Struktur und Funktion einer pflanzlichen

Adenosin-5´-phosphosulfat-Reduktase aus Catharanthus roseus (L.)

DISSERTATION

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen

vorgelegt von

Antje Maria Prior

aus Hemer

Bochum 2000

Tag der mündlichen Prüfung: 27.06.2000

An dieser Stelle möchte ich mich bei Herrn PD Dr. J. D. Schwenn für die interessanteThemenstellung dieser Arbeit und seine ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft bedanken.Für die freundliche Übernahme des Korreferates bedanke ich mich bei Herrn Prof.Dr. W. H. Kunau.Prof. Dr. W. B. Frommer danke ich dafür, daß ich in seinem Labor in Tübingen die Methodenzur Pflanzentransformation erlernen konnte.Außerdem möchte ich mich ganz herzlich bei allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeiternunserer Arbeitsgruppe, insbesondere Sandra, Annette und Christopher, für die angenehmeArbeitsatmosphäre, ihre Freundlichkeit und ihre Hilfe bedanken.Diese Arbeit wurde im Rahmen des Graduiertenkollegs „Biogenese und Mechanismenkomplexer Zellfunktionen“ durchgeführt. Bei den Kollegiaten und deren Betreuern bedanke ichmich für ihr Interesse am Fortgang meiner Arbeit.Schließlich danke ich Peter, meinen Eltern und Anne und Klaus für ihre Betreuung und dieUnterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit.

Inhaltsverzeichnis I

SeiteInhaltsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis V

1 Einleitung 1

2 Ergebnisse 11

2.1 Korrektur der Nukleotidsequenz des par-Genproduktes aus Catharanthusroseus 11

2.2 Computergestützte Analyse des par-Genproduktes aus Catharanthus roseus 122.2.1 Analyse der Primärstruktur des par-Genproduktes 122.2.1.1 Primärsequenzähnlichkeiten des par-Genproduktes zu Sequenzen der

EMBL-Datenbank 132.2.2 Vorhersage der Sekundär- und Tertiärstruktur des par-Genproduktes 152.3 Untersuchungen zur in vitro Funktion des par-Genproduktes aus

Catharanthus roseus 162.3.1 Import des par-Genproduktes in isolierte Chloroplasten aus Pisum sativum 162.3.2 Bakterielle Expression und Reinigung des par-Genproduktes aus

Catharanthus roseus 172.3.2.1 Oligomere Zustandsformen des par-Genproduktes aus Catharanthus roseus 192.3.3 Biochemische Charakterisierung des par-Genproduktes aus Catharanthus

roseus 202.3.3.1 Optimierung der in vitro Reaktionsbedingungen der APS-Reduktion

durch das par-Genprodukt 202.3.3.2 Absorptionsspektrum und alternative Reduktionsmittel des

par-Genproduktes 222.3.3.3 Bestimmung der Michaelis-Konstante Km für das Substrat Adenosin-5´-

phosphosulfat 232.3.3.4 Bestimmung der Michaelis-Konstanten Km für die Reduktionsmittel

Dithiothreitol und Glutathion 242.3.3.5 Beteiligung des Cystein317 an der Reduktion von Adenosin-5´-phosphosulfat 252.3.3.6 Einfluß des Glutamin220 auf die Sulfonukleotid-Spezifität des

par-Genproduktes 252.3.3.7 Proteindisulfid-Isomerase-Aktivität des par-Genproduktes 262.3.4 Untersuchungen zur Funktion der Domänen des par-Genproduktes aus

Catharanthus roseus 272.3.4.1 Bakterielle Expression und Reinigung der Core-Domäne des

par-Genproduktes 272.3.4.2 Aktivität der Core-Domäne des par-Genproduktes als Thioredoxin-

abhängige APS-Reduktase 282.3.4.3 Insulindisulfid-Reduktase-Aktivität des par-Genproduktes 30

Inhaltsverzeichnis II

2.3.4.4 Untersuchung der funktionellen Komplementation pro- und eukaryotischer,Cystein-auxotropher Mutanten durch die Core-Domäne despar-Genproduktes 31

2.4 Transgener Tabak zur Untersuchung der Funktion der APS-Reduktasein planta 34

2.4.1 Binäre Vektorkonstrukte zur Transformation von Nicotiana tabacum 342.4.2 Transformation von Nicotiana tabacum Pflanzen, Selektion und

Regeneration 362.4.3 Untersuchung der Integration transferierter DNA in das Genom von

Nicotiana tabacum 382.4.4 Analyse der Transkriptmenge der rekombinanten APS-Reduktase in

transgenen Nicotiana tabacum Pflanzen 412.4.5 Immunologischer Nachweis der rekombinanten APS-Reduktase in transgenen

Tabakpflanzen 452.4.6 APS-Reduktase-Aktivität in Proteinextrakten transgener Tabakpflanzen 482.4.7 Reinigung der in Nicotiana tabacum exprimierten (His)6-APS-Reduktase

aus Catharanthus roseus 50

3 Diskussion 53

3.1 Die cDNA par und ihr Genprodukt die APS-Reduktase aus Catharanthus roseus 54

3.2 In vitro Funktion der APS-Reduktase aus Catharanthus roseus 543.2.1 Funktion des Transitpeptids zum Chloroplastenimport 543.2.2 Funktion des par-Genproduktes als Glutathion-abhängige APS-Reduktase 563.2.3 Übereinstimmungen von APS-Reduktase und APS-Sulfotransferase 573.2.4 Struktur/Funktionsbeziehungen in der APS-Reduktase 583.3.5 Bedeutung der APS-Reduktase für die Sulfatreduktion in höheren Pflanzen 623.2.6 Phylogenetischer Vergleich der pflanzlichen APS-Reduktase und ihrer

mikrobiellen Homologa 643.3 Transgener Tabak zur Analyse der APS-Reduktase in planta 663.3.1 Etablierung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Nicotiana

tabacum durch binäre Plasmid-Konstrukte für die APS-Reduktase 673.3.2 Selektion von transgenen, APS-Reduktase überproduzierenden

Tabakpflanzen 683.3.3 Eigenschaften der angereicherten, in planta exprimierten APS-Reduktase

aus Catharanthus roseus 70

4 Zusammenfassung 72

5 Material und Methoden 74

5.1 Geräteliste 745.2 Feinchemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien 74

Inhaltsverzeichnis III

5.3 Bakterien- und Hefestämme 755.4 Pflanzenmaterial 765.5 Klonierungs- und Expressionsvektoren 765.6 Plasmide 775.7 Oligonukleotide und Sonden 805.8 Bakterien- und Hefeanzucht 825.9 Pflanzenanzucht 845.10 Molekularbiologische Methoden 855.10.1 Herstellung und Transformation kompetenter Zellen 855.10.2 Agrobakterien-vermittelte Transfomation von Nicotiana tabacum Pflanzen 865.10.3 Präparation von Nukleinsäuren 865.10.4 Klonierungstechniken und Agarosegelelektrophorese 875.10.5 Amplifizierung von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion 875.10.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) 895.10.7 Markierung von DNA mit Digoxigenin-Desoxyuridintriphosphat 895.10.8 Northern-Blot, Dot-Blot und Detektion von DNA/RNA- bzw. DNA/DNA-

Hybriden 895.10.9 Sequenzierung von DNA 905.10.10 In vitro Transkription, in vitro Translation und Chloroplastenimport 905.11 Rekombinante Proteinexpression in Escherichia coli, Zellaufschluß und

Proteinreinigung 905.11.1 Native Reinigung bakteriell exprimierter (His)10- und (His)6-Fusionsproteine 905.11.2 Gewinnung von Gesamtprotein aus Bakterienlysaten für die SDS-PAGE 915.11.3 Proteinextraktion aus Saccharomyces cerevisiae 915.11.4 Proteinextraktion aus Pflanzenmaterial 915.11.5 Aufreinigung von rekombinanten (His)6-Proteinen aus Extrakten transgener

Tabakpflanzen 925.12 Proteinbiochemische Methoden 925.12.1 Proteinbestimmung 925.12.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen 925.13 Immunologische Methoden 935.13.1 Transfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen (Western-Blot) 935.13.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen 935.14 Enzymatische Analysen 955.14.1 Synthese der radioaktiven Nukleotide [35S]-3´-Phosphoadenosin-5´-

phosphosulfat und [35S]-Adenosin-5´-phosphosulfat 955.14.2 Bestimmung der Adenosin-5´-phosphosulfat (APS)-Reduktase- und

3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS)-Reduktase-Aktivität 955.14.3 Insulindisulfid-Reduktionstest 965.14.4 Reaktivierung reduzierter, denaturierter RibonukleaseA 965.14.4 Bestimmung der Diaphorase-Aktivität 975.15 Abbildungen 97

6 Literatur 98

Inhaltsverzeichnis IV

7 Anhang 115

7.1 Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Klons Crpar4aus Catharanthus roseus 115

7.2 Nukleotidsequenz des cDNA-Klons Crpar1 aus Catharanthus roseus 1167.3 Nukleotidsequenz des cDNA-Klons Crpar2 aus Catharanthus roseus 1167.4 Primärstrukturvergleich der APS-Reduktase aus Catharanthus roseus

mit Proteinen der EMBL-Datenbank 1177.5 Agrobakterien-freie Nicotiana tabacum Transformanden mit genomischer

Integration der T-DNA der Plasmide pBINAr1.R.2.1, pBINAr2.N.2.13 und pBINAr3.2.17 118

7.6 Relative Intensitäten (I) der RT-PCR-Signale für die par-cDNA zur internenactin1-cDNA-Kontrolle (100 %) in ET1-, ET2- und ET3-Transformandenvon Nicotiana tabacum 119

Abkürzungsverzeichnis V

Abkürzungsverzeichnis

Abb AbbildungA dest Destilliertes WasserAMP AdenosinmonophosphatAmp AmpicillinAPS Adenosin-5´-phosphosulfatAR APS-ReduktaseATP AdenosintriphosphatBAP 6-Benzylaminopurinβ-B β-BaktylBCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-PhosphatBSA RinderserumalbuminBq BecquerelBp BasenpaarecDNA komplementäre DNACef CefotaximeCi Curie, 1 Ci = 3,7 x 1010 BqCMP Cyklisches 2´-3´-CytidinmonophosphatDCPIP 2,6-DichlorphenolindophenolDEAE DiethylaminoethylDig-11-dUTP Digoxigenin-11-desoxyuridin-5´-triphosphatDNA DesoxyribonukleinsäuredNTP DesoxynukleosidtriphosphatDTT DithiothreitolEDTA Ethylendiamin-N, N, N´, N´-tetraessigsäureET Echte TransformandeFd Ferredoxing Erdbeschleunigung (9,81 m x s-2)GMP GuanosinmonophosphatGSH reduziertes GlutathionGSSG oxidiertes GlutathionGrx GlutaredoxinHPLC High Performance Liquid Chromatography

(Hochdruckflüssigkeitschromatographie)IgG Immunglobulin GIMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography

(Metallafffinitätschromatographie)IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosidKan KanamycinkDa KilodaltonMW MolekulargewichtmRNA Boten-RibonukleinsäureMS Murashige und Skoog

Abkürzungsverzeichnis VI

NAA α-NaphtylessigsäureNADH Nicotinamid-adenin-dinukleotidNADPH Nicotinamid-adenin-dinukleotidphosphatNBT 4-NitroblautetrazoliumchloridNC NitrocelluloseOAS-TL O-Acetylserin-(thiol)-LyaseOD optische DichtePAP 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphatPAPS 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfatPBS Phosphat-gepufferte physiologische KochsalzlösungPCR Polymerase-KettenreaktionPDI Proteindisulfid-IsomerasePEG PolyethylenglycolPMSF PhenylmethylsulfonylfluoridRif RifampicinRNA RibonukleinsäureRT-PCR Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionrpm Umdrehungen pro MinuteSDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-GelelektrophoreseT-DNA Transfer-DNATab TabelleTBS Tris-gepufferte physiologische KochsalzlösungTrx ThioredoxinTris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanTriton X Octylphenol-polyethylenglykoletherU Unit (1 µmol Stoffumsatz/min)vgl vergleiche

Die Abkürzungen der Basen und Aminosäuren erfolgten nach der IUPAC-Nomenklatur.

Einleitung 1

1 Einleitung

Schwefel als essentieller Bestandteil aller lebenden Organismen ist in seinen unterschiedlichenOxidationsstufen eines der vielseitigsten Elemente der Biologie. Während Tiere auf reduziertenSchwefel angewiesen sind und ihren Bedarf durch schwefelhaltige Aminosäuren in derNahrung decken müssen, sind Pflanzen, Pilze und Bakterien in der Lage, diesenMakronährstoff in oxidierter Form aus der Umgebung aufzunehmen und zu assimilieren.

Pflanzen versorgen ihren Schwefelstoffwechsel dabei hauptsächlich durch die Aufnahme vonanorganischem Sulfat aus dem Boden. Das Sulfat gelangt über spezielle Transporter von denWurzeln durch den Transpirationsstrom in den Xylemgefäßen vorwiegend in dieMesophyllzellen und wird hier in der Vakuole gespeichert oder zur Synthese organischerSubstanzen (Abb. 1) verwendet.

Abb. 1: Die Produkte der Sulfatassimilation in höheren Pflanzen (e-: Elektronen)

Die Syntheseprodukte sind zum einen sekundäre Stoffwechselprodukte wie sulfatierteFlavonoide, Cholinsulfat oder Glucosinolate und Phytosulfokine, in denen der hexavalenteSchwefel in N- und O-Sulfatestern vorliegt (Matsubayashi und Sakagami, 1996, Varinet al., 1997). Zum anderen werden reduzierte Schwefelverbindungen gebildet indem das Sulfatdurch die Aufnahme von acht Elektronen zum divalenten Sulfid reduziert wird(Schwenn, 1994). Bei dieser assimilatorischen Sulfatreduktion entsteht zunächst durch einenZwei-Elektronenübergang tetravalenter Sulfit-Schwefel, und durch dessen Reduktion mitweiteren sechs Elektronen das Sulfid.Der tetravalente Schwefel ist als Sulfonsäurerest einer Quinovose-Kopfgruppe der Sulfolipidein den Thylakoid- und inneren Chloroplastenmembranen zu finden (Benning, 1998). Sulfid istBaustein der Aminosäuren Cystein und Methionin, die als primäre Produkte der reduktivenSulfatassimilation im wesentlichen der Proteinbiosynthese dienen. Von den proteinbildendenAminosäuren bestimmt Cystein in besonderem Maße die Struktur und katalytische Aktivität

SO42-N - u n d O -

S u lfa te s te r

S O32-

2 e-

6 e-

S2-

S u lfo l ip id e

C y s te inM e th io n inG S H

F eS -Z en trenC o fak to re nV itam in e

Einleitung 2

von Enzymen. Außerdem können Cysteinreste Eisen-Schwefel-Zentren in Proteinen bilden undkoordinieren, die zum Elektronentransport genutzt werden können. Ein relativ hoher Anteildes in der Pflanze produzierten Cysteins wird zur Synthese von Glutathion verwendet, einemTripeptid, das in der Zelle eine entscheidende Rolle als Antioxidans und universellesEntgiftungsmittel spielt (Bergmann und Rennenberg, 1993). Neben der Bedeutung in derProteinbiosynthese spielt Methionin in Form von S-Adenosyl-Methionin eine Rolle alsMethylgruppendonor in der Pflanze (Miyazaki und Yang, 1987). Der reduzierte Sulfid-Schwefel ist weiterhin Bestandteil von Cofaktoren und Vitaminen wie Thiamin, Liponsäure,Coenzym A oder Biotin, die für die Aufrechterhaltung des Zellmetabolismus essentiell sind.In Pflanzen erfolgt die assimilatorische Sulfatreduktion vorwiegend in den Chloroplasten(Schwenn und Trebst, 1976). Die benötigte Energie und die erforderlichenReduktionsäquivalente gehen aus der Photosynthese hervor. Aber auch in den Plastiden derWurzeln wird Sulfat reduziert, wobei die notwendige Energie und die Reduktionsmittel derRespiration entstammen.

Grundlegende Prinzipien der Biochemie und Physiologie des Schwefelstoffwechsels wurdendurch die ausgiebige Untersuchung der Enzyme und Gene des mikrobiellen Metabolismus derBakterien und Pilze geklärt. Die Aufklärung der Sulfatassimilation in höheren Pflanzen schrittdagegen wegen der Labilität und der geringen Konzentration der beteiligten Enzyme sowie derhohen Reaktivität ihrer Zwischenprodukte bisher nur langsam voran. Erst in den letzten Jahrenkonnten durch die Isolierung der kodierenden DNA-Sequenzen und die Analyse ihrerrekombinanten Genprodukte deutliche Fortschritte erzielt werden. Dabei wurden auffälligeParallelen in der Reaktionsfolge der pflanzlichen und mikrobiellen Sulfatreduktion festgestellt.Darüber hinaus spielen in höheren Pflanzen Aspekte wie die zelluläre Differenzierung undKompartimentierung eine entscheidende Rolle, die die Existenz spezifischer Isoformen derbeteiligten Enzyme erfordert.

Die Reduktion des anorganischen Sulfats in Pflanzen sowie in Bakterien und Pilzen wird in vierPhasen unterteilt: I). Sulfataufnahme und Transport, II). Aktivierung des Sulfats, III).Reduktion des aktivierten Sulfats und IV). Fixierung des Sulfids im primärenStoffwechselprodukt Cystein (Übersicht in: Schmidt und Jäger, 1992, Hell, 1997, Schwenn,1997, Leustek und Saito, 1999). Die Sulfatreduktion ist ein energetisch sehr kostspieligerVorgang, bei dem mit + 733 kJ mol-1 etwa doppelt so viel Energie wie für die Nitrat- oderKohlenstoffassimilation verbraucht wird (Schwenn, 1994).

I). Sulfataufnahme und TransportDie pflanzliche Sulfatassimilation beginnt mit einer aktiven Aufnahme des anorganischenSulfats durch die Wurzelzellen. Der anschließende Transport dieses Metaboliten durch diePflanze bzw. in der Zelle erfolgt durch mehrere Membransysteme und unterschiedlicheTransportmechanismen.Aus verschiedenen Pflanzengattungen konnten Transporter charakterisiert werden, die Sulfat ineinem Symport mit Protonen im Verhältnis 1 : 3 über die Plasmamembran translozieren, unddamit die Sulfataufnahme in die Wurzel- oder Blattzellen ermöglichen. Diese Proteine weisenmit ihren 12 vorhergesagten, transmembranen Domänen eine signifikante Übereinstimmung zu

Einleitung 3

pro- und eukaryotischen Sulfat-Permeasen auf. Hochaffine Plasmalemma-Transporter wurdenausschließlich in den Wurzeln nachgewiesen. Diese Transporter können geringe Mengen desNährstoffs aus dem Boden extrahieren und sind durch Sulfatmangel induzierbar (Smith et al.,1995 und 1997, Takahashi et al., 1997, Vidmar et al., 1999). Plasmamembran-Transporter mitgeringer Affinität zum Sulfat werden für Blätter und Wurzeln beschrieben. Sie sind nicht odernur geringfügig von der exogenen Schwefelversorgung abhängig und vermitteln vermutlich deninterzellulären Sulfattransport (Smith et al., 1995, Takahashi et al., 1996, Heiss et al., 1999).Der Langstreckentransport zwischen Wurzel- und Mesophyllzellen der Blätter erfolgt über dasXylem durch einen Austausch des Sulfats zwischen Wurzelzellen, Apoplast und Blattzellen(Clarkson et al., 1993).Die intrazellulären Sulfattranslokatoren bewirken die Aufnahme des Substrats in denChloroplasten oder die Vakuole. Obwohl die Vakuole als Speicherort bis zu 99 % deszellulären Sulfats beinhalten kann (Rennenberg, 1987, Cram, 1990), ist zu denTransportmechanismen in der Tonoplastenmembran bislang wenig bekannt. Die Aufnahme desSulfats in die Plastiden, den Ort der Sulfatreduktion, wird wahrscheinlich vomPhosphat/Triose-Phosphat-Translokator der inneren Choloplastenmembran oder einemProtonen/Sulfat-Symporter vermittelt (Flügge et al., 1989, Leustek und Saito, 1999).

II). SulfataktivierungDas anorganische Sulfat ist chemisch relativ inert. Bei der Reduktion des Sulfatschwefels zumSulfit muß ein stark negatives Redoxpotential von ∆E0`= - 517 mV überwunden werden(Thauer et al., 1977), welches von physiologisch relevanten Reduktionsmitteln wie Ferredoxin,NADPH, Thioredoxin oder Glutathion nicht überwunden werden kann. Das Sulfat muß dahervor Reduktion in eine aktivierte Form überführt werden. Die aktivierten Formen des Sulfats(Abb. 2) sind das unter ATP-Verbrauch entstehende Adenosin-5´-phosphosulfat (APS) und3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS). Diese Aktivierung verringert diePotentialdifferenz auf ∆E0`= - 60 mV für das Redoxpaar APS/Sulfit bzw. PAPS/Sulfit.

A d en in A d en in

Abb. 2: Strukturdarstellung der aktivierten Formen des Sulfats: Adenosin-5´-phosphosulfat(APS) und 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS)

Die Sulfataktivierung erfolgt in zwei Schritten durch die Enzyme ATP-Sulfurylase(EC 2.7.7.4) und APS-Kinase (EC 2.7.1.25).

Einleitung 4

Zunächst wird das Sulfat durch die ATP-Sulfurylase unter ATP-Verbrauch und Freisetzungvon Pyrophosphat (PPi) zu APS adenyliert:

SO42- + MgATP2- + H+

AT P -S u lfu ry lase

APS2- + MgPPi ∆G0`= + 45 kJ mol-1

Im Reaktionsprodukt APS liegt eine energiereiche, gemischte Anhydridbindung zwischen derPhosphatgruppe des AMP und dem Sulfat vor, deren Hydrolyse eine größere freie Enthalpieliefert als die ATP-Spaltung. Das Gleichgewicht dieser stark endergonen Reaktion liegt miteiner Gleichgewichtskonstanten von Keq = 10-8 weit auf Seiten des freien Sulfats (Siegel, 1975,Osslund et al., 1982). Zusätzlich wird die ATP-Sulfurylase durch ihr Reaktionsprodukt APSstark gehemmt. Für das Enzym aus Penicillium chrysogenum konnte beispielsweise eineProduktinhibierung schon für APS-Konzentrationen von weniger als 40 nM beobachtet werden(Seubert et al., 1985, Renosto et al., 1993). Damit APS gebildet werden kann, müssen dieProdukte der ATP-Sulfurylase-Reaktion aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Dasgebildete Pyrophosphat wird dabei in einer exergonen Reaktion durch die Pyrophosphatase(EC 3.6.1.1) gespalten, und das entstandene APS kann exergon durch Phosphorylierung der3´-OH-Gruppe der Ribose zu 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS) umgesetztwerden:

PPi + H2O P y ro p h o sp h atase

2 Pi ∆G0`= - 33,5 kJ mol-1

APS + MgATP2- A P S -K in ase

PAPS4- + MgADP- + H+ ∆G0`= - 25 kJ mol-1

Der zweite Aktivierungsschritt wird irreversibel von der ATP-abhängigen APS-Kinase(EC 2.7.1.25) katalysiert. Die APS-Kinase weist eine sehr hohe Affiniät zum APS auf und istdeshalb in der Lage, die von der ATP-Sulfurylase gebildeten, geringen Mengen diesesSubstrats zu phosphorylieren (Jender und Schwenn, 1984, Renosto et al., 1984,Satishchandran et al., 1992). Für die gesamten Aktivierungsschritte wird eineGleichgewichtskonstante von Keqges ≈ 0,002 - 0,02 angegeben, so daß PAPS im Gleichgewichtmillimolare Konzentrationen erreichen könnte (Seubert et al., 1985).

ATP-Sulfurylasen sind aus mikrobiellen und pflanzlichen Organismen bekannt. Die Reinigungund Charakterisierung einer pflanzlichen ATP-Sulfurylase wurde bereits 1982 von Oslund etal. publiziert. Danach folgten detaillierte Untersuchungen zur Lokalisation des Enzyms und zurDifferenzierung von plastidären und cytosolischen Isoformen in Spinat (Lunn et al., 1990,Renosto et al., 1993). Aus Solanum tuberosum konnten für beide Isoformen cDNAs isoliertwerden (Klonus et al., 1994). Mittlerweile sind auch die kodierenden Sequenzen plastidärerATP-Sulfurylasen aus Arabidopsis thaliana kloniert (Leustek et al., 1994, Murillo undLeustek, 1995, Logan et al., 1996). Bezüglich der Regulation dieses Enzyms scheint eineAbhängigkeit der Expression und enzymatischen Aktivität vom Schwefel- und Stickstoffstatusvorzuliegen (Brunold, 1993, Logan et al., 1996, Lappartient et al., 1999). Dabei wird eineKontrolle der ATP-Sulfurylase auf Transkriptionsebene vorgeschlagen (Leustek, 1996,

Einleitung 5

Yamaguchi et al., 1999). Aktuell sind auch transgene, die ATP-Sulfurylase überproduzierendeZellkulturen und Pflanzen verfügbar, die Aussagen zur physiologischen Relevanz des Enzymsermöglichen (Hatzfeld et al., 1998, Pilon-Smits et al., 1999).

Die Bildung von freiem PAPS durch die APS-Kinase wurde zunächst in Pilzen, Algen undBakterien nachgewiesen (Robbins und Lipman, 1958, Hodson, 1968, Kredich, 1971). DieAPS-Kinasen aus verschiedenen Organismen sind bereits weitgehend charakterisiert. DasEnzym aus Chlamydomonas reinhardtii konnte gereingt und in seinen enzymatischenEigenschaften mit einem postulierten Reaktionsmechanismus bestimmt werden (Schwenn undJender, 1981, Jender und Schwenn, 1984). Für die APS-Kinase aus P. chrysogenum liegenderzeit detaillierte Untersuchungen zum Katalysemechanismus vor (Renosto et al., 1985,MacRae und Segel, 1999), und die 3D-Struktur dieses Enzyms wurde kürzlich veröffentlicht(McRae et al., 2000). Aus Pflanzen gelang die Klonierung einer cDNA (akn1) für dieplastidäre APS-Kinase aus Arabidopsis thaliana (Arz et al., 1994, Jain und Leustek, 1994).Eine weitere Isoform aus A. thaliana (akn2) wurde durch die Two-Hybrid-Interaktion mit demakn1-Genprodukt isoliert und durch funktionelle Komplementation der APS-Kinase-defizienten Hefemutante MET14 identifiziert. Die Komplementation dieser Mutante führteauch zur Klonierung einer homologen APS-Kinase aus Catharanthus roseus (Schiffmann undSchwenn, 1998). Hinweise auf die plastidäre Lokalisation der APS-Kinase ergaben sich durchImportversuche des in vitro synthetisierten Proteins in intakte Chloroplasten (Schiffmann,1998, Lee und Leustek, 1998). Von Schiffmann (1998) wurden ferner die katalytischenKonstanten des rekombinanten Enzyms bestimmt, die auf eine effiziente APS-Phosphorylierung im Chloroplasten schließen lassen. Im Hinblick auf die physiologischeKontrolle der APS-Kinase wird eine Aktivierung des Enzyms durch reduziertes Thioredoxinangenommen (Schwenn und Schriek, 1984, Schriek und Schwenn, 1986, Schiffmann, 1998).Eine Beeinflussung der Transkriptmenge für die APS-Kinase durch den Sulfatstatus konnte beiA. thaliana nicht beobachtet werden (Lee und Leustek, 1998, Yamaguchi et al., 1999).

