (1µg/ml in TAE) inkubiert und anschließend nicht gebundenes

Ethidiumbromid durch Waschen der Gele in H2O (30 min) entfernt. Mit einem Eagle-Eye-

Videosystem (Stratagene) wurden die Ergebnisse dokumentiert. Die gewünschten DNA-

Fragmente wurden mit Hilfe des JetSorb-Systems (Genomed) aus dem Gel isoliert.

3.2.6. Ligation und Transformation

Die Ligation von DNA erfolgte über mindestens 24 h bei 16°C und wurde durch 10 min

Erhitzen auf 68°C gestoppt. Die 25 µl großen Ligationsansätze enthielten 100 ng Vektor, die

10-fache molare Menge an Insert, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5

mM ATP und 2 Weiss-Units T4-DNA-Ligase (New England Biolabs).

Für die Transformation wurde ein 200 µl Aliquot tiefgefrorener kompetenter Zellen in einem

Eppendorfgefäß in der Hand aufgetaut und für 10 min auf Eis temperiert. Anschließend

wurden Sie mit 25 µl des Ligationsansatzes vermischt und für weitere 30 min auf Eis

inkubiert. Nach einem 90 s "Hitzeschock" von 42°C, gefolgt von 2 min Abkühlen auf Eis

wurden 800 µl Medium zugegeben und für 1 h bei 37°C unter sanftem Schütteln inkubiert.

Um positiv transformierte Zellen mittels der Blau-Weiß-Selektion erkennen zu können,

wurden die transformierten Zellen auf LBamp XGal/IPTG Platten ausplattiert.

3.2.7. Herstellung kompetenter Zellen

Zur Herstellung von kompetenten Zellen wurde ein Protokoll der Firma New England Biolabs

angewandt, bei dem die Tranformationseffizienz durch Verwendung von RbCl neben CaCl2

erhöht wird. Zunächst wurde der Empfängerstamm auf Ψa-Platten ausplattiert und über Nacht

bei 37°C angezüchtet. Davon wurde eine einzelne Kolonie zum Animpfen von 5 ml Ψb-

Medium verwendet und bis zu einer OD550 von 0,3 bei 37°C geschüttelt. Mit dieser Vorkultur

wurden wiederum 100 ml auf 37°C vorgewärmtes Ψb-Medium angeimpft und für ca. 2 h bei

37°C unter Schütteln bis zu einer OD550 von 0,5 kultiviert. Nachdem die Zellsuspension für 5

Methoden

33

min auf Eis abgekühlt war, wurden die Zellen durch Zentrifugation (5 min, 5000 x g, 4°C)

geerntet, in 40 ml eiskaltem Tfb-1 resuspendiert und für 5 min auf Eis inkubiert.

Anschließend wurde nochmals zentrifugiert (5 min, 5000 x g, 4°C) und diesmal in 4 ml

eiskaltem Tfb-2 resuspendiert. Nach 15 min auf Eis wurden die jetzt kompetenten Zellen in

200 µl großen Aliquots in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80°C gelagert.

3.2.8. Sequenzierung von DNA

Bei der Sequenzierung von DNA wurde nach der Dideoxynukleotid-Kettenabruchmethode

von Sanger et al. (1977) vorgegangen, wobei der Sequenase 2.0-Kit mit modifizierter T7-

DNA-Polymerase (Tabor & Richardson, 1987) und α35S-dATP verwendet wurde. Als Primer

dienten die Standardprimer T3 und T7, sowie insertspezifische in Auftragssynthese

hergestellte Primer. Die Auftrennung der Abruchprodukte erfolgte durch eine Elektrophorese

in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (Sambrock et al., 1989) mit einem BRL

Sequencing System S2. Anschließend wurden die Gele fixiert und auf Whatmann 3MM

Filterpapier getrocknet. Nach einer 24 h Exposition auf einen Kodak XAR 5 Röntgenfilm

konnte das Ergebnis der Autoradiographie ausgewertet werden.

3.2.9. Klonierung, Expression und Reinigung von rekombinanten Teilen der B Untereinheit im pMal-c2-System

Als Antigene zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen 2 Abschnitte der

Untereinheit B, (Aminosäure 243-428 und Aminosäure 475-494) wurden überexprimierte

Fusionsproteine verwendet (Novak et al., 1992). Dazu wurden die entsprechenden

Teilsequenzen mittels PCR auf einem cDNA Klon der B-Untereinheit von M. sexta in einem

Sputnik-Expressionsvektor (Stratagene, Klon von Dr. Ralph Gräph zur Verfügung gestellt) als

Template amplifiziert und in den Expressionsvektor pMal c2 (New England Biolabs) kloniert.

Als Primerpaar für den bei V-ATPasen stark konservierten Mittelteil der B-Untereinheit (C2;

Aminosäuren 243-428) dienten 56KVORW2 (CTC TTC TTG AAC TTG GCC AA) als

Vorwärts-Primer und 56KREV2 (TAC TCA GAA TTC TTA GAG CGC CTC CTC ACC

CAC TA) als Rückwärts-Primer. Für den C-Terminus (C3; AS 475-494) wurde 56KVOR3

(ATG TTG AAG CGT ATC CCG GC) als Vorwärts-Primer und 56KREV3 (TAC TCA GAA

TTC TTA GTG ACG GGA GTC TCT GGG GT) als Rückwärts-Primer eingesetzt. Die

beiden Vorwärts-Primer generierten Blunt-Enden, wohingegen die beiden Rückwärts-Primer

eine Schnittstelle für EcoRI (unterstrichene Basen) einfügten. Die PCR-Produkte wurden wie

Methoden

34

beschrieben (3.2.1-5) über ein Agarosegel gereinigt, eluiert und nach 2 h Inkubation mit

EcoR1 bei 37° C eingefroren. Parallel dazu wurde das Plasmid pMAL-c2 gereinigt und

ebenfalls für 2 h mit EcoR1 und XMN1 inkubiert und anschließend eingefroren. Die Ligation

erfolgte über 72 h bei 16 ° C (3.2.6.). Anschließend wurden die Plasmide in kompetente E.

coli XL1 Blue-Zellen transformiert (3.2.6-7) und auf LBamp-Platten ausgestrichen. Je 5

positive Kolonien aus der Blau-Weiß-Selektion wurden abgenommen (C2 1-5 und C3 1-5)

und als Glycerindauerkulturen bei -70°C gelagert. Der korrekte Einbau des Inserts in das

Plasmid der Klone wurde später mittels DNA-Sequenzierung überprüft (3.2.8.).

Für die Expression der beiden Teilstücke C2 und C3 wurden jeweils zweimal 0,5 l TB-Amp

Medium mit je 5 ml einer Übernachtkultur der Klone C23 und C34 angeimpft. Nachdem die

Bakterien bis zu einer OD600 von 0,5 herangewachsen waren wurden sie mit 0,3 M IPTG

induziert, um das entsprechende rekombinante Protein herzustellen. 2 h später wurden die

Zellen durch eine Zentrifugation (20 min, 4000 x g, 4°C) pelletiert, in 50 ml Säulenpuffer

(200 mM NaCl, 1 mM Na-EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) resuspendiert und bei -20°C

eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Zellen in kaltem Wasser langsam aufgetaut und in

5 ml großen Aliquots auf Eis für 2 min ultrabeschallt (Branson Sonifier, Mikrotip, Stufe 6,

50% Impulsdauer), um die Zellen zu lysieren. Anschließend wurde die Suspension für 30 min

bei 9000 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand mit Säulenpuffer auf eine Proteinmenge

von ca. 3 mg/ml eingestellt.

Die Reinigung des Fusionsproteins aus dem Überstand erfolgte über Affinitäts-

chromatographie, wobei das maltosebindende Protein an die kovalent mit der Agarosematrix

der Säule (Volumen ca. 10 ml) verbundene Amylose bindet. Der gefilterte Überstand

(Spritzenvorsatzfilter, 0,45 µm) wurde auf die Säule aufgetragen und diese danach mit dem 8-

fachen Säulenvolumen an Säulenpuffer durchgespült. Das gebundene Protein wurde mit 10

mM Maltose im Säulenpuffer eluiert, gesammelt und auf einem SDS-Gel mit reinem

maltosebindendem Protein verglichen. Die Proben wurden ankonzentriert und zur

Immunisierung von Meerschweinchen zu Charles River, Deutschland geschickt (8,5 mg C23

bzw. 1 mg C34).

Methoden

35

3.2.10. Herstellung der rekombinanten Untereinheit C im pET System

Die rekombinante C Untereinheit, wurde für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern

und für Reassoziationsversuche mit dem pET Expressionssystem (Novagen) hergestellt.

Hierzu wurde der komplette kodierende Abschnitt der cDNA mittels PCR amplifiziert, in den

Vektor pET-16b eingefügt und in E. coli BL21 Zellen transformiert (Merzendorfer et al.,

2000). Die Zellen wurden mit 0,4 mM IPTG induziert und das rekombinante Protein mit Hilfe

eine N-terminal angefügten His-Tags über NTA-Säulen gereinigt. Dies erfolgte nach dem

vom Hersteller (Novagen) vorgegeben Protokoll, wobei der Elution des rekombinanten

Proteins mit 300 mM Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) ein Waschschritt mit

100 mM Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) vorraus ging. Um eine

Aggregation des eluierten Proteins durch von der Säule abgelöstes Ni2+ zu unterbinden, wurde

beim Fraktionieren eine 200 mM Na-EDTA-Lösung vorgelegt (Endkonzentration 10 mM in

den Fraktionen). Das so gewonnene Protein war frei von Verunreinigungen und konnte direkt

für die Immunisierung bzw. die Reassoziationsversuche eingesetzt werden.

Ergebnisse

36

4. Ergebnisse

4.1. Die V-ATPase aus M. Sexta

4.1.1. Optimierung der V1Vo Holoenzym Präparation

Ein Manko aller bisher beschriebenen Reinigungsprozeduren für V-ATPasen ist die im

Verhältnis zu F- und P-Typ-ATPasen relativ geringe Ausbeute pro Präparationsansatz, die

aufwendigere biochemische und strukturelle Untersuchungen verhindert. Dies gilt auch für

die Reinigung der V-ATPase aus dem Mitteldarm von M. sexta, bei der zudem bisher nur der

posteriore Abschnitt des Mitteldarms benutzt wurde, der nur etwa ein Drittel der gesamten

Länge ausmacht (Abb. 5).

Abb. 5: Unterschiede in der Morphologie des anterioren, medianen und posterioren Mitteldarmepithels von Manduca sexta. (A) longitudinal geöffneter Mitteldarm. Faltungsmuster des (B) anterioren Teils, (C) medianen Teils, und (D) posterioren Teils. (E) Querschnitt durch das anteriore und mediane Mitteldarmepithel. (F) Querschnitt durch das posteriore Mitteldarmepithel. (G) Schnitt durch die Apikalmembran einer Gobletzelle des anterioren und medianen Mitteldarmepithels. (H) Schnitt durch die Apikalmembran einer Gobletzelle des posterioren Mitteldarms. CC, Columnarzelle; GC, Kavität der Gobletzelle; NC, Kern der Columnarzelle; NG, Kern der Gobletzelle; M, Mitochondrium. Die Abbildung wurde übernommen aus Cioffi & Harvey (1981).

Ergebnisse

37

Allerdings befinden sich auch in seinem anterioren und medianen Abschnitt Goblet-Zellen,

deren Apikalmembranen mit sogenannten Portasomen (V-ATPase) besetzt sind (Cioffi &

Harvey, 1981) und in denen die V-ATPase auch durch immuncytochemische Untersuchungen

nachgewiesen wurde (Russell et al., 1992). Weiterhin hatten Cioffi & Harvey (1981) gezeigt,

dass es zwischen den drei Darmabschnitten keinen Unterschied im aktiven K+-Transport gibt.

Um die Präparationsausbeute an V-ATPase zu erhöhen, wurde deshalb versucht, diese auch

aus der Gobletzellapikalmembran des anterioren Mitteldarms zu reinigen. Bei der

angereicherten GCAM (Bande 2, 3.1.1.) und bei der aus ihr solubilisierten und gereinigten V-

ATPase (3.1.2.) aus dem anterioren Mitteldarm zeigte sich, dass sie in vergleichbarer Menge

gewonnen werden konnte und dass die Reinheit und Aktivität der gereinigten V-ATPase mit

der aus dem posterioren Abschnitt vergleichbar war (Tab. 2, Abb. 6).

Tab. 2: Ausbeute und Aktivität der V-ATPase aus Präparationen des anterioren und posterioren Mitteldarms. Angegeben ist die Ausbeute in µg Protein pro eingesetzter Raupe und die spezifische Aktivität in U/mg aus einem typischen Versuch. Mitteldarmabschnitt Posterior Anterior Ausbeute an angereicherter GCAM (Bande 2) 60 µg/Raupe 120 µg/Raupe Ausbeute an gereinigter V-ATPase aus Bande 2 10 µg/Raupe 14 µg/Raupe ATPase-Aktivität der gereinigten V-ATPase 1,8 U/mg 1,9 U/mg ATPase-Aktivität der gereinigten V-ATPase mit 0,5 mM NaN3

1,9 U/mg 1,8 U/mg

ATPase-Aktivität der gereinigten V-ATPase mit 0,5 mM NaN3 und 0,1 mM Na3VO4

1,7 U/mg 1,9 U/mg

96 kD67 kD

43 kD

30 kD

20 kD

14 kD

AB

C

E

FGc

D

1 2 3

Abb. 6: Gereinigte V-ATPase aus angereicherter GCAM. Coomassie gefärbtes SDS-Gel, Bahn 1, 5 µg Standardprotein, Bahn 2, 10 µg V-ATPase aus anteriorem Mitteldarm, Bahn 3, 10 µg V-ATPase aus posteriorem Mitteldarm.

Ergebnisse

38

Ein viel wichtigerer Befund war allerdings, dass das verwendete Detergenz C12E10 die V-

ATPase sehr selektiv solubilisiert, so dass keine Verunreinigungen mit anderen ATPasen vom

F-Typ (Hemmung durch Azid) oder P-Typ (Hemmung durch Vanadat) vorhanden waren,

welche sich in der gereinigten GCAM aus anteriorem Mitteldarm noch mit bis zu 50%

Fremd-ATPase-Aktivität bemerkbar machten (Tab. 3).

Tab. 3: Ausbeute und ATPase-Aktivität der reinen GCAM aus anteriorem und posteriorem Mitteldarm. Die Ausbeute ist in µg Protein pro verwendeter Raupe, die ATPase-Aktivität in U pro mg Protein und in Prozent der gesamten ATPase-Aktivität angegeben (n=3, ± S. D.). Posteriorer Mitteldarm Anteriorer Mitteldarm Ausbeute 6 µg/Raupe 12 µg/Raupe ATPase-Aktivität 0,65 ± 0,24 U/mg 100% 0,72 ± 0,28 U/mg 100% ATPase-Aktivität mit 0,5 mM NaN3 0,52 ± 0,29 U/mg 80% 0,41 ± 0,13 U/mg 56% ATPase-Aktivität mit 0,5 mM NaN3 und 0,1 mM Na3VO4

0,48 ± 0,11 U/mg 74% 0,3 ± 0,11 U/mg 50%

Diese Selektivität war eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung eines neuen

Reinigungsprotokolls für das V1Vo Holoenzym und den Vo Komplex aus dem

Mitteldarmrohhomogenat (3.1.2., 3.1.3.), das zu stark erhöhten Ausbeuten führte. Bei diesem

neuen Reinigungsprotokoll konnte zum einen auf die Anreicherung der GCAM, welche die

zeitaufwendige Entfernung der Längsmuskulaturstreifen vom Darmepithel beinhaltet,

verzichtet werden (3.1.1.). Zum anderem wurde nicht nur der posteriore Mitteldarmabschnitt,

sondern der ganze Mitteldarm als Ausgangsmaterial verwendet. Der komplette Darm wurde

homogenisiert und das daraus gewonnene Membranpellet mit C12E10 solubilisiert. Um

Verunreinigungen durch unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der V-

ATPase und anderen Proteinen zu minimieren, wurde dem Saccharosedichtegradienten, in

welchem der konzentrierte Solubilisierungsüberstand aufgetrennt wurde, 200 mM KCl

zugesetzt. Dies führte nicht nur zu einer höheren Reinheit, sondern auch zur Entdeckung der

bis dato nicht darstellbaren Untereinheit a (siehe 4.1.2.). Um die V-ATPase in einer noch

höheren Reinheit zu erhalten, wurden im Anschluß an die Dichtegradientenzentrifugation

noch 2 Chromatographieschritte eingeführt. Zunächst wurde eine Anionenaustauscher-

chromatographie auf einer Mono Q-, Resource Q- (beide Pharmacia) oder Hyper D Q-Säule

(Biosepra) durchgeführt, bei der das V1Vo Holoenzym in einem linearen Salzgradienten bei

einer NaCl-Konzentration zwischen 230 mM und 280 mM als relativ homogener Peak

eluierte (Abb. 7a). Bei einer anschließenden Gelpermeationschromatographie auf einer

Superdex 200-Säule (Pharmacia) eluierte das V1Vo Holoenzym dann in einem einzigen Peak

mit einer Schulter (Abb. 7b), auf die später noch näher eingegangen wird. Bei einer SDS-

Ergebnisse

39

PAGE des Elutionspeaks der Gelfiltration zeigte sich nach Silberfärbung (Abb. 7c), dass alle

Untereinheiten des V1Vo Holoenzyms vorhanden und keine nennenswerten Verunreinigungen

enthalten waren. Die Ausbeuten der neu entwickelten Präparation beliefen sich auf im

Durchschnitt 100 µg reines V1Vo Holoenzym/Raupe, was gemessen an der bisherigen

Ausbeute von ca. 10 µg V1Vo Holoenzym/Raupe mit geringerer Reinheit (Schweikl et al.,

1989) eine deutliche Steigerung darstellt. Außerdem ist noch zu erwähnen, dass bei der

herkömmlichen Art der Reinigung durch den hohen Zeitaufwand für die längsmuskelfreie

Präparation im Schnitt nur ca. 16 Raupen verwendet werden konnten. Da bei der Reinigung

aus dem Rohhomogenat von ganzen Mitteldärmen bis zu 32 Raupen verwendet werden

können, steigt somit die Gesamtausbeute noch zusätzlich.

Abb. 7: Reinigung des V1Vo Holoenzyms. a) Elutionsprofile des V1Vo Holoenzyms der Anionenaustauscher-chromatographie (Hyper D Q, Biosepra); b) Elutionsprofile des V1Vo Holoenzyms Gelpermeationschromato-graphie (Superdex 200, Pharmacia); c) Silbergefärbtes SDS-Gel des Elutionspeaks der Gelpermeations-chromatographie (1 µg Protein).

Ergebnisse

40

4.1.2. Entdeckung der Untereinheit a bei M. sexta

Bei den Versuchen, das V1Vo Holoenzym durch direktes Solubilisieren des Membranpellets

eines Mitteldarmrohhomogenats zu reinigen, wurde den Saccharoselösungen für die zonale

Dichtegradientenzentrifugation 200 mM KCl zugesetzt, um Verunreinigungen mit Proteinen,

die durch unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen am V1Vo Holoenzym haften zu

verhindern (siehe Abb. 6). Bei einer anschließenden Auftrennung der Probe auf einem SDS-

Gel zeigte sich dabei erstmals eine deutliche Bande mit einer apparenten Molekularmasse von

ca. 100 kDa (Abb. 8). Im weiteren wurde dann überprüft, ob es sich bei dieser Bande um die

Untereinheit a handelt, die bei den meisten anderen V-ATPasen beschrieben wurde, bei M.

sexta bis jetzt allerdings nachgewiesen werden konnte (Wieczorek et al., 2000).

Abb. 8: Entdeckung der Untereinheit a bei M. sexta. Ein mit Coomassie gefärbtes SDS-Gel (Bahn 1-3) und ein immungefärbter Westernblot (Bahn 4) des aus der GCAM des posterioren Mitteldarms gereinigten Holoenzyms, mit und ohne KCl im Dichtegradienten. Bahn 1, 5 µg Standardproteine (Molekularmassen in kDa), Bahn 2, 5 µg V1Vo Holoenzym aus GCAM, Bahn 3 und 4 , 5 µg V1Vo Holoenzym aus GCAM mit 200 mM KCl im Saccharosedichtegradienten, Bahn 4, gefärbt mit Serum gegen die 116 kDa Untereinheit a von chromaffinen Granula aus Rind (Gillespie et al., 1991).

Mit Hilfe von Antikörpern gegen die 116 kDa Untereinheit a von chromaffinen Granula aus

Rind (Gillespie et al., 1991) konnte die Vermutung, dass es sich bei dem 100 kDa Protein um

die Untereinheit a handelt bestätigt werden (Abb. 8). Inzwischen wurde cDNA für die

Untereinheit a aus dem Mitteldarm von M. sexta in unserer Arbeitsgruppe kloniert und

sequenziert (Merzendorfer et al., 2000; GenBank Acc.-Nr. AJ249390). Deshalb konnte auch

durch MALDI-MS-Analysen von tryptischen Peptiden der aus einem SDS-PAGE

ausgeschnittenen 100 kDa Bande eine eindeutige Identifizierung dieser Bande als

Untereinheit a mit einer Sequenzabdeckung von 36% erreicht werden (Abb. 9).

Ergebnisse

41

a) m/z gemessene Peptide erwartet m/z erste AS letzte AS Sequenz 705.411 705.405 195 200 (R)GNVFLR(Q) 732.384 732.404 182 187 (R)IPAFER(M) 763.380 763.410 51 56 (K)FVNEVR(R) 891.470 891.505 50 56 (R)KFVNEVR(R) 938.380 938.382 57 63 (R)RCDEMER(K) 954.382 954.377 methionine oxidized 1009.492 1009.420 cysteine acrylamide 1017.501 1017.548 180 187 (R)ERIPAFER(M) 1025.444 1025.458 258 266 (R)EMAMGVMTR(I) 1044.621 1044.657 170 179 (K)LGFVAGVILR(E) 1122.564 1122.605 122 130 (R)NYLELTELK(H) 1126.592 1126.622 346 356 (R)SGSSVPPILNR(M) 1166.568 1166.596 473 482 (K)SLNIFGSSWR(Q) 1173.552 1173.606 804 812 (R)LHWVEFQSK(F) 1260.588 1260.659 827 838 (R)FEVILDSAGPGR(G) 1271.643 1271.671 111 121 (R)EVNQNAEALKR(N) 1278.637 1278.706 121 130 (K)RNYLELTELK(H) 1288.596 1288.629 39 49 (R)DLNPDVNAFQR(K) 1419.673 1419.658 244 256 (R)ATLYPCPESPADR(R) 1490.661 1490.695 C acrylamide 1465.637 1465.663 357 368 (R)METLEDPPTYNR(N) 1481.659 1481.658 M ox. 1542.697 1542.690 136 148 (K)TQVFFDEMADPSR(E) 1558.685 1558.685 M ox. 1575.715 1575.759 244 257 (R)ATLYPCPESPADRR(E) 1646.750 1646.796 C acrylamide 1670.791 1670.785 135 148 (R)KTQVFFDEMADPSR(E) 1686.863 1686.780 M ox. 1738.841 1738.872 267 281 (R)IEDLNTVLGQTQDHR(H) 1821.852 1821.844 357 371 (R)METLEDPPTYNRNNK(F) 1837.879 1837.839 M ox. 2048.957 2048.978 75 93 (R)DGIPMLEIPGECPEAPQPR(E) 2064.900 2064.973 M ox. 2119.987 2120.016 C acrylamide 2079.948 2080.027 94 110 (R)EMIDLEATFEKLENELR(E) 2121.960 2121.983 201 219 (R)QAEIDTPLEDPSSSDQVYK(S) 2126.023 2126.071 372 389 (K)FTQAFQNLIYAYGVATYR(E) 2264.173 2264.153 611 630 (K)TSAYCAPSILITFINMMLFK(T) 2370.229 2370.256 320 340 (K)CLIAECWVPALDLETIQLALR(R) 2550.350 2550.402 740 761 M ox. (R)LWALSLAHAQLAEVAWNMLLRK(G) 2573.259 2573.267 346 368 (R)SGSSVPPILNRMETLEDPPTYNR(N) b) 1 MGSLFRSEEMTLCQLFLQSEAAYACVSELGELGLVQFRDLNPDVNAFQRKFVNEVRRCDE 60 61 MERKLRYLEKEIRRDGIPMLEIPGECPEAPQPREMIDLEATFEKLENELREVNQNAEALK 120 121 RNYLELTELKHILRKTQVFFDEMADPSREEEQVTLLGEEGLMAGGQALKLGFVAGVILRE 180 181 RIPAFERMLWRACRGNVFLRQAEIDTPLEDPSSSDQVYKSVFIIFFQGDQLKTRVKKICE 240 241 GFRATLYPCPESPADRREMAMGVMTRIEDLNTVLGQTQDHRHRVLVAAAKNIKNWFVKVR 300 301 KIKAIYHTLNLFNLDVTQKCLIAECWVPALDLETIQLALRRGTERSGSSVPPILNRMETL 360 361 EDPPTYNRNNKFTQAFQNLIYAYGVATYREVNPAPYTIITFPFLFAVMFGDLGHGALMAA 420 421 FGFWMCYKEKPLQAKKIDSEIWNIFFGGRYIILLMGLFSMYTGLIYNDIFSKSLNIFGSS 480 481 WRQNYNASTLTENKLLQLNPDSPDYLQYPYPFGIDPVWQLAEANKIIFMNAYKMKISIII 540 541 GVFHMLFGVCLSLWNHLYFKRRISVYVEFIPQILFLTLLFFYMVLLMFIKWTSYGPTPGA 600 601 FGSQDPAIVKTSAYCAPSILITFINMMLFKTDANTRPQCDDTMYAGQLQLQKFFVIVALL 660 661 CVPVMLFGKPYFIMKEQKQRARQGHQPVEGAAENGTAGGAPVPSSGHHDDDITEVFIHQG 720 721 IHTIEYVLGSVSHTASYLRLWALSLAHAQLAEVAWNMLLRKGLMSTDFQGGIFLYIVFAG 780 781 WAAISVSILVLMEGLSAFLHTLRLHWVEFQSKFYAGEGLSLPTGSRFEVILDSAGPGRGV 840 841 N Abb. 9: MALDI-MS Karte der Untereinheit a. Die durch MALDI-MS identifizierten tryptischen Peptide der 100 kDa Bande (a) und ihre Sequenzabdeckung (b) mit der Untereinheit a der V-ATPase aus M. sexta (GenBank Acc.-Nr. AJ249390). Die gefundenen Fragmente der MALDI-MS sind in der Aminosäuresequenz unterstrichen und fett gedruckt.

Ergebnisse

42

4.1.3. Die Untereinheit B und die Identifizierung ihrer putativen Isoform B´ als Hsp60

Da die bisher zu Immunfärbungen verwendeten Antiseren gegen das V1Vo Holoenzym so gut

wie keine Antikörper gegen die Untereinheit B enthielten und gegen diese auch keine

monoklonalen Antikörper zur Verfügung standen, sollten polyklonale Antikörper gegen eine

rekombinant hergestellte Untereinheit B produziert werden. Um die Möglichkeiten der

Anwendung zu erhöhen, wurde nicht die ganze Untereinheit, sondern zwei Teilsequenzen

ausgewählt: zum einen der Bereich von Aminosäure 243-428, welcher bei allen V-ATPasen

hoch konserviert ist, so dass die Antikörper auch gegen V-ATPasen aus anderen Organismen

zu verwenden sind, zum anderen der Bereich von Aminosäure 475-494 aus dem C-Terminus

der für M. sexta spezifisch ist und den die Antikörper deshalb nur in der Insekten V-ATPase

erkennen sollten (Novak et al., 1992). Beide Teilsequenzen der B Untereinheit wurden mit

spezifischen Primern in einer PCR vervielfältigt, die Produkte gereinigt, in den

Expressionsvektor pMalc2 (New England Biolabs) kloniert und dieser in E. coli Zellen (XL1

blue) transformiert. Die Expression des rekombinanten Fusionsproteins wurde induziert und

das Protein per Affinitätschromatographie auf einer Amylosesäule soweit als möglich

gereinigt. Bei einer Kontrolle in der SDS-PAGE waren dann auch Banden mit der für die

Fusionsproteine erwarteten Größe zu sehen (Abb. 10).