Bei Tieren, die PAPS als Sulfatgruppendonor für Sulfatierungsreaktionen benötigen (Niehrs etal., 1994, Suiko et al., 1997, Tamura et al., 1997), wird die Sulfataktivierung von denbifunktionellen PAPS-Synthetasen katalysiert. Diese Enzyme weisen N-terminale Homologienzur ATP-Sulfurylase und C-terminale Übereinstimmungen zur APS-Kinase auf und werdenvon einem durchgehenden offenen Leserahmen kodiert (Li et al., 1995, Rosenthal undLeustek, 1995, Jullien et al., 1997, Kurima et al., 1999). Sie werden als evolutive Fusion derEinzelenzyme betrachtet, die somit der thermodynamisch ungünstigen Sulfataktivierung durchein „Substratchanneling“ des APS entgegen wirken.

III). Reduktion des aktivierten SulfatsDie Reduktion des aktivierten Sulfats wird hinsichtlich der Sulfitbildung uneinheitlichbeschrieben.Bei Eubakterien und Pilzen dient PAPS unumstritten als Ausgangssubstanz für die Reduktiondes aktivierten Sulfats. Die PAPS-Reduktase (EC 1.8.99.4) katalysiert hier den erstenreduktiven Schritt der Sulfatassimilation. Das Substrat PAPS wird dabei durch einenZwei-Elektronenübergang zu freiem Sulfit und 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphat (PAP)

Einleitung 6

umgesetzt, das eine Endprodukt-Hemmung bewirkt. Als Elektronendonor fungiert dabei derredoxaktive Cofaktor Thioredoxin (Trx), der auch durch Glutaredoxin (Grx) substituiertwerden kann (Gonzales-Porqué et al., 1970, Tsang und Schiff, 1978a, Tsang, 1981, Lillig etal., 1999):

PAPS4- + Trx/Grx(SH)2 PA P S -R ed u k tase

SO32- + 2 H+ + PAP4- + Trx/Grx(S)2

Die Strukturgene für PAPS-Reduktasen sind aus diversen Prokaryoten und niederenEukaryoten bekannt (Krone et al., 1991 für Escherichia coli; Niehaus et al., 1992 fürAnacystis nidulans; Haverkamp und Schwenn, 1999 für Thiocapsa roseopersicina; Thomas etal., 1990 für Saccharomyces cerevisiae, Korrektur durch Berendt et al., 1995, Mansilla undMendoza, 1997 für Bacillus subtilis). Das Gen cysH für die PAPS-Reduktase aus E. coli K12kodiert für ein 28 kDa großes Polypeptid mit einem einzigen Cystein am C-Terminus. DiesesCystein befindet sich in einem konservierten, C-terminalen Aminosäure-Motiv (KXECGLH),das in allen bisher untersuchten PAPS-Reduktasen auftritt. Der Mechanismus der PAPS-Reduktion wurde durch kinetische Untersuchungen am Enzym aus S. cerevisiae und E. colials „Thorell-Chance ping-pong“-Mechanismus beschrieben (Schwenn et al., 1988, Berendt etal., 1995). Dabei überträgt das reduzierte Thioredoxin zunächst zwei Elektronen auf dieoxidierte (ox) Form der PAPS-Reduktase. Das reduzierte (red) Enzym transferiert dieseElektronen dann weiter zum Substrat:

Thioredoxin(SH)2 + Enzymox Thioredoxin(S)2 + Enzymred

Enzymred + PAPS4- Enzymox + PAP4- + SO32-

Die PAPS-Reduktase benötigt zur Reduktion von PAPS keine weiteren Cofaktoren. Daskonservierte Cystein fungiert als redoxaktive Gruppe und bildet im aktiven Zustand imEnzymdimer ein Dithiol/Disulfid-Redoxpaar. Berendt et al. (1995) konnten durchInaktivierung des Enzyms aus E. coli mit SH-Gruppen-spezifischen Hemmstoffen undgerichteter Mutagenese die funktionelle Beteiligung des Cysteins an der Katalyse nachweisen.Ebenfalls scheint auch einem Tyrosin- und einem Tryptophanrest eine wichtige Bedeutung imEnzym zuzukommen.Ein Großteil der 3D-Struktur der PAPS-Reduktase konnte durch Kristallisation undRöntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden (Savage et al., 1997). Das Protein wird durch6 zentrale β-Faltblätter aufgebaut, die von 9 α-Helices umgeben werden. Das katalytischeZentrum liegt im Innern des Enzyms mit einem stark positiven Oberflächenpotential, das dasnegativ geladene Substrat PAPS in die Bindenische dirigiert. Zwischen zwei β-Faltblätternbefindet sich eine flexible Region, die die Bindestelle des Substrates als „Deckel“ abschließt.Die 3D-Struktur der PAPS-Reduktase weist auffällige Übereinstimmungen zur ATP-Pyrophosphatase-Domäne der GMP-Synthetase auf. Das Protein konnte bislang nicht mitseinem Substrat oder einem Substratanalogon kristallisiert werden. Aufgrund derÜbereinstimmungen zur GMP-Synthetase wird von Savage und Mitarbeitern die Bindung vonAMP in der GMP-Synthetase als Modell für die PAPS-Bindung in der PAPS-Reduktase

Einleitung 7

zugrunde gelegt. Im kristallisierten Protein waren die C-terminalen 14 Aminosäuren nichtvorhanden. Da sich in diesem Bereich das katalytisch aktive Cystein des Enzyms befindet, kanndie Struktur bisher keinen vollständigen Einblick in die Funktion geben.

Die Analyse der pflanzlichen Sulfitbildung wird dagegen kontrovers diskutiert. Von Schwenn(1989) konnte im Spinat eine Thioredoxin-abhängige PAPS-Reduktase-Aktivität gemessenwerden, der bislang jedoch weder ein gereinigtes Enzym noch ein kodierendes Strukturgenzugeordnet werden konnte.Für einige Cyanobakterien, Algen und höhere Pflanzen wird demgegenüber seit langem APSals Substrat für die Sulfitbildung diskutiert (Schmidt und Jäger, 1992, Schiff et al., 1993,Schwenn, 1997, Hell, 1997). Für den ersten Schritt der pflanzlichen Reduktion wird in diesemZusammenhang eine APS-Sulfotransferase vorgeschlagen, die das aktivierte Sulfat auf denThiolrest eines unbekannten Akzeptormoleküls (R) überträgt und dabei zu gebundenem Sulfitreduziert (Schmidt, 1973, Abrams und Schiff, 1973):

APS2- + RSH A P S -S u lfo tran sfe rase

RS-SO32- + AMP2- + H+

Für die weitere Reduktion zum Sulfid wird eine nicht enzymatische Freisetzung des Sulfitsangenommen (Schiff et al., 1993).Die biochemischen Eigenschaften der APS-Sulfotransferasen werden überwiegend durchMessungen an Zellextrakten und partiell gereinigten Proteinen belegt (Hodson und Schiff,1971, Schmidt, 1976) und sind bei Anderson (1990) zusammengefaßt. Die APS-Sulfotransferase von Euglena gracilis konnte von Li und Schiff (1991) bis zur Homogenitätgereinigt werden. Für dieses Protein wird als aktive Form ein Tetramer mit einemMolekulargewicht von 102 kDa postuliert, das über kovalente Disulfidbrücken ausgebildetwird. Bei Behandlung mit reduzierten Thiolen zerfällt dieses Oligomer in seine Untereinheiten(25 - 28 kDa) und ist in der monomeren Form als APS-Sulfotransferase inaktiv. VonSchiffmann und Schwenn (1994) wurde in diesem Zusammenhang vorgeschlagen, daß dieAPS-Sulfotransferase Aktivität vermutlich eine unphysiologische Nebenaktivität dertetrameren APS-Kinase darstellt. Für die rekombinante, gereinigte APS-Kinase aus A. thalianawurde jedoch keine APS-Sulfotransferase Aktivität festgestellt (Schiffmann, 1998).Eine APS-Sulfotransferase Aktivität wurde gleichermaßen für ein gereinigtes Protein aus dermarinen Macroralge Porphyra yezoensis bestimmt (Kanno et al., 1996). Dieses Enzym-Oktamer wird aus 43 kDa großen Untereinheiten gebildet und nutzt verschiedeneThiolsubstrate, darunter auch GSH als Sulfitakzeptor. Eine kodierende cDNA für eine solcheAPS-Sulfotransferase konnte bisher allerdings noch nicht isoliert werden.

Das Produkt des ersten Reduktionsschrittes der Sulfatassimilation ist Sulfit, das in einemzweiten Schritt durch die Sulfitreduktase zu Sulfid reduziert wird. Während NADPH beiheterotrophen Organismen als Cofaktor fungiert, werden die Elektronen in photoautotrophenSpezies durch Ferredoxin (Fd) bereitgestellt:

Einleitung 8

SO32- + 3 [NADPH + H+]

N A D P H -S u lf itred u k tase S2- + 3 NADP+ + 3 H2O

SO32- + 6 Fdred

F d -S u lf i tred u k tase S2- + 6 Fdox + 3 H2O

Die NADPH-abhängigen Enzyme (EC 1.8.1.2) liegen als oligomere Flavo-Hämoproteine vor(Siegel und Davis, 1974a/b, Kobayashi und Yoshimoto, 1982). Die Ferredoxin-Sulfitreduktasen (EC 1.8.7.1) sind homooligomere Sirohäm Eisen-Schwefel Enzyme. Genebzw. cDNAs für diese Sulfitreduktasen konnte aus Synechococcus PCC7942 und A. thalianaisoliert werden (Gisselmann et al., 1993, Brühl et al., 1996). Mittlerweile wurde auch eingenomischer Klon der Sulfitreduktase analysiert (Bork et al., 1998). Die cDNA ausA. thaliana kodiert für ein Polypeptid mit einer plastidären Signalsequenz, so daß auch diesesEnzym in Pflanzen vermutlich im Chloroplasten lokalisiert ist. Im Gegensatz zuSulfattransportern und ATP-Sulfurylasen scheint der mRNA-Gehalt der Sulfitreduktase impflanzlichen Gewebe vom Ernährungsstatus nahezu unbeeinflußt zu sein (Bork et al., 1998).

IV). Fixierung des Sulfids im CysteinDas primäre Stoffwechselprodukt der assimilatorischen Sulfatreduktion ist im allgemeinenCystein. Eine Ausnahme bildet die Hefe, die anstatt Cystein zunächst Homocysteinsynthetisiert (Cherest und Surdin-Kerjan, 1991). Zur Fixierung des reduzierten Sulfid-Schwefels wird dieser in das aktivierte Aminosäuregerüst O-Acetylserin inkorporiert.Die Produkte dieser Katalyse der Pyridoxalphosphat-abhängigen O-Acetylserin-(thiol)-Lyase(OAS-TL, EC 4.2.99.8) sind Cystein und Acetat:

O-Acetylserin + HS- O A S -T L

Cystein + Acetat

Neben den bis zur Homogenität gereinigten O-Acetylserin-(thiol)-Lyasen aus Chloro- undChromoplasten konnten auch cytoplasmatische und mitochondriale Isoformen biochemischcharakterisiert werden (Lunn et al., 1990, Droux et al., 1992, Römer et al., 1992, Rolland etal., 1992). Für die entsprechenden Isoformen sind die kodierenden cDNAs bereits kloniert undsequenziert (Römer et al., 1992, Rolland et al., 1993, Hell et al., 1994, Saito et al., 1994a).Darüberhinaus liegen transgene Tabakpflanzen vor, die durch die Überexpression derO-Acetylserin-(thiol)-Lyase eine vermehrte Cysteinsynthese aufweisen (Saito et al., 1994b).

Die möglichen Stoffwechselwege mit den beteiligten Enzymen der assimilatorischenSulfatreduktion in höheren Pflanzen sind zur Übersicht in Abb. 3 zusammengefaßt.Bei einer direkten Reduktion von APS anstelle von PAPS läge eine Reaktionsfolge aus nurfünf enzymatischen Schritten vor, bei der nur ein Mol ATP zur Cysteinsynthese benötigtwürde. Die Reduktion von PAPS schließt demgegenüber einen zweiten Aktivierungsschritt einund würde dadurch 2 Mol ATP zur Sulfidbildung erfordern.

Einleitung 9

PA P S-R eduk tase

PA P S

A D P + PP i

A P S-Su lfo transferase

A P S-K inase

R S -S O3

-

S O32 -

S2 -

C yste in

O -A ce ty lse r in

A ce ta t

6 F d6 F d

6 F d Su lfit reduk tase

O A S-T L

S O4

2 -

A P S

AT P

AT P

P P i AT P -Su lfu ry lase

R SH

A M P

?

Trx

Trx

PA P

re d

re d

o x

o x

Abb. 3: Schematische Darstellung der möglichen Reaktionsfolge der pflanzlichenSulfatassimilationBiochemisch oder molekular nicht charakterisierte Reaktionen sind mit ? gekennzeichnet. Abkürzungen: ADP:5´-Adenosindiphosphat, AMP: 5´-Adenosinmonophosphat, APS: Adenosin-5´-Phosphosulfat, ATP:5´-Adenosintriphosphat, Fd: Ferredoxin, OAS-TL: O-Acetylserin-(thiol)-Lyase, ox: oxidiert, PAP:3´-Phosphoadenosin-5´-Phosphat, PAPS: 3´-Phosphoadenosin-5´-Phosphosulfat, PPi: Pyrophosphat, red:reduziert, RSH: Thiolakzeptor, Trx: Thioredoxin

Die biochemische und molekulare Charakterisierung der pflanzlichen Enzyme derSulfatassimilation, insbesondere der APS-Kinase aus A. thaliana, legten in den letzten Jahrennahe, daß auch höhere Pflanzen das Sulfat wie die Bakterien und Pilze unter Beteiligung einerPAPS-Reduktase assimilieren könnten.Bei dem Versuch die kodierende Sequenz für eine pflanzliche PAPS-Reduktase zu klonieren,wurde durch funktionelle Komplementation einer PAPS-Reduktase-defizienten E. coli Mutanteeine cDNA (par) aus einer heterotrophen, Sulfatmangel-adaptierten Zellkultur vonCatharanthus roseus isoliert (Uhrig, 1996), die auch die Cystein-Prototrophie einer adäquateneukaryotischen Mutante der Hefe wiederherstellte (Prior, 1996).

Einleitung 10

Die Funktion des par-Genproduktes als PAPS-Reduktase wurde jedoch in Frage gestellt, dadas rekombinante Polypeptid in ersten Analysen in vitro spezifisch APS mit Dithiothreitol zufreiem Sulfit reduzierte, und die cDNA gleichermaßen den APS-Kinase-Defekt einer Cystein-auxotrophen S. cerevisiae Mutante komplementierte (Prior, 1996).Diese Erkenntnisse ließen vermuten, daß die isolierte cDNA par für ein pflanzlichesGenprodukt kodiert, das möglicherweise als APS-Reduktase für die Sulfitbildung in höherenPflanzen relevant sein könnte.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Funktion dieses pflanzlichenpar-Genproduktes aus Catharanthus roseus als Sulfonukleotid-Reduktase zu klären, um damitzum Verständnis der Sulfitbildung und der Reaktionsfolge der assimilatorischenSulfatreduktion in höheren Pflanzen beizutragen.Dabei ergaben sich im wesentlichen zwei Untersuchungsschwerpunkte:

1). Auf der Basis computergestützter Strukturdaten sollte mit den Methoden der molekularenBiologie und der Biochemie die Funktion des par-Genproduktes zunächst in vitrocharakterisiert werden. Die heterologe Expression in Escherichia coli und die Reinigung desrekombinanten Proteins sollten die Untersuchung der enzymatischen und molekularenEigenschaften des Genproduktes ermöglichen. Dabei stand die Bestimmung der kinetischenKonstanten des Proteins im Vordergrund, die hilfreich bei der Beantwortung der Frage seinkönnten, wie eine mögliche APS-Reduktion mit der kinetisch ungünstigen APS-Synthese undeiner daran gekoppelten APS-Phosphorylierung vereinbart werden kann.

2). Durch die Herstellung transgener Pflanzen sollte darüber hinaus ein Zugang zur Analyse derProteinfunktion in vivo geschaffen werden. Die Expression des par-Genproduktes in plantasollte in dieser Hinsicht die Voraussetzung zur Untersuchung der Eigenschaften des nativenPflanzenproduktes, seiner subzellulären Verteilung und physiologischen Relevanz für dieassimilatorische Sulfatreduktion schaffen.

Ergebnisse 11

2 Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des pflanzlichen Genproduktes der cDNA paraus Catharanthus roseus (L.) untersucht. In diesem Zusammenhang sollte für die strukturelleund funktionelle Analyse des Genproduktes in vitro eine heterologe Expression der par-cDNAin Escherichia coli erfolgen.

Im Rahmen der Dissertation von Uhrig (1996) wurde das Plasmid pET16bpar∆1 (vgl. 5.6)hergestellt, das eine rekombinante Expression der cDNA par als (His)10-Fusionsprotein inE. coli ermöglichte und für die vorliegende Arbeit genutzt werden konnte. Da aus den vonUhrig angegebenen Daten zur Konstruktion dieses Expressionsplasmids keine eindeutigenRückschlüsse auf die Nukleotidsequenz im 5´-Bereich der verwendeten cDNA par möglichwaren, erfolgte in dieser Arbeit zunächst die Sequenzierung dieses Expressionsklons.

2.1 Korrektur der Nukleotidsequenz des par-Genproduktes aus Catharanthus roseus

Durch die Sequenzierung des Expressionsplasmids pET16bpar∆1 zeigten sichBasendifferenzen zur veröffentlichten Nukleotidfolge der Genbank (U63784). Daher wurdenauch die von Uhrig (1996) ursprünglich aus der cDNA-Bibliothek einer heterotrophen,Sulfatmangel-adaptierten Suspensionskultur von C. roseus isolierten Klone pCrpar1, pCrpar2und pCrpar4 (vgl. 5.6) nachsequenziert.

Die Sequenzierung dieser Klone bestätigte die Fehler in der par-Sequenz U63784 derGenbank. Diese Fehler betrafen neben einfachen oder mehrfachen Basenaustauschen, die zurSubstitution von vier einzelnen Aminosäuren führten, insbesondere eine zentrale AT-reicheBasenregion, in der an drei verschiedenen Positionen ein Adeninnukleotid überlesen wurde.Das führte in diesem Bereich zu einer Substitution von 4 aufeinander folgenden Aminosäurendurch 5 davon verschiedene Reste und ergänzte den offenen Leserahmen um drei Nukleotide.Das abgeleitete Genprodukt der korrigierten cDNA-Sequenz umfaßt demnach nicht 463sondern 464 Aminosäuren (vgl. 7.1). In Tab. 1 sind die Nukleotid- und daraus abgeleitetenAminosäureunterschiede der berichtigten Sequenz zu den Genbankdaten aufgeführt.

Die drei sequenzierten cDNA-Klone pCrpar1, pCrpar2 und pCrpar4 enthielten identische par-Sequenzen, die sich nur im 5´-Bereich in der Länge unterschieden (vgl. 7.1 - 7.3). Das PlasmidpCrpar4 enthielt die vollständige par-Sequenz. Der Klon pCrpar1 kodierte für das par-Genprodukt, dem 66 Aminosäuren am N-Terminus fehlten. Die Sequenz des Klons pCrpar2kodierte für ein N-terminal um 70 Aminosäuren verkürztes par-Genprodukt und zeigte beimVergleich mit den Daten von Uhrig ferner eine differente Struktur am 5`-Ende und im 3`-untranslatierten Bereich der Nukleotidfolge.

Ergebnisse 12

Tab. 1: Nukleotid- und Aminosäureunterschiede in der korrigierten par-Sequenz im Vergleichzur Genbank-Sequenz (EMBL U63784)Nukleotide und Aminosäuren der korrigierten Sequenz sind fett gedruckt. Falsche Basen in der Genbank-

Sequenz sind kursiv dargestellt, fehlende Basen sind mit „-“ gekennzeichnet. Die angegebenen Amino-

säurenummerierungen beziehen sich auf die jeweilige Position in der korrigierten Sequenz im Anhang 7.1. Die

Abkürzungen der Basen und Aminosäuren entsprechen der IUPAC-Nomenklatur.

Nukleotidtriplett(s) abgeleitete Aminosäure(n)

TGT → TGG C → W308

GAC → AAT D → N323

GGA → GAA G → E327

-ATAAT-ATGGG-AT →AATAATAATGGGAAT

I I W D →N N N G N 334

TCC → TTC S → F430

2.2 Computergestützte Analyse des par-Genproduktes aus Catharanthus roseus

2.2.1 Analyse der Primärstruktur des par-Genproduktes

Der offene Leserahmen der vollständigen cDNA par im Klon pCrpar4 kodiert für ein Proteinaus 464 Aminosäuren (Abb. 4) mit einer abgeleiteten molaren Masse von 51,6 kDa. Derberechnete isoelektrische Punkt liegt bei pH 6.07 (Programm PEPTIDEMASS, Wilkinset al., 1997).Durch die Bestimmung des Hydropathie-Index nach Kyte und Doolittle (1982) und dieweiterführende Sequenzanalyse mit dem Algorithmus TMpred (Hofmann und Stoffel, 1993)kann das par-Genprodukt als lösliches Protein eingestuft werden, das nur wenige hydrophobeBereiche enthält, die nicht auf Transmembranregionen schließen lassen (ohne Abbildung).

Mit Hilfe der PROSITE-Datenbank (Bairoch et al., 1995) wurde die abgeleitete par-Primärsequenz hinsichtlich möglicher posttranslationaler Modifikationen wie Glykosylierungen,Phosphorylierungen oder Myristylierungen untersucht. Es konnten 5 potentielleO-Glykosylierungs-, 4 N-Glykosylierungs-, 13 Phosphorylierungs- sowie 7 Myristylierungs-stellen identifiziert werden (Abb. 4).

Um Vorhersagen zur subzellulären Lokalisation des par-Genproduktes zu treffen, wurde dieAminosäurefolge mit den Algorithmus PSORT (Nakai und Kanehisa, 1992) durchmustert.Dabei wurde die größte Wahrscheinlichkeit für ein Vorkommen des par-Genproduktes imChloroplastenstroma (0,94) ermittelt. Mit Hilfe des Programms TargetP V1.0 (Emanuelsson,eingereicht) wurden die N-terminalen 70 Aminosäuren mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,9 alschloroplastidäres Transitpeptid eingestuft. Das speziell auf plastidäre Transitsequenzenangewendete Programm ChloroP V1.1 (Emanuelsson et al., 1999) sagte ebenfalls einesinguläre Spaltstelle nach Aminosäurerest 70 voraus (Abb. 4).

Ergebnisse 13

Eine Spaltung des Proteins an dieser Position würde ein matures Produkt mit einemMolekulargewicht von 44 kDa freisetzen. Hinweise auf eine Lokalisation des par-Genproduktes in anderen Zellkompartimenten wurden anhand der verwendeten Algorithmennicht gewonnen.

Abb. 4: Zusammenfassung der computergestützten Primärstrukturanalyse des par-Genproduktes aus Catharanthus roseusDie putativen posttranslationalen Modifizierungsstellen sind wie folgt gekennzeichnet: z = O-

Glykosylierungstellen [NetOGlyc 2.0 (Hansen et al., 1998)], grau unterlegt: N = N-Glykosylierungsstellen,

G = Myristylierungstellen [PredictProtein (Rost, 1996)], S oder T = Phosphorylierungsstellen [PhosphoBase

(Kreegipuu et al., 1999)]. Die wahrscheinliche Spaltstelle des Transitpeptids ist durch eine Pfeilspitze

gekennzeichnet.

2.2.1.1 Primärsequenzähnlichkeiten des par-Genproduktes zu Sequenzen derEMBL-Datenbank

Durch den Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der cDNA par mit der EMBL-Datenbank (BLASTP, Altschul et al., 1997) konnten verschiedene pro- und eukaryotischeProteinsequenzen mit Ähnlichkeiten zum par-Genprodukt identifiziert werden. ImPrimärstrukturvergleich (CLUSTAL, Higgins und Sharp, 1988) im Anhang 7.4 sind einige derhier aufgeführten Sequenzen dargestellt.

Die Aminosäurefolge ist über die gesamte Länge zu 70 - 75 % identisch mit 6 pflanzlichenSequenzen aus A. thaliana, die nach Beginn dieser Arbeit veröffentlicht wurden, und die alsPRH-Proteine bzw. APS-Reduktasen in der Datenbank angegeben werden (U53864, U53865und U53866 [Gutierrez-Marcos et al., 1996], AF016282, AF016283 und AF016284 [Setya etal., 1996).Im Teilsequenzvergleich schließt sich an das mögliche Transitpeptid (vgl. 2.2.1) im par-Genprodukt eine Domäne an, die Übereinstimmungen zu den bekannten mikrobiellen PAPS-Reduktasen aufweist. Von Aminosäure 71 - 321 wurden Identitäten zu PAPS-Reduktasen ausfolgenden Organismen ermittelt: 28 % für B. subtilis (U76751, Mansilla und Mendoza, 1997),25 % für S. cerevisiae (U25840, Thomas et al., 1990), 25 % für E. coli (P17854, Kroneet al., 1991). In allen Sequenzen ist u. a. das Aminosäuremotiv EC317GLH konserviert(Nummerierung aus der par-Sequenz). Für das Cystein in diesem Cluster und einen ebenfalls

Ergebnisse 14

konservierten Tyrosinrest (Y284 in der par-Sequenz) wurde im E. coli Enzym eine essentielleBedeutung für die Funktion der PAPS-Reduktase gezeigt (Berendt et al., 1995).An das konservierte Aminosäuremotiv EC317GLH, das in den PAPS-Reduktasen in der Nähedes C-Terminus gefunden wird, knüpft im par-Genprodukt und den Proteinen aus A. thalianaeine weitere Domäne an, die 144 Aminosäuren umfaßt, die keinerlei Entsprechungen in denmikrobiellen PAPS-Reduktasen finden. Primärsequenzvergleiche ergaben eine 22 %igeIdentität mit der Thioredoxin (Trx)-ähnlichen Domäne der Proteindisulfid-Isomerase (PDI) derMaus. Das in allen PDIs streng konservierte Motiv APWCXXC ist im par-Genprodukt anPosition 381 - 387 und in den Polypeptiden aus A. thaliana an homologer Stelle vertreten. ImPRH26-Protein ist das Alanin durch ein Arginin ersetzt. Die PDIs zählen neben denCofaktoren Thioredoxin und Glutaredoxin zur Thioredoxin-Superfamilie. Das TetrapeptidCXXC dient in den Proteinen dieser Familie als reaktive Gruppe zur Katalyse vonRedoxvorgängen mit Dithiol/Disulfid-Übergängen. PDIs katalysieren die korrekte Faltung vonProteinen (Freedman et al., 1994), Thioredoxin oder Glutaredoxin fungieren u. a. alsElektronendonor der PAPS-Reduktase (Gonzales-Porqué et al., 1970, Tsang und Schiff,1978a, Tsang, 1981, Lillig et al., 1999). Ein ähnliches Motiv CEPC ist im par-Genprodukt ausC. roseus außerdem im PAPS-Reduktase homologen Bereich an Position 289 - 292 zu findenund ebenso in den Proteinen aus A. thaliana konserviert.

Aufgrund der Primärstrukturähnlichkeiten ergibt sich für das par-Genprodukt die in Abb. 5schematisch dargestellte Einteilung in drei Domänen: das N-terminale Transitpeptid(Aminosäure 1 - 70), die PAPS-Reduktase-homologe Core-Domäne (Aminosäure 71 - 321)und die C-terminale Extension (Aminosäure 322 - 464) mit Übereinstimmungen zur Trx-ähnlichen Domäne der Proteindisulfid-Isomerasen. Auf diese Bezeichnungen und die gewählteFarbgebung wird im Verlauf der Arbeit zurückgegriffen.

Abb. 5: Schematische Darstellung der 3-Domänen-Primärstruktur des par-Genproduktes ausCatharanthus roseusDer Pfeil kennzeichnet die putative Prozessierungsstelle im vorhergesagten plastidären Transitpeptid. Die

Aminosäure Y284, das charakteristische Aminosäuremotiv EC317GLH der PAPS-Reduktasen, das konservierte

Motiv A381PWCRFC der Thioredoxin (Trx)-ähnlichen Domäne der Proteindisulfid-Isomerasen (PDI) und der

Cluster C289EPC sind hervorgehoben.

Ergebnisse 15

2.2.2 Vorhersage der Sekundär- und Tertiärstruktur des par-Genproduktes

Proteine mit geringer Identität in ihrer Primärstruktur können sehr ähnliche Sekundär- undTertiärstrukturen aufweisen, über die ein ähnliches Funktionsprinzip vermutet werden kann.Dies konnte beispielsweise für die PAPS-Reduktase aus E. coli und die GMP-Synthetasegezeigt werden (Savage et al., 1997).In dieser Hinsicht wurde mit den Programmen PHDsec (Rost und Sander, 1993, Rost undSander, 1994, Rost et al., 1994) und 3D-PSSM (Fischer et al., 1999, Kelley et al., 1999) dieSekundärstruktur des par-Genproduktes vorhergesagt und mit Sekundärstrukturen verglichen,die aus bekannten Tertiärstukturen der Protein-Datenbank (PDB) abgeleitet wurden (STRIDE:Frishman und Argos, 1995, DSSP: Kabsch und Sander, 1983). Dabei ergaben sich signifikanteStrukturübereinstimmungen mit der PAPS-Reduktase aus E. coli (PDB-Nr. 1sur) sowie dermenschlichen PDI (PDB-Nr. 1mek).

P P D T

Abb. 6: Primärsequenzvergleich und Sekundärstrukturvorhersage für das par-Genprodukt ausCatharanthus roseusVergleich des par-Genproduktes (C.r. par) mit der E. coli PAPS-Reduktase (E.c. cysH). Konservierte

Aminosäuen sind fett gedruckt, der Pfeil markiert die putative Spaltstelle für das Transitpeptid im par-

Genprodukt. PDHsec (par): Sekundärstrukturvorhersage für das par-Genprodukt aus C. roseus mit PDHsec,

DSSP 1sur: Sekundärstrukturableitung für die E. coli PAPS-Reduktase mit DSSP. Das modifizierte PP-Motiv

(PP) und das DT-Motiv (DT) in der PAPS-Reduktase sind gemäß der Angaben von Savage et al. (1997) und

Bork und Koonin (1994) markiert.

Ergebnisse 16

Die vorhergesagte Sekundärstruktur des par-Genproduktes zeigt im Core-Bereich auffälligeÜbereinstimmungen zur abgeleiteten Sekundärstruktur der PAPS-Reduktase aus E. coli. BeimVergleich der Sekundärstrukturen stimmen speziell die Länge und Position solcher α-Helicesund β-Faltblätter überein, die im E. coli Enzym zur Nukleotidbindenische beitragen. Das istzum einen das Purin-bindende modifizierte PP-Motiv, sowie das an der Orientierung desPurinrings beteiligte DT-Motiv (Savage et al., 1997, Bork und Koonin, 1994). Die PDHsec-Vorhersage ist für den nicht übereinstimmenden Bereich K184 - P233 im par-Genproduktuneindeutig. Die Verläßlichkeit des Algorithmus wurde jedoch dadurch bestätigt, daß eineVorhersage der Sekundärstruktur der E. coli PAPS-Reduktase mit Ausnahme dieser Regionden aus der 3D-Struktur abgeleiteten Elementen gleichkommt.Im Bereich der C-terminalen Extension ist die vom Algorithmus PSSM vorhergesagteSekundärstruktur von Aminosäure 352 - 464 zu mehr als 95 % identisch mit der N-terminalenTrx-Domäne der menschlichen Proteindisulfid-Isomerase (ohne Abbildung).

Im Hinblick auf die mögliche 3D-Struktur des par-Genproduktes wurde von Christopher Lillig(AG Schwenn, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum) mit Hilfe desComputerprogramms WHATIF (Vriend, 1990) auf der Basis der Kristallstruktur der E. coliPAPS-Reduktase (Savage et al., 1997) ein Modell der Core-Domäne entwickelt. DieseVorhersage weist auf eine nahezu identische Tertiärstruktur der Core-Domäne des pflanzlichenProteins und der bakteriellen PAPS-Reduktase hin, die nach Savage und Mitarbeitern ihrerseitsgroße Ähnlichkeit zur ATP-Pyrophosphatase-Domäne der GMP-Synthetase aufweist.

2.3 Untersuchungen zur in vitro Funktion des par-Genproduktes aus Catharanthusroseus

Die in Kapitel 2.2 auf der Basis der korrigierten Nukleotidsequenz der cDNA par (vgl. 2.1)erarbeiteten in silico Daten legten die Vermutung nahe, daß es sich bei dem par-Genproduktaus C. roseus um ein im Plastiden lokalisiertes partielles Strukturäquivalent der mikrobiellenPAPS-Reduktase und der PDI handeln könnte. Deshalb wurden im folgenden die computer-gestützten Struktur/Funktionsbeziehungen des par-Genprodukts in vitro untersucht.

2.3.1 Import des par-Genproduktes in isolierte Chloroplasten aus Pisum sativum

Mit Hilfe eines gekoppelten in vitro Transkriptions-, Translations- und Chloroplasten-importversuchs (vgl. 5.10.10) wurde zunächst überprüft, ob das par-Genprodukt in intakte,isolierte Chloroplasten importiert werden kann, und in welcher Weise eine Proteinreifungerfolgen kann.Die Importanalyse erfolgte durch eine gelelektrophoretische Auftrennung (SDS-PAGE, vgl.5.12.2) der Chloroplastenextrakte der Importphasen. Die durch [35S]-Cystein bzw. -Methioninmarkierten Import- und Prozessierungsprodukte wurden durch Autoradiographie desgetrockneten Gels nachgewiesen. Als Kontrolle diente das in vitro Translationsprodukt vorChloroplastenanbindung (Abb. 7).

Ergebnisse 17

Die in vitro Synthese des par-Genproduktes und der Chloroplastenimport wurdenfreundlicherweise von Dr. Lisa Heins (AG Prof. Dr. Jürgen Soll, Botanisches Institut derChristian-Albrechts-Universität zu Kiel) durchgeführt.

Abb. 7: In vitro Translation undChloroplastenimport des vom PlasmidpCrpar4 kodierten Genproduktes ausCatharanthus roseusAutoradiogramm einer SDS-PAGE (12,5 %): TL:

in vitro Translationsprodukt (P: Precursor), 1:

Chloroplastenextrakt nach Anbindung des

Translationsproduktes an die Chloroplasten; 2:

wie 1 nach Thermolysinbehandlung; 3:

Chloroplastenextrakt nach Import des Precursors;

4: wie 3 nach Thermo-lysinbehandlung (m:

matures Genprodukt).

Die in vitro Synthese des par-Genproduktes zeigte, daß vom Plasmid pCrpar4 einPrecursorprotein (P) mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 58 kDa translatiert(TL), von intakten Erbsenchloroplasten gebunden (1), importiert und im Plastiden prozessiertwurde, so daß ein matures Produkt (m) mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa45 kDa resultierte (3). Der Precursor wurde dabei vollständig importiert, da eine anschließendeThermolysinbehandlung ebenfalls das 45 kDa große Prozessierungsprodukt ergab (4). DiesesMolekulargewicht entspricht dem berechneten Molekulargewicht von 44,1 kDa nach einerSpaltung des Precursorproteins nach Aminosäure 70.

2.3.2 Bakterielle Expression und Reinigung des par-Genproduktes aus Catharanthusroseus

Anhand des Chloroplastenimports und der in vitro Prozessierung war anzunehmen, daß daspar-Genprodukt in seiner funktionellen Form als prozessiertes, 44 kDa großes Protein vorliegt.Zur Funktionsanalyse dieses gereiften Genproduktes sowie zur Synthese polyklonalerAntikörper wurde das Protein heterolog in Escherichia coli exprimiert und danach gereinigt.

Für die heterologe Expression in E. coli wurde das sequenzierte Plasmid pET16bpar∆1verwendet (vgl. 2.1). Dieses Konstrukt ermöglichte die Synthese des N-terminal um 70Aminosäuren deletierten par-Genproduktes als (His)10-Fusionsprotein (Par∆1). Die Expression

Ergebnisse 18

erfolgte in E. coli BL21(DE3) pLysS (vgl. 5.3) und war durch Isopropyl-β-D-thiogalaktosid(IPTG) induzierbar (vgl. 5.11).Zur nichtdenaturierenden Reinigung des (His)10-Fusionsprodukts wurde das lösliche Proteinder Expressionskultur zur Chromatographie an einer Metallaffinitätsmatrix (IMAC) eingesetzt(vgl. 5.11.1). Die Reinheit der jeweiligen Proteinfraktionen wurde durch eine denaturierendeSDS-PAGE kontrolliert (Abb. 8 A).

Abb. 8: Bakterielle Expression und Reinigung des Par∆-Proteins aus Catharanthus roseus(A) SDS-PAGE (12,5 %, Coomassie-Blaufärbung) der Proteinfraktionen einer Metallaffinitätschromatographie

(IMAC): 1: zur IMAC verwendetes, lösliches Protein der Expressionskultur E. coli BL21(DE3) pLysS mit

pET16bpar∆1 (12 µg), 2: Durchlauf der IMAC-Säule (12 µg Protein), 3: Proteine des Waschschritts mit

50 mM Imidazol (12 µg), Eluat (200 mM Imidazol) mit 1 - 2 µg gereinigtes Par∆1-Protein, M:

Molekulargewichtsmarker (10 kDa Leiter). (B) Western-Blot zu (A), Proteintransfer auf NC-Folie nach Towbin

(1979): α:AR Serum 1 : 3.000, Peroxidase-gekoppelter Sekundärantikörper 1 : 5.000.

Die Metallaffinitätschromatographie des löslichen Proteins einer 3 l Expressionskultur vonE. coli BL21(DE3) pLysS mit dem Plasmid pET16bpar∆1 lieferte im Eluat aus 30 gBakterienzellen etwa 10 mg des gereinigten (His)10-Fusionsproteins Par∆1. Das berechneteMolekulargewicht für dieses rekombinante Polypeptid beträgt 48,7 kDa. In derdenaturierenden SDS-PAGE wies das gereinigte Protein ein apparentes Molekulargewicht vonetwa 58 kDa als Monomer auf (Spur 4).Das gereinigte Protein wurde zur Herstellung eines polyklonalen Kaninchen Antiserums(α:AR Serum) herangezogen (Eurogentec, Belgien), mit dem im Immunoblot (Abb. 8 B)spezifisch nur das Par∆1-Protein im löslichen Protein der Expressionskultur (Spur 1) und imEluat (Spur 4) detektiert wurde. Die Nachweisgrenze dieses Antiserums in einer 3.000fachen

Ergebnisse 19

Verdünnung lag im Western-Blot nach Towbin (1979) bei etwa 150 ng gereinigten Antigens(ohne Abbildung).Das gereinigte Polypeptid Par∆1 stand damit in ausreichender Menge für eine biochemischein vitro Charakterisierung zur Verfügung. Das Antiserum konnte im weiteren für einenNachweis des Proteins in situ verwendet werden.

2.3.2.1 Oligomere Zustandsformen des par-Genproduktes aus Catharanthus roseus

In der denaturierenden SDS-PAGE nach Laemmli (1970) konnte ein monomeres Par∆1-Protein nachgewiesen werden (vgl. 2.3.2). Laut Primärsequenz enthält dieses Protein 7Cysteinreste, die an der Ausbildung oligomerer Zustandsformen beteiligt sein könnten. MitHilfe des hergestellten α:AR Serums wurde das Auftreten solcher oligomerer Zustandsformendes gereinigten Proteins nach einer Gelelektrophorese im Immunoblot überprüft. Dabei wurdeder Effekt von Reduktionsmitteln auf die Bildung von Oligomeren untersucht (Abb. 9). DieElektrophorese (vgl. 5.12.2) erfolgte unter Verwendung unterschiedlicher SDS- und DTT-Konzentrationen in den Proben.

Abb. 9: Monomerisierung desgereinigten Par∆1-Proteins durch DTTWestern-Blot einer SDS-PAGE (12,5 %) des

gereinigten Par∆1-Proteins (2 µg/Spur) bei

Verwendung unterschiedlicher Konzentra-

tionen an SDS und DTT in den Proben: 1: 1

% (w/v) SDS, kein Reduktionsmittel, 2: 2 %

(w/v) SDS, kein Reduktionsmittel, 3: 1 %

(w/v) SDS, 6,7 mM DTT, 4: 2 % (w/v) SDS,

6,7 mM DTT, M: 10 kDa Leiter als

Proteinstandard. Der Proteintransfer auf NC-

Folie erfolgte nach Towbin et al. (1979),

α:AR Serum 1 : 3.000, Peroxidase-

gekoppelter Sekundärantikörper 1 : 5.000.

Die Abbildung 9 zeigt im Immunoblot, daß das heterolog exprimierte Par∆1-Protein inAbwesenheit des starken Reduktionsmittels DTT Aggregate bildete (Spur 1), die durch eineerhöhte Konzentration des Detergenz nicht aufgelöst werden konnten (Spur 2). Der Zusatzvon 6,7 mM DTT führte dagegen zu einer vollständigen Monomerisierung des Proteins(Spuren 3, 4). Mit einer äquimolaren Menge GSH anstatt DTT als Reduktionsmittel in derSDS-PAGE konnte ebenfalls nur das Monomer im Westen-Blot identifiziert werden (ohneAbbildung).

Ergebnisse 20

2.3.3 Biochemische Charakterisierung des par-Genproduktes aus Catharanthusroseus

Erste Untersuchungen zum par-Genprodukt (Prior, 1996) deuteten darauf hin, daß daspflanzliche Protein in vitro die folgende Reaktion katalysiert: Adenosin-5´-phosphosulfat(APS) wird mit einem Dithiol-Substrat [R(SH)2] zu Sulfit (SO3

2-), 5´-Adenosinmonophosphat(AMP) und einem Disulfidprodukt [RSSR] umgesetzt.

APS + R(SH)2 → AMP + SO32- + RSSR + 2 H+

Eine Reduktion von PAPS durch das par-Genprodukt konnte dagegen nicht festgestelltwerden. Das artifizielle Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) fungierte in vitro alsElektronendonor der Reaktion. Die Bildung von Sulfit als Reaktionsprodukt konnte in vitronachgewiesen werden.Es lagen jedoch weder Untersuchungen zur Natur des Elektronendonors in vivo vor nochwaren die kinetischen Konstanten des Enzyms bekannt, die eine Bewertung der Reaktion imFließgleichgewicht der Reduktion vom hexavalenten Sulfat zum divalenten Sulfid ermöglichenkönnten. Im Vordergrund der biochemischen Analyse des par-Genproduktes aus C. roseusstand daher zunächst die kinetische steady state Untersuchung, die auch eine Identifizierungdes natürlichen Elektronendonors ermöglichen sollte.Die funktionelle Charakterisierung des rekombinanten Genproduktes Par∆1 erfolgte über dieenzymatische Aktivität der Sulfitbildung in vitro. Bei dem verwendeten Testsystem vonSchwenn und Schriek (1987) wurde die Enzym-katalysierte Freisetzung von säureflüchtigem[35S]-Sulfit aus [35S]-APS bestimmt (vgl. 5.14.2). Als Elektronendonor der Reaktion wurdedas artifizielle Reduktionsmittel DTT verwendet.

2.3.3.1 Optimierung der in vitro Reaktionsbedingungen der APS-Reduktion durch daspar-Geprodukt

In Vorversuchen wurde der Meßbereich bestimmt, in dem sich die APS-Reduktase-Aktivitätdes Par∆1-Proteins proportional zur eingesetzten Proteinkonzentration und Reaktionszeitverhält. Die Sulfitbildung war strikt linear für Enzymkonzentrationen von 10 bis 1.000 ng ml-1.Unter steady state Bedingungen sollte die Reaktionszeit 3 min nicht überschreiten, um nichtmehr als 10 % des eingesetzten Substrats APS zu Sulfit zu konvertieren (ohne Abbildung).

Die APS-Reduktase-Reaktion zeigte eine für enzymatische Reaktionen typischeTemperaturabhängigkeit. Zwischen 15 und 30°C wurde ein Q10-Wert von 1,85 bestimmt. Diemaximale Enzymaktivität wurde bei 40°C beobachtet. Bei Temperaturen oberhalb von 45°Ctrat ein rapider Aktivitätsverlust ein, der in der Denaturierung der Proteinstruktur begründet ist(Abb. 10 A).

Ergebnisse 21

[N a SO ] [m M ]2 4

]

1400

1200

1000

800

600

400

Tempera tu r [°C ]10 20 30 40 50

0 200 400 600 800 1000

850

700

550

400

v [m

U m

g]

-1

10 20 30 40 50 60t [m in ]

100

80

60

40

20

Ak t

ivitä

t [%

]

A B

C D

+ N a S O2 4

N a S O2 4

Abb. 10: APS-Reduktase-Aktivität des Par∆1-Proteins in Abhängigkeit von der Reaktions-temperatur (A), dem pH-Wert (B), der Na2SO4-Konzentration (C) sowie einer Vorinkubationmit DTT in An- oder Abwesenheit von Na2SO4 (D).(A) Reaktionsansatz: 100 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 20 mM DTT, 0,5 M Na2SO4, 4 µM [35S]-APS,

10 ng gereinigtes Par∆1-Protein. Reaktionsbedingungen: 3 min, 0 - 55°C; (B) wie (A) aber 100 mM

Tris/Maleinsäure pH 5.2 - 8.6 bzw. 100 mM Tris/HCl pH 7.0 - 9.0 oder 100 mM Glycin/NaCl pH 8.6 - 12.9,

25°C; (C) wie (A) aber 0 - 1000 mM Na2SO4, 25°C; (D) wie (A) aber +/- 0,5 M Na2SO4, die Reaktion wurde

nach der angegebenen Vorinkubationszeit durch Zugabe von 4 µM [35S]-APS gestartet. Die Meßpunkte wurden

aus zwei unabhängigen Meßreihen ermittelt.

Das pH-Optimum der APS-Reduktion wurde mit einem Puffersystem aus 100 mMTris/Maleinsäure von pH 5.2 bis pH 8.6 und Glycin/NaCl gleicher Molarität von pH 8.6 bispH 12.9 ermittelt. Die Verwendung eines Tris/HCl-Puffers von pH 7.0 bis pH 9.0 zeigte keineveränderte Aktivitätsrate. Die höchste Enzymaktivität wurde bei einem alkalischen pH-Wertvon 8.8 bestimmt (Abb. 10 B).

Ergebnisse 22

Da das gereinigte Par∆1-Protein in der SDS-PAGE in Abwesenheit starker Reduktionsmitteloligomere Aggregate bildete (vgl. 2.3.2.1), war denkbar, daß die funktionelle Struktur desEnzyms ein Di- oder Oligomer sein könnte. Daher wurde der Einfluß von anorganischenSalzen auf die APS-Reduktase-Aktivität in Abhängigkeit verschiedener Anionen verfolgt, diehydrophobe Wechselwirkungen fördern und damit oligomere Formen stabilisieren.Natriumsulfat bewirkte in diesem Zusammenhang in einer Konzentration von 0,5 M einemaximale Erhöhung der Umsatzgeschwindigkeit der APS-Reduktion um etwa ein 5faches(Abb. 10 C). Durch Natriumchlorid wurde dagegen maximal eine Verdopplung derEnzymaktivität bei einer Konzentration von 0,4 M erzielt (ohne Abbildung).

Die Aktivität des Par∆1-Proteins in Gegenwart von 20 mM DTT war auffallend stabil(Abb. 10 D). Nach 20minütiger Inkubation des Enzyms im kompletten Reaktionsansatz (vgl.5.14.2) ohne [35S]-APS bei 25°C wurde nach Zugabe des Substrats noch etwa 75 %Restaktivität bestimmt. Der Zusatz von 0,5 M Na2SO4 beeinflußte dabei die Stabilität nicht.

2.3.3.2 Absorptionsspektrum und alternative Reduktionsmittel des par-Genproduktes

Das par-Genprodukt Par∆1 katalysierte in vitro einen Zwei-Elektronentransfer vomartifiziellen Reduktionsmittel DTT auf den hexavalenten Sulfatschwefel im Substrat APS.Um eine mögliche Beteiligung chromophorer Gruppen am Elektronentransfer bei der APS-Reduktion zu untersuchen, wurde zunächst ein Absorptionsspektrum des gereinigten Par∆1-Proteins in einem Wellenlängenbereich von 240 - 450 nm aufgezeichnet.Neben einem proteintypischen Absorptionsmaximum bei 280 nm wurden keine weiterenMaxima detektiert, die auf das Vorhandensein einer prosthetischen Gruppe wie FAD,Häm/Sirohäm oder Fe-S-Cluster schließen ließen (ohne Abbildung). Eine Klassifizierung desProteins als Flavoprotein konnte ferner dadurch eine fehlende Diaphorase-Aktivitätausgeschlossen werden (vgl. 5.14.5).

Um Hinweise auf den natürlichen Cofaktor des par-Genproduktes zu erhalten, wurde diespezifische APS-Reduktase-Aktivität in Gegenwart einiger physiologischer Reduktionsmittelbestimmt. Als Elektronendonor dienten im Reaktionsansatz äquimolare Mengen DTT, Cystein,NADH, reduziertes Glutathion (GSH) sowie 20 µM Thioredoxin1 (Trx1) aus E. coli, dasseinerseits von DTT reduziert wurde (Tab. 2).

Mit Dithiothreitol (DTT) als Elektronendonor wurde eine APS-Reduktase-Aktivität von3,08 U mg-1 gemessen. Dieser Umsatz konnte durch Zusatz von Thioredoxin nicht gesteigertwerden. Mit dem Monothiol Glutathion (GSH) als Reduktand betrug die spezifische Aktivitätim Vergleich zum artifiziellen Dithiol DTT 83 %. Während mit NADH keinerlei Sulfit gebildetwurde, betrug der Umsatz mit Cystein, dem Endprodukt der Sulfatassimilation, weniger als0,1 U mg-1 (3 % der DTT-abhängigen Rate).

Ergebnisse 23

Tab. 2: Spezifische APS-Reduktase-Aktivität des Par∆1-Proteins bei Verwendungverschiedener ReduktionsmittelReaktionsansatz: 100 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 20 µM [35S]-APS, 150 ng gereinigtes Par∆1-

Protein, 10 mM Reduktionsmittel, Reaktionsbedingungen: 3 min, 25°C, n. d.: nicht detektierbar.

Reduktionsmittel v [U mg-1] %10 mM Cystein 0,094 3

10 mM NADH n. d. 0

10 mM GSH 2,57 83

10 mM DTT 3,08 100

10 mM DTT+ 20 µM Trx

3,08 100

Im folgenden wurden die Michaelis-Konstanten für das Substrat APS und die ReduktionsmittelDTT und GSH ermittelt.

2.3.3.3 Bestimmung der Michaelis-Konstante Km für das Substrat Adenosin-5´-phosphosulfat

Die Bestimmung der Michaelis-Konstante Km für das Substrat APS erfolgte unter steady stateBedingungen (vgl. 5.14.2) nach Michaelis und Menten (1913) und Lineweaver und Burk(1934). Hierzu wurde die APS-Reduktase-Aktivität des Par∆1-Proteins bei steigendenAPS-Konzentrationen (2 - 15 µM) und sättigenden Konzentrationen des Reduktionsmittels(20 mM DTT oder GSH) über die Bildung des Sulfits bestimmt (Abb. 11).

Abb.11: Sättigung des Par∆1-Proteinsmit Adenosin-5´-phosphosulfat (APS)Großes Diagramm: Abhängigkeit der

Reaktionsgeschwindigkeit v von der

eingesetzten APS-Konzentration bei

sättigenden Konzentrationen des Reduktions-

mittels DTT oder GSH.

Reaktionsansatz: 100 mM Tris/HCl pH 8.0,

10 mM Na2SO3, 20 mM DTT oder GSH,

0,5 M Na2SO4, 2 - 15 µM [35S]-APS, 10 ng

gereinigtes Par∆1-Protein, Reaktions-

bedingungen: 3 min, 25 °C.

Eingesetztes Sekundärdiagramm: Doppelt

reziproke Auftragung von v-1 gegen [APS]-1

nach Linewaever/Burk zur Bestimmung von

Km app(APS) und Vmax app, (app: apparent).

Ergebnisse 24

Die in Abbildung 11 dargestellte Auftragung der ermittelten spezifischen APS-Reduktase-Aktivität nach Michaelis und Menten diente als Basis für die Erstellung des eingesetztenSekundärdiagramms durch doppelt reziproke Auftragung der Meßwerte nach Lineweaver undBurk. Aus der berechneten Geradengleichung ergab sich für das Substrat APS bei Verwendungvon DTT ein Km-Wert von 3,9 ± 0,9 µM bei einer apparenten Reaktionsgeschwindigkeit Vmax

von 4,2 ± 0,6 U mg-1. Das entspricht einer molekularen Aktivität von 204 min-1.Wurde DTT als Elektronendonor durch GSH ersetzt, konnte für APS eine Affinität von 2,5 ±0,23 µM mit einer apparenten Vmax von 2,6 ± 0,14 U mg-1 ermittelt werden. Die Umsatzzahl(Turnover) betrug 126 min-1. Aus dem jeweiligen Verhältnis Vmax/Km ergab sich damit eineEffizienz von 8,7 x 105 bzw. 8,4 x 105 [M s]-1.