Abb. 10: Fusionsprotein aus Teilsequenzen der B Untereinheit und MBP. Coomassie-gefärbte SDS-PAGE der gereinigten Fusionsproteine. Bahn 1, Standardproteine (5 µg), Bahn 2 , MBP (1µg), Bahn 3 , MBP-C34 (1µg) und Bahn 4, MBP-C23 (1µg).

Die Fusionsproteine wurden direkt zur Immunisierung von zwei Meerschweinchen verwendet

und die erhaltenen Antiseren auf gereinigtem V1Vo Holoenzym getestet. Dabei kam es zu

einem überraschenden Ergebnis. Das Antiserum C23 detektierte die Untereinheit B und ein

weiteres Protein mit ca. 60 kDa im folgenden B´ genannt (Abb. 11b). Das Antiserum C34

erkannte die Untereinheit B überhaupt nicht, dafür aber ebenfalls das 60 kDa Protein B´. Das

Ergebnisse

43

Protein B´ wurde bisher häufig als schwache Bande bei der Reinigung der V-ATPase

beobachtet und ist auch in der neuen Präparationsmethode als Bande in der bereits erwähnten

mal mehr mal weniger ausgeprägten Schulter des Elutionspeaks der Gelfiltration zu sehen

(Abb. 11a).

Abb. 11: Entdeckung des Proteins B´. a) Elutionsprofil des V1Vo Holoenzyms von einer Superdex 200 Gelfiltrationssäule (Pharmacia). b) SDS-PAGE der Peaks I und II der Gelfiltration. Bahn 1-3 Coomassie gefärbt, Bahn 4-7, Westernblot. Bahn 1, Proteinstandard, Bahn 2, 4 und 6, Peak I; Bahn 3, 5 und 7, Peak II. Bahn 4 und 5, Immunfärbung mit Antiserum C23 und Bahn 6 und 7, Immunfärbung mit Antiserum C34.

Abb. 12: Vorkommen von B` in unterschiedlichen Präparationen. Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel. Bahn 1 , Standardproteine, Bahn 2, V1Vo Holoenzym aus angereicherter GCAM aus anteriorem Mitteldarm,. Bahn 3, V1Vo Holoenzym aus angereicherter GCAM aus posteriorem Mitteldarm. Bahn 4, V1Vo Holoenzym aus gereinigter GCAM aus anteriorem Mitteldarm. Bahn 5, V1Vo Holoenzym aus gereinigter GCAM aus posteriorem Mitteldarm. Bahn 6, V1 Komplex.

Ergebnisse

44

Es stellte sich nun die Frage, ob es sich bei diesem Protein um eine Isoform der Untereinheit

B handelt, und wenn ja, wo diese Isoform vorkommt. Zunächst wurde untersucht, in welchen

Präparationen die B´-Bande auftaucht. Das V1Vo Holoenzym wurde aus der angereicherten

GCAM (3.1.1.) und der gereinigten GCAM des anterioren und posterioren Mitteldarms

solubilisiert und isoliert und mit dem V1 Komplex verglichen (Abb. 12). Es zeigte sich, dass

beim V1Vo Holoenzym aus der angereicherten GCAM beider Darmabschnitte deutlich die

Bande B´ zu sehen ist. Hingegen ist B´ weder im V1Vo Holoenzym aus gereinigter GCAM

noch im V1 Komplex enthalten. MALDI-MS-Analysen der beiden Proteinbanden

ermöglichten eine eindeutige Identifizierung der Bande B als Untereinheit B entsprechend der

von der cDNA abgeleiteten Proteinsequenz (Abb. 15). Die Bande B´ konnte auf diese Weise

nicht identifiziert werden, da keine der gemessenen Fragmentmassen ein Pendant in der von

der cDNA abgeleiteten Proteinsequenz hatte (nicht gezeigt). Eine eindeutige Identifizierung

von B` erfolgte erst durch eine N-terminale Sequenzierung der entsprechenden Proteinbande

durch Dr. Barbara Schedding (Universität Münster). Die ersten 30 Aminosäuren konnten

eindeutig gelesen werden und ergaben bei der Suche in der Datenbank eine hohe

Übereinstimmung mit dem Hitzeschockprotein 60 (Hsp63) von Heliothis vireszens, dem

Tobacco Budworm (Abb. 13). Außerdem stimmten die 30 Aminosäuren mit der Sequenz

eines, bei einem sogenannten "Shotgun-Screening" für V-ATPase Untereinheiten von Ralph

Gräf in unserem Labor gefundenen Klons (Klon10) vollständig überein. Sowohl das Hsp63

aus H. vireszens als auch der Klon 10 beinhalteten eine vorgeschaltete Signalsequenz für den

mitochondrialen Import. Für Klon 10 wurde die mitochondriale Lokalisation mit einer

Wahrscheinlichkeit größer 90% vorhergesagt (PSORT II server). 1 10 20 30 40 50 60 +--------+---------+---------+---------+---------+---------+- Hsp60 M. sexta AKDVRFGADVRALMLQGVDILADAVAVTMG Klon 10 M. sexta SIRTKMLRLPRVVRQSISLHKSQQLT--RFYAKDVRFGADVRALMLQGVDILADAVAVTMG Hsp60 H. vireszens MFKMYRSPHITRNSFKYLKATNINSCRFYAKEVRFGPDVRSLMLQGVDILADADDVTMG 70 80 90 100 110 --------+---------+---------+---------+---------+- Hsp60 M. sexta Klon 10 M. sexta PKGRNVILEQSWGSPKITKDGVTVAKGVELKDKFQNIGAKLVQNVANNT Hsp60 H. vireszens PKGVNVILAKNLGPPKITKDGVTVAKGIDLKDKFQNIGARLVQNVANKTN Abb. 13: Sequenzvergleich Hsp60. Vergleich zwischen der durch N-terminale Sequenzierung des Protein B´ erhaltenen Sequenz (Hsp60 M. sexta), des durch ein shotgun screening erhaltenen Klons aus M. sexta (Klon 10 M. sexta) und des Hsp60 aus H. vireszens. Bei allen drei Sequenzen identische Aminosäuren (rot), bei zwei Sequenzen identische Aminosäuren (blau), andere (schwarz).

Ergebnisse

45

4.1.4. Identifizierung der Untereinheit D

Zu Beginn der Arbeit lag keinerlei Sequenzinformation zur bis dahin als D Untereinheit

bezeichneten SDS-Bande des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes vor. Die Bande

wurde nur auf Grund ihrer apparenten Molekularmasse von 32 kDa und wegen des

Vorkommens einer D Untereinheit bei anderen V-ATPasen als solche benannt. Um die

Identität dieser Bande aufzuklären, wurde sie aus einem SDS-PAGE Gel ausgeschnitten. Bei

der N-terminalen Sequenzierung eines Cyanbromid-Fragments durch Dr. Roland Schmid

(Abt. Mikrobiologie, Universität Osnabrück) konnte die Sequenz GRLAGAQKGHGLL

detektiert werden. Bei einer Datenbanksuche ergaben sich eindeutige Übereinstimmungen mit

D Untereinheiten anderer V-ATPasen (Beispiele in Abb. 14). Mittlerweile wurde diese

Sequenzinformation zur Synthese von degenerierten Primern benutzt, die zu einer

erfolgreichen Klonierung und Sequenzierung der cDNA der Untereinheit D von M. sexta

führte (Merzendorfer et al., 2000). 1 10 20 30 40 +--------+---------+---------+---------+-- B. taurus MSGKDRIEIFPSRMAQTIMKARLKGAQTGRNLLKKKSDALT C. albicans MSGAGNREQVFPTRMTLGVMKSKLKGAQQGHSLLKRKSEALT S. cerevisiae MSGNREQVFPTRMTLGLMKTKLKGANQGYSLLKRKSEALT M. sexta GRLAGAQKGHGLL

Abb. 14: Teilsequenz der D Untereinheit. Vergleich der Teilsequenz der D Untereinheit von M. sexta mit den entsprechenden Teilen der D Untereinheiten aus B. taurus, C. albicans und S. cerevisiae. Identische Aminosäuren (rot), andere (schwarz).

4.1.5. Analyse der Untereinheiten der V-ATPase durch MALDI-MS

Für weitergehende funktionelle und strukturelle Untersuchungen der V-ATPase war es nicht

nur notwendig, das Enzym in ausreichender Quantität und Qualität zu reinigen, sondern auch

alle seine Untereinheiten zu identifizieren. Zwar sind inzwischen alle Untereinheiten der V-

ATPase von M. sexta auf der Basis von cDNA-Sequenzen nachgewiesen (Dow et al., 1992;

Gräf et al., 1992; Novak et al., 1992; Gräf et al., 1994a; Gräf et al., 1994b; Lepier et al.,

1996; Merzendorfer et al., 1997b; Merzendorfer et al., 1999; Merzendorfer et al., 2000), doch

stand die eindeutige Identifizierung der Untereinheiten auf Proteinebene noch aus, zumal für

eine Reihe von Untereinheiten Isogene bzw. Isoformen existieren. Deshalb wurden alle

Banden eines SDS-PAGE Geles des V1Vo Holoenzyms bzw. des V1 Komplexes

ausgeschnitten und im Gel tryptisch verdaut (3.1.16.). Die extrahierten Peptide wurden mittels

Ergebnisse

46

MALDI-MS analysiert und den entsprechenden Abschnitten der sich aus ihrer cDNA

ergebenden Aminosäuresequenz zugeordnet (Abb. 15). Trypsin erwies sich für die

Untereinheit c und e als ungeeignet, da die meisten der entstehenden Fragmente nicht im

Meßbereich lagen. Bei der Untereinheit c, welche im Zusammenhang mit der Untersuchung

zur Makrolidbindestelle wichtig war (4.3.3.), wurde deshalb Chymotrypsin eingesetzt. Mit

Ausnahme der Untereinheit e konnten alle Untereinheiten durch eine deutliche Überein-

stimmung zwischen den analysierten Fragmenten und den cDNA-Sequenzen identifiziert

werden (Sequenzabdeckungen: A = 85%, B = 62 %, H = 58 %, C = 71%, D = 56%, E = 55%,

G = 79%, F = 66%, a = 36%, d = 47% und c = 76%). Bei der Untereinheit c konnten zwei

auffällige Massenfragmente von 1523,9 und 1739,9 m/z nachgewiesen werden, die nicht

durch die cDNA-Sequenz zu erklären sind (siehe auch 5.1.2.). Möglicherweise handelt es sich

hierbei um das Fragment einer Isoform der Untereinheit. Weiterhin ergaben sich aus der

MALDI-MS keine Hinweise auf Isoformen für andere Untereinheiten. Diese können

allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden, da sich Sequenzänderungen auch in nicht

repräsentierten oder nachweisbaren Fragmenten befinden können.

Abb. 15: MALDI-MS-Analyse aller Untereinheiten des V1Vo Holoenzyms. Für jede Untereinheit wurden die in der MALDI-MS gefundenen Massen ihren potentiellen Peptidfragmenten zugeordnet und in der Aminosäuresequenz fettgedruckt und unterstrichen hervorgehoben. Untereinheit A: 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601

MASKGGLKTIANEENEERFGYVFAVSGPVVTAEKMSGSAMYELVRVGYNE LVGEIIRLEGDMATIQVYEETSGVTVGDPVLRTGKPLSVELGPGILGSIF DGIQRPLKDINELTQSIYIPKGVNVPSLAREVDWEFNPLNVKVGSHITGG DLYGIVHENTLVKHKMLMPPRAKGTVTYIAPAGNYKVTDVVLETEFDGEK AQYTMLQVWPVRQPRPVTEKLPANHPLLTGQRVLDSLFPCVQGGTTAIPG AFGCGKTVISQALSKYSNSDVIIYVGCGERGNEMSEVLRDFPELTVEIEG VTESIMKRTALVANTSNMPVAAREASIYTGITLSEYFRDMGYNVSMMADS TSRWAEALREISGRLAEMPADSGYPAYLGARLASFYERAGRVKCLGNPDR EGSVSIVGAVSPPGGDFSDPVTAATLGIVQVFWGLDKKLAQRKHFPSINW LISYSKYMRALDDFYEKNYPEFVPLRTKVKEILQEEEDLSEIVQLVGKAS LAETDKITLEVAKLLKDDFLQQNSYSSYDRFCPFYKTVGMLKNIISFYDM SRHAVESTAQSDNKVTWNVIRDAMGNVLYQLSSMKFKDPVKDGEAKIKAD FDQLLEDMSAAFRNLED

50 10 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

Untereinheit B: 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451

MAKTLSAAQANKEHVLAVSRDFISQPRLTYKTVSGVNGPLVILDEVKFPK FSEIVQLKLADGTHRSGQVLEVSGSKAVVQVFEGTSGIDAKNTLCEFTGD ILRTPVSEDMLGRVFNGSGKPIDKGPPILAEDFLDIQGQPINPWSRIYPE EMIQTGISAIDVMNSIARGQKIPIFSAAGLPHNEIAAQICRQAGLVKIPG KSVLDDHEDNFAIVFAAMGVNMETARFFKQDFEENGSMENVCLFLNLAND PTIERIITPRLALTAAEFLAYQCEKHVLVILTDMSSYAEALREVSAAREE VPGRRGFPGYMYTDLATIYERAGRVEGRNGSITQIPILTMPNDDITHPIP DLTGYITEGQIYVDRQLHNRQIYPPVNVLPSLSRLMKSAIGEGMTRKDHS DVSNQLYACYAIGKDVQAMKAVVGEEALTPDDLLYLEFLTKFEKNFITQG NYENRTVFESLDIGWQLLRIFPKEMLKRIPASILAEFYPRDSRH

50 10 150 200 250 300 350 400 450 500

Ergebnisse

47

Untereinheit H: 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451

MANIGDEKVSQLIPTLGDDKIDMIAATSVLQIRASEIRQTQINWQSYLQG QMITQRDHDFIVNLDQRGQKDLPDKNPDACADVFLNLLTHISKDHTIQYI LVLIDDILSEDKSRVKIFRETKYSGNIWQPFLNLLNRQDEFVQHMTARII AKLACWHPQLMDKSDLHFYLSWLKDQLKMNNNDYIQSVARCLQMMLRVDE YRFAFLSVDGISTLLSILASRVNFQVQYQLVFCLWVLTFNPLLAEKMNKF NAIPILADILSDSVKEKVTRIVLAVFRNLIEKPQDQQVAKEHCIAMVQCK VLKQLSILEQKRSDDEDIMNDVEFLNERLQASVQDLSSFDQYATEVKSGR LEWSPVHKSAKFWRENAARLNERGQELLRTLVHLLEKSHDPVVLAVACYD VGEYVRHYPRGKHIIEQLGGKQRVMYLLSHDDPNVRYEALLAVQKLMVHN WEYLGKQLEKEQIDKQAGTVVGAKA

50 10 150 200 250 300 350 400 450 500

Untereinheit C: 1 51 101 151 201 251 301 351

MSEYWLISAPGDKTCQQTWEALNQATKANNLSLNYKFPIPDLKVGTLDQL VGLSDDLGKLDTFVEGVTRKVAQYLGEVLEDQRDKLHENLTANNDDLPHY LTRFQWDMAKYPIKQSLRNIADIISKQVGQIDADLKVKSSAYNALKGNLQ NLEKKQTGSLLTRNLADLVKKEHFILDSEYLTTLLVIVPKSMFNDWNANY EKITDMIVPRSTQLIHQDGDYGLFTVTLFKKVVDEFKLHARERKFVVREF AYNEADLVAGKNEITKLLTDKKKQFGPLVRWLKVNFSECFCAWIHVKALR VFVESVLRYGLPVNFQAALLVPSRRSARRLRDTLHALYAHLDHSAHHHAN AQQDSVELAGLGFGQSEYYPYVFYKINIDMIEKAA

50 10 150 200 250 300 350

Untereinheit D: 1 51 101 151 201

MSGKDRLAIFPSRGAQMLMKGRLAGAQKGHGLLKKKADALQVRFRLILSK IIETKTLMGEVMKEAAFSLAEAKFTTGDFNQVVLQNVTKAQIKIRSKKDN VAGVTLPIFESYQDGSDTYELAGLARGGQQLAKLKKNFQSAVKLLVELAS LQTSFVTLDEVIKITNRRVNAIEHVIIPRLERTLAYIISELDELEREEFY RLKKIQDKKKIIKDKAEAKKAALRAAGQDLRDSANLLDEGDEDLLF

50 10 150 200 250

Untereinheit E: 1 51 101 151 201

MALSDADVQKQIKHMMAFIEQEANEKAEEIDAKAEEEFNIEKGRLVQQQR LKIMEYYEKKEKQVELQKKIQSSNMLNQARLKVLKVREDHVRNVLDEARK RLAEVPKDIKLYSDLLVTLIVQALFQLVEPTVTLRVRQADKALVESLLGR AQQDYKAKIKKDVVLKIDNENFLPPDTCGGIELIAAKGRIKISNTLESRL ELIAQQLLPEIRNALFGRNPNRKFTD

50 10 150 200

Untereinheit G: 1 51 101

MASQTHGIQQLLAAEKRAAEKVSEARKRKAKRLKQAKEEAQDEVEKYRQE RERQFKEFEAKHMGTREGVAAKIDAETRIKIDEMNKMVQTQKEAVIKDVL NLVYDIKPELHINYRVV

50 10

Untereinheit F: 1 51 101

MALHAAVKGKLISVIGDEDTCVGFLLGGIGEINKNRHPNFMVVDKNTPVS EIEECFKRFVKRDDIDIILINQNVAELVRHVIDAHTAPVPSVLEIPSKDH PYDASKDSILRRAKGMFNPEDLVR

50 10

Untereinheit a: (siehe Abb. 9)

Ergebnisse

48

Untereinheit d: 1 51 101 151 201 251 301

MKGCIFNIDAGYLEGLCRGFKCGILKQSDYLNLVQCETLEDLKLHLQGTD YGTFLANEPSPLSVSTIDDKLREKLVIEFQHLRNHSVEPLSTFLDFITYS YMIDNIILLITGTLHQRPISELIPKCHPLGSFEQMEAIHVAATPAELYNA VLVDTPLAPFFVDCISEQDLDEMNIEIIRNTLYKAYLEAFYDFCKQIGGT TADVMCEILAFEADRRAIIITINSFGTELSKDDRAKLYPRCGKLNPDGLA ALARADDYEQVKAVAEYYAEYSALFEGAGNNVGDKTLEDKFFEHEVNLNV HAFLQQFHFGVFYSYLKLKEQECRNIVWISECVAQKHRAKIDNYIPIF

50 100 150 200 250 300 350

Untereinheit c; Trypsin und Chymotrypsin: 1 51 101 151

MAENPIYGPFFGVMGAASAIIFSALGAAYGTAKSGTGIAAMSVMRPELIM KSIIPVVMAGIIAIYGLVVAVLIAGSLDSPSNNYTLYRGFIHLGAGLAVG FSGLAAGFAIGIVGDAGVRGTAQQPRLFVGMILILIFAEVLGLYGLIVAI YLYTKQ

50 100 150

Untereinheit e: 1 51

MGASFVPITVFTILWGVVGIVCPIFAPKGPNRGIIQVVLMLTAATCWLFW LCAYMAQMNPLIGPRLNNETLIWISRTWGNPISNHTGA

50

Ergebnisse

49

4.2. Der V1 Komplex

4.2.1. Modifikation der Präparation des V1 Komplexes

Um die Struktur und die biochemischen Eigenschaften des V1 Komplexes intensiver

untersuchen zu können, war es erforderlich, die Stabilität und Aktivität des Komplexes über

längere Zeit zu erhalten. Bei Gräf et al. (1996) wurden alle Experimente direkt im Anschluß

an die Präparation durchgeführt, da schon bei einer Lagerung über Nacht die Aktivität des V1

Komplexes sich im Vergleich zur frischen Präparation stark verringerte. Bei Vortests einiger

Lagerungsbedingungen zeigte sich, dass sowohl die Zugabe von β-Mercaptoethanol als auch

ein Aufbewahren bei 4°C im Kühlschrank sich positiv auf die Aktivität des V1 Komplexes

auswirken (Tab. 4).

Tab. 4: Lagerungsbedingungen für den V1 Komplex und deren Auswirkung auf die Aktivität. Bei der gemessenen Aktivität handelt es sich um die Mg-ATPase-Aktivität in Gegenwart von 25% Methanol.

Lagerungsbedingungen Relative Aktivität

Kontrolle: 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 8,1 100% (2,4 U)

Nach 96 h in 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 8,1, 4°C 43%

Nach 96 h in 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, 25% Methanol pH 8,1, 4°C 42%

Nach 96 h in 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, 3 mM β-Mercaptoethanol pH 8,1, 4°C 62,5%

Einfrieren und/oder Lagern im flüssigem Stickstoff bewirkten einen kompletten Verlust der

Aktivität. Wurde der Komplex bei Raumtemperatur gelagert, zeigte sich bei einer

anschließenden Anionenaustauscherchromatographie, warum die Aktivität des V1 Komplexes

im Vergleich zur Lagerung bei 4°C schlechter wurde. Der V1 Komplex (II) mit hoher

Aktivität (Gräf et al., 1996), welcher im zweiten Peak eluiert, wandelt sich im Laufe der Zeit

komplett in die inaktivere Form des ersten Elutionspeaks (I) um (siehe Abb. 16).

Ergebnisse

50

Abb. 16: Denaturierung des V1 Komplexes bei Raumtemperatur. Zu sehen sind Elutionsprofile von einer Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q, Pharmacia). Der 2. Peak (II) einer V1 Komplex Präparation wurde in 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 150 mM NaCl bei RT gelagert und am folgenden Tag erneut auf der Anionenaustauschersäule aufgetrennt a). Dies wurde mit jeweils dem 2. Elutionspeak (II) wiederholt b) und c).

Da die einzelnen Untereinheiten des V1 Komplexes viele Cysteine enthalten und diese sowohl

membrangebunden im V1Vo Holoenzym als auch im freien V1 Komplex vom reduzierenden

Milieu des Cytosols umgeben sind, lag es nahe, schon bei der Präparation des V1 Komplexes

ein Reduktionsmittel zur Stabilisierung zu verwenden. Da β-Mercaptoethanol bereits seinen

positiven Effekt bei der Lagerung des V1 Komplexes gezeigt hatte, wurde es mit einer

Endkonzentration von 9,6 mM den Laufpuffern für die Chromatographie zugegeben

(Merzendorfer et al., 1997a). Dadurch verschwand der Anteil des V1 Komplexes mit

geringerer Aktivität bei der Anionenaustauscherchromatographie, also der 1. Elutionspeak

fast vollständig und der aktivere 2. Peak nahm entsprechend zu (Abb. 17). Deshalb wurde

auch in der anschließenden Gelpermeationschromatographie β-Mercaptoethanol als

Reduktionsmittel verwendet.

Ergebnisse

51

Abb. 17: Der Einfluß von β-Mercaptoethanol auf die Reinigung des V1 Komplexes. Vergleich zweier V1 Komplex Präparationen ohne a) und mit b) 9,6 mM β-Mercaptoethanol im Laufpuffer der Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q, Pharmacia).

Somit waren durch die Zugabe von 9,6 mM β-Mercaptoethanol in alle

Chromatographiepuffer und die anschließende Lagerung bei 4°C im Kühlschrank die

Vorraussetzungen geschaffen, größere Mengen des V1 Komplexes zu sammeln und

zeitaufwendigere Experimente, für die ein stabiles Enzym notwendig ist, durchzuführen. Bei

Proben, die unter diesen Bedingungen gereinigt und gelagert wurden, konnte nach 4 Wochen

noch eine Aktivität von bis zu 95% im Vergleich zur frischen Probe gemessen werden (nicht

gezeigt).

Ergebnisse

52

4.2.2. Die Untereinheitenzusammensetztung des V1 Komplexes in der 2-D Gelelektrophorese

Da es unklar war, ob zwei verschiedene Proteine wegen gleicher Eigenschaften in der SDS-

PAGE als eine einzige Proteinbande zu sehen sind, wurde der V1 Komplex mit der Methode

der 2-dimensionalen Gelelektrophorese analysiert. Dabei wurde in der ersten Dimension nach

dem Isoelektrischen Punkt getrennt, in der zweiten Dimension in einem SDS-PAGE-Gel nach

der apparenten Molekularmasse (Abb. 18).

Abb. 18: 2-D Gelelektrophorese des V1 Komplexes. Gezeigt ist die 2. Dimension, des Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gels. Auf dem Gel wurde als Referenz links 5 µg V1 Komplex und rechts 5 µg Proteinstandard aufgegeben. In der ersten Dimension wurden 20 µg V1 Komplex auf einem IEF-Dry Strip (Pharmacia, pH 3-10) aufgetrennt und anschließend auf das SDS-Gel aufgelegt. Die in der 2. Dimension wiedergefundenen Untereinheiten sind im Gel markiert. Ein unbekannter Spot wurde mit einem Pfeil markiert.

Bei dieser Auftrennung konnten alle Untereinheiten des V1 Komplexes wiedergefunden

werden und soweit spezifische Antikörper (A, B, E G Untereinheit) vorhanden waren, durch

Immunfärbung eines Westernblots der 2. Dimension identifiziert werden (nicht gezeigt). Die

Position der Untereinheiten im Gel entsprach zum einen ihrer apparenten Molekularmasse,

zum anderen aber auch dem von ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenz berechneten

Isoelektrischen Punkt (Tab. 5).

Ergebnisse

53

Tab. 5: Isoelektrische Punkte der Untereinheiten des V1 Komplexes. Der Isoelektrische Punkt wurde aus den abgeleiteten Aminosäuresequenzen ermittelt.

Untereinheit Isoelektrischer Punkt A 4,99 B 5,2 C 8,2 D 9,6 E 9,4 F 5,9 G 9,4 H 6,3

Einzig eine kleine Bande (Abb. 18, Pfeil), die etwas links und leicht höher als die

Untereinheit F lief, könnte auf eine mögliche Isoform der Untereinheit G hindeuten, von der

es mehr als ein Gen gibt (Lepier et al., 1996; Merzendorfer et al., 2000). Ein Westernblot mit

anschließender Immunfärbung mit dem monoklonalen Antikörper 47-5, welcher gegen ein

gemeinsames Epitop der E und G Untereinheit gerichtet ist, erkennt diese Bande allerdings

nicht. Inzwischen wird die Problematik der Isoformen von Untereinheiten von Stephan

Reineke in unserem Labor genauer untersucht, so dass mit neuen Erkenntnissen zu rechnen

ist. Außer diesem einen Punkt gab es keine weiteren auffälligen neuen Banden, die auf eine

Isoform oder eine bis dato unbekannte neue Untereinheit hindeuten würden.

4.2. 3. Untersuchung der Untereinheit C des V1 Komplexes

Obwohl die Untereinheit C dem katalytischen V1 Komplex des Holoenzyms zu zuordnen ist,

kommt sie im gereinigten V1 Komplex im Vergleich zum V1Vo Holoenzym allenfalls in

substöchiometrischen Mengen vor (Gräf et al., 1996; Svergun et al., 1998). Bei den

Untersuchungen zur Stimulierung der Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes durch

Alkohole (4.4.1.) zeigte sich, dass die Untereinheit C bei einer Gelpermeationschromato-

graphie in Gegenwart von 25% Methanol, 15% Ethanol, 10% Isopropanol oder 5% 1-

Propanol vom eigentlichen V1 Komplex abgetrennt werden kann (Abb. 19, nur für Methanol

gezeigt). Wird der V1 Komplex vor dem Auftragen auf die Gelfiltrationssäule mit dem

Alkohol gemischt, findet man die Untereinheit C in einem V1-Aggregat wieder, welches

deutlich größer als der ursprüngliche V1 Komplex ist und nahe dem Ausschlußvolumen

eluiert. Derselbe Effekt einer Aggregatbildung mit höherer Molekularmasse war auch bei

einer Saccharosedichtegradientenzentrifugation des V1 Komplexes in Gegenwart von

Ergebnisse

54

Methanol beobachten, wenn die Probe vorher auf 25% Methanol gebracht wurde. Das

Aggregat war dann bei einer wesentlich höheren Dichte wieder zu finden (Abb. 20).

Abb. 19: Einfluß von Methanol auf den V1 Komplex (Gelchromatographie). Auftrennung des V1 Komplexes durch Gelchromatographie mit Methanol im Laufpuffer. 2,5 mg (25 µg/µl) V1 Komplex wurde mit Methanol versetzt [25%] und in einer Superdex 200 Säule (Pharmacia) 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-Mercaptoethanol, 25% Methanol) aufgetrennt (Fraktion I und II). Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE Gel von unbehandeltem V1 Komplex (1); Fraktion I (2) und Fraktion II (3).