2.3.3.4 Bestimmung der Michaeliskonstanten Km für die ReduktionsmittelDithiothreitol und Glutathion

Zur Bestimmung der Michaelis-Konstanten für die Reduktionsmittel wurden steigendeKonzentrationen an DTT bzw. GSH (50 µM - 5 mM) bei sättigender APS-Konzentration(15 µM) in Aktivitätstest eingesetzt (Abb. 12).

0

3 .0

2 .0

1 .0

3 .5

2 .5

1 .5

0 .5

[D T T ] o d er [G S H ] [m M ]0 1 2 3 4 5

v [U

mg

]-1

Abb. 12: Sättigung des Par∆1-Proteinsmit den Reduktionsmitteln Dithio-threitol (DTT) und Glutathion (GSH)Großes Diagramm: Abhängigkeit der

Reaktionsgeschwindigkeit v von der

eingesetzten Konzentration der Reduktions-

mittel (DTT und GSH) bei sättigenden APS-

Konzentrationen. Reaktionsansatz: 100 mM

Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 50 µM -

5 mM DTT oder GSH, 0,5 M Na2SO4, 15 µM

[35S]-APS, 10 ng gereinigtes Par∆1-Protein,

Reaktionsbedingungen: 3 min, 25 °C.

Eingesetztes Sekundärdiagramm: Doppelt

reziproke Auftragung von v-1 gegen [APS]-1

nach Linewaever/Burk zur Bestimmung von

Km app(DTT), Km app(GSH) und Vmax app, (app:

apparent).

Für DTT wurde ein apparenter Km-Wert von 0,4 ± 0,11 mM ermittelt. Es ergab sich eineapparente Maximalgeschwindigkeit von 3,9 ± 0,21 U mg-1 (Turnover: 190 min-1). DieAffinitätskonstante für GSH betrug 3 ± 0,64 mM bei einer nahezu identischen Vmax von 3,5 ±0,57 U mg-1 (Turnover: 170 min-1).

Ergebnisse 25

2.3.3.5 Beteiligung des Cystein317 an der Reduktion von Adenosin-5´-phosphosulfat

Da im heterolog exprimierte Par∆1-Protein keine prosthetischen Gruppen nachgewiesenwerden konnten (vgl. 2.3.3.2), die an der Elektronenübertragung vom DTT oder GSH auf denhexavalenten Sulfatschwefel beteiligt sein könnten, lag die Vermutung nahe, daß Aminosäurenals mögliche elektronentransferierende Strukturen im Protein genutzt werden.Für die PAPS-Reduktase aus E. coli wurde gezeigt, daß die Mutation des Cystein239 in demkonservierten Aminosäurecluster ECGLH (vgl. 7.4) zur Inaktivierung des Enzyms führte(Berendt et al., 1995). Diesem Cystein wird eine essentielle Beteiligung an der Reduktion desSubstrats PAPS zugesprochen. Aufgrund der Ähnlichkeit zum par-Genprodukt (vgl. 2.2), dasin seiner Primärsequenz ebenfalls diesen Cysteinrest (C317) in konservierter Position enthält,kam eine Beteilung dieser Aminosäure an der Katalyse der APS-Reduktion in Frage.

Mit Hilfe der „Overlap-Extension-PCR“ (vgl. 5.10.5) wurde in der cDNA par das Kodon fürCystein317 (TGT) durch einen einfachen Basenaustausch in ein Triplett für Glycin (GGT)umgewandelt. Vom Plasmid pET16bparMutE5 (vgl. 5.6) wurde das mutierte par-Genproduktals (His)10-Fusionsprotein in E. coli BL21(DE3) pLysS exprimiert, das in seiner Primärstrukturmit Ausnahme des Cystein317 dem Par∆1-Protein entsprach (vgl. 2.3.2). Unter den in Kapitel2.3.3.1 ermittelten Reaktionsbedingungen war das gereingte, im Cystein317 mutierte par-Genprodukt vollständig inaktiv.

2.3.3.6 Einfluß des Glutamin220 auf die Sulfonukleotid-Spezifität des par-Genproduktes

Die vorhergesagte Sekundärstruktur des par-Genpoduktes zeigte im Core-Bereich auffälligeÜbereinstimmungen zur abgeleiteten Sekundärstruktur der PAPS-Reduktase aus E. coli, unddas 3D-Modell der Core-Domäne wies auf eine nahezu identische Tertiärstruktur hin (vgl.2.2.2). Trotz dieser strukturellen Konformität wies das pflanzliche Enzym eine hohe Affinitätzum APS auf (vgl. 2.3.3.3). Eine Reduktion von PAPS wurde dagegen nicht festgestellt(Prior, 1996). Es stellte sich daher die Frage nach möglichen Ursachen für die Diskriminierungvon PAPS.Mit Hilfe des 3D-Modells wurde die Aminosäure Glutamin220 identifiziert, die an derAPS-Spezifität des par-Genproduktes beteiligt sein könnte. Hierzu wurde das AMP alsProdukt der APS-Reduktion von C. Lillig (AG Schwenn, Lehrstuhl für Biochemie derPflanzen, Ruhr-Universität Bochum) mit Hilfe des Computerprogramms WHATIF (Vriend,1990) in die vorhergesagte 3D-Struktur der Core-Domäne einmodelliert. Dabei zeigte sich,daß die räumliche Nähe der 3´-Hydroxylgruppe im AMP zum benachbarten Peptidsauerstoffdes Q220 die Bindung eines in 3´-Stellung der Ribose phosphorylierten Nukleotidsbeinträchtigen könnte (ohne Abbildung).

Durch die „Overlap-Extension-PCR“ wurde daher in der par-cDNA das Kodon CAG für Q220

durch einfachen Basenaustausch zu CTG für Leucin mutiert (vgl. 5.10.5). Leucin befindet sichin homologer Position in der PAPS-Reduktase (vgl. 7.4). Das ExpressionsplasmidpET16bparMutQ7 (vgl. 5.6) enthielt die mutierte cDNA par, und ermöglichte die Expression

Ergebnisse 26

und Reinigung des mutagenisierten par-Genproduktes, das in seiner Primärstruktur mitAusnahme des Glutamin220 der Par∆1-APS-Reduktase entsprach (vgl. 2.3.2). Im Aktivitätstest(vgl. 5.14.2) war die Sulfitbildung des mutierten Proteins auch weiterhin spezifisch für APS.Dabei wurde unter steady state Bedingungen mit einer Reaktionsgeschwindigkeit von0,8 U mg-1 eine Substratsättigung bereits durch weniger als 2 µM [35S]-APS erreicht.

2.3.3.7 Proteindisulfid-Isomerase-Aktivität des par-Genproduktes

Neben den vorhergesagten Strukturkongruenzen zur PAPS-Reduktase ergab sich aus denvorhergesagten Sekundärelementen des par-Genproduktes in der C-terminalen Extension einegroße Übereinstimmung zur Thioredoxin-ähnlichen Domäne der Proteindisufid-Isomerase(PDI) (vgl. 2.2.2). Auf der Ebene der Primärsequenz ähnelt der Aminosäure-ClusterYAPWCRFC387 (vgl. 2.2.1.1) im C-Terminus des par-Genproduktes darüberhinaus stark demYAPWCGHC-Motiv der PDIs (Freedman et al. 1994).Eine PDI-Aktivität des par-Genproduktes wurde daher durch die Reaktivierung reduzierter,denaturierter RibonukleaseA (RNaseA) überprüft (vgl. 5.14.4). Als Kontrolle wurde die nicht-enzymatische Reaktivierung im Redoxpuffer und der Einfluß der PAPS-Reduktase aus E. coliauf Wiederherstellung der Aktivität der RNaseA gemessen (Abb. 13).

den ./red. R N aseA 0 .07 m g m l-1

+ PR 10µ M

+ P a r µ M∆1 10

RN

aseA

Akt

ivitä

t [%

]

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0t [m in ]

Abb. 13: Kinetik der Reaktivierung reduzierter, denaturierter RNaseA durch daspar-Genprodukt aus Catharanthus roseusReaktionsansatz (500 µl): 0,07 mg ml-1 reduzierte (red.), denaturierte (den.) RNaseA, 0,2 mM DTT, 0,3 mM

oxidiertes Glutathion (GSSG), 3,3 mM MgCl2, 15 mM Tris/Acetat pH 8.0 und alternativ 10 µM Par∆1-Protein

oder 10 µM (His)10-PAPS-Reduktase (PR) aus E. coli. Zu den angegebenen Zeiten wurden dem

Reaktionsansatz jeweils 80 µl entnommen und zur Bestimmung der Aktivität der RNaseA mit 1,12 ml

cyclischem 2´-3´-Cytidinmonophosphat (CMP: 0,8 mg ml-1 in Tris/HCl pH 7.4) versetzt. Dessen Hydrolyse

wurde nach Blackburn (1979) photometrisch bei einer Wellenlänge von 296 nm verfolgt. Die jeweilige

Enzymaktivität ist relativ zur Aktivität der nativen RNaseA angegeben.

Ergebnisse 27

Es zeigte sich, daß das Par∆1-Protein eine Proteindisulfid-Isomerase-Aktivität aufwies, unddadurch eine vollständige Reaktivierung der reduzierten, denaturierten RNaseA innerhalb von70 min katalysierte. Unter gleichen Bedingungen bewirkte die gereinigte PAPS-Reduktase ausE. coli (Lillig et al., 1999) nur eine 20 %ige Reaktivierung. Über die gesamte Reaktionszeitwurde im verwendeten Redoxpuffer (vgl. 5.14.4) ohne Katalysator keine oxidativeRückfaltung der RibonukleaseA beobachtet.

2.3.4 Untersuchungen zur Funktion der Domänen des par-Genproduktes ausCatharanthus roseus

Die biochemischen Untersuchungen zum Par∆1-Protein hatten gezeigt, daß dieAPS-Reduktion unabhängig von Thioredoxin durch die Substrate DTT oder GSH erfolgte. DiePDI-Aktivität ließ eine funktionelle Verwandtschaft zur Thioredoxin-Superfamilie annehmen.Aufgrund der strukturellen Übereinstimmungen der Core-Domäne zur mikrobiellen PAPS-Reduktase und der C-terminalen Extension zur Thioredoxin-ähnlichen Domäne der PDI konntedaher vermutet werden, daß das par-Genprodukt im Core als Sulfonukleotid-Reduktasefunktioniert, und der C-terminalen Extension dabei eine Rolle als intramolekularer,Thioredoxin-ähnlicher Cofaktor bei der Elektronenübertragung zukommt. Um diese Hypothesezu überprüfen, wurde im folgenden die enzymatische Funktion der Core-Domäne despar-Genproduktes untersucht.

2.3.4.1 Bakterielle Expression und Reinigung der Core-Domäne des par-Genproduktes

Zur heterologen Expression der Core-Domäne in Escherichia coli wurde das Expressions-plasmid pET16bpar∆2 konstruiert (vgl. 5.6), das eine 5´- und 3´-verkürzte par-Sequenzenthielt und die Expression der Aminosäuren 77 bis 322 des par-Genproduktes als(His)10-Fusionsprotein ermöglichte (Abb. 14).

Abb. 14: Veränderte Darstellung der 3-Domänen-Primärstruktur des par-Genproduktes ausCatharanthus roseusGelb hervorgehoben ist die PAPS-Reduktase-homologe Core-Domäne, die vom Plasmid pET16bpar∆2 als

(His)10-Fusionsprotein (Par∆2) exprimiert wurde. Die Kennzeichnung der Aminosäuren entspricht den

Angaben in Abb. 5.

Ergebnisse 28

Die rekombinante Expression und Reinigung der (His)10-Core-Domäne (Par∆2) despar-Genproduktes erfolgte gemäß Kapitel 2.3.2. Das apparente Molekulargewicht desgereinigten Fusionsproteins (Par∆2) in der SDS-PAGE und im Immunoblot betrug etwa43 kDa. Das berechnete Molekulargewicht liegt mit 33 kDa um 10 kDa darunter (ohneAbbildung).

2.3.4.2 Aktivität der Core-Domäne des par-Genproduktes als Thioredoxin-abhängigeAPS-Reduktase

Zur Überprüfung der Funktion des Par∆2-Proteins als Sulfonukleotid-Reduktase wurden diefür das Par∆1-Protein ermittelten Reaktionsbedingungen angewendet (vgl. 2.3.3.2). Unterdiesen Bedingungen wurde weder mit DTT noch GSH als Reduktionsmittel eine signifikanteSulfitbildung aus APS gemessen.Die Reaktionsbedingungen wurden deshalb zunächst dahingehend geändert, daß dem Ansatz(vgl. 5.14.2) rekombinantes Thioredoxin1 (Trx1) aus E. coli zugesetzt wurde, das seinerseitsdurch DTT im reduzierten Zustand gehalten wurde. Dadurch wurde in vitro eineWiederherstellung der APS-Reduktase-Aktivität des Par∆2-Proteins erzielt. Die Freisetzungdes säureflüchtigen Sulfits aus APS war unter Verwendung von 35 µM Trx1 beiEnzymkonzentrationen von 50 - 1.000 ng ml-1 linear.Eine Thioredoxin-abhängige oder -unabhängige Reduktion von PAPS durch das Par∆2-Proteinwurde nicht beobachtet.

Die Bestimmung der Michaeliskonstante Km des Par∆2-Proteins für das Substrat APS erfolgteentsprechend Kapitel 2.3.3.3 unter steady state Bedingungen bei sättigenden Konzentrationendes Trx1 (Abb. 15).

Abb. 15: Sättigung des Par∆2-Proteinsmit Adenosin-5´-Phosphosulfat (APS)Großes Diagramm: Abhängigkeit der

Reaktionsgeschwindigkeit v von der APS-

Konzentration bei sättigender Trx1-

Konzentration.

Reaktionsansatz: 100 mM Tris/HCl pH 8.0,

10 mM Na2SO3, 0,5 M Na2SO4, 10 mM DTT,

35 µM E. coli Trx1, 2 - 15 µM [35S]-APS,

50 ng Par∆2-Protein, Bedingungen: 3 min,

25°C.

Sekundärdiagramm: Doppelt reziproke

Auftragung von v-1 gegen [APS]-1 nach

Lineweaver/Burk zur Ermittlung von

Km app(APS) und Vmax app, (app: apparent).

Ergebnisse 29

Die im Lineweaver/Burk-Plot ermittelte apparente Affinitätskonstante Km(APS) entsprach beieiner Vmax app von 0,4 ± 0,03 µM mit 3,8 ± 0,08 µM der Km(APS), die für das Par∆1-Proteinermittelt wurde (vgl. 2.4.3).

Für Trx1 wurde bei sättigenden APS-Konzentrationen eine apparente Michaelis-Konstante von15,3 ± 1,27 µM ermittelt (Abb. 16). Die Maximalgeschwindigkeit der APS-Reduktion betrugdabei 0,6 ± 0,014 U mg-1 (Turnover = 20 min-1).

0

2

6

1 0

1 4

0 .2-0 .2 0 .4[T rx ] [µ M ]-1 -1

v [m

g U

]-1

-1

1 00

0 .08

0 .16

0 .24

0 .32

0 .40

2 0 3 0 4 0 5 0[Trx o d er G rx ] [µ M ]

v [U

mg

]-1

T r xG rx

Abb. 16: Sättigung des Par∆2-Proteinsmit Thioredoxin (Trx)Großes Diagramm: Abhängigkeit der

Reaktionsgeschwindigkeit v von der

eingesetzten Trx1- bzw. Glutaredoxin1

(Grx1)-Konzentration bei sättigender APS-

Konzentration. Reaktionsansatz: 100 mM

Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 0,5 M

Na2SO4, 10 mM DTT, 2 - 50 µM E. coli Trx1

oder 2 - 25 µM Grx1, 15 µM [35S]-APS, 50

ng Par∆2-Protein, Bedingungen: 3 min, 25°C.

Sekundärdiagramm: Doppelt reziproke

Auftragung von v-1 gegen [APS]-1 nach

Lineweaver/Burk zur Bestimmung von

Km app(Trx) und Vmax app, (app: apparent)

Da neben DTT auch GSH als Reduktionsmittel für die APS-Reduktion fungierte, und GSH alsElektronendonor für Glutaredoxin (Grx) und nicht Trx beschrieben wird (Holmgren, 1989),wurde im folgenden die APS-Reduktase-Aktivität des Par∆2-Proteins mit Grx1 aus E. colibestimmt, das seinerseits vom GSH reduziert wurde.Grx1 bewirkte als Substituent der C-terminalen Extension des par-Genproduktes im Vergleichzum Trx1 keine signifikante Sulfitbildung aus APS (Abb. 16). Die maximal erzielteReaktionsgeschwindkeit bei Verwendung von 25 µM Grx1 betrug im Vergleich zur Reaktionmit Trx1 gerade 4 %.

Die C-terminale Extension des par-Genproduktes konnte in vitro funktionell durch dasbakterielle Trx1 ersetzt werden. Im folgenden wurde überprüft, ob eine APS-Reduktion desPar∆2-Proteins auch bei Verwendung eines pflanzlichen Trx erfolgen konnte. Die APS-Reduktase-Aktivität des Par∆2-Proteins wurde daher mit TrxH3 aus A. thaliana bestimmt.Bei der Verwendung des TrxH3 wurde eine apparente Maximalgeschwindigkeit der Reaktionvon 2,2 U mg-1 bestimmt und war damit etwa 4fach größer als die mit Trx1 aus E. coliermittelte Vmax app. Die Affinität des Par∆2-Proteins zum TrxH3 war dagegen mit Km app =14,3 µM der Michaelis-Konstante für Trx1 entsprechend (ohne Abbildung).

Ergebnisse 30

2.2.4.3 Insulindisulfid-Reduktase-Aktivität des par-Genproduktes

Die Thioredoxin-abhängige Sulfitbildung der Core-Domäne (Par∆2) ließ auf eine Thioredoxin-ähnliche Funktion der C-terminalen Extension im par-Genprodukt schließen.Um eine Trx-Funktion dieser C-terminalen Extension zu verifizieren, wurde die Katalyse derReduktion des Insulindisulfids (Holmgren, 1979) durch das Par∆1-Protein im Vergleich zumPar∆2-Protein verfolgt (vgl. 5.14.3). Als Positivkontrolle erfolgte die Messung derInsulinreduktion durch Trx1 aus E. coli. Als Negativkontrolle wurde die nicht enzymatischeInsulinreduktion durch DTT und der Einfluß der PAPS-Reduktase aus E. coli auf die Rate derDisulfidreduktion gemessen (Abb. 17).

0

0 .10 .1

0 .2

0 .3

0 .4

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0t [m in ]

Ext

inkt

ion

(650

nm

)

T rx 0 .2 µ MPar 1 0 .38 µ MPar 2 0 .38 µ MP R 0 .38 µ MD T T 0 .83 m M

∆∆

Abb. 17: Kinetik der DTT-abhängigen Insulinreduktion durch das par-Genprodukt ausCatharanthus roseusReaktionsansatz (600 µl): 83 mM Kaliumphosphat pH 7.0, 1,7 mM EDTA, 140 µM Rinderinsulin, 0,83 mM

DTT und alternativ 0,38 µM Par∆1-Protein oder Par∆2-Protein oder E. coli (His)10-PAPS-Reduktase (PR) bzw.

0,2 µM E. coli Trx1. Die Trübung des Reaktionsansatzes durch die Reduktion des Insulins wurde

photometrisch bei einer Wellenlänge von 650 nm verfolgt.

Das Par∆1- sowie das Par∆2-Protein katalysierten die Reduktion des Insulindisulfids mitannähernd identischen Raten (0,07 ∆E [min µmol]-1 für Par∆1, 0,06 ∆E [min µmol]-1 fürPar∆2). Im Vergleich zum Trx1 aus E. coli (0,2 ∆E [min µmol]-1) machten diese Raten jeweils35 bzw. 30 % aus. Die PAPS-Reduktase aus E. coli hingegen konnte die Insulin-Reduktionnicht katalysieren. In Gegenwart dieses Enzyms entsprach die Reaktion der nicht-enzymatischen Insulindisulfid-Spaltung durch DTT, die weniger als 2 % der Enzym-katalysierten Rate ausmachte.

Ergebnisse 31

2.3.4.4 Untersuchung der funktionellen Komplementation pro- und eukaryotischer,Cystein-auxotropher Mutanten durch die Core-Domäne des par-Genproduktes

Es wurde gezeigt, daß die separierte Core-Domäne des par-Genproduktes (Par∆2) mitexogenem Thioredoxin die Reduktion von APS unabhängig von der C-terminalen Extensionkatalysierte (vgl. 2.3.4.2). Diese Reduktasefunktion wurde im folgenden durch die funktionelleKomplementation pro- und eukaryotischer, Cystein-auxotropher Mutanten in vivo untersucht.

Der Cystein-auxotrophe E. coli Stamm JM96 FAK (Krone et al., 1991) ist aufgrund einerMutation im cysH-Gen der PAPS-Reduktase nicht in der Lage, PAPS zu Sulfit zu reduzieren.Durch die phänotypische Komplementation dieser Mutante konnte die cDNA par aus einerBibliothek von C. roseus isoliert werden (Uhrig, 1996).Zur Komplementation dieses Bakterienstammes durch die 5`- und 3`-deletierte cDNA par∆2wurde das Plasmid pKSpar∆2 verwendet (vgl. 5.6), das eine Expression der Core-Domäne alsFusion mit der vom Vektor kodierten β-Galaktosidase in E. coli ermöglichte und durch IPTGinduziert wurde. Als Positivkontrollen dienten die Plasmide pUB5 (vgl. 5.6) und pCrpar4 (vgl.2.1), die für die PAPS-Reduktase aus E. coli (cysH) bzw. das vollständige par-Genprodukt ausC. roseus kodieren. Zur Kontrolle der Cystein-Auxotrophie der Mutante erfolgte eineTransformation mit dem Vektor pBluescript-II-KS+. Die Selektion komplementierender Kloneerfolgte durch ihr prototrophes Wachstum auf Minimalmedium mit Sulfat als einzigerSchwefelquelle und IPTG (vgl. 5.8). Die Effizienz der Transformation wurde durch dasauxotrophe Wachstum auf Cystein-haltigem Nährmedium überprüft. In Tab. 3 ist das Ergebnisder Transformation zusammengefaßt.

Tab. 3: Komplementation der PAPS-Reduktase-defizienten E. coli Mutante JM96 FAK durchhomologe und heterologe DNA der angegebenen Plasmide(+) = Bakterienwachstum, (---) = kein Bakterienwachstum, auxotroph: Minimalnährmedium mit Cystein (Cys)

als Schwefelquelle und IPTG, prototroph: Minimalnährmedium mit SO42- als Schwefelquelle und IPTG.

Plasmid/darin enthaltene(s) cDNAbzw. Gen

auxotroph prototroph

pBluescript-II-KS+/ohne + ---

pUB5/cysH aus E. coli + +

pCrpar4/par aus C. roseus + +

pKSpar∆2/par∆2 aus C. roseus + ---

Obwohl die Core-Domäne in vitro eine Thioredoxin-abhängige Sulfitbildung katalysierte,konnte keine funktionelle Komplementation der cysH-- Mutante von E. coli festgestellt werden.Vom Plasmid pKSpar∆2 wurde in E. coli JM96 FAK dennoch eine funktionsfähige Core-Domäne exprimiert, da in Proteinextrakten dieser Transformanden im Vergleich zuuntransformierten Zellen eine spezifische APS-Reduktase-Aktivität (v ≈ 1 mU mg-1) durchZusatz von 30 µM Trx1 nachgewiesen werden konnte (ohne Abbildung).

Ergebnisse 32

Als eukaryotische Mutanten waren die Cystein-auxotrophen S. cerevisiae Stämme MET14 undMET16 verfügbar, die keine funktionsfähige APS-Kinase bzw. die PAPS-Reduktasesynthetisieren. Diese Mutanten wurden bereits erfolgreich durch die par∆1-cDNA ausC. roseus komplementiert (Plasmid pYPGEpar∆1, Prior, 1996). Daher wurde im folgendengetestet, ob diese Mutanten durch die par∆2-cDNA im Shuttle-Vektor-KonstruktpYPGEpar∆2 (vgl. 5.6) zur Prototrophie ergänzt werden konnten.

Als Positivkontrollen wurden Shuttle-Vektorkonstrukte verwendet, die das Strukturgen cysHder E. coli PAPS-Reduktase (pYPGEcysH), die cDNA akn1 der APS-Kinase aus A. thaliana(pYPGEakn) oder die cDNA par∆1 (pYPGEpar∆1) enthielten (vgl. 5.6). Als Negativkontrollediente die Transformation mit dem Vektor pYPGE15.Die erfolgreiche Transformation wurde durch die Selektion aller Transformanden aufMinimalmedium mit Cystein und Methionin als Schwefelquelle (vgl. 5.8) überprüft, wobei dieUracil-Defizienz der Mutanten durch das vom Vektor kodierte ura3-Gen der Hefekomplementiert wurde (nicht dargestellt). Die Selektion komplementierender Klone erfolgtedurch ihr prototrophes Wachstum auf Minimalmedium mit Sulfat als einziger Schwefelquelle(Abb.18).

Aus Abbildung 18 ist hervorzuheben, daß auch die eukaryotischen Mutanten MET14 undMET16 nicht durch die cDNA par∆2 für die Core-Domäne des par-Genprodukteskomplementiert werden konnten. Vom Plasmid pYPGEpar∆2 wurde in den auxotrophkultivierten Transformanden S. cerevisiae MET14 pYPGEpar∆2 und S. cerevisiae MET16pYPGEpar∆2 dennoch eine funktionsfähige Core-Domäne exprimiert, da in Proteinextraktendieser Transformanden im Vergleich zu den untransformierten Zellen mit 30 µM Trx1 einespezifische APS-Reduktase-Aktivität mit v ≈ 0,6 mU mg-1 ermittelt werden konnte (ohneAbbildung).

Ergebnisse 33

Abb. 18: Funktionelle Komplementation der APS-Kinase-defizienten Hefemutante MET14und der PAPS-Reduktase-Mutante S. cerevisiae MET16 durch heterologe DNA aus E. coli,A. thaliana und C. roseusPrototrophes Hefewachstum auf Minimalmedium ohne Uracil, Cystein und Methionin: Die S. cerevisiae (S. c.)