Abb. 20: Einfluß von Methanol auf den V1 Komplex (Dichtegradientenzentrifugation). Auftrennung des V1 Komplexes in einem methanolhaltigen linearen Saccharosedichtegradienten. 2,5 mg (25 µg/µl) V1 Komplex wurde mit Methanol versetzt [25%] und auf einem linearem Saccharosedichtegradienten (10%-50% Saccharose in 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-Mercaptoethanol, 25% Methanol) für 90 min bei 310.000 x g und 4°C (VTi 65.1, Beckman) zentrifugiert. Der Proteingehalt der 500 µl Fraktionen (1, hohe Dichte; 20, niedrige Dichte) ist in µg angegeben. Inset, Silbergefärbte SDS-PAGE-Gele gleich großer Aliquots der gepoolten Fraktionen 4-7 (a) und der gepoolten Fraktionen 12-15 (b).

Ergebnisse

55

Beim Auftragen des V1 Komplexes ohne vorherige Zugabe von Alkohol auf eine mit Alkohol

äquilibrierte Superdexsäule wurde die Untereinheit C ebenfalls vom V1 Komplex abgetrennt,

allerdings entstand dabei kein Aggregat (Abb. 21). Die Untereinheit C konnte in diesem Fall

wegen der starken Verdünnung in der Säule nicht als Peak detektiert werden. Offensichtlich

ist die Bildung von Aggregaten bei hohen verwendeten Proteinkonzentrationen (25 µg/µl)

eine Folge der Zugabe von Alkohol. Wird die Probe hingegen langsam auf den

entsprechenden Alkoholanteil bei gleichzeitiger Erniedrigung der Proteinkonzentration

gebracht, wie dies im letzten Experiment der Fall war, kommt es zu keiner Aggregatbildung,

die Untereinheit C wird allerdings auch hier abgelöst.

Die Aggregation des V1 Komplexes bei hohen Proteinkonzentrationen in Gegenwart von

Alkohol wurde auch durch die Streukurven aus der Röntgenkleinwinkelstreuung bestätigt

(Abb. 22). Die Streukurve des V1 Komplexes in methanolhaltigem Puffer (Abb. 22b) zeigte

im Gegensatz zur Kontrolle ohne Alkohol (Abb. 22a) im oberen Bereich einen geraden

Verlauf, was auf eine Aggregation des Proteins schließen lässt.

Abb. 21: Abtrennung der Untereinheit C vom V1 Komplex (Gelchromatographie). Die Auftrennung des V1 Komplexes (2,5 mg, 25 µg/µl) durch Gelchromatographie erfolgte in einer Superdex 200 Säule (Pharmacia; Laufpuffer: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-Mercaptoethanol, 25% Methanol). a) Elutionsprofil. b) SDS-PAGE-Gel gefärbt mit Coomassie Blau (je 10 µg Protein). Bahn 1, Kontrolle, Bahn 2, Peak aus a).

Ergebnisse

56

Abb. 22: Streukurve des V1 Komplexes im Röntgenkleinwinkelstreuungsexperiment. a) ohne und b) mit 25% Methanol im Puffer (Protein,10 mg/ml).

Um das Phänomen der Ablösung der C Untereinheit vom V1 Komplex genauer untersuchen

zu können, wurde diese, nachdem die sie codierende cDNA von Xiao-Fan Zhao in unserem

Labor erfolgreich kloniert und sequenziert worden war (Merzendorfer et al., 2000) mit Hilfe

des PET-Systems in E. coli überexprimiert (siehe 3.2.9.). Bei Reassoziationsexperimenten

wurde zunächst der V1 Komplex durch Mischen mit Methanol [25%] und anschließender

Gelchromatographie vollständig von der Untereinheit C befreit (Abb. 23a). Dieser C-freie

Komplex wurde nach Überführung in einen methanolfreien Puffer mit 10-fachem Überschuß

an rekombinanter Untereinheit C inkubiert. Bei der anschließenden Gelchromatographie

zeigte sich, dass das rekombinante Protein an den V1 Komplex assoziiert und nicht

gebundenes Protein später eluiert (Abb. 23c). In einer Kontrolle ließ sich die rekombinante

Untereinheit genau wie die native Untereinheit durch Zugabe von Methanol wieder entfernen

(Abb. 23d). Wurde der durch Alkohol von der C Untereinheit befreite Komplex für einen

Aktivitätstest eingesetzt, gab es keinen meßbaren Unterschied zu seinem C-haltigem

Ursprungskomplex, weder bezüglich der Mg-ATPase-Aktivität in 25% Methanol noch

bezüglich der Ca-ATPase-Aktivität in wässrigem Milieu (nicht gezeigt). Auch eine Zugabe

von einem Überschuß von rekombinanter Untereinheit C hatte praktisch keinen Einfluß auf

Ergebnisse

57

die Eigenschaften des V1 Komplexes. Daraus läßt sich schließen, dass die C Untereinheit

offensichtlich keinen Einfluß auf die Aktivität des V1 Komplexes hat.

Abb. 23: Reassoziation der rekombinanten Untereinheit C an den V1 Komplex. Zu sehen sind jeweils die Elutionsprofile der Gelfiltration auf der Superdex 200 Säule (Pharmacia) und die mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE Gele der entsprechenden Peakfraktionen. a) Entfernung der nativen Untereinheit C vom V1 Komplex durch 25% Methanol im Laufpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-Mercaptoethanol). b) Der C-freie V1 Komplex (110 µl, 1 µg/µl) wurde im Eppendorfschüttler bei 4°C über Nacht im Laufpuffer inkubiert. c) Der C-freie V1 Komplex (110 µl, 1 µg/µl) wurde mit 100 µg rekombinanter Untereinheit C im Eppendorfschüttler bei 4°C über Nacht im Laufpuffer inkubiert. d) Der C-freie V1 Komplex (110 µl, 1 µg/µl) wurde mit 100 µg rekombinanter Untereinheit C im Eppendorfschüttler bei 4°C über Nacht im Laufpuffer inkubiert und vor der Gelfiltration mit 25% Methanol versetzt. Der Laufpuffer enthielt hier ebenfalls 25% Methanol.

Es stellte sich nun die Frage, ob sich die Untereinheit C auch beim V1Vo Holoenzym mit

Hilfe von Methanol ablösen läßt. Aus diesem Grunde wurde in einem Experiment eine

Gelchromatographie des V1Vo Holoenzyms in Gegenwart von 25% Methanol durchgeführt,

die erhaltenen Fraktionen in einem SDS-PAGE Gel aufgetrennt und nach Western Blotting

mit Antiserum gegen die rekombinante Untereinheit C analysiert (Abb. 24). Dabei zeigte sich,

dass sich beim Holoenzym im Gegensatz zum V1 Komplex die Untereinheit C durch den

Alkohol nicht ablösen ließ. Überraschenderweise löste sich im Kontrollexperiment in

Gegenwart von 0,01% des von uns standardmäßig zur Reinigung des V1Vo Holoenzyms

verwendeten Detergenz C12E10 die Untereinheit C vom V1 Komplex ab. Diese schon durch

Ergebnisse

58

das milde Detergenz hervorgerufene Dissoziation deutet darauf hin, dass die Untereinheit C

im Holoenzym stärker geschützt ist als im V1 Komplex. Der Schutz könnte eine Folge der

Lage der Untereinheit C und/oder stärkerer Wechselwirkungen mit dem Holoenzym sein.

Abb. 24: Entfernung der Untereinheit C vom V1 Komplex und vom V1Vo Holoenzym. a) Coomassiegefärbtes SDS-PAGE Gel. b) Westernblot eines SDS-PAGE Gels, immungefärbt mit polyklonalen Antikörpern gegen die rekombinante Untereinheit C. St, Standardproteine. 1, 10 µg V1 Komplex. 2, 10 µg V1 Komplex nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 im Laufpuffer. 3, 10 µg V1 Komplex nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 und 25% Methanol im Laufpuffer. 4, 10 µg V1Vo Holoenzym nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 im Laufpuffer. 5, 10 µg V1Vo Holoenzym nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 und 25% Methanol im Laufpuffer.

Ergebnisse

59

4.2.4. Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen

Chaotrope Ionen, wie das hier verwendete Iodid, stören die Ordnung von Wasser und machen

es lipophiler (Hatefi & Hanstein, 1969). Dies führt unter anderem dazu, dass hydrophobe

Wechselwirkungen zwischen Proteinen abgeschwächt oder aufgehoben werden. Wird der V1

Komplex mit 0,8 M KI 30 min auf Eis inkubiert, zerfällt er in zwei Subkomplexe, die bei

einer anschließenden Gelfiltration voneinander getrennt werden können (Subkomplexe I und

II, Abb. 25a). Der Subkomplex I besteht aus den Untereinheiten A, B, H, C, E und G und der

Subkomplex II aus A, B, E und G (Abb. 25b). Beide Subkomplexe wiesen keinerlei ATPase-

Aktivität auf (nicht gezeigt). Mit Hilfe von Eichproteinen (Thyroglobulin 669 kDa, Ferritin

440 kDa, Catalase 232 kDa und Aldolase 158 kDa) wurden die apparenten Molekularmassen

des V1 Komplexes und der Subkomplexe mittels Gelfiltration bestimmt (Abb. 26, Tab. 6). Für

den V1 Komplex ergab sich dabei eine Masse von 484 kDa, für Subkomplex I 275 kDa und

für Subkomplex II 190 kDa. Geht man von der mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung

ermittelten Molekularmasse des V1 Komplexes von 550 kDa aus (Svergun et al., 1998), ergibt

sich ein Korrekturfaktor von 1,14, welcher bei Subkomplex I zu einer Molekularmasse von

314 kDa und bei Subkomplex II zu einer Masse von 217 kDa führt. Diese beiden Massen

entsprechen in etwa den aus der cDNA abgeleiteten Massen der Subkomplexe (Tab. 6), wenn

man auch die unterschiedliche Stöchiometrie von A und B in den beiden Subkomplexen

berücksichtigt.

Weiterhin ist bemerkenswert, dass die Untereinheiten D und F in keinem der beiden

Komplexe enthalten sind und auch nicht separat gefunden werden. Ersteres deutet auf eine

eher periphere Lokalisation dieser beiden Untereinheiten im V1 Komplex hin, letzteres dass

diese beiden Untereinheiten als einzelne und kleine Proteine bei der verwendeten Gelfiltration

bis unter die Nachweisgrenze verdünnt werden.

Ergebnisse

60

Abb. 25: Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen. Der V1 Komplex zerfällt bei Behandlung mit 0,8 M KI in zwei Subkomplexe. a) Elutionsprofil der beiden Subkomplexe I und II bei einer Gelfiltration (Superdex 200, Pharmacia). b) Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel des unbehandelten V1 Komplexes V und der beiden Subkomplexe I und II.

Molekularmassenbestimmung mittels Gelfiltration

y = -0,2622Ln(x) + 3,5342

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

100000 1000000Molkularmassen (Da)

Kav

Abb. 26: Eichung der Superdex 200 Säule. Eichgerade der Proteine, Thyroglobulin 669 kDa, Ferritin 440 kDa, Catalase 232 kDa und Aldolase 158 kDa für die Molekularmassenbestimmung mittels Gelfiltration.

Tab. 6: Die Molekularmassen des V1 Komplexes und seiner durch KI-Behandlung entstehenden Subkomplexe. Die Massen wurden entweder mit Hilfe von Eichproteinen in der Gelfiltration oder als Summe der aus den cDNAs abgeleiteten Molekularmassen berechnet, wobei die Stöchiometrie von A und B berücksichtigt wurde.

Molekül Kav Molekularmasse nach Gelfiltration

Molekularmasse nach SDS-PAGE (Summe der Untereinheiten)

V1 Komplex 0,102 484 kDa A3B3HCDEFG = 550 kDa

Subkomplex I 0,25 275 kDa AB2HCEG = 317 kDa

Subkomplex II 0,346 190 kDa A2BEG = 231 kDa

Ergebnisse

61

4.3. Der Vo Komplex

4.3.1. Reinigung des Vo Komplexes

Nachdem es gelungen war, die während der Häutung bzw. während der Hungerphasen von

der GCAM abdissoziierten V1 Untereinheiten als intakten V1 Komplex aus dem Cytosol zu

isolieren, stellte sich die Frage, ob die Vo Untereinheiten als ganzer Komplex in der Membran

erhalten bleiben. Würde dies der Fall sein, dann sollten sie sich bei der Solubilisierung mit

C12E10 ähnlich wie das V1Vo Holoenzym verhalten und genauso wie dieses isoliert werden

können. Dazu wurde zuerst die GCAM von hungernden Raupen, genau wie für das V1Vo

Holoenzym beschrieben, als Bande 2 angereichert, anschließend mit C12E10 solubilisiert und

der Überstand nach Zentrifugation bei 100000 x g über einen Saccharosedichtegradienten

aufgetrennt. Dabei zeigte sich schon bei der Proteinverteilung innerhalb der

Gradientenfraktionen ein anderes Bild als bei fressenden Raupen (Abb. 27).

Proteinverteilung im Saccharosedichtegradienten

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6

Fraktionen

Proz

entu

ale

Prot

einv

erte

ilung

Abb. 27: Proteinverteilung im Saccharosedichtegradienten bei fressenden und hungernden Raupen. Verglichen wird der prozentuale Proteingehalt der einzelnen Fraktionen (Fraktion 1 hohe, Fraktion 6 niedrige Saccharosedichte) bezogen auf die gesamte Proteinmenge. Weiße Balken, fressende Raupen (n=3, Mittelwert ± S. D.) Schwarze Balken, hungernde Raupen (n=3, Mittelwert ± S. D.).

Ergebnisse

62

Es kam zu einer Umverteilung des Proteins von Fraktionen mit hoher Saccharosedichte,

welche normalerweise das V1Vo-Holoenzym enthalten (Fraktion 1 und 2) zu Fraktionen mit

geringerer Dichte (Fraktion 3 und 4). Im folgenden wurde dann, mittels gelelektrophoretischer

Analyse der Fraktionen und Westernblot mit spezifischen Antikörpern für die Untereinheit d

und die Untereinheit e gezeigt, dass es sich bei dieser Verschiebung tatsächlich um die

Untereinheiten des Vo Komplexes handelt (Abb. 28). Damit lässt sich feststellen, dass bei

hungernden Raupen der Vo Komplex als solcher in der Membran erhalten bleibt und sich als

Ganzes solubilisieren und anreichern lässt, da einzelne Untereinheiten nicht soweit in den

Saccharosegradienten einwandern würden.

Abb. 28: Verteilung der Untereinheiten d und e im Saccharosedichtegradienten. Gezeigt sind immun-gefärbte Westernblots der Saccharosedichtegradientenfraktionen von fressenden (oben) und hungernden Raupen (unten). Jede Fraktion wurde einmal mit einem Antiserum gegen das V1Vo Holoenzym (jeweils linker Blotstreifen), einmal mit dem Antiserum M40 gegen die Untereinheit d (jeweils mittlerer Blotstreifen) und einmal mit dem monoklonalen Antikörper 224-3 gegen die Untereinheit e (jeweils rechter Blotstreifen) immungefärbt.

Als nächster Reinigungsschritt wurde eine Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q,

Pharmacia oder Hyper D Q, Biosepra) mit der Vo Komplex-haltigen Fraktion des

Ergebnisse

63

Saccharosedichtegradienten durchgeführt, wobei der Vo Komplex relativ breit zwischen 230

und 350 mM NaCl eluiert (Abb. 29).

Abb. 29: Reinigung des Vo Komplexes durch Anionenaustauscherchromatographie. a) Der Vo Komplex eluiert bei der Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q, Pharmacia) zwischen 230 mM und 350 mM NaCl (Pfeile). b) Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel der Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie. Bahn 1 und 11, 5 µg Standardproteine. Bahn 2-10 und 12-19, je 10 µl der Fraktionen der Anionenaustauscher-chromatographie. Die Pfeile markieren den Bereich von 230 mM bis 350 mm NaCl. Die entsprechenden Fraktionen wurden gepoolt, ankonzentriert und einer

Gelpermeationschromatographie (Superdex 200, Pharmacia) unterzogen. Der Vo Komplex

eluierte als ein einzelner Peak und enthielt alle bekannten, ihm zugeordneten Untereinheiten

a, d, e und c, welche entweder mit Antikörpern oder radioaktivem 14C-DCCD identifiziert

wurden, sowie eine zusätzliche Bande mit einer apparenten Molekularmasse von 26 kDa

(Abb. 30). Später wurde von der doch sehr aufwendigen Präparation der angereicherten

GCAM, genau wie bei der Reinigung des V1Vo Holoenzyms, zur Solubilisierung eines

Rohhomogenats aus Mitteldärmen von hungernden Tieren übergegangen, wobei als

zusätzlicher Schritt zur Erhöhung des Anteils an Vo Komplexen in der Membran die nicht

abdissoziierten V1-Untereinheiten mit Hilfe von Kaliumiodid als chaotropem Ion abgelöst

wurden. Ausserdem wurde ebenfalls, wie bei der Reinigung des Holoenzyms, der

Ergebnisse

64

Saccharosedichtegradient mit 200 mM KCl versetzt, um lose assoziierte Proteine zu entfernen

und die Untereinheit a zu stabilisieren.

Abb. 30: Reinigung des Vo Komplexes mittels Gelpermeationschromatographie. a) Elutionsprofil des Vo Komplexes aus angereicherter GCAM mit 200 mM KCl im Saccharosegradienten von einer Superdex 200-Säule (Pharmacia). Der grau unterlegte Bereich entspricht dem Vo Komplex. b) SDS-PAGE-Gel dieses Vo Komplexes. Bahn 1, 1 µg Standardproteine, Silberfärbung. Bahn 2, 1 µg Vo Komplex; Silberfärbung. Bahn 3, 5 µg Vo Komplex, Autoradiographie mit radioaktiven 14C-DCCD, das spezifisch an die c Untereinheit bindet. Bahn 4, 1 µg Vo Komplex, Immunfärbung mit dem monoklonalen Antikörper 224-3 gegen die e Untereinheit. Bahn 5 , 5 µg Vo Komplex, Immunfärbung mit Antiserum M40 gegen die d Untereinheit. Bahn 6, 5 µg Vo Komplex, Immunfärbung mit Serum gegen die 116 kDa Untereinheit a von chromaffinen Granula aus Rind (Gillespie et al., 1991).

Ergebnisse

65

4.3.2. Identifizierung der 26 kDa Bande des Vo Komplexes

Zur Identifizierung der unbekannten 26 kDa Bande im gereinigten Vo Komplex wurde diese

nach SDS-PAGE mit einem Westernblots auf eine PVDF-Membran transferiert. Diese

Blotmembran wurde mit Coomassie Blau angefärbt, wobei als Besonderheit anzumerken ist,

dass sich die 26 kDa-Bande wie auch die Untereinheit c nicht anfärben ließen, sondern im

Gegenteil die Blotmembran an dieser Stelle weiß blieb (Abb. 31). Die 26 kDa-Bande wurde

ausgeschnitten und von Frau Dr. Schedding (Universität Münster) N-terminal ansequenziert.

Abb. 31: Blot der 26 kDa Bande aus dem Vo Komplex. Der Vo Komplex wurde nach SDS-PAGE auf PVDF-Membran geblottet und mit Coomassie Blau angefärbt.

Dabei wurde die Aminosäuresequenz [A R S] E N [P F] [I V] Y G P ermittelt, wobei die

Aminosäuren in Klammern eine gleich hohe Wahrscheinlichkeit haben. Bei einer BLAST-

Suche fand sich diese Teilsequenz ausschließlich als N-terminale Sequenz für c

Untereinheiten von V-ATPasen wieder. Die Variante M A E N P I Y G P um das N-terminale

Methionin erweitert entspricht genau dem N-Terminus der Untereinheit c von M. sexta (Abb.

32). Alle bisher gefundenen Isoformen c´´ unterscheiden sich von ihren c und c´ Varianten

durch die Verlängerung der N-Termini (Abb. 32), deshalb kann man mit hoher Sicherheit

ausschließen, dass es sich bei der 26 kDa Bande um die c´´ Isoform von M. sexta handelt. Da

die Untereinheit c typischerweise zur Bildung von Aggregaten neigt (Lepier et al., 1996),

handelt es sich bei der 26 kDa Bande sehr wahrscheinlich um ein Dimer von c.

Ergebnisse

66

Abb. 32: Sequenzvergleich Untereinheit c bzw. die n-terminale Sequenz der 26 kDa Bande mit anderen c Untereinheiten. Die Variante A E N P I Y G P der Teilsequenz die bei der n-terminalen Sequenzierung der 26 kDa Bande erhalten wurde, deckt sich mit dem n-Terminus der Untereinheit c aus M. sexta. Hier wurde diese Sequenz mit den N-Termini von V-ATPase Untereinheiten c aus anderen Organismen verglichen, für die neben der Isoform c auch eine Isoform c´ oder c´´ bekannt ist (S. cerevisiae, C. elegans und H. sapiens).

4.3.3. Markierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase

Plecomakrolide sind seit längerem als sehr spezifische Inhibitoren von V-ATPasen bekannt

(Bowman et al., 1988; Dröse et al., 1993), insbesondere die Concanamycine und

Bafilomycine (Abb. 41). Die Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen von Prof. Altendorf in

Osnabrück und von Prof. Zeeck in Göttingen führte zu einer Analyse der für die Hemmung

entscheidenden Komponenten der Plecomakrolide (Bindseil & Zeeck, 1994; Boddien, 1995;

Dröse et al., 1997; Dröse et al., 2001). Im Rahmen dieser Zusammenarbeit gelang es Dr.

Gudrun Ingenhorst (Göttingen), ein semisynthetisches Derivat des Concanamycin A

herzustellen (Ingenhorst, 2000). Dieses Derivat, das im folgenden als J-Concanolid A

bezeichnete 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-

concanolid A, besitzt gegenüber der Ausgangssubstanz zwei wichtige Modifikationen. Zum

einen hat es eine UV-aktivierbare Diazirinyl-Gruppe an der Position C9, zum anderen ein 125Jod an Position C23 des Hemiketalrings (Abb. 33). Mit Hilfe der Diazirinyl-Gruppe, die

nach UV-Belichtung ein hochreaktives Carben bildet, welches sofort eine kovalente Bindung

mit dem in unmittelbarer Nähe zur Verfügung stehenden Partner eingeht. Das 125I als

radioaktiver Marker sollte dann die mit dem Makrolid interagierende Untereinheit der V-

ATPase in der Autoradiographie nach SDS-PAGE sichtbar machen.

Ergebnisse

67

Abb. 33: Struktur des 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-concanolid A. Die gegenüber dem Ausgangsstoff Concanamycin A veränderten Positionen sind durch Nummern gekennzeichnet und die Reaktion bei UV-Belichtung dargestellt.

Zunächst wurde die Wirkung des J-Concanolids A auf die Aktivität der gereinigten V-ATPase

genauer untersucht und mit der Ausgangssubstanz Concanamycin A verglichen (Abb. 34),

wobei eine Probe mit nicht radioaktivem Jod verwendet wurde. Bei diesen Versuchen zeigte

es sich, wie entscheidend der richtige Umgang mit den Plecomakroliden für die Messung

reproduzierbarer Werte ist. Die Plecomakrolide erwiesen sich als äußerst empfindlich

gegenüber "Gefrier-Auftau-Zyklen" bzw. Lagerung in gelöster Form im Kühlschrank bei 4°C.

Die besten Ergebnisse wurden mit frisch in DMSO gelösten Substanzen erzielt, deren echte

Konzentration mit Hilfe ihres Extinktionskoeffizienten spektralphotometrisch bestimmt

wurde. Die Proben wurden anschließend entweder direkt verwendet oder aliquotiert, bei

-70°C gelagert und nur einmal direkt vor dem jeweiligen Versuch aufgetaut. Für das J-

Concanolid A ergab sich ein IC50 von 10-20 µM, welcher deutlich schlechter war als für das

parallel getestete Concanamycin A (IC50 10 nM), jedoch durchaus als noch ausreichend

spezifisch zu betrachten ist.

Ergebnisse

68

Abb. 34: Hemmung des V1Vo Holoenzyms durch Plecomakrolide. Jede der Kurven ist das Ergebnis eines Aktivitätstests mit einer unabhängigen V1Vo Holoenzym Präparation, wobei jeder Meßwert dem Mittelwert von 3 Versuchsansätzen entspricht. Die spezifische Aktivität des V1Vo Holoenzyms war im Standardansatz ohne Inhibitor 2,9± 0,5 U/mg (±S. D.). Concanamycin (? ), J-Concanolid A (¦ ).

Abb. 35: Konzentrationsabhängige Photoaffinitätsmarkierung des gereinigten V1Vo Holoenzyms mit J-Concanolid A. Tricine SDS-PAGE ( Sammelgel 4% T, 3% C; Distanzgel 10% T, 3% C; Trenngel 16,5% T, 3% C, Schägger & Jagow 1987). Bahn 1 mit Coomassie gefärbt, Bahn 2-9 Autoradiogramm des Gels nach 48 h Exposition auf einem Phosphoscreen. Es wurden je 20 µg V1Vo Holoenzym mit 100 µM (Bahn 2,3), 30 µM (Bahn 4), 10 µM (Bahn 5), 3 µM (Bahn 6), 1 µM (Bahn 7), 0,3 µM (Bahn 8 ) und 0,1 µM (Bahn 9) J-Concanolid A für 1 h auf Eis inkubiert und anschließend für 5 min bei 366 nm bestrahlt (ausser Bahn 2, Dunkelkontrolle).

Die Markierung der gereinigten V-ATPase wurde wie unter 3.1.13. beschrieben durchgeführt.

In der Autoradiographie ist deutlich zu erkennen, dass nur die Untereinheit c und selbst bei

der hohen Konzentration von 100 µM J-Concanolid A keine der anderen Untereinheiten

Ergebnisse

69

markiert wurde (Abb. 35). Auch bei der unbelichteten Probe wurde keine der Untereinheiten

markiert; die Radioaktivität wanderte unspezifisch ins Gel ein und verteilte sich über die

ganze Bahn 2. Bei der belichteten Probe mit 100 µM J-Concanolid A ohne Protein verblieb

die gesamte Sonde direkt in der Auftragstasche des Geles, das gleiche geschah auch mit dem

nicht an Protein gebundenen Anteil des J-Concanolid A in den Ansätzen mit Protein (nicht

gezeigt).

Die mit Coomassie Blau gefärbten Banden der Untereinheit c wurden im Anschluß an die

Autoradiographie aus dem Gel ausgeschnitten und die gebundene Radioaktivität in einem

Gamma-Counter gemessen (Abb. 36). Dabei ergab sich eine eindeutige Korrelation der an die

Untereinheit c gebundenen Radioaktivität mit der bei gleichen eingesetzten Konzentrationen

an J-Concanolid A gemessenen Hemmung der V-ATPase Aktivität.

Abb. 36: Die relative Hemmung des V1Vo Holoenzyms im Vergleich mit der gemessenen Radioaktivität. Die Banden der Untereinheit c aus dem SDS-Gel (Abb. 35) wurden ausgeschnitten und ihre Radioaktivität in einem Gamma-Counter bestimmt (68,3 cpm (100 µM-Bande), 69,9 cpm (30 µM-Bande), 63,6 cpm ( 10 µM-Bande), 59,1 cpm (3 µM-Bande), 57,4 cpm (1 µM-Bande), 55,2 cpm (0.3 µM-Bande), 56,6 cpm (0.1 µM-Bande) und 51,5 cpm (0 µM-Bande). Die prozentuale Hemmung der V-ATPase durch das J-Concanolid A wurde aus dem parallel durchgeführten Test mit nicht radioaktivem J-Concanolid A entnommen.

Um die Identität der als Untereinheit c bezeichneten Bande zweifelsfrei zu sichern, wurden in

Zusammenarbeit mit Simone König (Münster) MALDI-MS-Analysen der ausgeschnittenen

SDS-Gel Banden durchgeführt. Die nach einem chymotryptischen Verdau erhaltenen

Fragmente zeigen zum einen eindeutig, dass es sich bei der ausgeschnittenen Bande

tatsächlich um die Untereinheit c handelt und zum andern, dass durch die kovalente Bindung

des J-Concanolid A an die Untereinheit neue zusätzliche Fragmente entstehen (Abb. 37, Abb.

Ergebnisse

70

38). Sechs dieser Fragmente konnten ihren möglichen Peptiden zugeordnet werden. Es

handelt sich um die Fragmente der Aminosäuren 8-22, 12-29 und 85-87 deren Masse um 842

kDa erhöht wurde und Fragmente der Aminosäuren 1-7, 85-87 und 138-151 deren Masse um

972 kDa erhöht wurde. In Abb. 38 ist ein Ausschnitt aus dem Massenspektrum der mit J-

Concanolid A modifizierten Untereinheit c zusehen, der drei dieser Fragmente enthält.

Abb. 37: MALDI-MS-Karte der Untereinheit c nach einem Chymotrypsinverdau. Die mit J-Concanolid A markierte Proteinbande (oben) und die entsprechende Bande ohne J-Concanolid A Behandlung (unten) wurden aus einem SDS-GEL ausgeschnitten, mit Chymotrypsin verdaut und eine MALDI-MS durchgeführt. Den identifizierten Massen wurden jeweils die entsprechenden chymotryptischen Fragmente mit Angabe der ersten und letzten Aminosäure zugeordnet. Die angegebenen Fragmente sind in beiden Spektren zu finden. Bei der mit J-Concanolid A behandelten Probe wurden einige zusätzliche neue Massen gefunden, die wahrscheinlich auf eine Modifizierung durch J-Concanolid A zurückzuführen sind. Bei diesen Massen handelt es sich um die Fragmente der Aminosäuren 8-22, 12-29 und 85-87 deren Masse um 842 kDa erhöht wurde und Fragmente der Aminosäuren 1-7, 85-87 und 138-151 deren Masse um 972 kDa erhöht wurde.

Ergebnisse

71

Abb. 38: Bei Behandlung der Untereinheit c mit J-Concanolid A entstehen Fragmente mit erhöhter Masse. Ein Ausschnitt eines Massenspektrums der Untereinheit c, welche mit 10 µM J-Concanolid A behandelt wurde. Die Pfeile weisen auf drei Fragmente hin die möglicherweise durch J-Concanolid A modifiziert wurden. a) Mögliches Fragment Aminosäuren 8-22 plus 842 kDa (Sonde, die HJ verloren hat). b) Mögliches Fragment Aminosäuren 12-29 plus 842 kDa. c) Mögliches Fragment Aminosäuren 138-151 plus 972 kDa.

Um die Spezifität der Bindung von J-Concanolid A an die Untereinheit c zu überprüfen,

wurde versucht, die Markierung durch Vorinkubation Concanamycin A zu unterbinden (Abb.

39). 1 µM Concanamycin A führte schon zu einer deutlich schwächeren Markierung der

Untereinheit c, und bei Konzentrationen von 10 µm, 100 µm und 300 µM war überhaupt

keine Markierung mehr zu sehen. Concanamycin A konkurriert also mit seinem Derivat um

die gleiche Bindungsstelle in der Untereinheit c der V-ATPase.

Über die bisher geschilderten Markierungsversuche hinaus wurden auch solche mit GCAM-

Vesikeln und mit gereinigtem Vo Komplex durchgeführt (Abb. 40). Auch bei der

membrangebundenen V-ATPase, bei der sich alle Untereinheiten in ihrer natürlichen

Lipidumgebung befinden, wurde ebenfalls nur die Untereinheit c markiert. Genauso wurde

beim gereinigten Vo Komplex ebenfalls nur die Untereinheit c markiert, wobei die für den Vo

Komplex typische breite Bande der Untereinheit c im SDS-Gel auffällt.

Ergebnisse

72

Abb. 39: Die J-Concanolid A-Markierung der Untereinheit c kann durch Concanamycin A verhindert werden. Autoradiogramm eines Tricine SDS-PAGE Gels ( Sammelgel 4% T, 3% C; Distanzgel 10% T, 3% C; Trenngel 16,5% T, 3% C, Schägger & Jagow 1987) nach 48 h Exposition auf einem Phosphoscreen. Es wurden jeweils 20 µg gereinigtes V1Vo Holoenzym mit 10 µM J-Concanolid A inkubiert (Bahn 1-5). Vorinkubation der Proben mit 1 µM (Bahn 2), 10 µM(Bahn 3), 100 µM (Bahn 4) und 300 µM (Bahn 5) Concanamycin A.

Abb. 40: J-Concanolid markiert die Untereinheit c im membrangebundenem V1Vo Holoenzym und im gereinigtem Vo Komplex. SDS-PAGE Gel (10-15% T, 3,3% C) mit Coomassie gefärbt (Bahn 1, 3 und 5). Autoradiogramme des Gels nach 72 h Exposition auf einem Phosphoscreen (Bahn 2, 4 und 6). Bahn 1,2, 20 µg V1Vo Holoenzym, Bahn 3,4 20 µg gereinigter Vo Komplex, Bahn 5,6, 20 µg gereinigte GCAM. Alle Proben wurden mit 0,1 µM J-Concanolid A inkubiert und für 3 min mit UV-Licht (366 nm) behandelt.

Ergebnisse

73

4.3.4. Die Wirkung neuer Makrolide

Nun blieb noch die Frage zu beantworten, ob es sich bei der Bindestelle in der Untereinheit c

nur um die Concanamycin A Bindestelle, um die universelle Plecomakrolidbindestelle oder

sogar um die Bindestelle für eine noch größere Gruppe von Makrolidantibiotika handelt.

Hierzu wurden zunächst die bekannten Plecomakrolide Bafilomycin A1 und Bafilomycin B1

sowie eine Reihe neuerer Makrolide (Apicularen, Archazolid, Salicylihalamid und

Cruentaren) auf ihre hemmende Wirkung auf das gereinigte V1Vo Holoenzym getestet (Abb.

41, Abb. 42). Dabei zeigte sich, dass Bafilomycin A1 und B1 (IC50 10-20 nM) in ihrer

Hemmwirkung auf die V-ATPase im Gegensatz zu vielen Literaturdaten keine Unterschiede

im Vergleich zu Concanamycin A (IC50 10 nM) aufweisen.

Abb. 41: Die Strukturen der verwendeten Makrolide. Die Struktur von Cruentaren C33H51NO8 ist bis jetzt noch nicht gelöst.

Ergebnisse

74

Abb. 42: Die Hemmung des gereinigten V1Vo Holoenzyms durch Makrolide. Alle Substanzen wurden parallel in einem Versuchsansatz und mit einer V1Vo Holoenzym Präparation getestet. Jeder Wert entspricht dem Mittel aus 3 Versuchsansätzen.

Auch für Apikularen, Archazolid und Salicylihalamid ergaben sich gleich niedrige IC50 Werte

von 10-20 nM, lediglich Cruentaren und J-Concanolid A (Abb. 42) wichen mit ihren relativ

hohen IC50 Werten von 60 µM bzw. 10-20 µM etwas davon ab. Im Anschluß an die

Charakterisierung der Hemmeigenschaften wurden die Substanzen in einem Kompetitions-

versuch auf ihre Fähigkeit, mit J-Concanolid A um die Bindestelle in der Untereinheit c zu

konkurrieren, getestet (Abb. 43). Als weiterer Inhibitor der V-ATPase, von dem die Bindung

an die Untereinheit c bekannt ist, wurde in diesem Versuch auch noch DCCD eingesetzt. Die

beiden Bafilomycine und das Archazolid konnten die Markierung der Untereinheit c in

gleicher Weise verhindern wie Concanamycin A. Die anderen Makrolide, Apikularen,

Salicylihalamid und Cruentaren, waren nicht in der Lage, mit dem J-Concanolid A um die

Bindestelle zu konkurrieren, was eventuell auf eine andere Bindungsstelle bzw.

Wirkungsweise der Substanzen schließen läßt. Auch die Vorinkubation des V1Vo

Holoenzyms mit DCCD, welches kovalent an das Glutamat 139 bindet, bewirkte keine

Verdrängung der Markierung.

Ergebnisse

75

Abb. 43: Kompetitionsversuche mit anderen Makroliden und DCCD. Tricine SDS-PAGE Gel (Sammelgel 4% T, 3% C; Distanzgel 10% T, 3% C; Trenngel 16,5% T, 3% C, Schägger & Jagow 1987). Bahn 1 , Coomassie Blau gefärbt. Bahn 2-16, Autoradiogramm des Gels nach 48 h Exposition auf einem Phosphoscreen. Es wurden jeweils 20 µg gereinigtes V1Vo Holoenzym mit der entsprechenden Substanz vorinkubiert und anschließend mit 10 µM J-Concanolid A versetzt. Bahn 1, 20 µg V1Vo Holoenzym ; Bahn 2/3, 100/10 µM Bafilomycin A1; Bahn 4/11, Kontrolle ohne zusätzliche Substanz; Bahn 5/6, 100/10 µM Bafilomycin B1; Bahn 7/8, 100/10 µM Apicularen; Bahn 9/10, 100/10 µM Archazolid; Bahn 12/13, 100/10 µM Salicylihalamid; Bahn 14, 100 µM Cruentaren; Bahn 15/16, 100/10 µM DCCD.

Ergebnisse

76

4.4. Funktion und Regulation des V1Vo Holoenzyms und der V1 ATPase

4.4.1. Einfluß von Alkoholen und Detergenzien auf die Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes

Aus der Arbeit von Gräf et al. (1996) war einiges über die enzymatischen Eigenschaften des

V1 Komplexes bekannt wie z. B., die Stimulierung seiner Mg-ATPase-Aktivität durch

Methanol, ähnlich wie bei den F1 Komplexen aus Bakterien, Chloroplasten und

Mitochondrien (Hicks et al., 1986; Sakurai et al., 1981; Schuster, 1979; Ortiz Flores et al.,

1982). Die Wirkungsweise des Methanols wird zum einen auf eine Konformationsänderung

der Komplexe in der durch die Lösungsmittel bedingten hydrophoberen und somit

membranähnlicheren Umgebung und zum anderen durch die mögliche Freisetzung von

festgebundenem ADP erklärt (Anthon & Jagendorf, 1983). Eine hydrophobere Umgebung

sollten auch Detergenzien herstellen, aber weder C12E10 (0,03% und 0,003%) und

Octylglycosid (1,5% und 0,15%) konnten eine Mg-abhängige ATPase-Aktivität des V1

Komplexes induzieren (nicht gezeigt). In der Anwesenheit von Alkoholen zeigte sich jedoch

für jeden der verwendeten Alkohole ein Optimum für die Aktivierung der Mg-ATPase, das

bei 1-Propanol bei 5%, bei Isopropanol bei 10-15%, bei Ethanol bei 15% und bei Methanol

bei 25% lag (Abb. 44). Bei einer Gelchromatographie (Superdex 200, Pharmacia) zeigte sich

für alle bei ihrer Optimumskonzentration verwendeten Alkohole, das bereits beschriebene

Phänomen der Aggregation und des Ablösens der C Untereinheit.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30 35

Alkoholanteil in % (v/v)

Rel

ativ

e A

ktiv

ität

Methanol (n=5)

Ethanol (n=3)

Isopropanol (n=2)

1-Propanol (n=3)

Abb. 44: Einfluß von Alkoholen auf die Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes. Die Aktivitäten wurden auf den Wert bei 25% Methanol normiert, welcher bei jedem Versuch als Kontrolle mitgeführt wurde (Mittelwert ± S.D.).

Ergebnisse

77

In einem weiteren Versuch wurde überprüft, ob die durch Methanol induzierte Mg-ATPase-

Aktivität über die Zeit linear verläuft. Dazu wurde die Aktivität des V1 Komplexes in

Gegenwart von 15%, 20% und 25% Methanol nach 1, 2 und 3 min bestimmt. Wie Abb. 45

zeigt, war die Hydrolyserate von ATP zeitunabhängig für die einzelnen Alkoholkonzen-

trationen gleich groß.

Da sich eine Methanolkonzentration von 25% als optimal erwies und es für diese Bedingung

bereits einige Daten gab, wurde diese standardmäßig verwendet, um die Mg-ATPase

Eigenschaften des V1 Komplexes zu untersuchen. Weiterhin wurde, um eine einheitliche

Population von V1 Komplexen ohne verschieden große Mengen an assoziierter C Untereinheit

als Ausgangsmaterial zur Verfügung zu haben, der V1 Komplex durch eine

Gelchromatographie mit 25% Methanol im Laufpuffer von Resten der C Untereinheit befreit

und anschließend wieder in lösungsmittelfreien Puffer gebracht.

00,20,40,60,8

11,21,41,6

15 20 25

Methanolanteil (%)

U/m

g 1 min2 min3min

Abb. 45: Die methanolabhängige Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes hat einen linearen zeitlichen Verlauf. Gezeigt ist die ATPase-Aktivität in Gegenwart von 15%, 20% und 25% Methanol nach 1, 2 und 3 min eines typischen Experimentes.

Ergebnisse

78

4.4.2. Einfluß von Methanol auf das V1Vo Holoenzym

Die Wirkung von Methanol auf die Mg-ATPase-Aktivität wurde auch für das V1Vo

Holoenzym untersucht, wobei sich zeigte, dass es bei einer Konzentration von 20% zu einer

20-40%igen Stimulierung durch den Alkohol kommt (Abb. 46). Als naheliegende Ursache für

diese Erhöhung der Aktivität wurde ein Ablösen von V1 Komplexen vom V1Vo Holoenzyms

durch Methanol vermutet, welche dann einen Beitrag zur Gesamtaktivität leisten. Diese

Hypothese wurde durch eine Gelchromatographie (Superdex 200, Pharmacia) des V1Vo

Holoenzyms in Gegenwart von 20% Methanol überprüft und widerlegt (siehe Abb. 24).

Wahrscheinlich ist die Erhöhung der Aktivität auf die durch Mg-ATP-Hydrolyse bedingte

Dissoziation des Holoenzyms in V1 und Vo Komplex zurückzuführen. Betrachtet man den

Verlauf der Phosphatproduktion durch das Holoenzym ohne Methanol, so verringert sie sich

mit zunehmender Inkubationszeit, denn die abdissoziierten V1 Komplexe haben keinerlei Mg-

ATPase-Aktivität. Dagegen nimmt die Phosphatproduktion in Gegenwart von Methanol

deutlich weniger ab, da sich hier die freien V1 Komplexe mit ihrer durch Methanol

induzierten Mg-ATPase-Aktivität an der Gesamtaktivität beteiligen.

a) b)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 5 10 15 20 25Methanolanteil (%)

Akt

ivitä

t (U

/mg)

02468

1012141618

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 % Methanol

20 % Methanol

Abb. 46: Stimulierung der Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms durch Methanol. (a) Die Aktivität des V1Vo Holoenzyms wurde in Gegenwart von 0% - 25% Methanol bestimmt (2 µg Protein, 2 min Inkubationszeit, n=3, Mittelwerte ± S. D.). (b) Vergleich der Hydrolyse Aktivität ohne und mit 20% Methanol über die Zeit (2 µg Protein).

Ergebnisse

79

4.4.3. Abhängigkeit der Ca-abhängigen Hydrolyse-Aktivität des V1 Komplexes vom verwendeten Nukleosidtriphosphat

Für den V1 Komplex ist eine Ca-ATPase-Aktivität beschrieben, die mit zunehmender

Reaktionszeit abnimmt, wobei eine Produkthemmung durch ADP vermutet wurde (Gräf et al.,

1996 und Abb. 47). Wird hingegen Ca-GTP als Substrat angeboten, sinkt zwar die

Hydrolyserate um ca. 1/3 ab, ändert sich aber mit zunehmender Reaktionszeit nicht. Eine

direkte Überprüfung, ob ADP als Endprodukt den V1 Komplex hemmt, konnte in diesem Fall

nicht mit Hilfe eines regenerierenden Systems aus Pyruvatkinase und Phosphoenolpyruvat

durchgeführt werden, da die Pyruvatkinase ein Mg2+-abhängiges Enzym ist und schon Mg2+-

Konzentrationen von 0,1 mM die Ca2+-Aktivität des V1 Komplexes inhibieren. Alternativ

wurde Kreatinkinase und Phosphokreatin als Mg2+-unabhängiges regenerierendes System

getestet, dabei zeigte sich jedoch, dass auch dies nicht geeignet war, da Phosphokreatin sehr

säureinstabil ist und bei der Quantifizierung des freigesetzten Pi mit saurem Molybdat zerfällt.

Deshalb wurde der Einfluß von ADP auf die Aktivität des V1 Komplexes durch

Vorinkubation mit verschiedenen ADP Konzentrationen untersucht.

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15

Zeit (min)

nmol

Pi

Ca-ATP 4 µg ProteinCa-ATP 8 µg ProteinCa-GTP 4 µg ProteinCa-GTP 8 µg Protein

Abb. 47: Die Hydrolyse von Ca-ATP und Ca-GTP durch den V1 Komplex. Die Hydrolyse-Aktivität von 4 µg und 8 µg V1 Komplex für Ca-ATP und Ca-GTP nach 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 10 und 15 min wurde gemessen. Da mehr als 25 nmol produziertes Pi den Meßbereich des verwendeten Tests überschreiten konnten die 10 min Werte für 8 mg Protein und die 15 min Werte für 4 und 8 µg Protein mit Ca-GTP nicht ausgewertet werden.

Ergebnisse

80

4.4.4. Einfluß von Ca-ADP, Mg-ADP und Pi auf die Hydrolyse von ATP durch das V1Vo Holoenzym und den V1 Komplex

Die bisherigen Versuche zur Hydrolyse-Aktivität des V1 Komplexes legen eine

Endprodukthemmung der Ca-ATPase-Aktivität nahe, welche unter Einbeziehung des nach der

neuen Methode präparierten V1Vo Holoenzyms systematisch untersucht werden sollte. Von

diesem war schon durch die Versuche von Schweikl et al. (1989) bekannt, dass die Mg-

Aktivitäten des solubilisierten V1Vo Holoenzyms eine starke Endprodukthemmung aufweisen,

die durch ein ADP-regenerierendes System aus Pyruvatkinase und Phosphoenolpyruvat

teilweise aufgehoben werden kann. Aus diesem Grund wurde zunächst die Aktivität des

gereinigten V1Vo Holoenzyms mit und ohne Regeneration von ADP getestet. Es zeigte sich

im wesentlichen das gleiche Ergebnis wie bei Schweikl (1988), wobei die Inaktivierung des

Holoenzyms bei kleinen Proteinmengen und kurzen Inkubationszeiten nicht ganz so schnell

verlief. Ab einer Konzentration von ca. 50 µM produziertem ADP war allerdings ebenfalls

eine deutliche Hemmung zu beobachten (Abb. 48).

a) b)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Zeit (min)

nmol

Pi

0 U/ml PK3 U/ml PK10 U/ml PK30 U/ml PK

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15

Zeit (min)

nmol

Pi

0 U/ml PK3 U/ml PK10 U/ml PK30 U/ml PK

Abb. 48: Einfluß eines ADP-regenerierenden Systems. Es wurde die Mg-ATPase-Aktivität von 4 µg/160 µl (a) und 1 µg/160 µl (b) gereinigtem V1Vo Holoenzym in Gegenwart von 0, 3, 10 und 30 U/ml Pyruvatkinase und 10 mM Phosphoenolpyruvat (PEP) bestimmt.

Um unterscheiden zu können, ob schon die Anwesenheit der Hydrolyseendprodukte ADP

oder Pi einen Einfluß auf die Aktivität haben oder ob der Vorgang der Hydrolyse selbst zu

einer Inaktivierung notwendig ist, wurden einige Experimente durchgeführt, bei denen der V1

Komplex und das V1Vo Holoenzym mit ADP oder Pi und jeweils Ca2+ oder Mg2+

vorinkubiert wurde.

Beim V1 Komplex war die Mg-abhängige Aktivität in Gegenwart von 25% Methanol

vollkommen unabhängig von der vorgelegten ADP- oder Pi Konzentration, die in mehreren

Versuchen zwischen 0 und 30 µM bzw. 0 und 50 µM variiert wurde (Abb. 49, Abb. 52). Bei

Ergebnisse

81

den Vorversuchen für die Ca-ATPase-Aktivität zeigte sich dagegen schon eine deutliche

Hemmung bei der Verwendung von 30 µM ADP. In einem weiteren Test wurde dann die

ADP Konzentration auf bis zu 1 mM erhöht, was eine Hemmung der Anfangs-Hydrolyserate

der Ca-Aktivität um mehr als 70% zur Folge hatte (Abb. 49). Eine Vorinkubation mit Pi hatte

keine Auswirkung auf die Aktivität (Abb. 52).

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µM ADP1 µM ADP3 µM ADP10 µM ADP30 µM ADP

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µM ADP30 µM ADP100 µM ADP300 µM ADP1000 µM ADP

Abb. 49: Einfluß von ADP auf die Aktivität des V1 Komplexes. Methanol induzierte Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (1,5 µg Protein/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Mg-ADP-Konzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (4 µg Protein/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Ca-ADP-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei nach den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden.

Die Mg- und Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms wurde ebenfalls nicht durch

Vorinkubation mit Pi beeinflußt (Abb. 53). Auch die Ca-ATP-Hydrolyserate blieb weitgehend

unbeeinflußt von der vorgelegten Menge an Ca-ATP (Abb. 50) Dagegen zeigte hier eine

Vorinkubation mit Mg-ADP eine deutliche Hemmung (Abb. 50), die sich vor allem bei

kurzen Inkubationszeiten andeutete. Deshalb wurde der Einfluß von Mg-ADP auf die

Hydrolyse bei einer Inkubationszeit von 15 s untersucht (Abb. 51). Die Hemmung war

konzentrationsabhängig, wobei 100 µM vorgelegtes Mg-ADP zu 85% inhibierte.

Ergebnisse

82

Als weitere Parameter wurden noch eine Erhöhung der im Test verwendeten Mg-

Konzentration von 1 mM auf 3 mM bzw. eine Verdopplung der Proteinmenge bei Mg- und

Ca- Aktivität untersucht, was jeweils zu gleichen Ergebnissen führte (nicht gezeigt).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µM ADP0,1 µM ADP0,3 µM ADP1 µM ADP3 µM ADP10 µM ADP30 µM ADP

0

2

4

6

8

1 0

1 2

1 4

1 6

1 8

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µ M A D P0 , 1 µ M A D P0 , 3 µ M A D P1 µ M A D P3 µ M A D P1 0 µ M A D P3 0 µ M A D P

Abb. 50: Einfluß von ADP auf die Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms (1,3 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Mg-ADP-Konzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms (2,6 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Ca-ADP-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei nach den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden.

Ergebnisse

83

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 µM 0,1 µM 0,3 µM 1 µM 3 µM 10 µM 30 µM 100 µM

Vorinkubation mit µM [ADP]

nom

l Pi n

ach

15 s

Abb. 51: Hemmung der Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms durch Mg-ADP bei einer Inkubationszeit von 15 s. Je 4 µg V1Vo Holoenzym wurden für 5 min mit den entsprechenden Mengen Mg-ADP vorinkubiert (je 6 Proben).

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µM Pi5 µM Pi20µM Pi50 µM Pi

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

pi

0 µM Pi5 µM Pi20µM Pi50 µM Pi

Abb. 52: Einfluß von anorganischem Phosphat auf die Aktivität des V1 Komplexes. Methanol induzierte Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (1 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Pi-Konzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (4 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Pi-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei nach den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden. Das vorgelegte Pi wurde über die Meßwerte für 0 min korrigiert.

Ergebnisse

84

02468

101214161820

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µM Pi5 µM Pi20 µM Pi50 µM Pi

02468

101214161820

0 1 2 3 4 5Zeit (min)

nmol

Pi

0 µM Pi5 µM Pi20 µM Pi50 µM Pi

Abb. 53: Einfluß von anorganischem Phosphat auf die Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms (1,8 µg/ 160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Pi-Konzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms (3,6 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Pi-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei nach den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden. Das vorgelegte Pi wurde über die Meßwerte für 0 min korrigiert.

Ergebnisse

85

4.4.5. Bestimmung der endogen gebundenen Nukleotide des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes

Um die Ergebnisse der Experimente zum Einfluss von Nukleotiden auf die V-ATPase besser

interpretieren zu können, wurde zunächst der bis dato noch nicht untersuchte Gehalt von

endogen gebundenen Nukleotiden im V1Vo Holoenzym und im V1 Komplex aus hungernden

Raupen mit Hilfe der Luciferin/Luciferase-Methode bestimmt (3.1.19.). Für die Berechnung

des Verhältnisses von Nukleotide zu Protein wurde für das V1Vo Holoenzym eine

Molekularmasse von 800 kDa und für den V1 Komplex von 550 kDa angenommen. Dabei

ergab sich für das V1Vo Holoenzym ein ATP-Gehalt von 0,005 mol/mol Enzym und für den

V1 Komplex ein ATP-Gehalt von 0,0015 mol/mol Enzym (Tab. 7). Höhere Werte ergaben

sich für ADP mit einem Gehalt von 0,28 mol/mol Holoenzym und 1,7 mol/mol V1 Komplex

(Tab. 7). Der ADP-Gehalt des V1 Komplexes war unabhängig vom physiologischen Zustand

der Raupen: fressende, hungernde und sich häutende Tiere unterschieden sich nicht.

Tab. 7: Der Nukleotidgehalt des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes. Die Messung des Nukleotidgehaltes von mehreren unabhängigen Präparationen (n=3-14) erfolgte mit der Luciferin/Luciferase-Methode (Mittelwerte ± S. D., n. b., nicht bestimmt).

V1Vo Holoenzym V1 Komplex (hungernde Raupen)

V1 Komplex (fressende Raupen)

V1 Komplex (häutende Raupen)

ATP-Gehalt 0,005 ± 0,002 mol/mol (n=3)

0,0015 ± 0,001 mol/mol (n=3)

n. b. n. b.

ADP-Gehalt 0,28 ± 0,05 mol/mol (n=6)

1,7 ± 0,57 mol/mol (n=14)

1,63 ± 0,42 mol/mol (n=8)

1,75 ± 0,42 mol/mol (n=4)

Im weiteren wurde versucht, das im V1 Komplex gebundene ADP zu entfernen (Abb. 54).

Neben mehreren Variationen des für die Standardgelchromatographie (Superdex 200,

Pharmacia) verwendeten Puffers (150 mM NaCl, 20 mm Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM β-

Mercaptoethanol) durch Zugabe von 25% Methanol, 0,01% C12E10 oder 5 mM EDTA, wurde

auch eine Säulenchromatographie nach Senior et al. (1992) und eine Inkubation mit

alkalischer Phosphatase (Digel et al., 1996) versucht (Details, siehe 3.1.19.). Alle Proben

wurden nach der entsprechenden Behandlung zusammen mit der entsprechenden

Ausgangsprobe auf einem SDS-PAGE Gel analysiert, wobei keine Veränderung festgestellt

werden konnte (nicht gezeigt).

Obwohl Methanol die Mg-ATPase-Aktivität des V1-Komplexes stimuliert und linearisiert,

löst es kein ADP aus dem Komplex. Auch 5 mM EDTA, welches durch die Komplexierung

Ergebnisse

86

von divalenten Kationen das ADP aus seiner Bindestelle, die möglicherweise von Mg-ADP

besetzt ist herauslösen könnte, hatte ebenso wie das für die Reinigung des Holoenzyms

verwendete C12E10, welches sehr wenig ADP enthält, keine Wirkung. Die für F-ATPasen

erfolgreich zur Entfernung von Nukleotiden eingesetzte Chromatographie mittels einer langen

Sephadex G-50 Säule war ebenfalls uneffektiv. Lediglich die Inkubation mit alkalischer

Phosphatase bewirkte eine deutliche Reduktion des ADP-Gehaltes auf 1/3 des

Ausgangswertes. Ein Aktivitätstest dieses V1 Komplexes unter Standardbedingungen zeigte

allerdings keinen Unterschied zur Kontrolle im Hinblick auf die Ca- und die Mg-abhängige

Aktivität; dies könnte möglicherweise auf ein sofortiges wiederbesetzten der Bindestelle mit

ADP zurückzuführen sein. Für weitere Untersuchungen über den Einfluß von Nukleotiden

bzw. die Bindestelle des endogenen ADPs sollte deshalb darüber nachgedacht werden, diese

Methode in die Vorbereitung des V1 Komplexes mit einzubinden.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Kontrolle Methanol EDTA C12E10 Senior APP

rela

tiver

AD

P-G

ehal

t (%

)

Abb. 54: ADP-Gehalt unterschiedlich behandelter V1 Komplexe. Gelchromatographie in Superdex 200 mit 25% Methanol, mit 5 mM EDTA, mit 0,01% C12E10 im Laufpuffer; Gelchromatographie in Sephadex G-50 nach Senior et al. (1992); Inkubation mit alkalischer Phosphatase (APP) nach Digel et al. (1996). Vergleich mit jeweils parallel durchgeführten Kontrollen (100%).