Stämme MET14 und MET16 sowie die Transformanden mit dem Vektor pYPGE15 sind mit Sulfat als

Schwefelquelle nicht lebensfähig. Die Cystein-Prototrophie von S. cerevisiae MET14 kann durch die cDNA

akn für die A. thaliana APS-Kinase (pYPGEakn) und par∆1 (pYPGEpar∆1) für das Par∆1-Protein aus

C. roseus wiederhergestellt werden. S. cerevisiae MET16 wird durch das Strukturgen cysH für die E. coli

PAPS-Reduktase (pYPGEcysH) und die cDNA par∆1 für das Par∆1-Protein aus C. roseus komplementiert

(pYPGEpar∆1). Die cDNA par∆2 für die Core-Domäne des par-Genproduktes kann weder S. cerevisiae

MET14 (pYPGEpar∆2) noch S. cerevisiae MET16 (pYPGEpar∆2) zur Prototrophie ergänzen. Als

unabhängige Positivkontrolle fungiert der Wildtyp S. cerevisiae D273-10b.

Ergebnisse 34

2.4 Transgener Tabak zur Untersuchung der Funktion der APS-Reduktase inplanta

Die in vitro Analyse des par-Genproduktes aus C. roseus ließ auf eine Funktion des Proteinsals plastidäre APS-Reduktase schließen (vgl. 2.3). Im weiteren wird das par-Genprodukt daherals APS-Reduktase bezeichnet.Aufgrund der thermodynamischen und kinetischen Voraussetzungen der APS-Synthese sowieder effizienten APS-Phosphorylierung (vgl. Kap. 1) war im Chloroplasten eine Reduktion vonAPS mit der ermittelten Effizienz der APS-Reduktase jedoch zweifelhaft. Dieser Aspekt wirdhinsichtlich der physiologischen Bedeutung des Proteins für die Sulfatasssimilation der höherenPflanzen in Kapitel 3 diskutiert.In diesem Zusammenhang war allerdings weder die subzelluläre Lokalisation der APS-Reduktase im Chloroplasten immunologisch bewiesen noch war auszuschließen, daß dasnative, physiologisch funktionsfähige Pflanzenprodukt über biochemische und strukturelleEigenschaften verfügte, die das heterolog in E. coli exprimierte Protein nicht aufweis.Hinweise dafür konnten zum einen in den vorhergesagten posttranslationalen Modifikationen(vgl. 2.2.1) gefunden werden. Zum anderen war im nativen Protein durch das Vorkommen vonsieben Cysteinresten auch eine Einlagerung prosthetischer Gruppen denkbar. Wegen derfunktionellen in vitro Eigenschaften von Core-Domäne und C-terminaler Extension alsReduktase bzw. redoxaktiver Cofaktor war in planta überdies eine posttranslationaleProzessierung dieser Domänen nicht auszuschließen.Im Rahmen der Arbeiten von Wiesmann (1999) und Staudinger (2000) zum immunologischenNachweis sulfatassimilierender Enzyme in höheren Pflanzen und Zellkulturen wurde deutlich,daß eine Identifizierung der nativen APS-Reduktase oder pflanzlicher Homologe wegen dergeringen Konzentration dieses Proteins in planta vermutlich nicht möglich war.Um einen Zugang zur Funktion, der subzellulären Lokalisation und der physiologischenRelevanz des nativen Pflanzenproduktes zu schaffen, erfolgte im weiteren eine Überexpressionder APS-Reduktase aus C. roseus als Oligo-Histidin-Fusion im Wirt Pflanze.

2.4.1 Binäre Vektorkonstrukte zur Transformation von Nicotiana tabacum

Der Transfer der genetischen Information für die APS-Reduktase aus C. roseus in denpflanzlichen Wirtsorganismus N. tabacum erfolgte auf der Basis eines binären Vektorsystemsdurch Agrobacterium tumefaciens.Hierzu wurden drei Derivate des binären Vektorplasmids pBINAr(Kan) (vgl. 5.5) hergestellt,die eine in planta Überexpression der APS-Reduktase als Oligo-Histidin-Fusion und eineLokalisation des Produktes in unterschiedlichen Zellkompartimenten des Tabaks ermöglichensollten.1). Zur Expression einer plastidären APS-Reduktase wurde das Plasmid pBINAr1.R.2.1(vgl. 5.6) konstruiert. Es enthielt die cDNA par inklusive ihrer 5`-Transitsequenz im VektorpBINAr(Kan). Die kodierende Sequenz par wurde mit Hilfe der PCR am 3`-Ende um sechsKodontripletts für ein C-terminales Histidin-Hexapeptid verlängert. Die Herstellung desbinären Vektorplasmids pBINAr1.R.2.1 ist beispielhaft in Abb. 19 dargestellt.

Ergebnisse 35

5 ` 3 ` 3 ` 5 `

p 4C rpar

P R 4p a r B a mG C T (G TA G T G ) A C T3

R 6 H is S top464

P R 6 H isp a r B a m

P C R

1439 B p 6H is-P C R -F ragm en tpar

Su bk lon ieru ng p B luescr ip t-I I-K S +

B a mH I

p B IN A r1 .R .2 .1

Abb. 19: Schematische Darstellung der Konstruktion des binären VektorplasmidspBINAr1.R.2.1 zur Expression einer plastidären (His)6-APS-Reduktase in N. tabacumDie cDNA für die in ihre Primärstrukturdomänen gegliederte APS-Reduktase (grün: Transitpeptid, gelb: Core-

Domäne, blau: C-terminale Extension) wurde vom Plasmid pCrpar4 mit den Oligonukleotiden PRpar4Bam

und PRpar6HisBam amplifiziert. Der Primer PRpar6HisBam fügte in die par-Sequenz nach dem Kodon für die

C-terminale Aminosäure R464 sechs Tripletts für Histidin und ein anschließendes Stopkodon ein. Die

Subklonierung des PCR-Fragments erfolgte über den Vektor pBluescript-II-KS+ in den binären Vektor

pBINAr(Kan). Die Transfer-DNA ist durch einen roten Pfleil gekennzeichnet, LB: linke Borderegion, RB:

rechte Borderregion, CaMV 35-S: 35-S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, MCS: multiple

Klonierungsregion, OCS3`: Terminatorregion des Octopin-Synthase-Gens mit Polyadenylierungssignal, nptII:

Gen für die Neomycin-Phosphotransferase, KanR: Kanamycinresistenz, nos5`: Nopalinsynthase Promotor,

nos3`: Nopalinsynthase Terminator, ori V: Replikationsursprung, nptIII: Gen für die bakterielle Neomycin-

Phosphotransferase.

Ergebnisse 36

2). Das Konstrukt pBINAr2.N.2.13 (vgl. 5.6) sollte durch die Deletion der Transitsequenz eineLokalisation der (His)6-APS-Reduktase im Cytosol bewirken. Durch die Existenz einercytosolischen ATP-Sulfurylase (Renosto et al., 1993) wäre auch in diesem Zellkompartimentdas Substrat für die Sulfitbildung aus APS gegeben.3). Das Plasmid pBINAr3.2.17 (vgl. 5.6) konnte die Expression der APS-Reduktase als Fusionmit einem N-terminalen Histidin-Dekapeptid ermöglichen und sollte sicherstellen, daß dieCore-Domäne auch bei einer posttranslationalen Abspaltung der C-terminalen Extensionerfaßbar war.In Abb. 20 sind zum Überblick die Expressionskassetten in der Transfer (T)-DNA der obengenannten Plasmide schematisch aufgeführt.

Abb. 20: Rekombinante Expressionskassetten der binären Vektorkonstrukte pBINAr1.R.2.1,pBINAr2.N.2.13 und pBINAr3.2.17 zur Überproduktion plastidärer und cytosolischer APS-Reduktase als Oligo-Histidin-Fusion in N. tabacumpar: Modifizierte cDNA der in ihre Primärstrukturdomänen gegliederten APS-Reduktase aus C. roseus (grün:

Transitsequenz, gelb: Core-Domäne, blau: C-terminale Extension), CaMV 35-S: 35-S-Promotor des

Blumenkohlmosaikvirus, OCS3`: Terminatorregion des Octopin-Synthase-Gens, 6His: 6 Nukleotidtripletts für

Histidin, 10His: 10 Nukleotidtripletts für Histidin. Die wahrscheinliche Lokalisation des rekombinanten

Genproduktes im Chloroplasten oder Cytosol ist angegeben.

2.4.2 Transformation von Nicotiana tabacum Pflanzen, Selektion und Regeneration

Zur Agrobakterien-vermittelten Transformation von Tabakpflanzen wurde die „leaf-disc-Methode“ etabliert (vgl. 5.10.2), die sich nach der Erzeugung rekombinanter Agrobakterien (I)in eine Infektionsphase (II), die Cokultur (III) sowie eine Selektions- und Regenerationsphase(IV) gliederte und zu transgenem Sproßgewebe (V) führte. Die erarbeitete Methodik ist amBeispiel der Transformation von N. tabacum unter Verwendung des binären VektorplasmidspBINAr1.R.2.1 zusammenfassend in Abb. 21 aufgeführt.

Ergebnisse 37

p B IN A r1 .R .2 .1E lek tropo ration vonA . tu m efacien s G V2260

A . tum efa c ien s G V 2 2 60 p B IN A R 1 .R .2.1H erstellung e inerstationä ren K ultu r

Z ellsu sp ens io n

N icotia na tab a cu m P fla n zen(ste ril , 4 - 6 W ochen a lt)

Z e rschne iden der B lä tter in k le ine S tücke

v erw un d etes B la ttge w e be

(I)

(I I) In fek t io n

Inkubation de r Tabak-b la ttstücke in der Z ell-suspension von G V 2260 pB IN A r1 .R .2 .1

A . tum efaciens

E ind ringen der A g robak terienins P flanzengew ebe H erstellung des K on tak teszw ischen und P flanzenze lle (A ttachm ent)

A . tum efaciens

(I II ) C o ku ltu rInkubation de r in f iz ie rtenB latts tücke au f A ntib io tika-fre iem M S -M ed ium

2 - 3 m in

Ü bertragung der Transfe r-D N A

(E xpressionskassette und K anam yc in resis tenz )

ins P flanzengenom

(IV ) S e lek t io n +R eg enera t ion

S elek tion transfo rm ierterB lattzellen (K an ) A b tö tung von A g robak te rien(B akteriz ide ) Induk tion der K a llus- undSproßbildung (H o rm one)

RInkubation de r B latt-stücke au f Se lek tions-M ed ium m it K an ., -B . bzw. C ef., B A P

βα−ΝΑΑ,

(V ) S p ro ß ku ltu r vegetative Verm ehrung

A nzuch t de r Transfo rm andenau f M S -M ed ium m it K an .,

-B . bzw. C ef.β

2 d ( im D unkeln)

3 - 5 x 10 d (K urztag )

Abb. 21: Methodik zur Agrobakterien-vermittelten „leaf-disc“-Transformation vonN. tabacum mit dem Helferplasmid pGV2260 und dem binären Vektorplasmid pBINAr1.R.2.1Abkürzungen: α-NAA: α-Naphtylessigsäure, BAP: 6-Benzylaminopurin, β-B.: β-Baktyl, Cef.: Cefotaxime,

d: Tage, Kan.: Kanamycin, KanR: Kanamycinresistenz, MS: Murashige und Skoog.

Zur Infektion des verwundeten Blattmaterials von N. tabacum wurde der StammA. tumefaciens GV2260 verwendet. Dieser Stamm enthält das Helferplasmid pGV2260, dasdie agrobakteriellen Virulenz-Gene (vir) beinhaltet. Durch eine Transformation dieserBakterien (vgl. 5.10.1) mit den Plasmiden pBINAr1.R.2.1, pBINAr2.N.2.13 oderpBINAr3.2.17 lagen in den Agrobakterien die erforderlichen Plasmide des binärenTransformationssystems gleichzeitig vor, so daß während der Cokultur eine Übertragung derExpressionskassetten ins Pflanzengenom ermöglicht wurde.

Ergebnisse 38

Die anschließende Selektion transgener Blattzellen erfolgte durch die mit der Transfer-DNAübertragene Kanamycin-Resistenz (nptII-Gen), während die Agrobakterien durch Bakterizideabgetötet wurden. Die Regeneration wurde dabei durch Kallus-induzierende Hormoneeingeleitet.

Nach ca. vier Wochen wurde im wundnahen Bereich der transformierten Blattstückchen einKallusgewebe gebildet. Aus diesen Kalli entwickelten sich im Verlauf der weiteren Wochen dieErstsproße, wobei meistens aus einem Kallus mehrere Sprosse entstanden (Abb. 22). Vonjedem Kallus wurde eine Pflanze als Sproßkultur auf hormonfreiem Nährmediumherangezogen. Auf diese Weise wurden zu jedem binären Vektorkonstrukt 60 - 95 Kanamycin-resistente Pflanzen (T1-Generation) selektioniert, nummeriert und mindestens 3 x vegetativvermehrt bevor sie zur weiteren Analyse genutzt wurden.

Abb. 22: Entwicklungsstadien von Tabakgewebe nach einer Agrobakterien-vermittelten„leaf-disc“-Transformation mit dem Helferplasmid pGV2260 und dem binären VektorplasmidpBINAr1.R.2.1(A) 3 - 4 Wochen altes Kallusgewebe, (B) ca. 6 Wochen alte Erstsproße.

2.4.3 Untersuchung der Integration transferierter DNA in das Genom von Nicotianatabacum

Die selektionierten, Kanamycin-toleranten Pflanzen (vgl. 2.4.2) wurden zunächst daraufhinuntersucht, ob die Transfer (T)-DNA in das Tabakgenom inseriert wurde, und dieseTransformanden frei von Agrobakterien waren (= echte Transformanden).

Ergebnisse 39

Hierzu wurde ein Testsystem etabliert, das auf der Polymerase-Kettenreaktion mit dreispezifischen Oligonukleotidpaaren basierte: 1). das Oligonukleotidpaar PRnptIIPla1 undPRnptIIPla2 zur Identifizierung der T-DNA, 2). das Oligonukleotidpaar PRnptIIIBac1 undPRnptIIIBac2 zum Nachweis agrobakterieller Plasmid-DNA, und 3). das OligonukleotidpaarPRactinfwd und PRactinrev zur Überprüfung der Qualität der isolierten genomischen DNA.Das experimentelle Konzept zur Identifizierung der echten Transformanden ist in Abb. 23zusammengefaßt und wird im weiteren erläutert.

Abb. 23: Experimentelles Konzept zur Identifizierung echter Transformanden von N. tabacumdurch die PCRPRnptIIPla1 und PRnptIIPla2: zum pflanzlichen Neomycin-Phosphotransferase-Gen (nptII) in der T-DNA der

binären Plasmidkonstrukte pBINAr1.R.2.1, pBINAr2.N.2.13 und pBINAr3.2.17 homologe Oligonukleotide,

PRnptIIIBac1 und PRnptIIIBac2: zum bakteriellen Neomycin-Phosphotransferase-Gen (nptIII) außerhalb der

T-DNA homologe Oligonukleotide, PRactinfwd und PRactinrev: zum Haushaltsgen tob71 für Aktin1 aus

N. tabacum homologe Primer. KanR: Kanamycin-resistent.

Zur Identifizierung der T-DNA im Genom der Kanamycin-resistenten N. tabacum Pflanzenwurde in der PCR1 zunächst mit dem Oligonukleotidpaar PRnptIIPla1 und PRnptIIPla2 ein800 Bp großes Fragment des nptII-Gens aus der Gesamt-DNA amplifiziert. Das Gen für dieNeomycin-Phosphotransferase (nptII) unter der Kontrolle des nos-Promotors liegt in denbinären Vektorplasmiden pBINAr1.R.2.1, pBINAr2.N.2.13 und pBINAr3.2.17 wie die cDNApar innerhalb der linken und rechten Borderregion und konnte somit stellvertretend alsIntegrationsnachweis dienen.Da ein 800 Bp großes PCR-Produkt auch durch eine Kontamination der genomischen DNAmit agrobakterieller Plasmid-DNA bedingt sein konnte, wurden die DNA-Präparationen der

P C R 2 m it u nd

P R I IIB a c1P R I I IB a c2

n ptn pt

(M atr ize : G esam t-D N A alle r Transform anden m it PC R 1) posit iver

P C R 1 m it u nd

P R I IP la 1P R I IP la 2

n ptn pt

(M atr ize : G esam t-D N A alle r K an Transform anden)R

8 00 B p I I -P ro d u kt

n pt

6 00 B p I I I-P ro d u kt

n pt

9 29 B p 7 1 -P ro d u kt

tob

k ein Pro d uk t

k ein Pro d uk t

k ein Pro d uk t

w eite re A n layse in P C R 2

w eite re A n layse in P C R 3

K on tam ina n te n

F alsch P os it ive

E ch te Tr ans form a nden

m a n g elhaf te Q u alitä tg en o m ischer D N A

P C R 3 m it u nd

P R fw dP R rev

actinactin

(M atr ize : G esam t-D N A alle r Transform anden m it PC R 1) nega tiver

+

+

+

_

_

_

Ergebnisse 40

Transformanden mit positiver PCR1 in der PCR2 mit dem Oligonukleotidpaar PRnptIIIBac1und PRnptIIIBac2 auf das Vorhandensein des bakteriellen nptIII-Gens durchmustert. Durchdiese Primer wurde ein 600 Bp großes Fragment des nptIII-Gen vervielfältigt. Dieses Gen fürdie bakterielle Kanamycinresistenz war in den binären Vektorplasmiden außerhalb der T-DNAlokalisiert und wurde demnach nicht ins Pflanzengenom übertragen. Ein 600 Bp großes PCR-Produkt konnte demnach nur Folge einer Kontamination der transformierten Pflanzen mitA. tumefaciens sein (= Kontaminanten). Echte Transformanden, welche die T-DNA ins Genomintegriert hatten und frei von bakterieller Plasmid-DNA waren, lieferten dementsprechend inder PCR1 das 800 Bp große nptII-PCR-Produkt und in der PCR2 kein Produkt.Bei diesem Testsystem werden die „falsch positiven“ Pflanzen durch die negative PCR1 mitden nptII-spezifischen Primern ausgesondert. Da eine negative PCR auch durch einemangelhafte Qualität der Matrize bedingt sein konnte, wurde die Gesamt-DNA solcherPflanzen unter den gleichen Bedingungen anhand der Vervielfältigung charakteristischerTabaksequenzen überprüft. Mit Hilfe der Oligonukleotide PRactinfwd und PRactinrev konntein der PCR3 ein 929 Bp großes Fragment des tob71-Gens für Aktin1 im Tabakgenomamplifiziert werden. „Falsch positive“ Pflanzen zeigten in der PCR3 ein positives Signal mitden tob71-spezifischen Primern, jedoch kein Produkt in der PCR1.

Zur PCR wurde jeweils die Gesamt-DNA (vgl. 5.10.3) als Matrize mit einem Reaktionsmix fürmehrere Ansätze versetzt (vgl. 5.10.5). Die Verwendung eines gemeinsamen Reaktionsmixesfür eine Mehrzahl an Proben garantierte durch eine positive PCR die Funktionalität derReaktion. Durch eine negative PCR konnte eine Kontamination des Reaktionsmixesausgeschlossen werden. Als Positivkontrolle dienten dabei jeweils die binärenPlasmidkonstrukte (vgl. 2.4.1), als Negativkontrolle die Gesamt-DNA des Wildtyps vonN. tabacum. In Abb. 24 ist das Ergebnis der PCR-Analyse einer echten Transformande (= ET)mit den entsprechenden Kontrollen dargestellt.

Abb. 24: PCR-Analyse zurIdentifizierung der echten Trans-formande ET3.0 von N. tabacum

Agarosegelelektrophorese (0,8 % (w/v),

Ethidiumbromidfärbung) von PCR-Produkten

(75 - 150 ng) aus Reaktionen mit

unterschiedlicher Matrize und verschiedenen

Oligonukleotidpaaren (Oligos). M: Größen-

standard (500 ng λ-DNA EcoRI/HindIII); 1:

Gesamt-DNA aus der Transformande ET3.0 als

Matrize, PRnptIIPla1/PRnptIIPla2 als Oligos;

2: Matrize wie in 1, PRnptIIIBac1/

PRnptIIIBac2 als Oligos; 3: Gesamt-DNA des

Tabakwildtyps als Matrize , Oligos wie in 1; 4:

Matrize wie in 3, Oligos wie 2; 5: Plasmid

pBINAr3.2.17 als Matrize, Oligos wie 1, 6:

Matrize wie in 5, Oligos wie in 2.

Ergebnisse 41

Die PCR mit Gesamt-DNA der Tabaktransformande ET3.0 ergab mit dem OligonukleotidpaarPRnptIIPla1/PRnptIIPla2 das 800 Bp große nptII-Genfragment (Spur 1), das auch in derPositivkontrolle vom Plasmid pBINAr3.2.17 amplifiziert wurde (Spur 5). Mit dem PrimerpaarPRnptIIIBac1/PRnptIIIBac2 wurde in der DNA-Präparation keine agrobakterielle Plasmid-DNA identifiziert (Spur 2), mit der ein 600 Bp großes PCR-Produkt amplifizierbar wäre(Spur 6). Mit genomischer DNA einer Wildtyp-Pflanze (Negativkontrolle) wurde erwartungs-gemäß mit keinem Oligonukleotidpaar ein Amplifikat produziert (Spuren 3, 4).

Die Verteilung von echten Transformanden, Kontaminanten und „falsch positiven“ Pflanzen istzu jedem binären Vektorkonstrukt in Tab. 4 zusammengefaßt. Die Transformationseffizienzlag zwischen 50 und 65 %. Die echten Transformanden wurden im weiteren als ET1- (PlasmidpBINAr1.R.2.1), ET2- (Plasmid pBINAr2.N.2.13) und ET3-Transformanden (PlasmidpBINAr3.2.17) bezeichnet und sind im Anhang 7.5 aufgelistet. Phänotypisch auffällig wardarunter neben mehreren kleinwüchsigen Exemplaren mit gestauchten Internodien die PflanzeET3.3 mit „panaschierten“ Blättern. Die ET1-, ET2- und ET3-Transformanden wurdenweiterhin vegetativ vermehrt und im Anschluß für Studien zur Expression der APS-Reduktaseaus C. roseus verwendet.

Tab. 4: Effizienz der Agrobakterien-vermittelten Transformation von N. tabacum beiVerwendung binärer Vektorplasmide für die APS-Reduktase aus C. roseusAngegeben ist jeweils die Anzahl der durch die PCR identifizierten echten Transformanden (ET1-, ET2- und

ET3-Transformanden), der Kontaminanten und „falsch positiven“ Pflanzen. Die Effizienz ergibt sich aus der

Anzahl echter Transformanden zur Gesamtzahl der analysierten Exemplare.

binäresVektorplasmid

echteTransformanden

Kontaminanten falschPositive

Transformations-effizienz

pBINAr1.R.2.1 47 (ET1) 15 10 65 %

pBINAr2.N.2.13 38 (ET2) 25 5 56 %

pBINAr3.2.17 42 (ET3) 30 12 50 %

2.4.4 Analyse der Transkriptmenge der rekombinanten APS-Reduktase in transgenenNicotiana tabacum Pflanzen

Die N. tabacum Transformanden der Gruppen ET1, ET2 und ET3 enthielten in ihrem Genomdie T-DNA der binären Plasmidkonstrukte pBINAr1.R.2.1, pBINAr2.N.2.13 bzw.pBINAr3.2.17 (vgl. 2.4.3). Um die Expression der transgenen APS-Reduktase in diesenTransformanden zu quantifizieren, wurde zunächst die Transkriptmenge analysiert.

Es wurde deshalb versucht, die mRNA für die rekombinante APS-Reduktase in Gesamt-RNAPräparationen der Tabaktransformanden im Northern-Blot (vgl. 5.10.8) mit einer par-homologen, Digoxygenin-markierten Sonde (CrparDig, vgl. 5.7) nachzuweisen. Als Kontrollewurde eine zur cDNA actin1 aus N. tabacum homologe, Dig-markierte Sonde

Ergebnisse 42

(NtactinDig, vgl. 5.7) verwendet. Die genomische Sequenz, das tob71-Gen für Aktin1 zählt zuden „Haushalts“-Genen der Pflanze, wird konstitutiv in moderater Menge exprimiert und solltedeshalb im Northern-Blot detektierbar sein.Weder die Hybridisierung der par-homologen noch der actin1-homologen Sonde an Gesamt-RNA aus N. tabacum Transformanden führte zur Detektion eines Signals im Northern-Blotund ließ vermuten, daß die Empfindlichkeit des Dig-Detektionssystems zum Nachweis derspezifischen mRNAs in Gesamt-RNA-Präparationen zu gering war.

Zur Analyse der Transkriptmenge für die rekombinante APS-Reduktase in transgenenTabakpflanzen wurde daher die relative RT-PCR (Gaudette und Crain, 1991, Flemming et al.,1996) verwendet. Dabei erfolgte eine simultane reverse Transkription der mRNA für die APS-Reduktase und der Aktin1-mRNA aus N. tabacum als interne Kontrolle, und die anschließendeCoamplifizierung der gebildeten cDNAs. Die Coamplifizierung der konstitutiv exprimierten,internen Kontrolle wurde zur Probennormalisierung herangezogen, so daß dieTranskriptmengen für die APS-Reduktase in den Transformanden einer Gruppe (ET1, ET2oder ET3, vgl. 2.4.3) untereinander vergleichbar waren.In Tab. 5 sind die zur relativen RT-PCR-Analyse der drei Transformandengruppen jeweilsverwendeten Oligonukleotide, die optimierten Reaktionsbedingungen und Produkte derPolymerase-Kettenreaktion aufgelistet. Die Synthese und Vervielfältigung der cDNA für dietransgene APS-Reduktase erfolgte dabei spezifisch durch die Oligonukleotide PRpar6HisBambzw. PRpETpar10His (vgl. 5.7), die mit den kodierenden Regionen des Histidin-Hexapeptidsbzw. Dekapeptids des transgenen Produktes paarten und keine Entsprechungen im TabakWildtyp aufwiesen.

Tab. 5: Oligonukleotide, Reaktionsbedingungen und Produkte der RT-PCR-Analyse derN. tabacum Transformanden der Gruppen ET1, ET2 und ET3Die reverse Transkription erfolgte gemäß Kapitel 5.10.6 mit den reversen Oligonukleotiden zur cDNA-

Synthese. Der PCR-Reaktionsansatz (100 µl) enthielt 2 µl der Erststrangsynthese, 1 x Reaktionspuffer, 2,5 U

DNA-Polymerase, 200 µM dNTPs und die angegebenen Oligonukleotidpaare in der aufgezeigten Menge. Nach

einer Anfangsdenaturierung (94°C, 3 min) folgten 20 - 40 Wiederholungen des angegebenen PCR-Zyklus. Die

Oligonukleotidsequenzen sind Kapitel 5.7 zu entnehmen.

Transformanden-

gruppe

reverse Oligonukleotide

zur cDNA-Synthese

Oligonukleotidpaare

zur PCR

PCR-

Zyklus

Produkte

ET1 PRpar6HisBam

PRactinrev

PRparSeq2/ PRpar6HisBam

PRactinfwd/PRactinrev

(je 10 pmol)

94°C 1 min

58°C 1 min

72°C 70 s

1.071 Bp

605 Bp

ET2 PRpar6HisBam

PRactinrev

PRparSeq2/ PRpar6HisBam

PRactinfwd/PRactinrev

(je 10 pmol)

94°C 1 min

58°C 1 min

72°C 70 s

1.071 Bp

605 Bp

ET3 PRparEnd

PRactinrev

PRpETpar10His/ PRparEnd

(je 15 pmol)

PRactinfwd/PRactinrev

(je 10 pmol)

94°C 1 min

60°C 1 min

72°C 80 s

1.305 Bp

605 Bp

Ergebnisse 43

In Abb. 25 sind die PCR-Produkte nach reverser Transkription von Gesamt-RNA je einerET1-, ET2- und ET3-Transformande und die durchgeführten Kontrollen dargestellt.

Abb. 25: Coamplifizierung revers transkribierter mRNA für die rekombinante APS-Reduktaseaus C. roseus und Aktin1 aus N. tabacumAgarosegelelektrophorese (0,8 % (w/v), Ethidiumbromidfärbung) der Produkte (30 - 200 ng) aus PCR-

Reaktionen mit folgenden Matrizen: 1 - 3: cDNA der reversen Transkription von Gesamt-RNA einer ET1- (1),

ET2- (2) und ET3-Pflanze (3); 4: cDNA der reversen Transkription von Gesamt-RNA aus einer ET1-Pflanze

(Reaktionsansatz ohne Reverse Transkriptase); 5: cDNA der reversen Transkription von Gesamt-RNA aus

N. tabacum SNN Wildtyp; 6: Plasmid pBINAr1.R.2.1; 7: Plasmid pBINAr2.N.2.13; 8: Plasmid pBINAr3.2.17;

9: Plasmid pBSSKactin1; 10: genomische DNA aus einer ET1-Transformanden, R: zur RT-PCR eingesetzte

Gesamt-RNA aus N. tabacum (ca. 1,4 µg), G: zur PCR verwendete genomische DNA aus N. tabacum (ca.

50 ng), M: λ-DNA EcoRI/HindIII (500 ng). Reverse Transkription und PCR nach Angaben in Tab. 5.

Durch die RT-PCR wurde aus der Gesamt-RNA (Spur R) einer ET1- bzw. ET2-Transformande ein 1.071 Bp großes Fragment der cDNA für die (His)6-APS-Reduktase unddas 605 Bp große Fragment der actin1-cDNA coamplifiziert (Spur 1, 2). Aus der Gesamt-RNA einer ET3-Pflanze wurde neben dem actin1-Fragment das 1.305 Bp große Fragment dercDNA für die (His)10-APS-Reduktase vervielfältigt (Spur 3). Als Negativkontrollen diente jeein Ansatz ohne Reverse Transkriptase (beispielhaft in Spur 4). Aus der N. tabacum Wildtyp-RNA wurde nur das Fragment für die actin1-cDNA amplifiziert (Spur 5). Als Positivkontrollendienten in der PCR die zur Tabaktransformation verwendeten Plasmide bzw. das PlasmidpBSSKactin1 mit der cDNA für Aktin1 aus N. tabacum (Spuren 6 - 9). Die RNA-Präparationen waren frei von genomischer DNA, da in keiner RT-PCR das Intron-haltige,929 Bp große genomische Fragment des tob71-Gens für Aktin1 vervielfältigt wurde. AlsPositivkontrolle hierfür erfolgte die Coamplifizierung des tob71-Fragments und der cDNA fürdie (His)6-APS-Reduktase (Spur 10) aus genomischer DNA (Spur D) einer ET1-Transformande.

Ergebnisse 44

Nach Halford (1999) wird bei der RT-PCR die Effizienz der reversen Transkription alskonstant angesehen. Um über die RT-PCR-Produktmengen auf die Transkriptmengenschließen zu können, war zu gewährleisten, daß die Produktmengen der Polymerase-Kettenreaktion in direkter Korrelation zur eingesetzten cDNA-Menge standen. Daher sollte diePCR beendet werden, wenn sowohl die cDNA par für die transgene APS-Reduktase als auchdie actin1-cDNA noch exponentiell amplifiziert wurden und durch Agarosegelelektrophoreseund Ethidiumbromidfärbung detektierbar waren.Zur Festlegung dieses linearen PCR-Bereiches wurde die Zyklenzahl variiert währendsämtliche weiteren Reaktionsbedingungen konstant blieben. Die Bestimmung des linearenBereiches ist in Abb. 26 beispielhaft für die Coamplifizierung der cDNAs aus einer reversenTranskription von Gesamt-RNA einer ET1-Transformanden dargestellt. Nach Beendigung derangegebenen Zyklen wurden Aliquots der Ansätze im Agarosegel aufgetrennt. ZurQuantifizierung der PCR-Produktmenge wurde mit Hilfe des Computerprogramms RaytestTINA 2.09 die Bandenintensität der ethidiumbromidgefärbten Produkte (Abb. 26 B)densitometrisch ermittelt. Die gemittelten Werte aus 3 Bestimmungen mit höchstens 7 %Abweichung wurden logarithmisch gegen die entsprechende Zyklenzahl aufgetragen(Abb. 26 A). Die Linearität dieser Quantifizierung wurde mit bekannten DNA-Mengen derPCR-Produkte abgesichert. Dabei war die Bandenintensität direkt proportional zureingesetzten DNA-Menge (nicht dargestellt).

Abb. 26: Ermittlung des linearen PCR-Bereichs zur Coamplifizierung dercDNAs par und actin1(A) Abhängigkeit der logarithmischen

Bandenintensität von der Zyklenzahl der

PCR. actin1: PCR-Produkt der cDNA actin1,

par: PCR-Produkt der transgenen cDNA par,

OD: optische Dichte, Bkg: Hintergrund

(B) Agarosegelelektrophorese (0,8 % (w/v),

Ethidiumbromidfärbung) der PCR-Produkte

nach 22 - 40 Zyklen. Der PCR-Ansatz

entsprach den Angaben in Tab. 5 mit 2 µl

Erststrangsynthese von Gesamt-RNA einer

ET1-Pflanze als Matrize. Aufgetrennt wurden

15 µl der nach Zyklus 22 - 28 gestoppten

Ansätze, 10 µl der nach Zyklus 30 - 34

beendeten Ansätze und 7,5 µl der nach 36 -

40 Zyklen gestoppten Reaktionen.

Für die RT-PCR mit Gesamt-RNA aus ET1- und ET2-Transformanden wurde einelinearisierbare Abhängigkeit der Amplifizierung der par- und actin1-cDNA bis PCR-Zyklus 30beobachtet. Die exponentielle Coamplifizierung der gebildeten cDNAs aus ET3-Individuenerfolgte bis PCR-Zyklus 29.

Ergebnisse 45

Unter diesen Voraussetzungen wurden durch die RT-PCR 22 ET1-Transformanden, 20 ET2-und 16 ET3-Pflanzen untersucht. Zur Probennormalisierung wurde jeweils die relativeIntensität des RT-PCR-Signals für die amplifizierte par-cDNA zur internen actin1-cDNA-Kontrolle (100 %) ermittelt (vgl. 7.6). Diese Relativierung machte die Transkriptmengen despar-Genproduktes in den Transformanden einer Gruppe (ET1, ET2 oder ET3) untereinandervergleichbar und ermöglichte eine Auswahl putativer Überexprimierer (vgl. 7.6), die imfolgenden weiter analysiert wurden. Es konnten auch solche Klone identifiziert werden, indenen trotz der genomischen Integration der T-DNA durch die RT-PCR kein Transkript fürdas par-Genprodukt nachweisbar war. Bei diesen Klonen wurde die Anzahl der Zyklen derPCR auf 40 erhöht.In Abb. 27 ist beispielhaft die relative Quantifizierung der RT-PCR-Podukte aus Gesamt-RNAeiniger ET1-Pflanzenklone dargestellt.

Abb. 27: Relative Quantifizierung der Transkriptmenge der transgenen APS-Reduktase inverschiedenen ET1-Transformanden von N. tabacumAgarosegelelektrophorese (0,8 % (w/v), Ethidiumbromidfärbung) der PCR-Produkte revers transkribierter

mRNA für die transgene APS-Reduktase (par) und Aktin1 (actin). Die Bandenintensitäten wurden

densitometrisch ermittelt. Zur Relativierung der Signale für das Produkt der par-cDNA wurde die

Bandenintensität des actin1-Produktes jeweils gleich 100 % gesetzt. n. d.: kein par-cDNA Produkt detektierbar.

2.4.5 Immunologischer Nachweis der rekombinanten APS-Reduktase in transgenenTabakpflanzen

Durch die relative RT-PCR wurden aus jeder Transformandengruppe N. tabacum Pflanzen alsputative Überexprimierer ausgewählt (s. u.), in denen die Expression der transgenen APS-Reduktase im weiteren immunologisch untersucht wurde.Zu diesem Zweck wurden Proteinextrakte aus Blättern der folgenden, 6 Wochen alten Pflanzengewonnen (vgl. 5.11.3):

• ET1-Pflanzen: ET1.1, ET1.3, ET1.7, ET1.14, ET1.17, ET1.25, ET1.55, ET1.57, ET1.64,ET1.70

• ET2-Pflanzen:ET2.10, ET2.11, ET2.25, ET2.51• ET3-Pflanzen:ET3.3, ET3.28. ET3.30, ET3.42

Ergebnisse 46

Da die Transkripte der rekombinanten APS-Reduktase mit Dig-markierten Sonden nichtnachweisbar waren, und nur durch die sensitivere RT-PCR detektiert wurden (vgl. 2.4.4) waranzunehmen, daß auch das Genprodukt erst durch eine Konzentrierung der Proteinextrakteund die Verwendung eines effizienten Western-Transferverfahrens (vgl. 5.13.1) immunologischidentifiziert werden konnte. Die Proteine wurden deshalb durch eine Ammoniumsulfat-Fällung(75 %) konzentriert, in der denaturierenden SDS-PAGE aufgetrennt und nach Michov (1995)auf Nitrocellulose-Membranen transferiert. Bei der Verwendung des α:AR Serums (vgl. 2.3.2)war keine Detektion der transgenen APS-Reduktase möglich. Zur immunologischen Detektiondes transgenen Proteins wurden deshalb einerseits die von Staudinger (2000) angereichertenα:AR Immunglobuline (α:ARIgG, Nachweisgrenze: 10 ng gereinigte (His)10-APS-ReduktasePar∆1) und andererseits monoklonale Penta-His-Antikörper (α:HisIgG, Nachweisgrenze: 2 ngeines Oligo-Histidin-Fusionsproteins) verwendet (vgl. 5.13.2).Als Referenzprotein für die transgene APS-Reduktase mit C-terminalem Histidin-Hexapeptidin ET1- und ET2-Transformanden wurde vom Plasmid pBTac2.N.2 (vgl. 5.6) in E. coli JM109eine (His)6-APS-Reduktase exprimiert und durch IMAC gereinigt (ohne Abbildung). Diesesbakterielle Produkt entsprach in seiner Primärstruktur dem voraussichtlichen Produkt imCytosol der ET2-Pflanzen. Durch eine Abspaltung des Transitpeptids in dem vermutlichplastidären Produkt der ET1-Pflanzen war ebenfalls ein gleichartiges Polypeptid zu erwarten.Als Positivkontrolle für das transgene Polypeptid im Cytosol der ET3-Pflanzen wurde dasbakteriell exprimierte, gereingte (His)10-Fusionsprotein Par∆1 (vgl. 2.3.2) verwendet. AlsNegativkontrolle wurde zum Immunoblot der Wildtyp-Proteinextrakt eingesetzt.

Die Proteinextrakte der ET1-Pflanzen (ET1.1, ET1.3, ET1.7, ET1.14, ET1.17, ET1.25,ET1.55, ET1.57, ET1.64, ET1.70) lieferten im Western-Blot mit beiden Antikörpernübereinstimmende Immunpräzipitate, die auf ein Vorkommen der transgenen APS-Reduktaseschließen ließen. In den Proteinextrakten aus den ET2- und ET3-Transformanden (ET2.10,ET2.11, ET2.25, ET2.51, ET3.3, ET3.28. ET3.30, ET3.42) konnte trotz der vorhandenenTranskripte (vgl. 2.4.4) durch Western-Blotting kein Immunsignal nachgewiesen werden (ohneAbbildung).

In Abb. 28 sind stellvertretend die detektierten Immunsignale in Extrakten zweier ET1-Transformanden mit den entsprechenden Kontrollen dargestellt.Im Coomassie-Blaugefärbten SDS-Gel dieser aufgetrennten Extrakte (A) wurde im Vergleichzum Wildtypprotein keine erkennbare Überexpression der APS-Reduktase festgestellt. Etwa20 % des Gesamtproteins entsprach der großen Untereinheit der Ribulose-1´-5´-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco) aus N. tabacum.Für den Western-Blot in (B) erfolgte eine Reaktion mit den angereicherten α:ARImmunglobulinen. Die Extrakte der transgenen Tabakpflanzen ET1.3 und ET1.14 (Spuren2, 3) zeigten mit diesem Antikörper im Vergleich zum Wildtyp-Extrakt (Spur 1) verstärkteImmunantworten bei 45 und bei 55 kDa sowie eine schwache Reaktion dazwischen, die in denGrößenbereich der großen Untereinheit der Rubisco fiel. Das berechnete Molekulargewichteiner in ET1-Pflanzen exprimierten (His)6-APS-Reduktase betrug bei der erwartetenProzessierung des Transitpeptids nach Aminosäure 70 (vgl. 2.2.1) 44,9 kDa. Die Referenz, das

Ergebnisse 47

in E. coli exprimierte, gereinigte (His)6-Fusionsprotein mit einem berechnetenMolekulargewicht von 44,6 kDa, zeigte ein starkes Immunsignal bei 48 kDa (Spur P1). Umdas Laufverhalten dieses Fusionsproteins in der SDS-PAGE in Gegenwart einesTabakextraktes zu überprüfen, wurden Wildtyp-Proteinextrakte mit diesem gereinigtenFusionsprotein versetzt. In diesen Proben wurde die Immunantwort bei 45 kDa detektiert(Spur P2) und ließ annehmen, daß das Laufverhalten der (His)6-APS-Reduktase in der SDS-PAGE durch die Ribulose-1´-5´-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco) beeinflußt wird.

Abb. 28: Immunologische Detektion transgener (His)6-APS-Reduktase in Proteinextrakten ausET1-Transformanden von N. tabacum(A) SDS-PAGE (12,5 %, Coomassie-Blaufärbung): M: 10 kDa-Leiter Größenstandard; 1: Proteinextrakt aus

N. tabacum SNN Wildtyp (50 µg); 2: Extrakt aus der Transformande ET1.3 (50 µg); 3: Extrakt aus der

Transformande ET1.14 (50 µg). Rubisco: Ribulose-1´-5´-bisphosphat-Carboxylase.

(B) Immunoblot zu (A), Western-Transfer nach Michov (1995). Zusätzliche Proben: ca. 0,5 µg gereinigte,

(His)6-APS-Reduktase aus E. coli JM109 (P1) und ein N. tabacum SNN Wildtyp-Extrakt, dem etwa 70 ng der

bakteriell exprimierten, gereinigten (His)6-APS-Reduktase zugesetzt waren (P2). α:AR Immunglobuline

(α:ARIgG) 1: 1.000, Alkalische Phosphatase-gekoppelter Sekundärantikörper 1 : 7.500.

(C) wie (B): Penta-His Antikörper (α:HisIgG) 1 : 1.000, Alkalische Phosphatase-gekoppelter Sekundär-

antikörper 1 : 7.500.

In (C) wurden die Proben mit dem monoklonalen Penta-His-Antikörper (α:His IgG) inkubiert.In den Extrakten der ET1-Transformanden (Spuren 2, 3) und den Positivkontrollen (SpurenP1, P2) wurden übereinstimmende Immunsignale zum Blot in (B) nachgewiesen. Im Wildtyp-Protein als Negativkontrolle war mit diesem Antikörper keine Reaktion detektierbar (Spur 1).Demnach lag die Vermutung nahe, daß die 45 und die 55 kDa immunpositiven Proteinbandender transgenen (His)6-APS-Reduktase aus C. roseus entsprechen.

Zum Vergleich der immunreaktiven Proteinmenge in den Extrakten der TransformandenET1.1, ET1.3, ET1.7, ET1.14, ET1.17, ET1.25, ET1.55, ET1.57, ET1.64 und ET1.70wurden gleiche Proteinmengen dieser Extrakte gemeinsam geblottet und mit dem Penta-HisAntikörper inkubiert.

Ergebnisse 48

Die immunpositiven Signale im Western-Blot wurden densitometrisch (Raytest TINA 2.09)erfaßt und sind in Tab. 6 als prozentuales Verhältnis zum Immunsignal der gleichzeitigtransferierten, bakteriell exprimierten und gereinigten (His)6-APS-Reduktase (100 %)angegeben.

Tab. 6: Vergleich der immunreaktiven Proteinmenge im Western-Blot konzentrierterProteinextrakte aus ET1-Transformanden von N. tabacumDie gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteinextrakte (jeweils 42 µg Protein der angegebenen

Transformanden ET1.1 - ET1.70) wurden auf NC-Folie transferiert und mit dem Penta-His-Antikörper

(1 : 1.000) und dem Alkalische-Phosphatase-gekoppelten Sekundärantikörper (1 : 7.500) inkubiert. Die

densitometrisch ermittelten Bandenintensitäten der Immunpräzipitate dienten als Maß für die immunreaktiven

Proteinmengen und sind relativ zur Referenz (ca. 100 ng gereinigte, in E. coli exprimierte (His)6-APS-

Reduktase) angegeben. n. d.: nicht detektierbar.

Probe Referenz T1.1 T1.3 T1.7 T1.14 T1.17

RelativeBandenintensität [%]

100 4,8 7,4 n. d. 50 20

Probe T1.25 T1.55 T1.57 T1.64 T1.70

RelativeBandenintensität [%]

36 31 43 32 3,2

In den Extrakten der Klone ET1.14, ET1.25 und ET1.57 wurden mit relativenBandenintensitäten von 50, 36 und 43 % die stärksten Immunsignale nachgewiesen.

2.4.6 APS-Reduktase-Aktivität in Proteinextrakten transgener Tabakpflanzen

Um die positiven Immunantworten in den Proteinextrakten der ET1-Transformanden (ET1.1,ET1.3, ET1.7, ET1.14, ET1.17, ET1.25, ET1.55, ET1.57, ET1.64, ET1.70) mit einererhöhten APS-Reduktase-Aktivität zu korrelieren, wurde im folgenden die Sulfitbildunggemessen. Durch Verwendung der selben Extrakte für den Immunoblot und die Bestimmungder enzymatischen Aktivität konnten Variationen durch die Proteinisolierung ausgeschlossenwerden.Im Aktivitätstest (vgl. 5.14.2) wurden die für die gereinigte (His)10-APS-Reduktase (Par∆1)ermittelten Reaktionsbedingungen angewendet (vgl. 2.3.3.1). Als Referenz diente dieFreisetzung von [35S]-Sulfit durch Proteinextrakte der Wildtyp Pflanzen. Die der Abb. 29zugrunde liegenden Werte für die spezifische APS-Reduktase-Aktivität wurden für jedePflanze durch eine Mehrfachbestimmung der linear gebildeten Sulfitmenge bei ansteigendenProteinkonzentrationen im Test berechnet und sind zusätzlich relativ zur Wildtyp-Aktivitätangegeben.

Ergebnisse 49

Unter den enzymatisch untersuchten Pflanzen wiesen besonders die Klone ET1.14, ET1.25und ET1.57 eine erhöhte APS-Reduktase-Aktivität im Proteinextrakt auf. Die größte Aktivitätwurde im Extrakt der Transformande ET1.14 gemessen, der im Vergleich zum Wildtypextrakteine 16,7fach höhere spezifische Aktivität zur Sulfitbildung aus APS aufwies.

Abb. 29: Spezifische APS-Reduktase-Aktivität in Proteinextrakten der ET1-Transformandenvon N. tabacumReaktionsansatz: 100 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 20 mM DTT, 0,5 M Na2SO4, 15 µM [35S]-APS

und 5 - 100 µg Proteinextrakt aus den angegebenen Pflanzen. Reaktionsbedingungen: 25°C, 5 min. Die

absoluten Werte für die spezifische Aktivität zur Sulfitbildung sind als Vielfaches der Aktivität des Wildtyps

(Wt) oberhalb der Balken dargestellt.

Ferner wurde die APS-Reduktase-Aktivität in Enzymextrakten der ET2-Transformanden(ET2.10, ET2.11, ET2.25, ET2.51) und der ET3-Klone (ET3.3, ET3.28. ET3.30, ET3.42)bestimmt. In keinem dieser Proteinextrakte war eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhteAPS-Reduktase-Aktivität detektierbar.Weder in den enzymatisch untersuchten Extrakten der ET1-, noch der ET2- oder ET3-Transformanden konnte eine Thioredoxin-abhängige oder -unabhängige Reduktion von[35S]-PAPS (vgl. 5.14.2) nachgewiesen werden.

Die immunpositiven Antikörperreaktionen und die erhöhte APS-Reduktase-Aktivität in denuntersuchten Extrakten der ET1-Transformanden ET1.14, ET1.25 und ET1.57 ließen auf eineExpression der (His)6-APS-Reduktase aus C. roseus in diesen N. tabacum Klonen schließen.

W t E T1 .1

E T1 .3

E T1 .7

E T1 .1 4

E T1 .1 7

E T1 .2 5

E T1 .5 5

E T1 .5 7

E T1 .7 0

150

450

750

1050

1350

SO

[pm

olm

g m

in]

32-

-1

-1

12 ,57

4 ,08

0 ,97

16 ,7

0 ,87

11,8

5 ,1

9 ,9

5 ,5

3 ,4

Ergebnisse 50

Die Pflanzen ET1.57 und ET1.25 unterschieden sich phänotypisch nicht von WildtypIndividuen. Der Klon ET1.14 war dagegen kleinwüchsig, wies stark gestauchte Internodien aufund zeigte bei vegetativer Vermehrung eine vergleichsweise verzögerte Bewurzelung und einverlangsamtes Wachstum. Um über hinreichend Ausgangsmaterial zur Reinigung dertransgenen (His)6-APS-Reduktase zu verfügen, wurde die Transformande ET1.25 genutzt.

2.4.7 Reinigung der in Nicotiana tabacum exprimierten (His)6-APS-Reduktase ausCatharanthus roseus

Zur Reinigung der in planta exprimierten (His)6-APS-Reduktase aus C. roseus im analytischenMaßstab durch die IMAC (vgl. 5.11.4) wurde eine Proteinpräparation (vgl. 5.11.3) aus 4,5 gBlättern der 6 Wochen alten ET1.25-Transformande von N. tabacum verwendet.Die Proteinfraktionen der Aufreinigung wurden durch eine denaturierende SDS-PAGE undWestern-Blotting (Abb. 30) analysiert.

Abb. 30: Reinigung der rekombinant in N. tabacum ET1.25 exprimierten (His)6-APS-Reduktase aus C. roseus(A) SDS-PAGE (12,5 %, Coomassie-Blaufärbung): M: 10 kDa-Leiter Proteinstandard, 1: 50 µg Rohextrakt aus

der ET1.25-Transformande von N. tabacum, 2: 20 µg des Säulendurchlaufs, 3: 1 µg der 15 mM Imidazol-

Waschfraktion, 4: 0,28 µg (His)10-APS-Reduktase (Par∆1), 5: 0,26 µg Referenzprotein (gereinigte, in E. coli

vom Plasmid pBTac2.N.2.3 exprimierte (His)6-APS-Reduktase), 6: 0,79 µg des 50 mM Imidazol-Eluates.

APS-R: APS-Reduktase.

(B) Immunoblot: Die Proteinfraktionen aus (A) wurden auf NC-Folie transferiert [Western-Transfer nach

Michov (1995)], die Folie wurde mit dem Penta-His Antikörper (α:HisIgG) in 1.000facher oder den α:AR

Immunglobulinen (α:ARIgG) in 4.000facher bzw. dem α:AR Serum (α:ARS) in 1.000facher Verdünnung

inkubiert. Alkalische Phosphatase-gekoppelter Sekundärantikörper 1 : 7.500. M: 10 kDa-Leiter oder Dalton

Mark VII-L Proteinstandard; 1, 2, 3 und 6 wie in A; 4: 40 ng (His)10-APS-Reduktase (Par∆1), 5: 70 ng

Referenzprotein.

Ergebnisse 51

Aus 31,3 mg des Zellextraktes der ET1.25-Transformande wurden mit Hilfe der IMAC13,3 µg Protein (0,05 %) eluiert. Im SDS-Gel (Abb. 30 A) konnten in diesem nochinhomogenen Eluat (Spur 6) bei etwa 50 und 52 kDa Proteinbanden identifiziert werden, dieim Western-Blot (Abb. 30 B) sowohl mit dem monoklonalen Penta-His Antikörper(α:HisIgG) als auch mit den α:AR Immunglobulinen (α:ARIgG) und dem α:AR Serum(α:ARS, vgl. 2.3.2) eine Immunantwort lieferten. Bei diesen immunreaktiven Polypeptidenhandelt es sich möglicherweise um verschiedene Reifezustände, Abbauprodukte und/oderModifikationen der exprimierten (His)6-APS-Reduktase, die über das C-terminale Histidin-Hexapeptid an die Matrix gebunden wurden. Im Säulendurchlauf (Spur 2) oder derWaschfraktion (Spur 3) waren mit dem Penta-His Antikörper keine Immunpräzipitatenachweisbar. Bei höheren Imidazol-Konzentrationen (bis 200 mM) wurde kein weiteres,immunreaktives Protein eluiert (nicht dargestellt). Als Positivkontrolle diente das gereinigte, inE. coli exprimierte (His)10-Fusionsprotein Par∆1 (Spur 4, vgl. 2.3.2). Zum Größenvergleichder bakteriell und der in planta exprimierten (His)6-APS-Reduktase wurde als Referenzproteindie vom Plasmid pBTac2.N.2.3 in E. coli exprimierte, gereinigte (His)6-APS-Reduktaseeingesetzt (Spur 5) (vgl. 2.4.5). Das berechnete Molekulargewicht dieses bakteriellexprimierten Polypeptids entsprach mit 44,6 kDa praktisch dem berechneten Wert (44,9 kDa)für eine im Chloroplasten gereifte (His)6-APS-Reduktase in N. tabacum ET1.25. Die apparenteGröße des in E. coli exprimierten Proteins (ca. 48 kDa) stimmte jedoch mit keinerimmunpositiven Bande im Eluat überein. Mit 50 und 52 kDa entsprach das apparenteMolekulargewicht der immunpositiven Signale im Eluat in etwa dem berechnetenMolekulargewicht für eine ungespaltene (His)6-APS-Reduktase (52, 4 kDa).

Durch die Messung der Freisetzung von [35S]-Sulfit aus radioaktiv markiertem APS(vgl. 5.14.2) wurden die Immunsignale in den Proteinfraktionen der Reinigung mit einerAPS-Reduktase-Aktivität korreliert (Tab. 7).