Ergebnisse

87

4.4.6. Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in vitro

Da gezeigt werden konnte, dass ADP einen starken Einfluß auf die Aktivität der V-ATPase

hat, sollte überprüft werden, ob diese Hemmung durch eine Dissoziation des V1Vo

Holoenzyms in seine beiden Subkomplexe bewirkt wird. Aus diesem Grunde wurde das V1Vo

Holoenzym mit den entsprechenden Nukleotiden vorinkubiert, gefolgt von einer

Zentrifugation im Saccharosedichtegradienten (siehe 3.1.24.). Die deutlichste Zunahme an

Vo-Untereinheiten in Fraktionen niedriger Dichte, verbunden mit deren Abnahme in

Fraktionen hoher Dichte, zeigte sich bei Inkubation des Holoenzyms mit 2 mM Mg-ATP

(Abb. 55). Dies bedeutet, dass es unter diesen Inkubationsbedingungen zu einer Dissoziation

von V1 Komplex und Vo Komplex kam. Ein schwächerer Effekt wurde durch Inkubation mit

2 mM Mg-ADP sowie mit 2 mM Mg-ADP und 2 mM Pi erzielt, wobei sich zwischen diesen

beiden Inkubationsvarianten kein signifikanter Unterschied zeigte. Hingegen ergab sich bei

Inkubation des Holoenzyms mit 2 mM Ca-ATP, mit 2 mM Ca-ADP, mit 0,2 mM Mg-ADP,

sowie mit 0,2 mM Mg-ADP und 0,2 mM Pi kein deutlich sichtbarer Effekt, der auf eine

größere Dissoziationsrate des Holoenzyms schließen lassen könnte.

Abb. 55: Einfluß von Mg- und Ca-ADP, Mg- und Ca-ATP und von Pi mit Mg-ADP auf die Dissoziation des V1Vo Holoenzyms. a) und b) Silbergefärbte SDS-PAGE Gele der Saccharosedichtegradientenfraktionen (a) hohe Dichte (b) niedrige Dichte. 1, Kontrolle. 2, 2 mM Mg-ADP. 3, 2 mM Mg-ATP. 4, 2 mM Ca-ADP. 5, 2 mM Ca-ATP. c) und d) Silbergefärbte SDS-PAGE Gele der Saccharosedichtegradientenfraktionen (c) hohe Dichte (d) niedrige Dichte. 1, Kontrolle. 2, 0,2 mM Mg-ADP. 3, 2 mM Mg-ADP. 4, 0,2 mM Mg-ADP, 0,2 mM Pi. 5, 2 mM Mg-ADP, 2 mM Pi.

Ergebnisse

88

Bei den vorausgegangenen Experimenten war die Konzentration der Nukleotide so groß, dass

jedes Holoenzymmolekül mehr als 1000 ATP hydrolysierte. Daher war es von Interesse, wie

sich die V-ATPase bei Inkubation mit äquimolaren Nukleotidkonzentrationen verhält. Bei

einer ATP Konzentration von 1 µM steht jedem eingesetzten V1Vo Holoenzym (100 µg/80µl)

theoretisch ca. 1 ATP zur Verfügung. Wie Abb. 56 zeigt, reichte dies tatsächlich aus, um den

ungefähr gleichen Dissoziationseffekt zu erzeugen. Ein Gemisch von 1 µM ATP und 0,2 mM

ADP führte allerdings zu keiner spürbaren Dissoziation von V1 und Vo Komplex. Mit Hilfe

des nicht hydrolysierbaren ATP Analogons AMP-PNP sollte getestet werden, ob die

Besetzung der ATP-Bindestelle alleine schon eine Dissoziation bewirken kann. Dies ist nicht

der Fall, da die Probe mit AMP-PNP keinerlei Unterschied zur Kontrolle aufwies (Abb. 56).

Möglicherweise bietet AMP-PNP aber einen Schutz vor der durch ATP bewirkten

Dissoziation, da diese in Kombination mit dem Analogon bei einer ATP Konzentration von 2

mM geringer ausfällt als ohne. AMP-PNP konkurriert möglicherweise sowohl mit ATP als

auch mit dem entstehenden ADP um die Bindestelle im Enzym. Zur Verdeutlichung dieser

Ergebnisse wurde zusätzlich zu den SDS-PAGE Gelen auch noch die Proteinverteilung in den

Saccharosegradienten analysiert, wodurch sich der Dissoziationsgrad ebenfalls sehr schön

darstellen läßt (Abb. 57).

Zusätzlich wurde auch der Nukleotidgehalt der Fraktionen dieses Versuches bestimmt, wozu

jeweils die Fraktionen 2-4 und 7-9 zusammengefasst wurden (Abb. 58). In keinem der beiden

Pools konnte ATP in nennenswerter Menge nachgewiesen werden. Der ATP-Gehalt der

Fraktion 2-4, welche jeweils das komplette V1Vo Holoenzym enthalten, entsprach mit 0,001

mol/mol V-ATPase in etwa dem bereits bestimmten Wert (siehe auch 4.4.5.). In der Fraktion

7-9 in der sich neben dem Vo Komplex auch V1-ATPase befindet konnte, kein ATP

nachgewiesen werden. Anders sah es hingegen mit dem ADP-Gehalt der Proben aus. Bei der

Inkubation mit 2 mM Mg-ATP erhöhte sich der ADP-Gehalt der Fraktion 2-4 im Vergleich

zur Kontrolle um das Dreifache. Auch bei der Mischung aus 2 mM AMP-PNP und 2 mM

ATP erhöhte sich der ADP-Gehalt leicht. Bei der Verwendung von 2 mM AMP-PNP alleine

konnte eine deutliche Verringerung des ADP-Wertes registriert werden. In der Fraktion 7-9

war der ADP-Gehalt bei allen Versuchsbedingungen ca. gleich groß und pendelte um 0,2 mol

ADP/mol Enzym (da V1 und Vo Untereinheiten in der Fraktion 7-9 enthalten sind wurde auch

hier mit einer Molekularmasse von 800 kDa gerechnet). Es konnte also keine Erhöhung des

ADP-Gehaltes in den abdissoziierten V1 Komplexen festgestellt werden. Hieraus lässt sich

zunächst schließen, dass vermutlich nicht die feste Bindung eines ADP-Moleküls an das

Enzym zu dessen Dissoziation führt.

Ergebnisse

89

Abb. 56: Einfluß von geringen ATP-Konzentrationen und von AMP-PNP auf die Dissoziation des V1Vo Holoenzyms. a)- h) Silbergefärbte SDS-PAGE Gele der Saccharosedichtegradienten (1) Standardproteine, (2-10) entspricht Fraktion 40/2-25/2 (siehe 3.1.24.). (a) Kontrolle, (b) 2 mM Mg-ATP, (c) 1 µM Mg-ATP, (d) 1 µM Mg-ATP, 0,2 mM Mg-ADP, (e) 0,2 mM Mg-ADP, (f) 2 mM Mg-AMP-PNP, (g) 2 mM Mg-AMP-PNP, 0,2 mM Mg-ATP, (h) 2 mM Mg-AMP-PNP, 2 mM Mg-ATP.

Ergebnisse

90

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fraktion

Pro

tein

vert

eilu

ng (%

)

Kontrolle2 mM ATP1 µM ATP1 µM ATP 0,2 mM ADP 0,2 mM ADP2 mM AMP-PNP0,2 mM ATP 2 mM AMP-PNP2 mM ATP 2 mM AMP-PNP

Abb. 57: Proteinverteilung in den Saccharosedichtegradienten. Gezeigt ist die Proteinverteilung in den Gradienten der Dissoziationversuche mit geringer ATP-Konzentration und AMP-PNP (1-9 entspricht Fraktion 40/2-25/2, siehe auch Abb. 56).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Kontrolle2 mM ATP1 µM ATP1 µM ATP + 0,2 mM ADP

0,2 mM ADP2 mM AMP-PNP2 mM AMP-PNP + 0, 2 mM ATP

2 mM AMP-PNP + 2 mM ATP

mol

AD

P/m

ol E

nzym

Fraktion 2-4

Fraktion 7-9

Abb. 58: ADP-Gehalt der Saccharosedichtegradientenfraktionen. Die Fraktionen 2-4 und 7-9 des Dissoziationversuche mit geringer ATP-Konzentration und AMP-PNP (1-9 entspricht Fraktion 40/2-25/2, siehe auch Abb. 56 und 57) wurden gepoolt, ankonzentriert und ihr Gehalt an gebundenem ADP mit wie unter 3.1.22 beschrieben bestimmt. Bei der Berechnung des Verhältnisses wurde jeweils ein Molekulargewicht des V1Vo Holoenzyms von 800 kDa benutzt. Zur Kontrolle wurde auch der ATP-Gehalt bestimmt, welcher für die Fraktionen 2-4 bei 0,001 mol/mol Enzym lag und sich für die Fraktionen 7-9 unter der Nachweisgrenze befand.

Ergebnisse

91

4.4.7. Einfluß von DCCD und Concanamycin A auf die Mg2+ und Ca2+-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms

Das Carbodiimid DCCD und das Plecomakrolid Concanamycin A sind Inhibitoren, die ihre

Bindestelle und somit ihren Wirkungsort im Vo Komplex des Enzyms haben, obwohl die

Hydrolyse von ATP im V1 Komplex erfolgt. Die Mg-abhängige Hydrolyse von ATP wurde in

diesem Versuchsansatz durch 0,01 µM Concanamycin A stark und durch 0,1 µM komplett

gehemmt (Abb. 59 , siehe auch 4.3.3.). DCCD hatte nur in höheren Konzentration von 100

µM einen hemmenden Einfluss auf das Enzym. Ganz anders sah das Ergebnis für die Ca-

ATPase-Aktivität aus, welche weder durch Concanamycin noch durch DCCD wesentlich

beeinflußt wurde (Abb. 60). Hieraus lässt sich schließen, dass die Ca-ATPase-Aktivität des

V1Vo Holoenzyms keine Protonentranslokation durch den Vo Komplex induziert. Die

Entkopplung von ATP-Hydrolyse und Protonentransport könnte auf eine Uni-site Katalyse in

der Gegenwart von Ca2+ zurückzuführen sein. Ob es sich hierbei um ein Phänomen des

detergenssolubilisierten und gereinigten V1Vo Holoenzyms handelt oder dies auch in der

nativen Membranumgebung erfolgt, wurde in der Folge an gereinigten GCAM-Vesikeln

getestet.

Ergebnisse

92

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4Zeit (min)

nmol

Pi

Kontrolle1,5 µM DCCD100 µM DCCD0,01 µM Con A0,1 µM Con A

Abb. 59: Einfluß von DCCD und Concanamycin A Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Die Proben (840 µl, 25 µg/ml, n=2) wurden mit den entsprechenden Hemmstoffen für 10 min vorinkubiert, die Hydrolyse mit 120 µl ATP (Endkonzentration 1 mM) gestartet und zu den angegebenen Zeiten 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen und in N2 eingefroren.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4Zeit (min)

nmol

Pi

Kontrolle1,5 µM DCCD100 µM DCCD0,01 µM Con A0,1 µM Con A

Abb. 60: Einfluß von DCCD und Concanamycin A Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Vorgehen wie Abb. 59.

Ergebnisse

93

4.4.8. Messung des Protonentranports an GCAM-Vesikeln mit Mg2+- und Ca2+-ATP als Substrat

Die vorhergehenden Versuche zur Inhibierung der Mg- und Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo

Holoenzyms durch die Vo Komplex-spezifischen Inhibitoren DCCD und Concanamycin A

legten nahe, dass es einen Unterschied zwischen der ATP-Hydrolyse mit Mg2+ oder Ca2+ als

divalentem Kation gibt, der sich auf die Protonentranslokation auswirkt. Diese Vermutung

wurde durch fluorometrische Messungen des Protonentransports in gereinigten GCAM-

Vesikeln verifiziert. Die Anwesenheit von 1 mM Mg2+ induzierte einen ATP-getriebenen

Protonentransport der durch Quenchen der Acridinorange-Fluoreszenz gemessen wurde (Abb.

61a). Durch die Aktivierung des K+/H+-Antiporters in der GCAM mit KCl konnte diese

Ansäuerung wieder aufgehoben werden (Wieczorek et al., 1991). Dagegen konnte die

Protonentranslokation durch Ca2+-Konzentrationen von 1-15 mM nicht induziert werden

(Abb. 61c-d). Ca2+-Konzentrationen bis zu 15 mM beeinflussten die MgATP-induzierte

Ansäuerung der Vesikel nicht. Auch der Zusatz von Ca2+, nachdem mit Mg2+ eine

Ansäuerung erreicht wurde, hatte keine Wirkung (Abb. 61c).

Abb. 61: Fluorometrische Messung des Protonentransports in GCAM-Vesikeln. In den Versuchen (a-d) wurden jeweils 10 µl GCAM-Vesikel (ca. 10 µg Protein) eingesetzt und die Änderung der Acridinorange-fluoreszenz nach Zugabe von 1 mM MgCl2 (1), 20 mM KCl (2), 1 mM CaCl2 (3), 3 mM CaCl2 (4) und 15 mM CaCl2 (5) gemessen (es sind jeweils die Endkonzentrationen in der Küvette angegeben). Bei Versuch (c) war bereits 4 mM CaCl2 vorgelegt.

Ergebnisse

94

4.4.9. Messungen kapazitiver Ströme des rekonstituierten V1Vo Holoenzyms

Um den elektrogenen Schritt bei der Protonentranslokation über die Membran elektrisch

erfassen zu können wurde das V1Vo Holoenzym zunächst in Liposomen rekonstituiert. Diese

Proteoliposomen wurden dann an einen Blacklipid Bilayer adsorbiert und die kapazitiven

Ströme bei der Hydrolyse von ATP durch das V1Vo Holoenzym gemessen. Der Strom war

abhängig von der eingesetzten Konzentration an ATP und die Werte reproduzierbar zu

messen (Abb. 62a-c). Da der Strom durch Concanamycin A inhibierbar war, kann er als

spezifisch für das rekonstituierte V1Vo Holoenzym betrachtet werden (Abb. 62d.). Auch

zeigte sich wie bereits bei der GCAM auch im rekonstituierten System, dass die Hydrolyse

von Ca-ATP keinen Protonentransport antreibt (Abb. 62e) und dass Ca2+ die Mg-ATP-

abhängige Protonentranslokation nicht beeinflusst (Abb. 62f-h).

Abb. 62: Blacklipidbilayer: Messungen der Stromstärke von Bilayeradsorbaten. Für die hier gezeigten Versuche wurden jeweils 43 µl Proteoliposomen eingesetzt. Zum Zeitpunkt 0 s wurde mit einem Laserblitz das caged ATP freigesetzt. a) 300 µM caged ATP, 1 mM MgCl2. b) und c) 1 mM caged ATP, 1 mM MgCl2. d) 1 mM caged ATP, 1 mM MgCl2, 10 µM Concanamycin A (10 min Vorinkubation). e) 1 mM caged ATP, 3 mM CaCl2. f) und g) 1 mM caged ATP, 3 mM CaCl2, 1 mM MgCl2. h) 1 mM caged ATP, 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2.

Diskussion

95

5. Diskussion

5.1. Die Struktur der V-ATPase aus M. sexta

5.1.1. Das V1Vo Holoenzym

Die Isolierung der V-ATPase aus dem Mitteldarmepithel von Tabakschwärmern (Schweikl et

al., 1989) war mit dem Manko behaftet, dass die Präparation im Verhältnis zur Ausbeute sehr

aufwendig war und dass deswegen nur eine vergleichsweise geringe Anzahl von

Experimenten mit einer Präparation durchgeführt werden konnte. Ausserdem enthielten die

Präparationen nicht alle konstitutiven V-ATPase-Untereinheiten (Wieczorek et al., 2000). In

dieser Arbeit wurden bestehende Reinigungsprotokolle optimiert und neue

Reinigungsprotokolle etabliert. Erst dadurch war es möglich, für das V1Vo Holoenzym sowie

seine beiden Teilkomplexe V1 und Vo die genaue Untereinheitenzusammensetzung zu

bestimmen und darüber hinaus Strukturdaten, besonders über den katalytischen V1 Komplex,

zu gewinnen.

Für die Erhöhung der Ausbeute und die wesentlich einfachere und schnellere Präparation des

V1Vo Holoenzyms sind vor allem zwei Ergebnisse ausschlaggebend. Zum einen hat die V-

ATPase aus dem anterioren Mitteldarmabschnitt die gleichen enzymatischen Eigenschaften

und die gleiche Untereinheitenzusammensetzung wie die V-ATPase aus dem posterioren

Mitteldarm, so dass der ganze Mitteldarm als Ausgangsmaterial für die Reinigung der V-

ATPase verwendet werden kann. Zum anderen solubilisiert das Detergenz C12E10 die V-

ATPase so selektiv aus dem Mitteldarmepithel, dass sich die aufwendige längsmuskelfreie

Präparation des Mitteldarmepithels und die Anreicherung der GCAM auf einem

Saccharosestufengradienten erübrigt; vielmehr kann ein Rohhomogenat des Mitteldarm-

epithels als Ausgangsmaterial für die Reinigung der V-ATPase verwendet werden. Die

zusätzlichen Chromatographieschritte mit einem Anionenaustauscher und einer Gelfiltration

ermöglichten die Reinigung eines V1Vo Holoenzyms aus M. sexta, dass mit den

Untereinheiten A, B, C, D, E, F, G und H alle bekannten Untereinheiten des V1 Komplexes

und mit den Untereinheiten a, c, d und e auch die des Vo Komplexes enthält. Die Ausbeute an

V1Vo Holoenzym liegt mit 100 µg pro Raupe mehr als 10 mal höher als bei der bisherigen

Präparationsmethode. Die Identifikation aller Untereinheiten erfolgte über MALDI-MS-

Analyse von tryptischen bzw. chymotryptischen Fragmenten ihrer aus einem SDS-PAGE Gel

Diskussion

96

ausgeschnittenen Proteinbanden und deren Abgleich mit den Fragmenten eines theoretischen

Verdaus ihrer, aus der cDNA abgeleiteten, Aminosäuresequenzen (Dow et al., 1992; Gräf et

al., 1992; Novak et al., 1992; Gräf et al., 1994a; Gräf et al., 1994b; Lepier et al., 1996;

Merzendorfer et al., 1997; Merzendorfer et al., 1999; Merzendorfer et al., 2000). Bis auf die

Untereinheit e, deren tryptische Fragmente außerhalb des Meßbereichs lagen, konnten alle

Proteinbanden eindeutig den jeweiligen Untereinheiten zugeordnet werden. Letztere war

allerdings bereits durch monoklonale Antikörper und N-terminale Sequenzierung eindeutig

identifiziert worden (Merzendorfer et al., 1999).

5.1.2. Der Vo Komplex

Bei der neuen Präparationsmethode des V1Vo Holoenzyms ist besonders die Entdeckung der

Untereinheit a hervorzuheben, die für lange Zeit bei Insekten nicht dargestellt werden konnte

(Wieczorek et al., 2000). Die Abwesenheit dieser Untereinheit stellte ein Problem dar, weil

bei Mutageneseexperimenten an der V-ATPase der Hefe gezeigt wurde, dass sie essentiell für

die Assemblierung und/oder die Protonentranslokation der V-ATPase ist (Manolson et al.,

1994; Leng et al., 1996; Leng et al., 1998). Weiterhin gilt die Untereinheit a als Kandidat für

einen wichtigen Bestandteil des sogenannten Stators in Modellen, welche die Arbeitsweise

der V-ATPase in Analogie zur F-ATPase erklären (Kagawa & Hamamoto, 1996; Junge et al.,

1997). Tatsächlich wurde dieser second stalk erstmalig bei V-ATPasen

elektronenmikroskopisch dokumentiert (Boekema et al., 1997), was bald danach zu seiner

Entdeckung bei F-ATPasen führte (Wilkens & Capaldi, 1998). Des weiteren wurde die

Untereinheit a bisher als Favorit für die Bindung von Plecomakroliden gehandelt (Zhang et

al., 1994), wobei dies in dieser Arbeit allerdings widerlegt werden konnte. Die besondere

Proteolyse-Empfindlichkeit der Untereinheit a war zwar bekannt (Adachi et al., 1990a), so

dass ein Abbau des Proteins während der Reinigung nach Schweikl et al. (1989) durchaus

möglich gewesen wäre, allerdings konnte selbst die Verwendung eines ganzen Cocktails von

Proteaseinhibitoren (Wieczorek et al., 2000) die scheinbare "Degradation" nicht verhindern.

Mit der Erhöhung der Ionenstärke im Saccharosedichtegradienten durch 200 mM KCl gelang

es nun erstmals, das V1Vo Holoenzym mit seiner Untereinheit a zu reinigen. Offensichtlich

bewirkt die höhere Ionenstärke der Lösung durch verstärkte hydrophobe Wechselwirkungen

eine festere Bindung der Untereinheit a an den Rest des V1Vo Holoenzyms. An welche der

Untereinheiten der V-ATPase die Untereinheit a fester bindet bzw. mit welcher der

Untereinheiten sie überhaupt interaggiert, ist für M. sexta bisher noch nicht untersucht. Auch

Diskussion

97

bei anderen V-ATPasen sind die Wechselwirkungen mit den anderen Untereinheiten nicht

vollständig geklärt. Bei Hefe sind allerdings Interaktionen der Untereinheit a mit der

Untereinheit d, c, A und H beschrieben (Tomashek et al., 1996; Landolt-Marticorena et al.,

2000). Mittlerweile ist die Untereinheit a aus dem Mitteldarm kloniert und sequenziert

(Merzendorfer et al., 2000), eine weitere Isoform wurde in der cDNA von Malpighischen

Gefäßen gefunden und teilweise kloniert und sequenziert (Reineke, Merzendorfer, Vor der

Brüggen und Wieczorek, nicht publiziert).

Bei Hafer konnte die Untereinheit a bisher ebenfalls nicht als Bestandteil des gereinigten

V1Vo Holoenzyms nachgewiesen werden, obwohl sie im Vo Komplex, welcher nativ in der

Membran vorkommt, enthalten ist (Li & Sze, 1999). Da das Reinigungsprotokoll für die V-

ATPase aus Hafer keine Salze enthält wäre es interessant zu überprüfen, ob sich bei Erhöhung

der Ionenstärke auch bei dieser V-ATPase der gleiche Effekt einstellt.

Neben der modifizierten Reinigung des ganzen V1Vo Holoenzyms wurde auch ein Protokoll

zur Reinigung des nativen Vo Komplexes etabliert. Dabei wurde die Anreicherung des freien

Vo Komplexes in der GCAM durch die Abdissoziation des V1 Komplexes bei hungernden

Raupen ausgenutzt (Gräf et al. 1996) und gezeigt, dass neben dem cytosolischen V1 Komplex

auch der membranständige Vo Komplex als ganzes erhalten bleibt und mit einer hohen

Ausbeute 50 µg/Raupe isoliert werden kann. Durch die hohe Reinheit der Präparation war es

möglich, die genaue Untereinheitenzusammensetzung des Vo Komplexes, aus den

Untereinheiten a, c, d und e zu bestimmen. Wie bereits für das V1Vo Holoenzym ausgeführt,

gelang es auch hier erstmalig die Untereinheit a als konstitutiven Bestandteil des Vo

Komplexes einer Insekten V-ATPase darzustellen.

Die Untereinheit d, die bereits als Bestandteil des Vo Komplexes aus Clathrinvesikeln von

Rindern etabliert war (Zhang et al., 1992; Zhang et al., 1994) konnte auch für die Insekten V-

ATPase nachgewiesen werden (Merzendorfer et al., 1997b). Diese Untereinheit besitzt im

Gegensatz zu den anderen Vo Untereinheiten keinen Membrandurchgang (Merzendorfer et

al., 1997b) und wird nur durch ihre Wechselwirkungen mit den anderen Untereinheiten an

den Vo Komplex gebunden, wo sie jedoch eine wichtige Rolle bei der Assemblierung des

V1Vo Holoenzyms spielt (Bauerle et al., 1993).

Als neuer konstitutiver Bestandteil des nativen Vo Komplexes konnte die Untereinheit e

erstmalig bei M. sexta nachgewiesen werden (Merzendorfer et al., 1999); ihre Entdeckung

sicherte ab, dass ein kurz zuvor durch Co-Reinigung mit der Rinder V-ATPase gefundenes

Protein auch dort als V-ATPase-Untereinheit angesehen werden kann (Ludwig et al., 1998).

Die homologe Untereinheit in Hefe (VMA21) gehört nicht zur reifen V-ATPase, sondern ist

Diskussion

98

nur während der Assemblierung im Endoplasmatischen Retikulum mit dem Vo Komplex

assoziiert. Im Gegensatz zur Untereinheit e von M. sexta wird sie dort durch ein

Retentionssignal zurückgehalten und weist auch keinerlei Glycosylierungen auf, die bei M.

sexta immerhin 10 kDa zur apparenten Molekularmasse von 20 kDa beitragen.

Die Untereinheit c konnte durch die Autoradiographie nach Inkubation mit 14C-DCCD und

durch die MALDI-MS-Analysen ebenfalls eindeutig dem Vo Komplex zugeordnet werden.

Bei vielen anderen Spezies, z. B. S. cerevisiae, C. elegans und H. sapiens konnten inzwischen

neben c auch dessen Isoformen c´ und c´´ gefunden werden, wobei die Isoform c´ gleich groß

wie c ist, die Isoform c´´ größer ist (19-23 kDa) und wahrscheinlich einen

Membrandurchgang mehr besitzt (Hirata et al., 1997; Oka et al., 1997; Nishigori et al., 1998).

Für S. cerevisiae konnte gezeigt werden, dass zum einen jede der 3 Isoformen für die richtige

Funktion eines V-ATPase-Moleküls exprimiert werden muß (Hirata et al., 1997) und dass

zum anderen in jedem Vo Komplex jeweils eine Untereinheit c´ und c´´, sowie mehrere

Untereinheiten c vorhanden sind (Powell et al., 2000). Bei M. sexta wurden diese Isoformen

bisher vergeblich gesucht, obwohl es zumindest nach Ergebnissen von Northern-Blot-

Hybridisierungen zwei Transskripte unterschiedlicher Größe für das Proteolipid gibt (Dow et

al., 1992). Die Bande mit der apparenten Molekularmasse von 26 kDa, die als einziges

unbekanntes Protein im gereinigten Vo Komplex zu erkennen ist erschien aus naheliegenden

Gründen als guter Kandidat für die Isoform c´´. Dies erschien insbesondere plausibel, da bei

früheren Versuchen, die Untereinheit c in der GCAM mit 14C-DCCD zu markieren, auch ein

Signal bei 26 kDa zu finden war (Sumner et al., 1995). Bei der N-terminalen Sequenzierung

dieser Bande stellte es sich dann aber heraus, dass die erhaltene Sequenzinformation genau

dem N-Terminus der Untereinheit c entspricht. Bei einem Vergleich mit mehreren Isoformen

aus anderen Organismen zeigte sich, dass alle Isoformen der Kategorie c´´ ihren

Größenunterschied zu c und c´ hauptsächlich durch eine Verlängerung des n-Terminus

erhalten. Deshalb ist es sehr unwahrscheinlich, dass es sich bei der 26 kDa Bande um c´´

handelt. Für die Untereinheit c ist andererseits bekannt, dass sie beim Erhitzen der Proben für

die SDS-PAGE sehr leicht Aggregate bildet, die sehr groß werden und dadurch eine

Einwanderung ins Gel verhindern können (Finbow & Pitts, 1993; Lepier et al., 1996). Um

eine Aggregation zu vermeiden, werden die Proben des V1Vo Holoenzyms und des Vo

Komplexes in unserem Labor standardmäßig entweder nur 45 s auf 95°C erhitzt oder für 30

min bei 37°C erwärmt. Da das Vermeiden der Aggregation trotzdem nicht vollständig zu

gelingen scheint, dürfte es sich bei der 26 kDa Bande mit ziemlicher Sicherheit um eine

Dimer der Untereinheit c handeln. Nichtsdestotrotz gibt es, neben den bereits erwähnten zwei

Diskussion

99

Produkten aus der Northern-Blot-Hybridisierung, einen weiteren Hinweis auf die Existenz

einer Isoform c´ der Untereinheit c. Bei allen MALDI-MS-Analysen der Untereinheit

tauchten reproduzierbar zwei markante chymotryptische Massenfragmente auf (1523,9 und

1739,9 m/z), die nicht in der Sequenz von c wiederzufinden sind. Dabei könnte es sich um

Fragmente der Isoform c´ handeln, welche normalerweise ca. die gleiche Molekularmasse wie

c hat und deshalb in der normalen SDS-PAGE nicht von dieser zu unterscheiden ist. 2-D

Gelelektrophoresen, wie für den löslichen V1 Komplex, waren sowohl mit dem V1Vo

Holoenzym, als auch mit dem Vo Komplex bisher nicht erfolgreich. Einen neuen Ansatz bietet

die trägerfreie isoelektrische Fokussierung mit dem Octopussystem der Firma Dr. Weber,

welches gerade für Membranproteine besonders geeignet ist.