Tab. 7: APS-Reduktase-Aktivität in Proteinfraktionen der Reinigung rekombinant inN. tabacum ET1.25 exprimierter (His)6-APS-Reduktase aus C. roseusReaktionsansatz: 100 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3, 20 mM DTT, 0,5 M Na2SO4, 15 µM [35S]-APS,

0,08 - 30 µg Protein der jeweiligen Fraktion. Reaktionsbedingungen: 25°C, 5 min. Die aufgelisteten Werte für

die spezifische APS-Reduktase-Aktivität wurden für jede Probe durch eine Mehrfachbestimmung der linear

gebildeten Sulfitmenge bei ansteigenden Proteinkonzentrationen im Test berechnet und sind mit ihrer

Standardabweichung angegeben. n. d.: nicht detektierbar.

Proteinfraktion Proteinmenge

[mg]

spezifische Aktivität

[mU mg-1]

Gesamtaktivität

[mU]

Rohextrakt 31,300 0,846 ± 0,054 26,4 ± 1,69

Säulendurchlauf 28,800 n. d. n .d.

15 mM Imidazol-Wasch 0,3720 2,99 ± 0,18 1,11 ± 0,067

50 mM Imidazol-Eluat 0,0133 15,5 ± 0,50 0,21 ± 0,007

Ergebnisse 52

Im Rohextrakt der Transformande ET1.25 wurde eine spezifische APS-Reduktase-Aktivitätvon 0,846 mU mg-1 ermittelt. Im Säulendurchlauf war keine Sulfitbildung meßbar. DieWaschfraktion wies eine spezifische Aktivität von 2,99 ± 0,18 mU mg-1 auf. Diese Aktivitätwar vermutlich auf das orthologe Protein aus N. tabacum zurückzuführen, weil im Western-Blot dieser Fraktion keine Immunreaktion mit dem Penta-His Antikörper detektiert wurde. ImEluat, das gemäß dem Immunoblot die transgene (His)6-APS-Reduktase enthielt, wurde einespezifische APS-Reduktase-Aktivität von 15,5 ± 0,5 mU mg-1 ermittelt. Das entsprach einer18fachen Anreicherung gegenüber dem Rohextrakt. In keiner Säulenfraktion wurde dagegeneine Thioredoxin-abhängige oder -unabhängige PAPS-Reduktion gemessen (nicht dargestellt).

Im Vergleich zu der spezifischen Aktivität der in E. coli exprimierten, gereinigten (His)6-APS-Reduktase als Referenzprotein (v = 2,2 U mg-1, nicht dargestellt) war die Aktivität im Eluatjedoch 140fach geringer.Bei der Betrachtung der Gesamtaktivitäten in den einzelnen Proteinfraktionen war einAktivitätsverlust von 95 % zu verzeichnen. Von ursprünglich 26,4 ± 1,69 mU im Rohextraktentfielen 1,11 ± 0,067 mU auf die 15 mM Imidazol-Waschfraktion. Im Eluat wurde eineGesamtaktivität von lediglich 0,21 ± 0,007 mU ermittelt. Eine Reinigung der in plantaexprimierten (His)6-APS-Reduktase aus C. roseus war demnach möglich, doch mit einemVerlust der enzymatischen Aktivität verbunden.

Diskussion 53

3 Diskussion

Höhere Pflanzen benötigen zur Deckung ihres Schwefelbedarfs anorganisches Sulfat, das fürdie Synthese verschiedener Metabolite und Coenzyme verwendet wird. Der Schwefel wird aufzwei Wegen assimiliert, indem er durch Konjugationsreaktionen nach einer Aktivierung inorganische Moleküle eingebaut oder in einer Folge enzymatischer Schritte über aktiviertesSulfat zu Sulfit und Sulfid reduziert wird.

Die biochemische und molekulare Charakterisierung der Enzyme der Sulfataktivierungund -reduktion ließ in den letzten Jahren auffällige Übereinstimmungen in der Reaktionsfolgeder reduktiven Sulfatassimilation der Mikroorganismen und höheren Pflanzen erkennen(Übersicht in: Schwenn, 1994 und 1997). Dies legte die Vermutung nahe, daß Pflanzen, wieBakterien und Pilze, das aktivierte Sulfat in Form von PAPS zu freiem Sulfit reduzieren. DieseHypothese steht im Widerspruch zu der seit langem postulierten direkten Reduktion von APSzu gebundenem Sulfit (Übersicht in: Schmidt und Jäger, 1992, Schiff et al., 1993). Aufgrundfehlender molekularer Daten zu einer pflanzlichen PAPS-Reduktase oder der APS-Sulfotransferase blieb die sulfitbildende Reaktion in höheren Pflanzen umstritten. Als erstegenetische Informationen wurden in diesem Zusammenhang cDNAs aus Catharanthus roseusund Arabidopsis thaliana isoliert, deren abgeleitete Genprodukte Homologien zu mikrobiellenPAPS-Reduktasen aufweisen. (Uhrig, 1996, Gutierrez-Marcos et al., 1996, Setya et al., 1996).Die Identität der Genprodukte als PAPS-Reduktase wurde aufgrund vorläufiger enzymatischerDaten und der funktionellen Komplementation APS-Kinase-defizienter Mutanten vonS. cerevisiae und E. coli in Frage gestellt (Prior, 1996, Gutierrez-Marcos et al., 1996, Setya etal., 1996). Diese ersten experimentellen Befunde deuteten demgegenüber auf eine Funktion derGenprodukte als Adenosin-5´-phosphosulfat (APS)-Reduktasen hin.Zu Beginn dieser Arbeit lagen noch keine detaillierten strukturellen und biochemischen Datenzu diesen pflanzlichen Genprodukten vor. Ebensowenig konnten Aussagen zur Funktion,subzellulären Verteilung und insbesondere zum physiologischen Stellenwert der Proteinein planta getroffen werden. In dieser Hinsicht wurde in der vorliegenden Arbeit dasGenprodukt der cDNA par aus Catharanthus roseus auf der Grundlage computergestützterStrukturdaten mit molekularbiologischen, biochemischen und immunologischen Methodenuntersucht.

Ein elementarer Aspekt dieser Arbeit lag in der Klärung der enzymatischen und molekularenFunktion des Proteins in vitro. Das rekombinant in Escherichia coli exprimierte Protein wurdestrukturell und funktionell analysiert und konnte als APS-Reduktase charakterisiert werden.Die Ermittlung der biochemischen Daten bildete eine Basis zur Bewertung des Enzyms alsAPS-Reduktase in der Reaktionsfolge der pflanzlichen assimilatorischen Sulfatreduktion. Dadie Synthese eines Pflanzenenzyms einer Vielzahl posttranslationaler Prozesse unterliegenkann, die erst zum physiologisch funktionsfähigen Polypeptid führen, sollte darüber hinaus dasnative Pflanzenprodukt betrachtet werden. Wegen der Unzugänglichkeit des nativen Proteinswurden transgene Tabakpflanzen erzeugt, die die APS-Reduktase aus C. roseusüberexprimieren. Dadurch wurde die Voraussetzung geschaffen zur Untersuchung derFunktion und Relevanz des Proteins in planta.

Diskussion 54

3.1 Die cDNA par und ihr Genprodukt die APS-Reduktase aus Catharanthus roseus

Als Grundlage zur enzymatischen und molekularen Charakterisierung der APS-Reduktasein vitro diente die cDNA par aus einer heterotrophen Zellkultur von C. roseus (Uhrig, 1996).Die in der vorliegenden Arbeit korrigierte Nukleotidsequenz und das abgeleitete Genprodukt(vgl. 2.1) wurden einer Untersuchung mit gängigen computergestützten Analyseverfahrenunterzogen.Die Nukleotidsequenz kodiert für ein Genprodukt aus 464 Aminosäuren mit einem abgeleitetenMolekulargewicht von 51,6 kDa und dem isoelektrischen Punkt bei pH 6.07 (vgl. 2.2.1). DasGenprodukt ist zu 70 - 75 % identisch mit den Homologa aus Arabidopsis thaliana (Gutierrez-Marcos et al., 1996, Setya et al., 1996) und findet in Teilbereichen mit Identitäten von22 - 28 % Entsprechungen in den mikrobiellen PAPS-Reduktasen und den Proteindisulfid-Isomerasen (PDI) (vgl. 2.2.1.1). In dieser Arbeit konnten signifikante Übereinstimmungen dervorhergesagten Sekundärstruktur der APS-Reduktase zur PAPS-Reduktase aus E. coli undder N-terminalen Thioredoxin-ählichen Domäne der menschlichen PDI identifiziert werden(vgl. 2.2.2). Ferner wurde von Lillig (unveröffentlicht) ein 3D-Modell der PAPS-Reduktase-homologen Domäne der APS-Reduktase entwickelt, in dem dieser Bereich des Proteins unddie E. coli PAPS-Reduktase sehr ähnliche Tertiärstrukturen aufweisen. Diese Vorhersagenlassen zur Klassifizierung der APS-Reduktase trotz der eher geringen Identitäten derPrimärstruktur auf ein Protein mit Übereinstimmungen zu den mikrobiellen PAPS-Reduktasenund den eukaryotischen Proteindisulfid-Isomerasen (PDI) schließen. Für die PAPS-Reduktaseaus E. coli und die GMP-Synthetase wurde gezeigt, daß Proteine mit deutlich geringererIdentität in der Primärstruktur entsprechende Sekundär- und Tertiärstrukturen aufweisenkönnen und ähnlichen Funktionsprinzipien unterliegen (Savage et al., 1997).Aktuell wurden auch APS-Reduktasen aus Brassica juncea (Heiss et al., 1999) und Lemnaminor (Suter et al., 2000) veröffentlicht, deren Primärstrukturen zu 71 bzw. 67 % identischsind mit der Sequenz aus C. roseus. Allen pflanzlichen Polypeptiden gemeinsam ist eineN-terminale Präsequenz, die sich hieran anschließende PAPS-Reduktase-homologeCore-Domäne und die C-terminale-Extension mit Homologien zu den Proteinen derThioredoxin-Superfamilie.

3.2 In vitro Funktion der APS-Reduktase aus Catharanthus roseus

3.2.1 Funktion des Transitpeptids zum Chloroplastenimport

Kernkodierte Proteine können N-terminale Präsequenzen besitzen, die den Import in dieentsprechenden Zellkompartimente determinieren und in der Regel anschließend abgespaltenwerden. Für das abgeleitete Genprodukt der cDNA par wird eine Lokalisation imChloroplasten vorhergesagt (PSORT, Nakai und Kanehisa, 1992). Dabei ist ein suborganellesVorkommen im Stroma wahrscheinlich (vgl 2.2.1). Die speziell auf pflanzliche Proteineanzuwendenden Algorithmen TargetP V1.0 (Emanuelsson, eingreicht) und ChloroP V1.1(Emanuelsson et al., 1999) klassifizieren die ersten 70 Aminosäuren der APS-Reduktase alschloroplastidäres Transitpeptid mit einer Spaltstelle im Konsensusmotiv VPS70↓A. Diese

Diskussion 55

Spaltstelle erfüllt die von Gavel und Heijne (1990) beschriebenen Kriterien einersemikonservierten Erkennungssequenz für eine stromäre Chloroplastenprotease weitestgehend.Gemäß der Sekundärstrukturvorhersage mit dem Programm 3D-PSSM (Fischer et al., 1999,Kelley et al., 1999) und dem Algorithmus nach Chou und Fasman (1978) ist auch die vonBassam et al. (1994) beschriebene Ausbildung eines β-Faltblattes als sterische Voraussetzungfür die Spaltung im Bereich der Aminosäurefolge gegeben. Als Konsequenz der Vorhersagenkann eine Lokalisation der APS-Reduktase im Chloroplastenstroma postuliert werden. Esbleibt jedoch zu berücksichtigen, daß die cDNA par aus einer heterotrophen Zellkulturstammte, die keine entwickelten Chloroplasten, sondern Proplastiden enthält.

Das par-Genprodukt konnte in der vorliegenden Arbeit in vitro in mature Chloroplasten vonP. sativum importiert werden (vgl. 2.3.1). Dies befürwortet die Prognosen zur Funktion derPräsequenz als Transitpeptid und zum Vorkommen der APS-Reduktase im Chloroplasten einerdifferenzierten Pflanze. Eine eindeutige Evidenz für die subzelluläre Verteilung des Proteinskann jedoch nur durch den Nachweis in organello erbracht werden und wird dahingehend inKapitel 3.3 erörtert. Für die vorhergesagte singuläre Spaltung des Proteins an derProzessierungstelle VPS70↓A und eine daraus abgeleitete suborganelle Lokalisation imChloroplastenstroma spricht überdies der Befund, daß ausgehend von dem in vitrotranslatierten Protein in Erbsenchloroplasten nur ein Prozessierungsprodukt von 45 kDanachgewiesen wurde. Das berechnete Molekulargewicht einer durch N-terminale Spaltungnach Aminosäure 70 gereiften APS-Reduktase stimmt mit 44,1 kDa damit überein.

Aufgrund dieser Daten ist anzunehmen, daß die APS-Reduktase in ihrer funktionellen Form alsprozessiertes, 44 kDa großes Protein vorliegt. Die Funktionalität des N-terminal um dieTransitsequenz deletierten Polypeptids konnte von Prior (1996) in ersten Messungen durch dievergleichende Bestimmung der APS-Reduktase-Aktivität des deletierten und des vollständigenProteins bestätigt werden. Darüber hinaus gelang die funktionelle Komplementation Cystein-auxotropher Mutanten von S. cerevisiae durch eine 5`-verkürzte par-cDNA für dieAPS-Reduktase ohne Transitpeptid. Die Komplementation sowohl des APS-Kinase-Defektesder Hefemutante MET14 als auch der PAPS-Reduktase-Defizienz der S. cerevisiae MutanteMET16 wurden auf eine direkte Reduktion von APS durch das par-Genproduktzurückgeführt.

Auch die homologen Proteine aus A. thaliana, B. juncea und L. minor weisen N-terminalePräsequenzen auf. In den APS-Reduktasen sind die Transitpeptide eher uneinheitlich währenddie Core-Domänen und die C-terminalen Extensionen sehr starke Übereinstimmungenaufweisen. Diese Befunde deuten ebenfalls darauf hin, daß der physiologisch funktionelle Teildieser Proteine durch Abspaltung des Transitpeptids freigesetzt wird. Aus L. minor wurdeaktuell eine native APS-Reduktase isoliert und N-terminal ansequenziert (Suter et al., 2000).Der sequenzierte Bereich stimmte dabei mit dem von der cDNA abgeleiteten Genproduktüberein, das durch Abspaltung des Transitpeptids entstünde und unterstützt damit dieVorstellung von einer N-terminalen Prozessierung zum maturen, biologisch aktiven Protein.

Diskussion 56

3.2.2 Funktion des par-Genproduktes als Glutathion-abhängige APS-Reduktase

Die Charakterisierung der enzymatischen Aktivität und der biochemischen Eigenschaften einesGenproduktes dient der Klärung seiner Identität und Funktion.Zur enzymatischen und molekularen Darstellung der APS-Reduktase aus C. roseus wurde daspar-Genprodukt ohne das Tansitpeptid heterolog in E. coli als (His)10-Fusionsprotein (Par∆1)exprimiert und bis zur Homogenität gereinigt. Das gereinigte Protein diente zur Synthese einespolyklonalen Antiserums, das in Extrakten bakterieller Expressionskulturen eine hoheSpezifität zum Antigen aufwies (vgl. 2.3.2). Die Verwendung dieses Serums zurIdentifizierung eines nativen Proteins in situ wird in Kapitel 3.3 diskutiert.Für das rekombinante Protein wurde ein apparentes Molekulargewicht von 58 kDa bestimmt,das somit um 10 kDa vom berechneten Molekulargewicht (48,7 kDa) abweicht. Die Mobilitätin der SDS-PAGE könnte durch das Histidin-Dekapeptid und/oder strukturelle Eigenschaftender APS-Reduktase beeinflußt werden. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, daß auch fürdie als (His)10-Fusion exprimierte Core-Domäne (Par∆2, vgl. 2.3.4.1) eine Differenz von10 kDa zwischen dem apparenten und berechneten Molekulargewicht beobachtet wurde.

Zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der APS-Reduktase wurde dieReaktionsgeschwindigkeit des rekombinanten Proteins in Abhängigkeit von APS und denReduktionsmitteln Dithiothreitol (DTT) und Glutathion (GSH) unter steady state Bedingungenbestimmt. DTT fungierte in der Reaktion als artifizieller Elektronendonor. Im Hinblick auf einephysiologisch relevante Reaktion werden im weiteren die GSH-abhängigen Konstantendiskutiert, die sich nur wenig von den DTT-abhängigen Werten unterscheiden (vgl. 2.3.3.3 und2.3.3.4).Für APS wurde mit dem physiologischen Reduktionsmittel GSH eine Affinitätskonstante Km

von 2,5 µM bestimmt. Es wurde eine apparente Vmax von 2,6 U mg-1 ermittelt, die einermolekularen Aktivität von 126 min-1 entspricht. Die verfügbare APS-Konzentration imChloroplasten ist bisher nicht bekannt, wird aber aufgrund der thermodynamisch und kinetischungünstigen APS-Synthese durch die ATP-Sulfurylase (Osslund et al., 1982) und ihrer starkenProduktinhibition (Seubert et al., 1985, Renosto et al., 1993), sowie der Labilität des APS beizellulärem pH als sehr gering eingeschätzt (Balharry und Nicholas, 1970, Schwenn, 1994,Schwenn, 1997, Hell, 1997). Um über die Affinitätskonstante Aussagen zu erzielbarenUmsatzraten der APS-Reduktase treffen zu können, wird eine Bestimmung derAPS-Konzentration im Chloroplasten erforderlich.Die Affinitätskonstante für GSH wurde in der vorliegenden Arbeit mit Km = 3 mM ermittelt beieiner apparenten Maximalgeschwindigkeit von 3,5 U mg-1, die einer Wechselzahl von 170 min-1

entspricht. Die APS-Reduktase ist wie bereits erörtert vermutlich im Chloroplasten lokalisiert.In diesem Zellkompartiment wird für reduziertes GSH eine Konzentrationen von 3 - 10 mMangenommen (Foyer und Halliwell, 1976, Andersen et al., 1983), die damit ausreichend wäre,um mindestens eine halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit zu erzielen. Daher kann GSH invivo als Elektronendonor der pflanzlichen APS-Reduktase fungieren.Bick und Mitarbeiter (1998) schlagen für die APS-Reduktase aus A. thaliana ebenfalls GSHals Elektronendonor vor, und ermittelten einen Km-Wert von 0,6 mM. Die kodierende cDNA(apr) dieses Enzyms aus A. thaliana wurde wie die par-cDNA durch funktionelle

Diskussion 57

Komplementation einer PAPS-Reduktase-defizienten E. coli Mutante (cysH-) isoliert (Setya etal., 1996). In weiteren in vivo Studien wurde gezeigt, daß eine funktionelle Komplementationder Cystein-Auxotrophie der E. coli cysH--Mutante nur dann erfolgte, wenn der Stamm überGlutathion verfügte (Bick et al., 1998). Die Autoren schlagen ferner in der C-terminalenDomäne der APS-Reduktase eine Bindestelle für GSH vor. Diese Ergebnisse unterstützen dieAnnahme, daß es sich bei GSH um den physiologischen Elektronendonor der APS-Reduktasehandelt, der seinerseits im Licht durch die NADPH-abhängige Glutathion-Reduktase mitElektronen versorgt wird.

Sulfit als Reaktionsprodukt der APS-Reduktase wurde in der vorliegenden Arbeit nachSchwenn und Schriek (1987) im Aktivitätstest nachgewiesen. Von C. Lillig (persönlicheMitteilung) wurde AMP als Produkt der APS-Reduktion durch eine „reversed phase“-HPLCnach Schwenn und Jender (1980) identifiziert. Für die APS-Reduktase aus C. roseus kanndaher die folgende Reaktion postuliert werden:

APS2- + 2 GSH → SO32- + 2 GSSG + AMP + 2 H+

3.2.3 Übereinstimmungen von APS-Reduktase und APS-Sulfotransferase

Seit langem wird in der Literatur eine APS-Sulfotransferase-Reaktion beschrieben, bei derdurch die Übertragung der aktivierten Sulfatgruppe auf den Thiolrest eines Trägermolekülsdie Reduktion zum Sulfit erfolgt (Abrams und Schiff, 1973, Schmidt, 1973). Als Produktdieser Reaktion wird ein im Thiosulfonat gebundenes Sulfit beschrieben. Die Natur desTrägermoleküls war bislang nicht bekannt. Es wurde jedoch vorgeschlagen, daß es sich hierbeium GSH handeln könnte (Tsang und Schiff, 1978b). Bei der Bestimmung der enzymatischenAktivität der APS-Sulfotransferase wurde entsprechend der APS-Reduktase der Umsatz vonsäureflüchtigem [35S]-APS zu [35S]-Sulfit gemessen. Das Trägermolekül wurde dabei in vitrodurch DTT oder GSH ersetzt (Übersicht in: Brunold, 1990). Daher ist denkbar, daß diebestimmte APS-Sulfotransferase-Aktivität eine Funktion der APS-Reduktase sein könnte. Indiesem Zusammenhang ist anzumerken, daß Sulfit als Reaktionsprodukt der APS-Reduktaseals hochreaktives Nukleophil leicht mit oxidiertem Glutathion (GSSG) reagieren und imS-Sulfoglutathion gebundenes Sulfit (GSSO3) bilden kann. Andererseits reagiertSulfoglutathion auch nichtenzymatisch mit GSH, und dabei wird Sulfit freigesetzt (Abrams undSchiff, 1973).Weitere Indizien für eine Übereinstimmung von APS-Sulfotransferase-Aktivität und APS-Reduktase liegen darin, daß die APS-Reduktase vermutlich im Chloroplasten lokalisiert ist(vgl. 2.3.1), und in diesem Zellkompartiment auch die APS-Sulfotransferase-Aktivitätdetektiert wurde (Schwenn et al., 1976, Frankhauser und Brunold, 1978). Ferner wurde eineerhöhte APS-Sulfotransferase-Aktivität aus Sulfatmangel-adaptierten Pflanzen extrahiert(Brunold et al., 1987), und von Uhrig (1996) und Gutierrez-Marcos und Mitarbeitern (1996)wurde unter Sulfatmangel eine vermehrte Transkriptmenge der APS-Reduktase nachgewiesen.

Diskussion 58

Das berechnete Molekulargewicht für die prozessierte APS-Reduktase aus C. roseus beträgt44 kDa und entspricht damit annähernd der relativen molekularen Masse von 43 kDa, die fürdas Monomer der gereinigten APS-Sulfotransferase aus Porphyra yezoensis ermittelt wurde(Kanno et al., 1996) und auch für eine APS-Sulfotransferase aus Spinat berichtet wird (Araund Sekiya, 1996). Neben den übereinstimmenden Molekulargewichten von APS-Reduktaseund APS-Sulfotransferase können auch Kongruenzen der biochemischen Eigenschaften zumEnzym aus P. yezoensis festgestellt werden. In Übereinstimmung zur APS-Reduktase (Par∆1)mit einer apparenten Michaelis-Konstante Km(APS) = 2,5 µM (vgl. 2.3.3.3) wurde für dieAPS-Sulfotransferase eine Affinitätskonstante für das Substrat APS von 2,1 µM ermittelt undauch die Km-Werte für DTT und GSH sind sehr ähnlich (Kanno et al., 1996). Wie bei der APS-Reduktase (vgl. 2.3.3.2) wurde eine maximale Sulfitbildung bei Verwendung derReduktionsmittel DTT und GSH beobachtet, während mit Cystein nur 2 % der DTT-abhängigen Reaktionsgeschwindigkeit erzielt wurde. Darüber hinaus fallen signifikanteÄhnlichkeiten im alkalischen pH-Optimum und der Abhängigkeit der enzymatischen Aktivitätvon anorganischen Salzen (Na2SO4) auf, so daß nahe liegt, daß es sich bei der APS-Reduktaseund der APS-Sulfotransferase um orthologe Genprodukte handelt. Diese Hypothese wirdaufgrund der Befunde zur APS-Reduktase aus A. thaliana auch von Bick und Leustek (1998)in Betracht gezogen.

In Hinblick auf die Übereinstimmung von APS-Reduktase und APS-Sulfotransferase ist auchdie kürzliche Isolierung einer APS-Reduktase aus Lemna minor hilfreich. Von Suter undMitarbeitern (2000) wurde ein natives Enzym gereinigt, das zuvor als APS-Sulfotransferasebeschrieben wurde (Brunold et al., 1987). Das gereinigte Enzym bildete als Reaktionsproduktim wesentlichen freies Sulfit und nicht S-Sulfoglutathion. Das abgeleitete Genprodukt derkodierenden cDNA ist ein Homolog der APS-Reduktasen aus C. roseus, A. thaliana undB. juncea, so daß die APS-Sulfotransferase von den Autoren jetzt als APS-Reduktasebezeichnet wird.

3.2.4 Struktur/Funktionsbeziehungen in der APS-Reduktase

Im Western-Blot einer SDS-PAGE der gereinigten APS-Reduktase aus C. roseus (Par∆1)wurden Aggregate des Proteins beobachtet, die durch Zusatz von Reduktionsmitteln (6,7 mMDTT oder GSH) aufgelöst werden konnten (vgl. 2.3.2.1). Dies läßt darauf schließen, daß dieseAggregate der APS-Reduktase durch die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrückenbedingt sind. Die APS-Reduktase enthält 7 Cysteinreste pro Monomer, die an intermolekularenDisulfiden beteiligt sein könnten.Zur Bestimmung der Km(APS) wurden DTT- und GSH-Konzentrationen verwendet(20 mM, vgl. 2.3.3.3), die in der Gelelektrophorese ausreichend waren, eine Monomerisierungder APS-Reduktase zu bewirken. Es ist demnach unwahrscheinlich, daß die aktiveKonformation des Enzyms ein auf intermolekularen Disulfidbrücken beruhendes Oligomerdarstellt. Diese Annahme wird dadurch unterstützt, daß die APS-Reduktase-Aktivität inGegenwart von 20 mM DTT auffallend stabil war (vgl. 2.3.3.1). Aufgrund des positivenEffektes auf die Enzymaktivität durch hohe Konzentrationen von anorganischen Salzen

Diskussion 59

(0,5 M Na2SO4, vgl. 2.3.3.1), die eine Ausbildung hydrophober Wechselwirkungen fördern,wäre dagegen für die aktive Konformation ein auf solchen hydrophoben Wechselwirkungenberuhendes Oligomer denkbar. Die PAPS-Reduktase aus E. coli liegt beispielsweise in ihreraktiven Konformation als Dimer vor, das in nichtdenaturierenden Gelen durch eine Reduktionmit DTT oder Thioredoxin nicht monomerisiert wird. Das Enzym bildet unter reduzierendenBedingungen jedoch in der SDS-PAGE ebenfalls Monomere (Berendt et al., 1995, Lillig et al.,1999).Die Elektronenübertragung in der rekombinanten APS-Reduktase ist ähnlich der PAPS-Reduktase aus E. coli unabhängig von prosthetischen Gruppen (vgl. 2.3.3.2). In der PAPS-Reduktase bildet ein Dithiol/Disulfid-Redoxpaar die elektronentransferierende Struktur. DiesesRedoxpaar wird von zwei konservierten, singulären Cysteinresten im Enzymdimer gebildet(Berendt et al., 1995). Die Mutagenese des singulären Cysteins in der PAPS-Reduktase führtezur Inaktivierung des Enzyms. Dieses Cystein ist auch in der APS-Reduktase Sequenz inPosition 317 konserviert (vgl. 7.4). Die Mutagenese des konservierten Cys317 in der APS-Reduktase bewirkte ebenfalls eine vollständige Inaktivierung des pflanzlichen Enzyms(vgl. 2.3.3.5) und scheint demnach funktionell an der Reduktion von APS beteiligt zu sein. Mit7 Cysteinresten pro Monomer wäre in der APS-Reduktase zusätzlich ein intramolekularesRedoxpaar denkbar.