5.1.3. Der V1 Komplex

Auch die Reinigung des cytosolischen V1 Komplexes wurde im Vergleich zu Gräf et al.

(1996) modifiziert, so dass zum einen die Stabilität und Aktivität des Komplexes über

mehrere Wochen konserviert werden kann, und zum anderen eine größere Menge an Raupen

bei einer Präparation verarbeitet werden konnte, was die Menge an gereinigtem V1 Komplex

pro Präparationstag erhöht. Als entscheidend für die Erhaltung der Aktivität erwies sich die

Zugabe eines Reduktionsmittels schon früh während der Präparation, um bei der großen

Anzahl an Cysteinen im V1 Komplex die Bildung von Disulfidbrücken zu verhindern, die zu

einem deutlichen Aktivitätsverlust der V1-ATPase führen (diese Arbeit; Gräf et al., 1996).

Auch konnte inzwischen gezeigt werden, dass die Oxidation des V1 Komplexes zu

Änderungen seiner 3D-Struktur führt (Grüber et al., 2000b). Einen weiteren wichtigen

Einfluß hatte die Lagerungstemperatur von 4°C, bei der sich die V1-ATPase am stabilsten

erwies. Mit Hilfe der 2-D Gelelektrophorese konnte die genaue Zusammensetzung des V1

Komplexes aus den Untereinheiten A, B, C, D, E, F, G und H ermittelt werden, welche auch

durch die Ergebnisse von Immunfärbungen mit spezifischen Antikörpern und durch MALDI-

MS-Analysen bestätigt wurde. Die 2-D Gellektrophorese zeigte weiterhin, dass keine

Isoformen von Untereinheiten, die sich in ihren isoelektrischen Punkten unterscheiden, im V1

Komplex enthalten sind.

Diskussion

100

5.1.4. Die putative Isoform der Untereinheit B gehört zu den Hsp60-Proteinen

Für B Untereinheiten von V-ATPasen sind in mehreren Organismen Isoformen, die in

unterschiedlichen Organen bzw. Zellkompartimenten exprimiert werden, beschrieben (Wang

& Gluck, 1990; Van Hille et al., 1994; Bartkiewicz et al., 1995). Bei der Verwendung der

zwei monospezifischen Antiseren C23 und C34, welche gegen die Aminosäuren 243-428

bzw. gegen die Aminosäuren 475-494 der Untereinheit B gerichtet waren, wurde

überraschenderweise eine Bande B´ zwischen der A und der B Untereinheit mit einer

Molekularmasse von 60 kDa erkannt. C23 markierte dabei die Banden B und B´, C34

hingegen nur die Bande B´. Die B´ Bande ist sowohl in der gereinigten V-ATPase aus

Mitteldarmrohhomogenat als auch in der gereinigten V-ATPase aus angereicherter GCAM

von anteriorem und posteriorem Mitteldarm enthalten, nicht aber in der V-ATPase aus

gereinigter GCAM des anterioren und posterioren Mitteldarms und im V1 Komplex. Da die

letzteren Präparationen entweder aus reinen Membranen erfolgten oder direkt aus dem

Cytosol, lag die Vermutung nahe, dass es sich möglicherweise um eine endosomale Isoform

der Untereinheit B handeln könnte, die nicht in der Plasmamembran V-ATPase vorkommt.

Eine andere Möglichkeit wäre, dass es sich bei der Untereinheit B in der Plasmamembran V-

ATPase um ein posttranslational C-terminal verkürztes Protein handeln könnte, da es nicht

durch das Antiserum C34 gegen diesen Bereich erkannt wird. Bei einer MALDSI-MS

Analyse zeigte sich allerdings, dass es sich bei der Bande B um das vollständige Protein

einschließlich des C-Terminus handelt. Eine N-terminale Sequenzierung von B´ klärte

schließlich dessen Identität als Mitglied der Hsp60 Familie, für welches bereits zusätzliche

Sequenzinformation durch ein "shotgun screening" vorhanden war. Dieser Klon 10 aus M.

sexta enthält eine mitochondriale Lokalisationsequenz, die im Fall von B´ nicht mehr

vorhanden ist; dies spricht dafür, dass es sich tatsächlich in Mitochondrien befindet. Durch

die Zerstörung der Mitochondrien bei der Homogenisation des Gewebes wird es freigesetzt

und bindet eventuell als Chaperon an beschädigte Teile der V-ATPase und wird deshalb

mitgereinigt. Aus der späteren Elution in der Gelchromatographie im Vergleich zum reinen

Holoenzym lässt sich schließen, dass es nicht an die intakte bzw. vollständige V-ATPase

bindet, sondern an Teilkomplexe die möglicherweise "beschädigt" sind. Es stellt sich nun die

Frage, warum Antikörper gegen zwei verschiedene Teilbereiche der B-Untereinheit dieses

Hsp60 erkennen. Hierfür gibt es zwei mögliche Erklärungen. 1. Bei der Reinigung der

Fusionsproteine für die Herstellung der Antiseren wurde aus den zur Expression verwendeten

Diskussion

101

E. coli Zellen GroEL, ebenfalls ein Mitglied der Hsp60 Familie, mitgereinigt. Deshalb

produzierten die zur Immunisierung verwendeten Meerschweinchen Antikörper gegen

GroEL, welche das Hsp60 aus M. sexta erkennen. 2. Es ist bekannt, dass es zwischen der α

Untereinheit der F-ATPasen und Chaperonen konservierte Regionen gibt, welche auch in der

B-Untereinheit von V-ATPasen vorhanden sind und dass Antikörper gegen zwei synthetische

Peptide dieser Regionen der α Untereinheit von F-ATPasen sehr stark mit GroEL

kreuzreagieren (Luis et al., 1990, Alconada et al., 1994). Einige dieser konservierten Motive

kommen sowohl bei der B-Untereinheit von M. sexta als auch bei Hsp60 Proteinen der

Insekten vor (nicht gezeigt, hier wurde mit Hsp63 von H. vireszens verglichen da nur ein Teil

der M. sexta Sequenz bekannt ist), so dass auch hier eine Kreuzreaktion auftreten könnte.

5.1.5. Gehört die Untereinheit C zum V1 Komplex?

Bei Gräf et al. (1996) enthielten die gereinigten cytosolischen V1 Komplexe ebensowenig

eine Untereinheit C, wie die V1 Komplexe aus S. cerevisiae (Kane, 1995) und die gestrippten

V1 Komplexe aus chromaffinen Granula von Rind (Moriyama & Nelson, 1989). Allerdings ist

die Untereinheit C in den nach der modifizierten Methode gereinigten V1 Komplexen, wenn

auch in substöchiometrischen Mengen, enthalten. Sie läßt sich aber durch die Zugabe von

Alkoholen sehr leicht vom V1 Komplex abtrennen, weshalb zunächst vermutet wurde, dass

dadurch die Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes hervorgerufen wird. Der C-freie

Komplex zeigt aber in wässriger Lösung ebenfalls nur Ca-ATPase- und keine Mg-ATPase-

Aktivität. Die rekombinante Untereinheit C reassoziiert problemlos mit dem C-freien

Komplex und dieser hat die gleichen enzymatischen Eigenschaften wie der C-freie oder der

native C-haltige V1 Komplex. Dies scheint dem Ergebnis von Peng et al. (1993) zu

widersprechen, welche bei Clathrinvesikeln feststellten, dass durch Zugabe der

rekombinanten Untereinheit C zu einem Subkomplex aus A, B und D dessen Ca-ATPase-

Aktivität um ein 15-faches auf ein Drittel der Aktivität des intakten V1 Komplexes anstieg.

Dieser Subkomplex wurde allerdings unter sehr harschen Bedingungen hergestellt, so dass die

Aktivitätssteigerung möglicherweise durch die Wirkung der Untereinheit C als Stabilisator

oder auch Chaperon für diesen Subkomplex zurückzuführen ist und er dadurch erst in eine

aktivere Konformation gebracht wird. Der V1 Komplex aus M. sexta scheint hingegen mit und

ohne die Untereinheit C bereits in seiner richtigen Konformation zu sein.

Eine mögliche Antwort auf die Frage der Rolle der Untereinheit C ergab sich aus dem

Befund, dass sie sich mit Alkoholen nicht vom V1Vo Holoenzym entfernen läßt. Dagegen

Diskussion

102

reichen bereits 0,01% des Detergens C12E10, welches standardmäßig zur Solubilisierung und

Reinigung des V1Vo Holoenzyms benutzt wird, aus, um sie vom V1 Komplex abzulösen. Dies

zeigt, dass es einen großen Unterschied in der Wechselwirkung von Untereinheit C mit dem

V1Vo Holoenzym und dem V1 Komplex gibt. Es wurde bereits gezeigt, dass die Untereinheit

C zwar nicht für die Assemblierung der Komplexe V1 und Vo notwendig ist, wohl aber für die

Assemblierung der Beiden zum intakten Holoenzym (Beltran & Nelson, 1992; Ho et al.,

1993; Doherty & Kane, 1993). Auch bei der glukoseabhängigen Dissoziation der V-ATPase

in Hefe ist die Untereinheit C weder im V1- noch im Vo-Komplex zu finden, bei einer

Reassoziation ist sie allerdings wieder im V1Vo Holoenzym zu finden. Deshalb ist es sehr

wahrscheinlich, dass bedingt durch die einzige bisher nachgewiesene Aufgabe der

Untereinheit C, nämlich bei der Assemblierung des V1Vo Holoenzyms mitzuwirken, ihre

Lokalisation am Interface zwischen den beiden Komplexen zu finden ist, wo sie

möglicherweise durch die Untereinheit a "eingeklemmt" wird (siehe Modell Abb. 3). Die

Anwesenheit im gereinigten V1-Komplex von M. sexta ist vielleicht nur auf eine

präparationsbedingte hohe Affinität der Untereinheit C zum V1 Komplex zurückzuführen, was

auch die leichte Reassoziation der rekombinanten Untereinheit belegt.

5.1.6. Ist die Untereinheit E bei V-ATPasen das funktionelle Homolog zur Untereinheit γ der F-ATPasen?

Bei der Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen zerfiel dieser in zwei

Subkomplexe bestehend aus den Untereinheiten AB2HCEG und A2BEG mit einem

Molekulargewicht von ca. 310 bzw. 230 kDa. Keiner der beiden Komplexe zeigte eine Ca-

oder Mg-ATPase-Aktivität und in keinem der beiden Komplexe waren die Untereinheiten D

und F enthalten. Es sieht so aus, als ob der V1 Komplex durch KI in zwei asymmetrische

Hälften gespalten würde, die zusammengesetzt fast wieder einen ganzen Komplex von ca.

540 kDa ergeben. Für die F Untereinheit ist bekannt, dass sie leicht vom V1 Komplex

abzulösen und auch wieder zu reassozieren ist (Gräf et al., 1994b; Gräf et al., 1996).

Ausserdem gibt es Hinweise darauf, dass die beiden Untereinheiten D und F miteinander

interagieren (Thomashek et al., 1997). Interessant war jedoch das Verschwinden der D

Untereinheit bei gleichzeitigen Verbleiben der E Untereinheit an den Komplexen, da bei den

V-ATPasen immer noch sehr kontrovers diskutiert wird, welche dieser beiden Untereinheiten

das Homologe für die Untereinheit γ der F-ATPasen darstellt (Bowman et al., 1995; Nelson et

al., 1995; Xu & Forgac, 2000; Grüber et al., 2000a). Im aktuellen Struktur-Funktions-Modell

für die F-ATPasen (Review in Stock et al., 2000), das zum einen durch hochauflösenden

Diskussion

103

Strukturdaten (Abrahams et al., 1994; Bianchet et al. 1998; Stock et al., 1999; Hausrath et al.,

1999; Gibbons et al., 2000) und zum anderen durch Experimente, bei denen die Rotation der γ

Untereinheit relativ zur α und β Untereinheit gezeigt wurde (Duncan et al., 1995; Sabbert et

al., 1996; Noji et al., 1999), gestützt wird, übernimmt die langgestreckte γ Untereinheit der F-

ATPase die wichtige Aufgabe, die bei der Katalyse von ATP entstehende Bewegung im

hexagonalen Kopfteil der F1-ATPase zum für die Protonentranslokation verantwortlichen Fo-

Teil zu vermitteln. Beide Untereinheiten der V-ATPase haben keinerlei auffällige

Sequenzhomologie zur γ Untereinheit der F-ATPasen, aber für beide wird eine langgestreckte

Struktur aus α-Helices vorhergesagt, wodurch zumindest diese Anforderung erfüllt wäre. Für

die Untereinheit E spricht weiterhin ihre Stabilität gegenüber der Trypsinisierung, des V1

Komplexes und des V1Vo Holoenzyms und der Behandlung durch chaotrope Ionen, bei denen

die D Untereinheit als eine der ersten verschwindet; dabei bleibt die durch Methanol

induzierte Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes nichtsdestotrotz erhalten (Grüber et al.,

2000a; Reineke, Hunke, Huss und Wieczorek, unpublizierte Ergebnisse). Auch ein Komplex

aus den Untereinheiten A, B, C und E der Clathrinvesikel aus Rind zeigt ohne die

Untereinheit D eine Ca-ATPase-Aktivität (Peng et al., 1993). Der schnelle Abbau der D

Untereinheit deutet, genau wie deren herauslösen aus dem V1 Komplex durch chaotrope

Ionen, auf eine eher exponierte Position hin, die sich eigentlich nicht mit einer für ein γ-

Homolog a priori zu erwartenden geschützten Lage im Inneren des Enzyms vereinbaren läßt.

Weiterhin konnten für die E Untereinheit in Abhängigkeit von zugesetzten Nukleotiden

verschiedene Nulllängen-Vernetzungsprodukte entdeckt werden, was auf eine Bewegung der

E Untereinheit bei der Hydrolyse, evtl. eine Rotation, hindeutet (Grüber et al., 2000a). Auch

ist bei einer Pflanzen-V-ATPase die Entstehung einer Disulfidbrücke innerhalb der E

Untereinheit, durch Zugabe eines ATP-Analogons und einer dadurch verursachten

Konformationsänderung beobachtet worden (Kawamura et al. 2001). Eine Studie allerdings,

bei der die Untereinheit D entweder zufällig oder gerichtet mutiert wurde, zeigte bei

vollständig assemblierten V-ATPasen einen eindeutigen Zusammenhang zwischen der

Untereinheit D, der ATPase-Aktivität und dem Protonentransport, was wiederum diese als γ-

Homolog favorisiert (Xu & Forgac, 2000). Unter diesem Gesichtspunkt können die

Ergebnisse der KI-Behandlung auch folgendermaßen interpretiert werden: Die Untereinheit D

muß als rotierendes Element leicht drehbar sein und sollte deshalb keine allzu starken

Wechselwirkungen, z. B. hydrophober Natur zu anderen Untereinheiten eingehen können. Da

der V1 Komplex durch KI "in der Mitte" gespalten wird, was aus den entstehenden

Diskussion

104

Fragmenten AB2HCEG und A2BEG ersichtlich ist, könnte in diesem Fall die Untereinheit D

einfach aus dem Komplex "herausfallen" (Abb. 63). Ausserdem ist die Untereinheit E in

beiden Subkomplexen der KI-Spaltung enthalten und somit möglicherweise mehr als einmal

pro Enzym vorhanden. Dies spricht ebenfalls gegen ihre Funktion als Pendant zur γ-

Untereinheit, welche in der F-ATPase als einzelne Kopie vorliegt. Auch die ATPase-Aktivität

des V1 Komplexes ohne D darf nicht überbewertet werden, da die Ca-ATPase-Aktivität im

V1Vo Holoenzym als wahrscheinliche uni-site Katalyse sowieso keinen Protonentransport

bewirkt und deshalb auch kein γ-Homolog erforderlich ist. Möglicherweise handelt es sich

auch bei der Methanol stimulierten Mg-ATPase-Aktivität um eine solche uni-site Katalyse.

Eine vollständige Klärung, welche der V-ATPase Untereinheiten nun wirklich das Homolog

zur γ Untereinheit der F-ATPasen ist, wird erst durch eine Struktur der V-ATPase in atomarer

Auflösung möglich sein.

Abb. 63: Modell der Spaltung des V1 Komplexes durch KI.

5.1.7. Die räumliche Struktur des V1 Komplexes

Bislang kamen vor allem zwei bildgebende Verfahren, die Röntgenkleinwinkelstreuung und

die Elektronenmikroskopie, für die Analyse der räumlichen Struktur des V1 Komplexes zum

Einsatz (Svergun et al., 1998; Radermacher et al., 1999; Grüber et al., 2000a; Radermacher et

al., 2001). Die erste Methode hat, trotz der relativ geringen Auflösung, den entscheidenden

Vorteil, dass sie mit einem unfixierten Objekt arbeitet und damit die erhaltenen Bilder die

Struktur unter physiologischen Bedingungen widerspiegeln. In diesen Röntgenkleinwinkel-

Diskussion

105

streuungsexperimenten wurde die Struktur des V1 Komplexes mit einer Auflösung von 3,6

nm bestimmt. Der V1 Komplex hat die Form eines Pilzes, wobei der Durchmesser des Kopfes

ca. 14,5 nm beträgt und der Stiel eine Länge von 11 nm hat. Der Kopfteil zeichnet sich

ausserdem durch eine dreifache Symmetrie aus, die sich mit der alternierenden Anordnung

der jeweils drei Kopien der A und der B Untereinheit erklären läßt, wie sie auch für die α-

und β-Untereinheiten der F1-ATPase beobachtet wurde (Abrahams et al., 1994). Die Messung

von Konformationsänderungen im V1 Komplex mit der Röntgenkleinwinkelstreuung ist

möglich, wie bereits durch eine Veränderung der Struktur in Abhängigkeit vom Redox-

Zustand gezeigt werden konnte (Grüber et al., 2000b). Um mehr Details über den löslichen V1

Komplex und im besonderen über die Feinstruktur des Stiels zu erhalten, wäre auf jeden Fall

eine Untersuchung des vollständig C-freien V1 Komplexes und eine Analyse der durch KI-

Behandlung entstehenden asymmetrischen Hälften des V1 Komplexes sehr interessant.

Die mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung gewonnenen Daten decken sich sehr gut mit

den für die V1-ATPase (Radermacher et al., 1999; Grüber et al., 2000a; Radermacher et al.,

2001) und das Holoenzym (Abb. 2) aus M. sexta durch Elektronenmikroskopie erhaltenen.

Auch sie bestätigen die bereits aus anderen Organismen, wie N. Crassa und C. fervidus

bekannten Strukturmerkmale der V-ATPasen (Dschida & Bowman, 1992; Boekema et al.,

1997, 1998 und 1999). In der Aufsicht zeigen sie wiederum eine hexagonale Anordnung der

Untereinheiten A und B, und in der Seitenansicht die Unterteilung in Kopf und Stiel. Auch

die zusätzlichen Massen auf beiden Seiten des Stiels sind zu erkennen, welche in

elektronenmikroskopischen Bildern mit höherer Auflösung als zweiter bzw. dritter Stiel der

V-ATPase interpretiert wurden (Boekema et al., 1999). Zumindest einer dieser zusätzlichen

Stiele ist nach dem vorgeschlagenen Rotor- und Stator-Modell für die Funktionsweise der V-

ATPase in Analogie zur F-ATPase notwendig (Junge et al., 1997; Junge, 1999).

Eine Besonderheit der V-ATPase von M. sexta gegenüber V-ATPasen aus anderen

Organismen ist die hohe Dichte in der sie in die GCAM integriert ist, wie

elektronenmikroskopische Bilder eindrucksvoll zeigen (Abb. 2). In der chromaffinen Granula

aus Rindern sind es nur ca. 20 V-ATPasen pro Organelle und in den Clathrinvesikeln

vermutlich nur 2 pro Vesikel und auch in der Vakuolenmembran von N. crassa sind es

deutlich weniger als in der GCAM von M. sexta (Schmidt et al., 1982; Forgac et al., 1984;

Bowman et al., 1989). Die hohe, quasi kristalline Dichte der V-ATPase in der GCAM soll in

einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Engel (Biozentrum Basel) dazu

genutzt werden, mit Hilfe der Kraftmikroskopie und der Elektronenkristallographie die

Struktur der V-ATPase in ihrer nativen Membran weiter zu untersuchen. Vor allem soll dabei

Diskussion

106

auch die Struktur des Vo Komplexes, von dem es bis jetzt so gut wie keine Daten gibt, mit

einbezogen werden. Zum einen können dafür sogenannte right-side-out Vesikel und zum

anderen mit Hilfe von KI vom V1 Komplex befreite Vesikel verwendet werden.

5.2. Die Aktivität der V-ATPase

5.2.1. Ca2+ ist kein vollwertiger Ersatz für Mg2+

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der V-ATPase von M.

sexta deutliche Unterschiede in Hinblick auf ihre Wechselwirkung mit Mg2+ bzw. Ca2+

aufweist. Messungen der Enzymaktivität sowie Protonentransport- und Spannungsmessungen

ergaben, dass die Hydrolyse von Ca-ATP im V1 Komplex, im Gegensatz zur Hydrolyse von

Mg-ATP, nicht zu einer Kommunikation mit dem Vo Komplex führt, die in eine

Protonentranslokation mündet. Auch für die V-ATPase aus Clathrinvesikeln war gezeigt

worden, dass Ca2+ nicht als Ersatz für Mg2+ verwendet werden kann, da die Hydrolyse von

Ca-ATP dort ebenfalls keinen Protonentransport antreibt (Xie & Stone, 1988). In dieser

Arbeit wurde, neben der Aufgabe des Mg2+ als Co-Faktor für die ATP-Hydrolyse, eine

weitere Funktion des Mg2+ als Koppler zwischen Hydrolyse und Protonentransport und eine

zweite Bindestelle für Mg2+ diskutiert. Begründet wurde dies durch den 500-fachen

Konzentrationsunterschied zwischen der geringen, zur Hemmung der Ca-ATPase-Aktivität

und der hohen, für eine optimale Mg-ATPase-Aktivität benötigten Mg2+-Konzentration. Auch

in zwei weiteren Untersuchungen wurde eine mögliche zusätzliche Mg2+-Bindestelle bei V-

ATPasen postuliert. Zum einen bei Markierungsversuchen mit α-[32P]ATP bei der V-ATPase

aus chromaffinen Granula deutlich mehr Mg2+ benötigt als für die Bildung von Mg-ATP als

Substrat erforderlich war (Moriyama & Nelson, 1987). Zum anderen erhielten David & Baron

(1994) sowohl für die Osteoklasten als auch für die Nieren V-ATPase einen jeweils 2-fach

höheren Km-Wert für Mg2+, als nach der Bestimmung des Km-Wertes für ATP zu erwarten

gewesen wäre. Auch bei F-ATPasen konnte ein ähnlich unterschiedlicher Einfluß der beiden

divalenten Kationen auf die Aktivität des Enzyms festgestellt werden. Bei mitochondrialen F-

ATPasen bewirkt Ca2+ zwar ebenso wie Mg2+ eine ATP-Hydrolyse, nicht aber einen

Protonentransport (Pullman et al., 1960). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Mg2+

vermutlich bei der Dissoziation und Reassoziation von F1- und F0 Komplex bei E. coli eine

Rolle spielt (Vogel & Steinhart, 1976).

Diskussion

107

Obwohl es diesen entscheidenden Unterschied zwischen den beiden Kationen gibt, kann die

genauere Betrachtung der Ca-ATPase-Aktivität wichtige Erkenntnisse über Teilschritte der

ATP-Hydrolyse liefern. Dies gilt im besonderen für Untersuchungen am isolierten V1

Komplex, der in wässriger Lösung nur als Ca-ATPase aktiv ist. Hier konnten bereits mit Hilfe

von CuCl2-Vernetzungsexperimenten wechselnde Interaktionen zwischen einzelnen

Untereinheiten, in Abhängigkeit von Ca-ATP und Ca-ADP, gefunden werden (Grüber et al.,

2000a).

5.2.2. Warum ist der isolierte V1 Komplex inaktiv?

Der gereinigte cytosolische V1 Komplex hat eine Ca-abhängige ATPase-Aktivität und

keinerlei Mg-ATPase Aktivität. Die Ca-ATPase-Aktivität wird sogar schon durch 0,1 mM

Mg2+ vollständig inhibiert (Gräf et al., 1996). Durch die Zugabe von Methanol läßt sich

allerdings eine Mg-abhängige Hydrolyse von ATP induzieren (Gräf et al., 1996). Diese

methanolabhängige Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes ist vollkommen linear und

unabhängig vom produzierten oder vorgelegten ADP, ähnlich wie es z. B. für den

mitochondrialen F1-Komplex aus Rinderherz beschrieben ist (Ortiz Flores et al., 1982). Bei

der Überprüfung, ob dieser Effekt auch mit anderen Alkoholen erreicht werden kann, zeigte

sich, dass mit zunehmender Kettenlänge weniger Volumenanteil der Alkohole zugesetzt

werden muß, um eine optimale Aktivität zu erhalten. Diese Reihenfolge entspricht der

Aktivierung der Mg-ATPase-Aktivität der CF1-ATPase durch Alkohole (Kneusel et al., 1982;

Mochimaru & Sakurai, 1998), was auf einen vergleichbaren Aktivierungsmechanismus bei

den CF1- und den V1 Komplexen schließen läßt. Allerdings bewirkt Methanol bei der CF1-

ATPase die Freisetzung von festgebundenen Nukleotiden (Anthon & Jagendorf., 1984),

während beim V1 Komplex keine Veränderung des Gehaltes an festgebundenem ADP

gemessen werden konnte. Aus diesem Grunde kann die Stimulierung der Mg-abhängigen

ATPase-Aktivität durch die Freisetzung eines endogenen inhibitorischen ADPs aus dem

Komplex ausgeschlossen werden. Bis auf die Restablösung, der nur leicht assoziierten und

substöchiometrisch vorhandenen Untereinheit C, deren An- oder Abwesenheit keinerlei

Einfluß auf die Aktivität hat, wurde keine weitere Untereinheit durch die Inkubation mit

Alkoholen aus dem Komplex entfernt. Auch die Untereinheit H verbleibt im V1 Komplex,

was insofern von Bedeutung ist, da für den V1 Komplex einer Vma13p∆ Mutante der Hefe

eine geringe, Methanol-unabhängige Mg-ATPase-Aktivität (0,265 U/mg) beschrieben wurde,

die sich durch Zugabe von Methanol verdoppeln läßt (Parra et al., 2000). Eine Aktivierung

Diskussion

108

des Komplexes durch die Entfernung einer inhibitorischen Untereinheit, analog zur

Entfernung der Untereinheit ε der CF1-ATPasen (McCarty, 1992), ist deshalb auszuschließen.

Für die vollständige Inhibierung der Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes in wässriger

Lösung, d. h. in Abwesenheit von Methanol, bieten sich zwei Alternativen an. Zum einen

könnte bei einer Inkubation mit Mg2+ und ATP genau ein Hydrolyseschritt stattfinden, wobei

das entstandene Mg-ADP das Enzym sofort blockiert. Dies bedeutet, dass nach der Inkubation

mit Mg2+ und ATP zusätzliche Nukleotide im V1 Komplex enthalten sind. Falls sich diese

durch Methanol wieder entfernen lassen, wäre die Wirkungsweise geklärt. Zum anderen

könnte sich bei Zugabe von Mg2+ ein inhibierender Komplex aus Mg2+ und bereits

gebundenem ADP bilden, der die Hydrolyse des beim Reaktionsstarts zugegebenen Tris-

ATPs verhindert. Bei einem von endogenen Nukleotiden befreiten V1 Komplex sollte sich

dann Hydrolyse-Aktivität nachweisen lassen. Eine vergleichbare Wirkung von Mg2+ wurde

bei der F1-ATPase und bei der CF1-ATPase nachgewiesen (Drobinskaya et al., 1985; Carmeli

et al., 1981; Digel et al., 1996). Bei der CF1-ATPase wird die aus der Entfernung von

endogenem Nukleotid resultierende schnellere Startgeschwindigkeit der Hydrolyse durch

Wiederbeladen des Enzyms mit Mg-ADP rückgängig gemacht (Digel et al., 1998).

Im Gegensatz zur linearen Mg-ATP-Hydrolyse-Aktivität in Gegenwart von Methanol ist die

Ca-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes einer Endprodukthemmung durch Ca-ADP

unterworfen, was durch die starke Hemmung der Hydrolyse nach Vorinkubation mit ADP

und die lineare Ca-GTPase-Aktivität bestätigt wird. Auch für den isolierten V1 Komplex aus

Hefe ist eine Hemmung der Ca-ATP-Hydrolyse durch ADP und eine lineare Ca-GTPase-

Aktivität beschrieben (Parra & Kane, 1998). Der verwendete V1 Komplex aus Hefe enthält,

im Gegensatz zum V1 Komplex aus M. sexta, keinerlei gebundene Nukleotide. Es handelt sich

aber nicht um einen nativ abdissoziierten, sondern einen durch Deletion von Vma3p

(Untereinheit c) gewonnenen V1 Komplex. Dieser besteht zwar aus allen Untereinheiten (A,

B, D, E, F, G und H), kann aber wegen des defekten Vo Komplexes nicht an die Membran

andocken. Somit hat er weder native ATPase-Aktivität, noch eine native Dissoziation hinter

sich und enthält möglicherweise deswegen kein Nukleotid. Die V1 Komplexe aus beiden

Organismen zeigen aber eine ähnliche Hemmung durch Ca-ADP, weshalb diese sehr

wahrscheinlich nicht durch das bei M. sexta bereits endogen vorhandene ADP vermittelt wird,

sondern durch ein neu gebundenes Ca-ADP. Dieses besetzt möglicherweise eine der

katalytischen Bindestellen und verhindert so weitere Hydrolyse-Aktivität. Für die V1-ATPase

aus Thermus thermophilus ist eine derartige Inaktivierung durch gebundenes ADP

beschrieben (Yokoyama et al., 1998). Dort liegt der ADP-Gehalt des Enzyms zunächst bei

Diskussion

109

weniger als 0,1 mol/mol und steigt während der Hydrolyse bis zur vollständigen Inaktivierung

auf 1,5 mol/mol an.

5.2.3. Die V-ATPase-Aktivität wird durch ADP gehemmt

Die Hydrolyse-Aktivität des V1Vo Holoenzyms aus M. sexta wird durch Mg-ADP deutlich

erniedrigt, wobei man zwischen zwei verschiedenen Arten der Hemmung unterscheiden muß;

die Hemmung durch das während der ATP-Hydrolyse gebildete ADP (siehe 5.2.4.) und die

Hemmung der Startgeschwindigkeit durch Vorinkubation mit Mg-ADP. Letztere scheinen

alle V-ATPasen gemeinsam zu haben, da sie bereits für Vertreter aus verschiedenen Spezies

publiziert wurde. So wird die ATP-Hydrolyse der V-ATPase aus chromaffinen Granula durch

100 µM ADP allosterisch gehemmt (Moriyama & Nelson, 1987). Auch für den ATP-

abhängigen Protonentransport durch die V-ATPasen in der Niere und in den Osteoklasten

konnte eine inhibierende Wirkung von ADP auf die Startgeschwindigkeit, mit Ki-Werten von

37 bzw. 17 µM, gezeigt werden (David & Baron, 1994). Weiterhin konnten Webster et al.

(1995) einen inhibitorischen Effekt von ADP bei Konzentrationen von 25 bis 200 µM auf die

Protonentransportaktivität der V-ATPase in chromaffinen Granula feststellen. In einer

späteren Arbeit dieser Autoren gelang es, mit Hilfe von [3H]ADP dessen Bindung an eine

hochaffine Bindestelle (Kd=70 nM) nachzuweisen (Webster & Apps, 1996). Für Clathrin-

vesikel wurde eine bereits bei ADP-Konzentrationen von 0,2 µM beginnende Hemmung des

Protonentransport entdeckt (Vasilyeva & Forgac, 1998). Nicht zuletzt hat die V-ATPase aus

M. sexta mit einer 50%igen Hemmung der Hydrolyse-Aktivität bei ca. 2 µM ADP eine

vergleichbar hohe Empfindlichkeit. Alle diese Ergebnisse sind weitgehend in Einklang mit

dem von Webster et al. (1995) aufgrund von kinetischen Daten vorgeschlagenen Modell für

die Funktion der V-ATPase. Demnach gibt es für die V-ATPase zwei

Konformationszustände, eine katalytisch aktive R-Konformation und einen inaktive T-

Konformation, mit jeweils drei katalytischen und einer regulatorischen Bindestelle für

Nukleotide. ADP bindet dabei bevorzugt an die T-Konformation der V-ATPase und reguliert

dadurch die Aktivität des Enzyms.

Eine vergleichbare Art der Verzögerung der katalytischen Aktivität gibt es auch bei den F-

ATPasen. Als Ursache für deren Hemmung nach Vorinkubation mit Mg-ADP geht man von

der Besetzung der hochaffinen katalytischen Bindestelle durch ein Mg-ADP aus, die ähnlich

auch bei der normalen Hydrolyse gemäß dem binding change Mechanismus erfolgt

(Vasilyeva et al., 1982; Feldman & Boyer, 1985; Boyer, 1989; Milgrom & Cross, 1993).

Diskussion

110

5.2.4. Mg-ATP spielt eine wichtige Rolle bei der Dissoziation der V-ATPase in den V1 und den Vo Komplex

Schon seit geraumer Zeit ist bekannt, dass in vitro bei der membrangebundenen bzw.

rekonstituierten V-ATPase der katalytische V1 Komplex, unter dem Einfluß von chaotropen

Ionen und/oder von Nukleotiden vom Vo Komplex abgetrennt werden kann, wobei eine

Inkubation auf Eis (cold inactivation) die Dissoziation zusätzlich unterstützt (Moriyama &

Nelson, 1989; Bowman et al., 1989; Arai et al., 1989; Kane et al., 1989; Adachi et al.,

1990b). Dabei wurden die stärksten Dissoziationsraten in Gegenwart von Mg-ATP erreicht.

Die Vorinkubation mit NEM, welches die Bindung und Hydrolyse von ATP an die

Untereinheit A verhindert, unterbindet auch eine Dissoziation des Holoenzyms (Bowman et

al., 1989; Moriyama & Nelson 1987 und 1989). Ausserdem wurde mit Hilfe von nicht

hydrolysierbaren ATP-Analoga gezeigt, dass die Bindung von ATP alleine nicht ausreicht,

um eine Dissoziation zu induzieren. Deshalb wird vermutet, dass die V-ATPase während der

ATP-Hydrolyse einen Konformationszustand durchläuft, der sie anfällig für eine Dissoziation

durch chaotrope Ionen macht.

Nachdem die Dissoziation der V-ATPase unter in vivo Bedingungen in der Hefe

nachgewiesen werden konnte, gibt es einige wichtige Hinweise darauf, dass auch in vivo die

ATP-Hydrolyse eine entscheidende Rolle für die Dissoziationsfähigkeit des Enzyms spielen

könnte. So sind inzwischen mehrere Hefe-Mutanten bekannt, die nicht mehr in der Lage sind,

ATP zu hydrolysieren und offensichtlich als Folge davon auch keine Dissoziation der V-

ATPase nach Glukoseentzug aufweisen (Parra & Kane, 1998; MacLeod et al., 1999). Eine

dieser Mutanten ist zwar in der Lage, ATP zu binden, dissoziiert aber trotzdem nicht

(MacLeod et al., 1999). Andererseits reagierte ein Hefestamm mit einer Mutation in der

Untereinheit D (Vma8), was einen mehr als 90%igen Verlust der V-ATPase-Aktivität und des

Protonentransports zur Folge hat genauso wie der Wildtyp mit Dissoziation des Enzyms auf

die Entfernung von Glukose aus dem Nährmedium (Xu & Forgac, 2000). Es reicht also schon

eine relativ geringe Aktivität der V-ATPase aus, um in vivo die Möglichkeit der Regulation

der V-ATPase durch Dissoziation zu erhalten. Die indirekte Vermutung, dass nur wenige

Hydrolyseschritte für eine Dissoziation der V-ATPase erforderlich sind, konnte in der

vorliegenden Arbeit experimentell bestätigt werden. Allein die Hydrolyse von einem einzigen

Mg-ATP pro Holoenzymmolekül scheint vollkommen ausreichend zu sein, die V-ATPase

soweit zu destabilisieren, dass eine Dissoziation in V1 und Vo Komplex erfolgt. Auch die

Diskussion

111

Inkubation mit hohen Mg-ADP-Konzentrationen löst eine teilweise Dissoziation der V-

ATPase aus (Moriyama & Nelson 1989; Bowman et al., 1989). Für die Dissoziation könnte

man sich folgendes Szenario vorstellen. Mg-ATP bindet an die V-ATPase, wird hydrolysiert

und das entstehende Mg-ADP wird sofort durch ein neues Mg-ATP ersetzt. Ist aufgrund eines

ungünstigen ADP/ATP-Verhältnisses nicht ausreichend ATP vorhanden, verbleibt das Mg-

ADP in der Bindetasche. Diese Konformation der V-ATPase ist offensichtlich relativ instabil;

das Enzym tendiert damit zur Dissoziation, die umso wahrscheinlicher ist, je länger die

instabile Konformation beibehalten wird. Möglicherweise erklärt dies auch den Effekt der

cold inactivation bei dem die V-ATPase bei Inkubation mit Mg-ATP auf Eis deutlich

schneller dissoziiert als unter gleichen Bedingungen bei Raumtemperatur (Moriyama &

Nelson, 1989). Da die ATP-Hydrolyse bei niedrigen Temperaturen langsamer erfolgt ist das

Enzym möglicherweise bei jedem Reaktionsschritt länger in einer instabilen Mg-ADP-

Konformation als bei Raumtemperatur und dissoziiert deshalb leichter.

Widersprüchlich sind in diesem Zusammenhang die Befunde in Hinblick auf den ADP-Gehalt

der abdissoziierten V1 Komplexe. In den in vitro erhaltenen Komplexen konnte kein ADP

nachgewiesen werden, dagegen haben alle nativ von der Membran abdissoziierten V1

Komplexe einen ADP-Gehalt von ca. 1,7 mol/mol. Der ADP-Gehalt im intakten Holoenzym

stieg bei den in vitro Versuchen allerdings auf einen ähnlichen Wert von 1,8 mol/mol an. Um

die Rolle des ADPs in diesem Zusammenhang zu verstehen, ist es notwendig zu klären, ob 1)

ADP in beiden Fällen an der gleichen Stelle gebunden ist, was auf eine gleiche Funktion

hinweisen würde oder ob 2) verschiedene Bindestellen vorhanden sind, die unterschiedliche

Funktionen implizieren. Beim Holoenzym könnte es sich um einen Sensor für die

Energieladung der Zelle handeln, welcher die Dissoziation des V1 Komplexes vom Vo

Komplex induziert. Dass die V-ATPase selbst auf wechselnde ATP/ADP-Verhältnisse in der

Zelle reagiert, zeigen die Ergebnisse von Dietz et al. (1998). Hier wurde die V-ATPase aus

Gerste mit unter verschiedenen Bedingungen in vivo gemessenen ATP/ADP-Verhältnissen

inkubiert und die Aktivität bestimmt. Diese korrelierte mit der in vivo gemessenen

Ansäuerung der Vakuole unter den selben Bedingungen.

Beim V1 Komplex könnte das endogene ADP die Mg-ATPase-Aktivität abschalten, wie es

bei T. thermophilus der Fall ist (Yokoyama et al., 1998). Für die Bindung des ADPs bieten

sich zunächst natürlich die 3 katalytischen Untereinheiten A an. Nach kinetischen

Untersuchungen hat die V-ATPase allerdings neben drei katalytischen Bindestellen auch noch

mindestens eine regulatorische Bindestelle (Webster et al., 1995). Es gibt bereits eine ganze

Reihe von Befunden, welche belegen dass auch andere Untereinheiten mit Nukleotiden

Diskussion

112

interagieren. Die Untereinheit B der V-ATPase aus Hefe kann sowohl mit 2-Azido-ATP als

auch mit BzATP markiert werden (Zhang et al., 1995; Vasilyeva & Forgac, 1996). Weiterhin

konnte in chromaffinen Granula die Untereinheit D mit radioaktivem ATP markiert werden

(Moriyama & Nelson, 1987). Auch konnte kürzlich die Untereinheit E mit 8-N3-3´-biotinyl-

ATP markiert werden, wobei diese Markierung allerdings als Folge der engen Nachbarschaft

der Untereinheit E, als putatives γ-Homolog, mit der katalytischen Untereinheit A interpretiert

wurde (Schäfer et al., 2001). Da es in einem Vorversuch bereits durch die Verwendung von

alkalischer Phophatase gelang, den nativen V1 Komplex deutlich von seinem endogen

gebundenen ADP zu befreien und das native Holoenzym quasi frei von Nukleotiden ist sollte

es mit den entsprechenden Nukleotid-Sonden möglich sein die Bindestelle des ADPs zu

identifizieren.

5.3. Makrolid Antibiotika als Inhibitoren der V-ATPase

5.3.1. Die Identifizierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase

Die Plecomakrolide Bafilomycin und Concanamycin, welche von Werner et al. (1983, 1984)

erstmals beschrieben wurden, sind seit mehreren Jahren für ihre sehr spezifische und

reversible Hemmung von V-Typ ATPasen in nanomolaren Konzentrationen, aber auch für die

Hemmung von P-Typ ATPasen in mikromolaren Konzentrationen bekannt (Bowman et al.,

1988; Dröse et al., 1993; Dröse & Altendorf, 1997). Über die Art der Inhibierung bzw. die

Bindungsstelle der Antibiotika in den Enzymen ist allerdings sehr wenig bekannt.

Hanada et al. (1990) berichteten, dass Bafilomycin A1 bei V-ATPasen aus chromaffinen

Granula des Rindes mit dem Vo Komplex interagiert, da durch Zugabe von Vo Komplexen zu

gereinigtem V1Vo Holoenzym, dessen Hemmung durch Bafilomycin A1 unterdrückt werden

konnte, zugesetzte V1 Komplexe dagegen waren wirkungslos. Der Vo Komplex als Zielort der

Plecomakrolidhemmung wurde durch zwei weitere Publikationen zur V-ATPase aus

Clathrinvesikeln von Rindern bestätigt (Crider et al., 1994; Zhang et al., 1994). Zum einen

konnte durch 1 nM Bafilomycin A1 der passive Protonenfluß durch das säureaktivierte

rekonstituierte V1Vo Holoenzym und durch den säureaktivierten rekonstituierten Vo Komplex

unterbunden werden. Zum anderen wurde die Hemmung des ATP-getriebenen

Protonentransports von rekonstituiertem V1Vo Holoenzym durch Bafilomycin A1 untersucht.

Durch Zugabe von rekonstituiertem Vo Komplex, rekonstituierter Untereinheit a oder

Diskussion

113

gemeinsam rekonstituierten Untereinheiten a und d konnte diese vermindert werden, nicht

jedoch durch Untereinheit d alleine oder der Kombination aus c und c´. Daraus schlossen die

Autoren auf eine Bindungsstelle für Bafilomycin A1 in der Untereinheit a. Ein Widerspruch

ergab sich allerdings aus der Beobachtung, dass Proteoliposomen mit den gemeinsam

rekonstituierten Vo-Untereinheiten c, c´ und a, bzw. c, c´, d und a keinerlei Wirkung hatten.

Dies läßt auf eine Veränderung der Eigenschaften der Untereinheiten während der Reinigung

bzw. der Rekonstitution schließen.

Die Ergebnisse aus drei weiteren Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Wirkung von

Bafilomycinen auf die V-ATPase unabhängig von der Untereinheit a stattfindet. So zeigten Li

& Sze (1999), dass bei der gereinigten V-ATPase aus Hafer, welche keine Untereinheit a

enthält, die ATP-Hydrolyse durch Bafilomycin inhibiert wird. Ähnliches konnte in Hinblick

auf die Enzymaktivität bereits für die gereinigte V-ATPase aus M. sexta gezeigt werden,

deren Präparation früher ebenfalls keine Untereinheit a enthielt, die aber trotzdem sensitiv für

Bafilomycin war (Wieczorek et al., 1991). Weiterhin beobachten Landolt-Marticorena et al.

(2000) eine Hemmung der ATP-Hydrolyse durch Bafilomycin auch nachdem der

Protonentransport durch die Trypsinisierung der Untereinheit a von der ATP-Hydrolyse

entkoppelt wurde.

Einen Hinweis auf die Untereinheit c des Vo Komplexes als möglicher Bindungspartner für

Plecomakrolide lieferte eine Affinitätschromatographie mit kovalent gebundenem

Bafilomycin C1, welche zur Reinigung der V-ATPase aus Hühnchenosteoklasten eingesetzt

wurde (Rautiala et al., 1993). Dabei zeigte die Untereinheit c eine sehr hohe Affinität zur

Bafilomycin C1 Säule und eine Vorinkubation mit dem Untereinheit c spezifischen Inhibitor

DCCD in einer Konzentration von 1 mM verhinderte die Bindung der V-ATPase an die

Säule, woraus auf eine Bindestelle des Bafilomycins in der Untereinheit c nahe der DCCD-

Bindestelle geschlossen wurde. Allerdings bindet DCCD bei dieser hohen Konzentration

nicht nur an Carboxylgruppen wie die von Glutamat und Aspartat, sondern auch an

Sulfhydrylgruppen und Tyrosin-Seitenketten (Azzi et al., 1984). Deshalb konnte eine

Modifikation von Makrolidbindestellen in anderen Untereinheiten bzw. an einer anderen

Stelle der Untereinheit c nicht ausgeschlossen werden. Außerdem war zum Zeitpunkt der

Publikation die Anwesenheit bzw. Identität der Untereinheit a in der V-ATPase aus

Hühnchenosteoklasten noch nicht geklärt, so dass diese möglicherweise nur nicht detektiert

werden konnte. Durch ein mit 3H markiertes Derivat des Bafilomycins A1 konnte bei der V-

ATPase aus Hühnchenosteoklasten eine nicht kovalente Bindung an den Vo Komplex

nachgewiesen werden (Mattsson & Keeling, 1996), wodurch die direkte Interaktion von

Diskussion

114

Plecomakroliden mit dem Vo Komplex endgültig bestätigt wurde. Weiterhin unklar war

jedoch, in welcher der Vo Untereinheiten die Plecomakrolidbindestelle sitzt. Diese Frage

konnte nun durch die Experimente der vorliegenden Arbeit eindeutig geklärt werden.

Wie bereits erwähnt, wurde in einer langjährigen Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen von

Prof. Altendorf (Universität Osnabrück) und Prof. Zeeck (Universität Göttingen) versucht, die

für die Hemmung entscheidenden Strukturelemente der Plecomakrolide zu finden und

diejenigen Positionen zu identifizieren, die für eine Modifikation ohne großen Verlust an

Spezifität und Hemmung geeignet sind (Dröse et al., 1993; Dröse et al., 2001). Für die

biologische Wirksamkeit erwies sich der Makrolactonring als essentiell und der

Hemiketalring für eine maximale Hemmung als entscheidend. Die Position C23, an der bei

Concanamycin A ein Zuckerrest gebunden ist, der lediglich zu einer höheren chemischen

Stabilität der Verbindung beiträgt, konnte ohne Aktivitätsverlust entfernt und modifiziert

werden. Ähnliche Untersuchungen an Bafilomycin A1 von Gagliardi et al. (1998, 1999)

zeigten ebenfalls, dass diese Position, bei Bafilomycinen handelt es sich um C21, ohne

Einfluß auf die Aktivität modifiziert werden kann. Deshalb wurde diese Position mit einem 125I besetzt, welches zu Detektion mittels Autoradiographie genutzt wurde. Als weitere Stelle,

bei der eine Modifikation keinen Einfluß auf die Hemmungseigenschaften hat, bot sich die

Position C9 an, deren OH-Gruppe gegen eine UV-aktivierbare Gruppe, ein

Trifluormethylaryldiazirin (Brunner et al., 1980) ausgetauscht wurde. Diese Gruppe bildet

nach UV-Bestrahlung bei 360 nm ein hochreaktives, aber sehr kurzlebiges Carben, welches

mit allen in Proteinen vorkommenden Resten kovalente Bindungen eingehen kann, wobei die

Reaktion mit Nucleophilen die bevorzugte ist. Außerdem wurde noch die Position C21

deoxyliert, was sich positiv auf die Stabilität der Verbindung auswirkte. Die daraus

resultierende Verbindung 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-

[125I]Iodo-concanolid A, (J-Concanolid A, Abb. 33) wurde zunächst als nicht radioaktive

Verbindung für Hemmstudien des gereinigten V1Vo Holoenzyms eingesetzt und hatte mit

einem IC50 von 10-20 µM im Vergleich zu seiner Ausgangssubstanz Concanamycin A mit

einem IC50 10 nM zwar eine schlechtere Hemmung, die aber immer noch als ausreichend

erachtet wurde. Bei der konzentrationsabhängigen Markierung des V1Vo Holoenzyms mit der

Sonde konnte nur die Markierung der Untereinheit c beobachtet werden. Selbst mit einer

Konzentration von 100 µM, bei der die ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms bis zu 90%

gehemmt ist, wurde keine andere Untereinheit markiert. Die direkte Bindung der Sonde an die

Untereinheit c wird durch vier weitere Befunde gestützt. Erstens konnte bei

Radioaktivitätsmessungen der an Hand der Proteinfärbung identifizierten und aus dem SDS-

Diskussion

115

PAGE Gel ausgeschnittenen Bande eine Zunahme der daran gebundenen Radioaktivität in

Abhängigkeit von der eingesetzten Sondenkonzentration gemessen werden. Diese korreliert

auch mit dem Grad der Inhibierung des V1Vo Holoenzyms bei den gleichen Konzentrationen.

Zweitens wird auch im gereinigten Vo Komplex nur die Bande der Untereinheit c markiert

wobei diese Markierung ein, für den Vo Komplex typisches Bild der Untereinheit c, mit einer

relative breiten Bande aufweist, die auch in der Proteinfärbung wie in der Autoradiographie

mit 14C-DCCD zu bemerken ist. Drittens wird in den Vesikeln der GCAM, in der sich das

V1Vo Holoenzym in seiner nativen Membran mit der originären Lipidzusammensetzung

befindet, ebenfalls nur die Untereinheit c markiert. Letztlich konnte die Untereinheit c per

MALDI-MS-Analyse der aus dem SDS-PAGE-Gel ausgeschnittenen Banden, die auch

Radioaktivität aufwiesen, eindeutig identifiziert werden. In Gegenwart der Sonde konnten

kovalente Modifikationen an bestimmten Fragmenten festgestellt werden, die ohne Sonde

nicht vorhanden waren. Die Massenzunahme der Fragmente von Aminosäure 8-22, 12-29 und

85-87 um 842 kDa entspricht der Masse des J-Concanolids A, welches seine HI-Gruppe

verloren hat. Dieser Verlust ist wahrscheinlich auf die Säureempfindlichkeit der Sonde und

die doch sehr niedrigen pH-Werte bei der Gelfixierung und der Vorbereitung für die MALDI-

MS zurückzuführen. Bei den drei anderen gefundenen Fragmenten, Aminosäure 1-7, 85-87

und 138-151 erhöhte sich die Masse um 972 kDa. Diese Erhöhung ist etwas kritischer zu

betrachten, da bei Bindung der ganzen Sonde nur eine Massenzunahme von 970 kDa zu

erwarten ist. Möglicherweise ereignet sich eine zusätzliche Modifikation der Sonde, z. B. das

Öffnen einer der C-C Doppelbindungen und Anlagerung zweier Protonen. Die Untersuchung

einer möglichen Modifikation der Sonde und die sehr zeitaufwendige, genauere Analyse und

Sequenzierung der erhaltenen modifizierten Fragmente dauert noch an. Allerdings sprechen

mehrere Hinweise dafür, dass es sich bei den Fragmenten tatsächlich um die Umgebung der

Bindestelle handelt. Erstens taucht das Fragment 85-87 mit beiden Modifikationen auf.

Zweitens überlappen sich die Fragmente 8-22 und 12-29, und das Fragment 1-7 liegt in ihrer

direkten Nachbarschaft. Drittens befinden sich die Fragmente 1-7 und 85-87 nach

Vorhersagen zur Topologie der Untereinheit c auf der luminalen Seite der Membran und auch

die anderen Fragmente sind in der luminalen Hälfte der Membran zu finden (Tab. 9; Findlay

et al., 1997). Dagegen war keines der gefundenen Fragmente cytosolisch orientiert. Deshalb

kann man vermuten, dass die Bindetasche für J-Concanolid A und somit auch für

Concanamycin A auf der luminalen Seite der Membran liegt oder von dort zugänglich ist.

Diskussion

116

Tab. 9: Topologie der Untereinheit c. Die Daten für die Untereinheit c von M. sexta wurden aus NiceProt view of SWISS-PROT für Acc. Nr. P31403 übernommen. Aminosäurenummer Orientierung 1-7 Lumen 8-30 Membran 31-52 Cytosol 53-73 Membran 74-92 Lumen 93-114 Membran 115-126 Cytosol 127-152 Membran 153-156 Lumen

Auch die Spezifität der Sonde konnte untermauert werden, da sich die Markierung durch 10

µM J-Concanolid A mit 1 µM vorgelegtem Concanamycin A deutlich abschwächen und

durch höhere Konzentrationen (10 µM, 100 µM und 300 µM) ganz verhindern läßt, was eine

gemeinsame Bindestelle für Concanamycin A als Ausgangssubstanz und J-Concanolid A als

dessen Derivat nahelegt. Für die vollständige Verdrängung der Markierung muß demnach

mehr Concanamycin A eingesetzt werden als für die vollständige Hemmung der ATP-

Hydrolyse. Die Ursache dafür ist möglicherweise, dass für eine vollständige Hemmung,

ähnlich wie für DCCD gezeigt (Forgac, 1998), nur ein einziges gebundenes Inhibitormolekül

pro V-ATPase benötigt wird; im optimalen Fall stünden dem J-Concanolid A noch die 5

weiteren Bindestellen der anderen Untereinheiten c zur Verfügung. Es müssen demgemäß alle

sechs Untereinheiten c mit Concanamycin A besetzt sein, bis keine Markierung mehr möglich

ist.

Neben den Concanamycinen gehören auch die bereits mehrfach erwähnten Bafilomycine zu

den Plecomakroliden (Bindseil & Zeeck, 1994). Zwei Vertreter dieser Gruppe, Bafilomycin

A1 und Bafilomycin B1, wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit getestet, die V-ATPase zu

hemmen bzw. mit J-Concanolid A um die Bindestelle in der Untereinheit c zu konkurrieren.

Mit einem IC50 zwischen 10-20 nM lagen sie exakt im Bereich des parallel getesteten

Concanamycin A. Dies war zunächst etwas überraschend, da Concanamycin A eigentlich als

der potentere Inhibitor für V-ATPasen gilt und der bisher bekannte IC50-Wert für Bafilomycin

A1 bei M. sexta auch etwas höher lag (Bowman et al., 1988; Dröse et al., 1993; Wieczorek et

al., 1991). Der niedrigere Wert für Bafilomycin A1 liegt wahrscheinlich zum einen an der

großen Reinheit der verwendeten Plecomakrolide, die wir direkt von der Arbeitsgruppe von

Prof. Zeeck (Göttingen) erhalten hatten und zum anderen an der schon beschriebenen

Lagerung der in DMSO gelösten Makrolide bei -70°C und der strikten Vermeidung von

Diskussion

117

Gefrier-Auftau-Zyklen, besonders bei den instabileren Bafilomycinen. Gleiche

Empfindlichkeit der V-ATPase gegenüber allen drei verwendeten Plecomakroliden kommt

nicht nur bei M. sexta vor sondern ist auch für Mesembryanthemum crystallinum beschrieben

worden (Dröse et al., 2001). Die Unterschiede zur V-ATPase von N. crassa könnten sich

durch unterschiedliche Affinitäten erklären lassen; die höhere Flexibilität des mit 18 C-

Atomen größeren Lactonrings der Concanamycine erlaubt gegenüber dem steiferen 16 C-

Ring der Bafilomycine eine leichtere Anpassung an eine von Spezies zu Spezies

möglicherweise verschieden gestalteten Bindungstasche (Kinashi et al., 1984; Dröse &

Altendorf, 1997). Auf jeden Fall konnten beide verwendeten Bafilomycine die Markierung

der Untereinheit c durch J-Concanolid A unterbinden, was verallgemeinernd einen Schluss

auf eine gemeinsame Bindestelle in der Untereinheit c für Plecomakrolide zulassen dürfte.

Leider gibt es außer bei den drei erwähnten Organismen offensichtlich keine vergleichenden

Untersuchungen zur Hemmung von Bafilomycinen und Concanamycinen. Bei einem

Sequenzvergleich der Untereinheiten c dieser drei Spezies, zeigen sich jedoch gemeinsame

Unterschiede von M. sexta und M. crystallinum zu N. crassa, die evtl. zu einer veränderten

Bindetasche führen könnten (Abb. 64). Von den 10 gefundenen Aminosäureaustauschen sind

5 neutral, bei den anderen 5 handelt es sich um Wechsel von polaren zu hydrophoben Resten

oder umgekehrt (L→N, T→A, S→A, S→A), sowie einen Austausch von einem polaren

Glutamin (Q91) zu einem positiv geladenem Histidin (H92 bzw. H95). Diese zusätzliche

Ladung befindet sich in der unmittelbaren Nachbarschaft des Fragmentes 85-87, welches

vermutlich mit J-Concanolid A markiert wird. Durch gerichtete Mutationen an diesen

Positionen, unterstützt von vergleichenden Analysen anderer V-ATPasen, die den Austausch

Q→H haben wie z. B. die Pflanzen-V-ATPasen oder nicht haben wie z. B. die Säuger-V-

ATPasen (siehe auch Abb. 65) könnte untersucht werden, ob dieser Zusammenhang wirklich

besteht.

Abb. 64: Vergleich der Untereinheiten c von N. crassa, M. sexta und M. crystallinum. Die Aminosäuren aus der Sequenz von N. crassa, welche sich von den beiden anderen Sequenzen unterscheiden, diese aber gemeinsam haben, sind hervorgehoben. (grau unterlegt, neutrale Austausche; schwarz unterlegt, nicht neutrale Austausche)

Diskussion

118

5.3.2. Gibt es eine gemeinsame Bindestelle für Makrolide in V-ATPasen?

Die Plecomakrolide gehören zur Familie der Makrolide, in deren Reihen einige neue

Substanzen mit ganz unterschiedlichen Wirkungen auf V-ATPasen aus verschiedenen Spezies

beschrieben sind. Eine dieser neuen Gruppen bei den Makroliden sind die Benzolacton-

Enamide (Erickson et al., 1997). Zwei Vertreter dieser Gruppe wurden hier bezüglich ihres

Einflusses auf die V-ATPase aus M. sexta untersucht, das Salicylihalamid und das Apikularen

A. Salicylihalamid wurde erstmals aus dem marinen Schwamm Haliclona sp. isoliert und hat

eine stark cytotoxische Wirkung. Sehr wahrscheinlich wird Salicylihalamid allerdings nicht

von Haliclona sp. selbst, sondern von einem symbiontischen Mikroorganismus dieses

Schwammes produziert (Erickson et al., 1997). Bei Untersuchungen mit V-ATPasen aus

verschiedenen Spezies ergab sich für Salicylihalamid ein sehr differenziertes Bild; so wurde

die V-ATPase von S. cervisae und N. crassa nicht gehemmt, wohl aber Säuger-V-ATPasen

aus Leber, Niere und Osteoklasten (Boyd et al., 2001).

Für den zweiten Vertreter der Benzolacton-Enamide, das Apikularen A, isoliert aus dem

Myxobakterium Chondromyces robustus ist ähnliches bekannt; es hat keinerlei Effekt auf

Hefen und filamentöse Pilze, wirkt aber stark toxisch auf Säugetierzellen (Kunze et al., 1998;

Jansen et al., 2000; Boyd et al., 2001).

Archazolid und Cruentaren gehören ebenfalls zur Gruppe der Makrolide und werden auch aus

Myxobakterien isoliert (Prof. Reichenbach & Dr. Sasse, GBF Braunschweig, persönliche

Mitteilung). Archazolid führt bei Wachstumstests in Säugetierzelllinien zu den gleichen

cytotoxischen Wirkungen und den gleichen morphologischen Veränderungen wie

Salicylihalamid, Concanamycin und Bafilomycin z. B. die Erweiterung des Endoplasma-

tischen Retikulums oder die Bildung von Streßfaserbündeln (Reichenbach, 1997 und Dr.

Sasse, persönliche Mitteilungen). Für Cruentaren werden dagegen wesentlich höhere

Konzentrationen für eine Hemmung des Zellwachstums benötigt, und die morphologischen

Veränderungen der Zellen haben andere Ausprägungen, was auf eine andere Wirkungsart der

Cytotoxizität hinweist (Dr. Sasse, persönliche Mitteilung). Diese letzten drei Vertreter der

Makrolide wurden in dieser Arbeit erstmals auf ihre Wirkung auf V-ATPasen getestet,

Salicylihalamid zum ersten Mal bei einer Insekten V-ATPase. Für Salicylihalamid,

Apikularen und Archazolid wies die V-ATPase die gleiche Empfindlichkeit auf wie für die

Plecomakrolide mit einem IC50 von 10-20 nM. Mit der Insekten V-ATPase wurde somit

neben den Säuger-V-ATPasen eine zweite Gruppe von V-ATPasen mit hoher Sensitivität

Diskussion

119

gegenüber Benzolacton-Enamiden etabliert und Archazolid A als neue V-ATPase hemmende

Substanz in die Makrolidfamilie eingeführt.

Warum die V-ATPase von M. sexta und die V-ATPasen von Säugern im Gegensatz zu V-

ATPasen aus S. cervisae und N. crassa auf die Benzolacton-Enamide reagieren, ist nicht klar.

Geht man allerdings von der Annahme aus, dass die Benzolacton-Enamide, ähnlich wie die

Plecomakrolide an die Untereinheit c binden, ergeben sich bei einem Vergleich der

Aminosäuresequenzen dieser Untereinheit, welche bei allen Spezies hoch konserviert ist, fünf

Positionen, die nur S. cervisae und N. crassa gemeinsam haben (Abb. 65). Ob einer dieser

Aminosäureaustausche allerdings die Unempfindlichkeit der V-ATPase aus diesen beiden

Organismen gegenüber Benzolacton-Enamiden bewirkt, müßte wiederum durch gezielte

Mutageneseexperimente überprüft werden. Auch wurden bisher noch keine Tests an

pflanzlichen V-ATPasen durchgeführt, welche im Vergleich (Abb. 65) ebenfalls

berücksichtigt sind.

Abb. 65: Sequenzvergleich der V-ATPase Untereinheiten c. Es sind die Sequenzen folgender Spezies miteinander verglichen: S. cerevisiae, N. Crassa, R. norvegicus, H. sapiens, B. taurus, A. aegyptie, N. norvegicus, N. tabacum, G. hirsutum, M. crystallinum und O. sativa. Die fünf Aminosäuren die nur S. cerevisiae und N. crassa im Vergleich zu allen anderen Spezies gemeinsam haben, sind hervorgehoben.

Besonders interessant waren in diesem Zusammenhang auch die Versuche, die Markierung

durch J-Concanolid A durch die vier neuen Makrolide zu kompetitieren. Mit 10 µM

Archazolid A gelang es, ähnlich wie mit Concanamycin A, Bafilomycin A1 bzw. B1 die

Markierung vollständig zu unterdrücken, mit Salicylihalamid und Apikularen gelang dies,

obwohl sie die gleiche Effizienz in der Hemmung der V-ATPase zeigen, nicht.

Diskussion

120

Wie nach den Beobachtungen von Dr. Sasse zu erwarten war, hatte Cruentaren einen deutlich

höheren IC50 von 60 µM bezüglich der Hemmung der V-ATPase, und es konnte ebenfalls

keine Verdrängung der Markierung durch J-Concanolid A nachgewiesen werden.

Damit gibt es einen entscheidenden Unterschied in der Wirkungsweise von Plecomakroliden

und Archazolid A gegenüber den Benzolacton-Enamiden, da sie bei gleichen IC50 Werten

einen verschiedenen Einfluß auf die Markierung mit J-Concanolid A haben. Hierfür bieten

sich zwei Erklärungsmöglichkeiten an. Erstens, die beiden Gruppen haben verschiedene

Bindungsstellen an die V-ATPase und binden dort unabhängig voneinander an das Enzym,

möglicherweise sogar an unterschiedlichen Untereinheiten. Bisher gibt es keine Daten über

die Wirkungsweise der Benzolacton-Amide-Hemmung auf die V-ATPase. Es ist nur der

Effekt auf Zellkulturen bzw. die V-ATPase-Aktivität, nicht aber ein Einfluß auf die

Protonenleitfähigkeit des Vo Komplexes gezeigt, wie dies für Plecomakrolide geschehen ist

(Crider et al., 1994; Zhang et al., 1994), so dass durchaus eine andere inhibitorische Wirkung

auf die V-ATPase-Aktivität denkbar wäre. Die zweite Möglichkeit könnte in der Größe der

Bindetasche der V-ATPase für die Makrolide begründet liegen. Diese muß relativ groß sein,

da sowohl der Makrolidring als auch der Hemiketalring einen entscheidenden Einfluß auf die

Hemmung der V-ATPase haben (Dröse et al., 1993; Gagliardi et al., 1999; Dröse et al.,

2001). Vielleicht ist sie bei einer Vorinkubation mit Plecomakroliden und Archazolid A

blockiert, weshalb sich das J-Concanolid A nicht einlagern kann. Dagegen füllen die

kleineren Benzolacton-Amide diese Tasche nicht vollständig aus und das J-Concanolid A hat

zusätzlich Platz um zu binden oder es verdrängt durch seine Anlagerung das Benzolacton-

Amid.

5.3.3. Die V-ATPase von M. sexta: Ein Modellsystem für die Osteoporoseforschung

Die Untersuchung der V-ATPase und die Wirkungsweise ihrer spezifischen Inhibitoren, vor

allem aus der Gruppe der Makrolide, wird im Zusammenhang mit der Osteoporoseforschung

immer wichtiger. Die zum Knochen hin orientierten Membranen der Osteoklasten sind dicht

mit V-ATPasen bestückt (Blair et al., 1989), und es gibt einen direkten Zusammenhang

zwischen der V-ATPase und dem Abbau von Knochenmaterial durch die Osteoklasten

(Chatterjee et al., 1992; Blair, 1998). Eine spezifische Hemmung der V-ATPase in

Osteoklasten könnte also den Knochenabbau verhindern oder verlangsamen. Es konnte schon

gezeigt werden, dass Bafilomycin A1 in vitro und in vivo in der Lage ist, genau dies zu

bewirken (Sundquist et al., 1990; Farina et al., 1995). Allerdings wirkt Bafilomycin auch auf

Diskussion

121

alle anderen V-ATPasen im Organismus und seine Letaldosis liegt bei 1 mg/kg

Lebendgewicht. Bekannt sind aber auch osteoklastenspezifische Isoformen von V-ATPase

Untereinheiten (Van Hille et al., 1993, 1995; Bartkiewicz et al., 1995; Lee et al., 1996; Li et

al., 1996) und eine Regulation der mRNA für V-ATPase Untereinheiten während der

Osteoklastenreifung (Laitala-Leinonen et al., 1996). Deshalb wird versucht, ausgehend von

der bekannten Struktur von Bafilomycin, durch Modifikation einen Inhibitor zu finden, der

nur die V-ATPase in den Osteoklasten hemmt (Farina & Gagliardi, 1999; Gagliardi et al.,

1998; Keeling et al., 1998). Durch die Entdeckung der neuen Mitglieder der Makrolidfamilie,

die zwischen V-ATPasen aus verschiedenen Spezies unterscheiden können, bietet sich eine

neue Ansatzmöglichkeit, um gewebespezifische Inhibitoren der V-ATPasen zu finden (Boyd

et al., 2001; Farina & Gagliardi, 1999). Da die V-ATPase aus M. sexta ähnlich wie die V-

ATPase aus Osteoklasten durch die Benzolacton-Amide gehemmt wird, eignet sie sich auch

aufgrund ihrer hohen Reinheit und Verfügbarkeit hervorragend für eine Struktur-Funktions-

Analyse von neuen Inhibitoren.

Eine weitere wichtige Gemeinsamkeit zwischen der V-ATPase aus M. sexta und der V-

ATPase aus Osteoklasten spiegelt sich in einer für beide beobachteten Interaktion mit dem

Cytoskelett der Zelle wieder. So konnte gezeigt werden, dass die V-ATPase während der

Aktivierung der Osteoklasten mit dem Aktincytoskelett direkt interagiert und in vitro an F-

Aktin bindet (Lee et al., 1999; Holliday et al., 2000). Auch die V-ATPase aus M. sexta kann

in vitro direkt an Aktin binden, und in der Zelle colokalisiert sie mit Aktinfilamenten

(Merzendorfer et al., 2001). Mit ihrer Empfindlichkeit gegenüber Plecomakroliden und der

neuen Gruppe der Benzolacton-Amide, sowie ihrer Interaktion mit dem Aktincytoskelett stellt

die V-ATPase von M. sexta damit möglicherweise ein ideales Modell dar, mit dem

grundlegende Fragen in der Osteoporose-Forschung geklärt werden können.

Zusammenfassung

122

6. Zusammenfassung

Die V-ATPase im larvalen Mitteldarm des Tabakschwärmers Manduca sexta energetisiert die

gesamten sekundär aktiven Transportprozesse in diesem Epithel. Sie ist einer der best

untersuchten Vertreter dieser Klasse von Ionentransport-ATPasen und hat sich als ideales

Objekt für die Untersuchung von Struktur, Funktion und Regulation dieser Proteinfamilie

erwiesen. In der vorliegenden Dissertation wurde die Struktur des V1Vo Holoenzyms, des V1

Komplexes und des Vo Komplexes, die Regulation der V-ATPase-Aktivität und die

Hemmung der V-ATPase durch Makrolide untersucht.

Mit der Modifikation von bestehenden und der Etablierung von neuen Protokollen gelang es

das V1Vo Holoenzym, den V1 Komplex und den Vo Komplex in Milligramm-Mengen zu

reinigen und damit die Vorraussetzung für neue Erkenntnisse über die Struktur der V-ATPase

zu schaffen.

Durch N-terminale Sequenzierung, Immunfärbung und/oder MALDI-MS konnten neben den

bereits bei M. sexta bekannten Untereinheiten A, B, E, F, G, c und d auch die restlichen

Untereinheiten C, D, H, a und e identifiziert werden. Das als Kontamination der V-ATPase

häufig auftauchende Protein B´ wurde als ein mitochondriales Hsp60 identifiziert. Bei dem

sowohl im Holoenzym als auch im Vo Komplex vorhandenen 26 kDa großen Protein handelt

es sich sehr wahrscheinlich um ein Dimer der Untereinheit c und nicht, wie bislang vermutet

um deren Isoform c´´. Für die im V1 Komplex nur substöchiometrisch vorhandene

Untereinheit C konnte gezeigt werden, dass sie im Gegensatz zur Situation beim V1Vo

Holoenzym nur sehr schwach gebunden ist. Sie lässt sich schon unter relativ milden

Bedingungen (0,01% C12E10) vom V1 Komplex abtrennen, reassoziiert aber andererseits auch

sehr leicht wieder an den V1 Komplex, wie mit einer rekombinanten Untereinheit gezeigt

werden konnte. Durch die Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen ergaben sich

Hinweise, die eher auf die Untereinheit D als auf die Untereinheit E als Homolog der V-

ATPasen zur γ-Untereinheit der F-ATPasen schließen lassen. Durch die Erhöhung der

Ionenstärke während eines Reinigungsschrittes gelang es erstmals, die Untereinheit a bei einer

Insekten V-ATPase darzustellen. Dies gelang sowohl für das V1Vo Holoenzym als auch für

den Vo Komplex und war besonders wichtig, da die Untereinheit als der Favorit für die

Bindung der V-ATPase spezifischen inhibitorischen Plecomakrolide angesehen wurde. Wie

sich allerdings herausstellte, ist die Untereinheit c des Vo Komplexes die einzige Untereinheit

die durch das semisynthetische Concanamycin-Derivat, 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-

Zusammenfassung

123

benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-concanolid A (J-Concanolid A) spezifisch markiert

wird. Durch MALDI-MS konnten einige Bereiche der Untereinheit c bestimmt werden, die

potentiell mit der Sonde interagieren. Diese Abschnitte befinden sich alle auf der luminalen

Seite der Membran. Beim Testen einer Reihe neuer Makrolide zeigte sich erstaunlicherweise,

dass Salicylihalamid, Apikularen und Archazolid ähnlich wie Concanamycin A, Bafilomycin

A1 und B1, mit einem IC50 von ca. 20 nM die V-ATPase schon bei sehr niedrigen

Konzentrationen hemmen. Das ebenfalls getestete Cruentaren lag mit einem IC50 von 60 µM

hingegen deutlich höher. Neben Concanamycin und den Bafilomycinen ist auch Archazolid in

der Lage, die Markierung durch J-Concanolid A zu unterbinden, was auf eine gemeinsame

Bindestelle dieser drei Makrolide hinweist.

Die Untersuchung der Enzymaktivität der V-ATPase zeigte zum einen eine deutliche

Endprodukthemmung durch das entstehende ADP und zum anderen dass Mg2+ nicht durch

Ca2+ zu ersetzten ist, da Ca2+-ATP im Gegensatz zu Mg2+-ATP keinen Protonentransport

unterstützt. Für den Mechanismus der Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in seinen V1 und

Vo Komplex scheinen Nukleotide von entscheidender Bedeutung zu sein. Während das V1Vo

Holoenzym praktisch nukleotidfrei ist, sind im abdissoziierten V1 Komplex ein bis zwei

Moleküle ADP enthalten. Die Bindung von ADP oder AMP-PNP an das Holoenzym bewirkt

keine Dissoziation der V-ATPase. Allerdings genügt bereits die Hydrolyse von nur einem

Molekül Mg2+-ATP pro Enzym, um eine Dissoziation zu induzieren. Aus diesem Befund

kann geschlossen werden, dass die V-ATPase während der Hydrolyse einen Konformations-

zustand durchläuft, in dem sie instabil ist und zur Dissoziation neigt.

Literaturverzeichnis

124

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Werner, G., Hagenmaier, H., Drautz, H., Baumgartner, A. and Zähner, H. (1983). Metabolic products of microorganisms. 224. Bafilomycins, a new group of macrolide antibiotics. Production, isolation, chemical structure and biological activity. J Antibiot 37, 100 -117.

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Xu, T. and Forgac, M. (2000). Subunit D (Vma8p) of the yeast vacuolar H+-ATPase plays a pole in coupling of proton transport and ATP hydrolysis. J Biol Chem275, 22075-81.

Yokoyama, K., Muneyuki, E., Amano, T., Mizutani, S., Yoshida, M., Ishida, M. and Ohkuma, S. (1998). V-ATPase of Thermus thermophilus is inactivated during ATP hydrolysis but can synthesize ATP. J Biol Chem 273, 20504-10.

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Zhang, J. M., Myers, M. and Forgac, M. (1992). Characterization of the V0 Domain of the Coated Vesicle (H+)-ATPase. J Biol Chem 267, 9773-78.

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Zhang, X., Herring, C. J., Romano, P. R., Szczepanowska, J., Brzeska, H., Hinnebusch, A. G. and Qin, J. (1998). Identification of phosphorylation sites in proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Chem 70, 2050-9

Publikationen

133

8. Publikationen

Orginalpublikationen: Grüber, G., Radermacher, M., Ruiz, T., Godovac-Zimmermann, J., Canas, B., Kleine-

Kohlbrecher, D., Huss, M., Harvey, W. R. and Wieczorek, H. (2000). Three-Dimensional Structure and Subunit Topology of the V(1) ATPase from Manduca sexta Midgut. Biochemistry 39, 8609-16.

Huss, M., Gaßel, M., Dröse, S., Ingenhorst, G., Koenig, S., Zeeck, A., Altendorf, K. and Wieczorek, H. (in Revision). Plecomacrolides bind to subunit c of the insect V-ATPase. Biochemistry.

Merzendorfer, H., Graf, R., Huss, M., Harvey, W. R. and Wieczorek, H. (1997). Regulation of proton-translocating V-ATPases. J Exp Biol 200, 225-35.

Merzendorfer, H., Huss, M., Schmid, R., Harvey, W. R. and Wieczorek, H. (1999). A novel insect V-ATPase subunit M9.7 is glycosylated extensively. J Biol Chem 274, 17372-8.

Svergun, D. I., Konrad, S., Huss, M., Koch, M. H., Wieczorek, H., Altendorf, K., Volkov, V. V. and Grüber, G. (1998). Quaternary structure of V1 and F1 ATPase: significance of structural homologies and diversities. Biochemistry 37, 17659-63.

Wieczorek, H., Grüber, G., Harvey, W. R., Huss, M. and Merzendorfer, H. (1999). The plasma membrane H+-V-ATPase from tobacco hornworm midgut. J Bioenerg Biomembr 31, 67-74.

Wieczorek, H., Grüber, G., Harvey, W. R., Huss, M., Merzendorfer, H. and Zeiske, W. (2000). Structure and regulation of insect plasma membrane H(+)V-ATPase. J Exp Biol 203, 127-35.

Abstracts und Kurzvorträge: Huss, M., Merzendorfer, H., Dietlein, T., Harvey, W. R. and Wieczorek, H. (1997).

Regulation of the insect V-ATPases. Verhandlungen der Deutschen Zoologischen Gesellschaft, 107

Huss, M., Grüber, G., Harvey, W. R., Merzendorfer, H., Schmid, R. and Wieczorek, H. (1999). Structural features of the insect V-ATPase: the catalytic V1 complex. Zoology 102, 66

Merzendorfer, H., Huss, M., Reineke, S., Harvey, W. R., Schmid, R. and Wieczorek, H. (1999). Structural features of the insect V-ATPase: the membrane bound Vo complex. Zoology 102, 69

Merzendorfer, H., Huss, M., Reinike, S., Harvey, W. R., Schmid, R. and Wieczorek, H. (1999). Structural features of the insect V-ATPase: the Vo complex. Comparative Biochemistry and Physiology 124A, S81

Kurzvortrag 5th Inter. Congress of Comparative Physiology and Biochemistry, Calgary 1999: Huss, M., Grüber, G., Harvey, W. R., Merzendorfer, H., Schmid, R. and Wieczorek, H.

(1999). Structural features of the insect V-ATPase: the V1 complex. Comparative Biochemistry and Physiology 124A, S6

Abkürzungsverzeichnis

134

9. Abkürzungsverzeichnis

ADP: Adenosin-Diphosphat

AMP-PNP: Adenylyl-Imino-Diphosphat

APP: Alkalische Phosphatase

APS: Ammoniumpersulfat

ATP: Adenosin-Triphosphat

BCIP: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat

BSA: Bovine serum albumin

BzATP: 3-O-(4-Benzoyl)Benzoyladenosin-5´-triphosphat

C12E10: Polyoxyethylen-10-Laurylether

DCCD: N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid

DMSO: Dimethylsulfoxid

DTT: Dithiothreitol

EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure

GCAM: Goblet cell apical membrane

GTP: Guanosin-Triphosphat

J-Concanolid A: 9-O-[p-(Trifluoroethyl-diazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-

[125I]Iodo-concanolid A

kDa: Kilodalton

MALDI-MS: Matrix unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie

MBP: Maltose bindendes Protein

MOPS: N-Morpholinopropansulfonsäure

NBT: 4-Nitroblautetrazoliumchlorid-Hydrat

NEM: N-Ethylmaleimid

PAGE: Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SDS: Sodium dodecyl sulfate

TCA: Trichloressigsäure

TEMED: N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

Tris: 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol

Tween 20: Polyoxyethylensorbitanmonolaureat

Lebenslauf

135

10. Lebenslauf

Markus Huß Persönliche Angaben Geburtstag: 13. März 1968 Geburtsort: Augsburg Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: seit 25. Juli 1997 verheiratet mit Tanja Huß, geb. Beutmüller Eltern: Huß Manfred und Renate, geb. Rößler Schulbildung 1974-1978 Besuch der Hans Adlhoch Grundschule in Augsburg 1978-1987 Besuch des Holbein Gymnasiums in Augsburg (mathematisch-

naturwissenschaftlicher Zweig) Juni 1987 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife Wehr/Ersatzdienst Juli 1987-Feb. 1989 Zivildienst beim Malteser Hilfsdienst Augsburg Hochschulbildung Okt. 1989-Sept. 1995 Studium an der Ludwig-Maximillians-Universität München,

Diplomstudiengang Biologie Mai 1992 Vordiplom

Hauptstudium mit der Fächerbelegung Zoologie (Hauptfach), Biochemie, Pflanzenphysiologie und Anthropologie/Human-genetik Diplomarbeit im Labor von Prof. Dr. Wieczorek, Zoologisches Institut der Universität München

Sept. 1995 Abschluß als Diplom-Biologe univ. 1996 Wissenschaftlicher Mitarbeiter von Prof. W. R. Harvey (Temple

University, PA, USA) 1997 Promotionsstudium

Doktorarbeit im Labor von Prof. Dr. Wieczorek (zunächst Zoologisches Institut der Universität München, seit 1998 Arbeitsgruppe Tierphysiologie Universität Osnabrück)

Eidesstattliche Erklärung

136

11. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen recht herzlich bedanken, die mich während meiner

Studien und der vorliegenden Doktorarbeit unterstützt und zum erfolgreichen Abschluß

beigetragen haben:

Zunächst bedanke ich mich bei M. sexta ohne deren Mitteldarmepithel es die ganze V-

ATPase Forschung wesentlich schwerer hätte.

Prof. Dr. Helmut Wieczorek danke ich für die Betreuung, die guten Forschungsbedingungen

in einem modernen Labor und die vielen intensiven, nicht nur forschungsrelevanten

Diskussionen.

Prof. Dr. Karlheinz Altendorf danke ich für die Übernahme des Koreferates und die

Zusammenarbeit im Rahmen der Untersuchungen der Makrolide.

Bei allen Mitgliedern unserer ehemaligen Arbeitsgruppe aus München und unserer jetzigen

Arbeitsgruppe hier in Osnabrück bedanke ich mich für die gute Zusammenarbeit und das

angenehme Arbeitsklima, besonders bei Bruni Förg-Brey, Gundula Key, Daniela Kleine-

Kohlbrecher, Thomas Krüppel, Harald Mikoleit, Hans Merzendorfer, Stephan Reineke,

Tobias Schafmeier und Wolfgang Zeiske.

Weiterhin vielen Dank an die Arbeitsgruppe Mikrobiologie für die stets freundliche Hilfe und

Unterstützung bei Problemen aller Art, hier vor allem an Michael Gaßel und Stefanie Konrad.

Bei Simone König, Klaus Fendler, Eva Grabsch, Barbara Schedding, Roland Schmid, Gudrun

Ingenhorst, Prof. Zeeck, Michel Koch und Gerhard Grüber bedanke ich mich für die

erfolgreiche Zusammenarbeit.

Weiterhin möchte ich mich bei Prof. Reichenbach und Dr. Sasse von der GBF

(Braunschweig) und Dr. Boyd vom NCI (Maryland) für die Bereitstellung von Makroliden

bedanken.

Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, vor allem bei meiner Mutter und

meiner Ehefrau Tanja, die mich immer unterstützt und mir den Rücken freigehalten haben.

Documents

Struktur, Funktion und Regulation der Plasmamembran V ...nbn:de:gbv:... · Struktur, Funktion und Regulation der ... Einfluß von Ca-ADP, Mg-ADP und Pi auf die Hydrolyse von ATP durch