Die APS-Reduktase weist in ihrer Core-Domäne strukturelle Übereinstimmungen zur PAPS-Reduktase aus E. coli auf und ähnelt in ihrer C-terminalen Extension der N-terminalenThioredoxin-ähnlichen Domäne der Proteindisulfid-Isomerase (PDI) (vgl. 2.2). DieUntersuchungen zur Funktion der Par∆2-APS-Reduktase haben gezeigt, daß dieses PAPS-Reduktase-Homolog mit DTT oder GSH keine Sulfitbildung aus APS katalysierte (vgl.2.3.4.2). Da die APS-Reduktase-Aktivität dieses deletierten Proteins durch exogenesThioredoxin wiederhergestellt werden konnte, kann angenommen werden, daß dieThioredoxin-ähnliche PDI-Domäne der APS-Reduktase als intramolekularer, redoxaktiverCofaktor der Core-Domäne an der Elektronenübertragung vom DTT bzw. GSH auf APSbeteiligt ist. Dies erlaubt eine funktionelle Einteilung der APS-Reduktase in eine Reduktase-und eine Cofaktordomäne.Die ermittelte Affinitätskonstante der Par∆2-APS-Reduktase für ihr Substrat APS entsprachmit 3,8 µM der Km(APS) für das Par∆1-Protein (vgl. 2.3.3.3). Diese Befunde belegen, daß imEnzym aus C. roseus die Bindung des Substrates APS in der PAPS-Reduktase-homolgenCore-Domäne erfolgt, und diese Domäne die Reduktasefunktion beinhaltet. Da in dervorhergesagten Sekundärstruktur der Core-Domäne (vgl. 2.2.2) speziell die Länge und diePosition solcher Sekundärelemente mit der PAPS-Reduktase aus E. coli übereinstimmen, dieim bakteriellen Enzym zur Nukleotidbindenische beitragen (Savage et al. 1997, Bork undKoonin, 1994), kann eine ähnliche Substratbindung vermutet werden. Das 3D-Modell derCore-Domäne weist ferner auf eine nahezu identische Tertiärstruktur zur PAPS-Reduktase ausE. coli hin, die durch eine zukünftige Kristallisation des Proteins aus C. roseus aufgeklärtwerden kann.Im 3D-Modell zur Substratbindung der Core-Domäne wurde die Aminosäure Glutamin220 alsUrsache struktureller Unterschiede zur PAPS-Reduktase identifiziert, die an derSubstratspezifität der APS-Reduktase beteiligt sein könnten (vgl. 2.3.3.6). Durch den

Diskussion 60

Austausch von Q220 gegen Leucin, der entsprechenden Aminosäure im Enzym aus E. coli,wurde in der APS-Reduktase keine veränderte Substratspezifität, aber eine unterschiedlicheSubstratsättigung und Reaktionsgeschwindigkeit festgestellt. Die ermittelten Daten könnten einHinweis darauf sein, daß APS in der postulierten Nische im mutierten Protein mit veränderterAffinität bindet, jedoch ineffizient umgesetzt wird.

Die APS-Reduktase katalysierte die Reaktivierung der reduzierten, denaturierten RNaseA(2.3.3.7) sowie die Reduktion des Insulindisulfids (2.2.4.3). Solche Redoxreaktionen mitDithiol/Disulfidübergängen werden von den Proteinen der Thioredoxin-Superfamiliekatalysiert, zu der neben den Thio- und Glutaredoxinen auch die Proteindisulfid-Isomerasen(PDIs) und die bakteriellen Chaperone (Dsb-Proteine) zählen (Holmgren, 1989, Bardwell,1994, Andersen et al., 1997, Gilbert, 1998). Diesen Disulfid-Oxidoreduktasen ist gemeinsam,daß sie mindestens eine sogenannte Thioredoxin-Domäne mit einem redoxaktiven Tetrapeptidaus zwei Cysteinresten enthalten, die durch zwei proteinspezifische Aminosäuren getrennt sind(CXXC). Das Cystein-Tetrapeptid im Aminosäurecluster Y380APWCRFC in der C-terminalenCofaktor-Domäne der APS-Reduktase ähnelt stark dem Motiv YAPWCGHC in denProteindisulfid-Isomerasen (Freedman et al., 1994) und ist in veränderter Form auch in denorthologen Polypeptiden aus A. thaliana, B. juncea und L. minor erhalten (Gutierrez-Marcoset al., 1996, Setya et al., 1996, Heiss et al., 1999, Suter et al., 2000). Die PDIs undChaperone katalysieren in vivo die Oxidation und Isomerisierung von Disulfidbrücken undbewirken die korrekte Faltung von Proteinen (Freedman et al., 1994, Bardwell, 1994). Thio-und Glutaredoxine reagieren in vivo bevorzugt als Disulfid-Reduktase und fungieren u. a. alsReduktionsmittel der PAPS-Reduktase (Gonzales-Porqué et al., 1970, Tsang und Schiff,1978a, Tsang, 1981, Lillig et al., 1999). In vitro sind Thioredoxine aber auch als PDI zurReaktivierung denaturierter, reduzierter RNaseA wirksam (Pigiet und Schuster, 1986). DiePDI-Aktivität und die Insulindisulfid-Reduktase-Aktivität der APS-Reduktase können daherals Funktion der C-terminalen Cofaktor-Domäne interpretiert werden und erlauben eineKlassifizierung der APS-Reduktase als Mitglied der Thioredoxin-Superfamilie. Es ist jedochanzumerken, daß auch die C-terminal um diese Domäne deletierte Par∆2-APS-Reduktase dieReduktion des Insulindisulfids katalysierte. Als redoxaktive Gruppe käme in diesemZusammenhang eventuell das Aminosäuremotiv C289EPC in Betracht. Die Sekundärstruktur-vorhersagen geben für diesen Bereich allerdings keine α-helikale Struktur an, die in denDisulfid-Oxidoreduktasen am Aminoterminus des Motivs AXWCXXC lokalisiert ist (Martin etal., 1993). Eine Funktion als redoxaktives Zentrum bleibt durch Mutagenesen zu überprüfen.

Die C-terminale Cofaktor-Domäne der APS-Reduktase konnte in vitro funktionell durch Trx1aus E. coli, das pflanzliche TrxH3 aus A. thaliana nicht aber durch Glutaredoxin1 aus E. coli(Grx1) ersetzt werden (vgl. 2.3.4.2). Die Michaeliskonstanten der Par∆2-APS-Reduktase fürTrx1 und TrxH3 (15,3 µM bzw. 14,3 µM) weisen eine auffällige Übereinstimmung zurKonstante der PAPS-Reduktase aus E. coli auf (Km(Trx1) = 13,7 µM, Lillig et al., 1999) unddeuten auf eine ähnliche Interaktion von Reduktase-Domäne (Par∆2) und Cofaktor (Trx) hin.Die in der vorliegenden Arbeit berichtete Diskriminierung von Grx1 bei der APS-Reduktiondurch das rekombinante Par∆2-Protein könnte in einer Inkompatibilität der molekularen undelektrostatischen Oberflächen bei der Wechselwirkung von Reduktase-Domäne und Grx1

Diskussion 61

begründet sein. Für die PAPS-Reduktase aus E. coli, die Trx1 aber auch Grx1 alsElektronendonor nutzt, wurde eine ähnliche Diskriminierung des strukturell zum Grx1 sehrähnlichen Grx3 beobachtet (Lillig et al., 1999).Eine Beschreibung der C-terminalen Extension der APS-Reduktase als intramolekulares Trxscheint in Bezug auf GSH als Elektronendonor der APS-Reduktase nicht sinnvoll, da Trx nichtdurch GSH reduziert werden kann (Holmgren, 1989). Thioredoxine werden durch NADPH-oder Ferredoxin-abhängige Thioredoxin-Reduktasen mit Elektronen versorgt (Williams, 1995,Schürmann, 1995). Wray und Mitarbeiter (1998) haben gezeigt, daß die NADPH-abhängigeThioredoxin-Reduktase Elektronen vom NADPH auf eine homologe APS-Reduktase ausA. thaliana überträgt. Von Bick et al. (1998) wurde jedoch nachgewiesen, daß dadurch keineAPS-Reduktion erzielbar ist. Diese Autoren beschreiben für die C-terminale Domäne einerIsoform der APS-Reduktase aus A. thaliana eine Glutaredoxin-ähnliche Funktion undpostulieren gleichermaßen GSH als physiologischen Elektronendonor der APS-Reduktase.Bick und Mitarbeiter konnten zeigen, daß die C-terminale Enzymdomäne die GSH-abhängigeReduktion von Hydroxyethyldisulfid, Cystin und Dehydroascorbat katalysierte und dabei Ratenerzielt wurden, die vergleichbar waren zur Katalyse dieser Reaktionen durch Grx.Aufgrund der Thioredoxin- und Glutaredoxin-ähnlichen Eigenschaften der C-terminalenDomäne der APS-Reduktasen wäre diese als eigenständiges Mitglied der Thioredoxin-Superfamilie zu deuten.

Um der Frage nachzugehen, ob die Reduktase-Domäne auch in vivo funktionell ist, wurde eineheterologe Expression der par∆2-cDNA in Cystein-auxotrophen Mutanten von E. coli und derHefe vorgenommen (vgl. 2.3.4.4). Den Mutanten von E. coli und S. cerevisiae ist gemeinsam,daß die Enzymfolge der assimilatorischen Sulfatreduktion nach der Sulfataufnahme undAktivierung durch die ATP-Sulfurylase unterbrochen ist, und in nächster Folge kein Sulfitgebildet werden kann. Da die funktionelle Komplementation der pro- und eukaryotischenMutanten durch die vollständige cDNA par4 bzw. die cDNA par∆1 möglich war (Uhrig,1996, Prior, 1996), kann angenommen werden, daß in diesen Mutanten eine APS-Reduktionerfolgt. Die in vitro Funktion der Core-Domäne des par-Genproduktes als Reduktase konntedurch die ausbleibende Komplementation der Mutanten durch die cDNA par∆2 in vivo nichtbestätigt werden. In den Hefe-Mutanten wäre die ausbleibende Komplementation eventuelldurch eine Inkompatibilität der Hefe-Thioredoxine oder -Glutaredoxine zur Reduktase-Domäne erklärbar. Gleichermaßen wurde von Bick und Mitarbeitern (1998) festgestellt, daßdie DNA für die C-terminale Domäne einer Isoform der APS-Reduktase aus A. thaliana eineTrx/Grx-Doppelmutante von E. coli nicht komplementierte, und demnach als Cofaktor derbakteriellen PAPS-Reduktase in vivo nicht funktionell erschien.Die ausbleibende Komplementation der bakteriellen Mutante ist dagegen unverständlich. ImZellextrakt der transformierten E. coli Mutante wurde bei sättigenden Substratkonzentrationenfür APS (10 µM) und Trx1 (30 µM) eine spezifische APS-Reduktase-Aktivität von 1 mU mg-1

festgestellt. Die APS-Konzentration in der verwendeten E. coli Mutante ist nicht bekannt, kannaber aus den in Kapitel 3.2.2 genannten Gründen als sehr gering eingeschätzt werden. FürThioredoxin werden in E. coli intrazelluläre Konzentrationen bis zu 10 µM angegeben (Tsang,1981). Die mangelnde Komplementation ist womöglich dahingehend zu deuten, daß durch einezu geringe Rate der Sulfitbildung das prototrophe Wachstum in den transformierten Zellen

Diskussion 62

nicht aufrecht erhalten werden kann. Dieser Aspekt könnte künftig durch eine Überexpressionvon Trx1 in den untersuchten Transformanden überprüft werden.

3.2.5 Bedeutung der APS-Reduktase für die Sulfatreduktion in höheren Pflanzen

Die Daten der vorliegenden Arbeit zur Lokalisation der APS-Reduktase im Chloroplasten,ihrer in vitro Funktion zur Glutathion-abhängigen Sulfitbildung und die Übereinstimmungenzur APS-Sulfotransferase lassen auf eine direkte Beteiligung dieses Enzyms an derReaktionsfolge der assimilatorischen Sulfatreduktion in höheren Pflanzen in der in Abb. 31dargestellten Weise schließen.

S O A P S4

2-

2 G SH

G S S G

N A D P H + H +

N A D P+

A R (A P SS T )

G R S O3

2 -

PA P S

S2 -

S u lfa tie rungsre ak tionen

Cys te inS IR O A S T L

A P SK

S T

Abb. 31: Hypothetische Reaktionsfolge der Sulfatassimilation in höheren Pflanzen (verändertnach Bick und Leustek, 1998)Die vermutlich an der Reaktionsfolge beteiligten Enzyme sind fett gedruckt. Abkürzungen: APS: Adenosin-5´-

Phosphosulfat, APSST: APS-Sulfotransferase, AR: APS-Reduktase, GSH: reduziertes Glutathion, GSSG:

oxidiertes Glutathion, GR: Glutathion-Reduktase, OASTL: O-Acetylserin-(thiol)-Lyase, PAPS: 3´-

Phosphoadenosin-5´-Phosphosulfat, ST: Sulfotransferase.

Bei dieser möglichen Reaktionsfolge der Sulfatassimilation nimmt das aktivierte Sulfat in Formvon APS eine zentrale Rolle ein, indem es einerseits als Substrat für den reduktivenStoffwechsel zum Cystein dient, und andererseits über PAPS in einer Vielzahl vonSulfatierungsreaktionen metabolisiert wird. Am Verzweigungspunkt zur Cysteinbiosynthesegreift bei dieser Vorstellung die APS-Reduktase an, die in einer Glutathion-abhängigenReaktion freies Sulfit bildet, das durch die Sulfitreduktase zu Sulfid reduziert wird. Sulfid wirdim Anschluß im Cystein fixiert. Glutathion wurde in der vorliegenden Arbeit als putativerElektronendonor der APS-Reduktase identifiziert (vgl. 2.3.3.4) und wird seinerseits von derNADPH-abhängigen Glutathion-Reduktase reduziert.

Die dargestellte Reaktionsfolge schließt eine Beteiligung der APS-Kinase für dieCysteinbiosynthese, wie sie für Mikroorganismen beschrieben wird (Übersicht: Schwenn, 1994

Diskussion 63

und 1997) aus. Für die APS-Kinase kommt in diesem Modell eine Funktion bei der Syntheseder pflanzlichen N- und O-Sulfatester in Frage. Solche Sulfatkonjugationen werden durchSulfotransferasen katalysiert, die PAPS als Sulfatgruppendonor verwenden (Übersicht in:Varin et al., 1997). Diese Sulfatierungen spielen in Pflanzen eine entscheidende Rolle inintermolekularen Erkennungs- und Signalprozessen sowie bei der Regulation vonPflanzenwachstum und -entwicklung. Die Sulfotransferasen weisen eine hohe Affinität zumPAPS auf. Bislang konnten jedoch nur cytoplasmatische oder an die Plasmamembranassoziierte PAPS-Sulfotransferasen identifiziert werden. Die APS-Kinasen werden dagegenausschließlich als plastidäre Enzyme beschrieben, so daß die Bildung von N- undO-Sulfatestern einen noch nicht identifizierten Transport des PAPS vom Chloroplasten insCytosol erfordern würde. Gleichwohl kann auch die von einer PAPS-Reduktase katalysierteReduktion von PAPS im Plastiden der Pflanze nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden(Hell, 1997, Wray et al., 1998).

Stellt man die Frage nach der Verfügbarkeit des Substrats APS für die APS-Reduktase, sobleibt zu berücksichtigen, daß im Chloroplasten durch die favorisierte Rückreaktion der ATP-Sulfurylase und die APS-Kinase bereits zwei Enzyme vorliegen, die APS als Substrat mit hoherAffinität umsetzen können. Die Frage, ob die APS-Reduktase die thermodynamisch undkinetisch ungünstige APS-Synthese antreiben kann, kann noch nicht beantwortet werden. Diekinetischen Konstanten der APS-Reduktase haben eine Effizienz von 8,4 x 105 [M s]-1 ergeben(vgl. 2.3.3.3). Für die APS-Kinase aus A. thaliana mit ihrer hohen Affinität zum APS(Km = 0,14 µM) und einer Vmax von 7,35 U mg-1 wird eine 31fach höhere Umsatzeffizienz zurPhosphorylierung des Substrats angegeben (Lillig, persönliche Mitteilung). Die APS-Kinasewürde ungeachtet der assimilativen Verwertung von PAPS eine APS-Reduktion imChloroplasten durch direkte Substratkonkurrenz deutlich beeinträchtigen oder verhindern,wenn keine räumliche bzw. zeitliche Separation oder eine strikte Regulation beider Enzymegegeben ist.

Zur Regulation des intrazellulären APS/PAPS-Pools wird von Peng und Verma (1995) einGleichgewicht vorgeschlagen, bei dem eine 3´(2´),5´-Diphosphonukleosid-3´(2´)-Phospho-hydrolase (DPNPase) durch die Dephosphorylierung von PAPS zwischen denKonjugationsreaktionen und der reduktiven Sulfatassimilation umschalten kann. Die zugrundeliegenden DNA-Sequenzen aus Reis und A. thaliana (Quintero et al., 1996, Cheong et al.,1996) kodieren durchweg für cytoplasmatische Enzyme. Plastidäre Isoformen, die die APS-Konzentration im Chloroplasten kontrollieren könnten, sind dagegen bislang nicht isoliertworden.Die cDNA par für die APS-Reduktase wurde von Uhrig (1996) aus einer Sulfatmangel-adaptierten Zellkultur von C. roseus isoliert. Wie bereits in Kapitel 3.1.4 erwähnt, wurde vonUhrig unter Sulfatmangel eine erhöhte Transkriptmenge der APS-Reduktase beobachtet, unddies konnte auch für die orthologen Enzyme aus A. thaliana demonstriert werden (Gutierrez-Marcos et al., 1996). Takahashi und Mitarbeiter (1997) stellten in A. thaliana unterSulfatmangel eine Zunahme der mRNA für den Sulfattransporter, die ATP-Sulfurylase und dieAPS-Reduktase fest, während die Transkriptmenge der APS-Kinase keine signifikanteVeränderung erkennen ließ. Die Autoren schlagen vor, daß durch eine Akkumulation der

Diskussion 64

Transkriptmengen des Transporters, der ATP-Sulfurylase sowie der APS-Reduktase und dervermutlich damit verbundenen Zunahme der Genprodukte unter Mangelbedingungen eineeffiziente Cysteinsynthese gewährleistet werden könnte. Ähnliche Befunde werden auch vonYamaguchi et al. (1999) beschrieben. Da in allen Untersuchungen kein Einfluß derSulfatversorgung auf die mRNA der Sulfitreduktase beobachtet wurde, ist fraglich, ob bei derangenommenen Regulation das Zwischenprodukt Sulfit als hochreaktive und damit toxischeKomponente effizient weiterverarbeitet werden kann. Ferner sind bislang keine Daten zumabsoluten Proteingehalt der sulfatassimilierenden Enzyme in Pflanzen bekannt.

Außerhalb der Cysteinbiosynthese wäre auch eine Funktion der APS-Reduktase in derSulfolipidbiosynthese vorstellbar. Das Sulfolipid Sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)enthält als charakteristische Kopfgruppe die Quinovose, ein Glucosederivat, bei dem diesechste Hydroxylgruppe durch einen Sulfonsäurerest ersetzt ist (Heinz, 1993, Benning, 1998).Die Sulfonsäure stammt nach Hoppe und Schwenn (1981) aus dem Sulfit der assimilatorischenSulfatreduktion. Hinweise auf eine Beteiligung einer APS-Reduktase an dieser Synthese liegenin Kompetitionsexperimenten von Kleppinger-Sparace und Mudd (1990), in denen einedeutliche Preferenz von APS gegenüber PAPS als Vorläufer des SQDG festgestellt wurde.

3.2.6 Phylogenetischer Vergleich der pflanzlichen APS-Reduktasen und ihrermikrobiellen Homologa

Abgesehen von der Substratspezifität stellt sich die APS-Reduktase aus C. roseus als Homologder mikrobiellen PAPS-Reduktasen dar.Die bis heute untersuchten pflanzlichen APS-Reduktasen bilden eine Gruppe relativ großerProteine mit hoher Identität (67 - 75 %), die sich im wesentlich durch das plastidäreTransitpeptid und die C-terminale Cofaktordomäne von den mikrobiellen PAPS-Reduktasen(cysH) und den cysH-homologen Proteinen unterscheiden. Ein phylogenetischer Vergleich derpflanzlichen Enzyme mit den mikrobiellen Homologa ist in Abb. 32 als Stammbaumdargestellt.Dieser phylogenetische Vergleich legt bei den Schwefel-autotrophen Organismen imwesentlichen eine Entwicklung von drei Gruppen nahe. Eine Gruppe umfaßt die PAPS-Reduktasen der Pilze, die zweite beinhaltet die cyanobakteriellen und enterobakteriellenEnzyme sowie die PAPS-Reduktase des chemolitotrophen Bakteriums Thiocapsaroseopersicina. Die dritte Gruppe ist dagegen eher inhomogen und schließt neben denpflanzlichen APS-Reduktasen und einem homologen Genprodukt der MakroalgeEnteromorpha intestinalis auch bakterielle Sequenzen ein.Für die Ferredoxin-abhängige Sulfitreduktase aus A. thaliana ließ sich eine eindeutigephylogenetische Verwandtschaft zu dem Cyanobakterium Anacystis nidulans feststellen, dieeine Herkunft dieses Gens von einem bakteriellen Endosymbionten nahelegte (Gisselmann,1993). Ein ähnlicher Zusammenhang läßt sich aus den vorliegenden Sequenzdaten für diepflanzlichen APS-Reduktasen jedoch nicht ableiten. Auf Primärstrukturebene weisen die APS-Reduktasen stattdessen die größte Identität zu den prokaryotischen Proteinen ausPseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Rhizobium tropici und Bacillus subtilis auf.

Diskussion 65

R hizo b iu m tro p ic i

B ac i llu s su b til is

M ycob a c te r iu mtub ercu lo sis

E sch er ich ia co liS a lm o n e lla typ h im ur iu m

T h io ca psa ro seop ersic in a

S ynech o cyst is P C C 6 8 03S ynech o coccu s sp .E m er ice lla n idu la n s

S acch aro m yces ce rev is iae

S ch izo sacch aro m yces p om be

B ra ss ic a ju nceaA ra b id op sis th a l ian a A P R 1A ra b id op sis th a l ian a A P R 2

C atharanthus roseus

E nte rom o rp ha in tes tina lis

P seu d om on as a erug in osa

B urkh o lde r ia cep a c ia0 ,1

Abb. 32: Dendogramm der APS-Reduktasen, PAPS-Reduktasen und cysH-homologerGenprodukteDer Primärsequenzvergleich erfolgte mit dem Programm CLUSTAL (Higgins und Sharp, 1988), der Baum

wurde mit dem Programm TREEVIEW (Page, 1996) erstellt. Die Sequenzen entsprechen folgenden

Genbankeinträgen: A. thaliana (APR1: AF016282, APR2: AF16283), B. subtilis (U76751), B. cepacia

(AF170343), C. roseus (vgl. 7.1), E. coli (M23008), E. nidulans (X82555), E. intestinalis (AF069951),

M. tuberculosis (Z81368), P. aeruginosa (U95379), R. tropici (AJ001223), S. cerevisiae (J05591),

S. typhimurium (M23008), S. pombe (Z69729), Synechococcus sp. (M84476), Synechocystis PCC6803

(P72794), T. roseopersicina (Z23169).

Die Polypeptide aus Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Rhizobium tropici undBacillus subtilis beinhalten neben den in allen PAPS-Reduktasen konservierten Aminosäurenauch die nur in den APS-Reduktasen zu findenden Motive C197C und C289XXC(Nummerierung der C. roseus Sequenz, vgl. 7.4). Das gereinigte Enzym aus P. aeruginosa(Bick et al., 2000) wird als Thioredoxin-abhängige APS-Reduktase beschrieben und weistdamit nicht nur eine strukturelle sondern auch funktionelle Verwandtschaft zu den pflanzlichenAPS-Reduktasen auf. Die Autoren verfügen ebenfalls über erste Hinweise zur APS-Reduktionin R. tropici, B. cepacia und Mycobacterium sp..Von Abola und Mitarbeitern (1999) wurde indiesem Zusammenhang in weiteren Arten der Gattung Rhizobium und in Agrobakteriumtumefaciens eine APS-Reduktion nachgewiesen. Bei den genannten Bakterien handelt es sichum Bodenbewohner, die in engem Kontakt zu Pflanzen stehen. Dies legt die Idee eineshorizontalen Gentransfers nahe.Bacillus subtilis steht im Dendogramm zwischen den enterobakteriellen Vertretern mit PAPS-Reduktasen und den APS-reduzierenden Organismen. Das cysH-Gen aus B. subtiliskomplementierte eine PAPS-Reduktase-defiziente E. coli Mutante (Mansilla und Mendoza,

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1997). In ersten Analysen des rekombinant exprimierten Genproduktes in bakteriellenZellextrakten wurde von Lillig (persönliche Mitteilung) eine Thioredoxin-abhängige APS- undPAPS-Reduktase-Aktivität festgestellt. Die künftige Charakterisierung des gereinigtenGenproduktes wird Aufschluß über die nutzbaren Substrate liefern, und könnte Hinweise aufdie Herkunft der pflanzlichen APS-Reduktasen liefern.

3.3 Transgener Tabak zur Analyse der APS-Reduktase in planta

Die Reduktion von APS im Chloroplasten der höheren Pflanzen war unter Berücksichtigungder Thermodynamik der APS-Synthese und der Effizienz der APS-Phosphosporylierunganhand der in vitro Daten zur Umsatzeffizienz und subzellulären Lokalisation der APS-Reduktase nicht zweifelsfrei. Um einen Zugang zur Funktion, subzellulären Verteilung undphysiologischen Relevanz der APS-Reduktase in planta zu ermöglichen, wurde das Enzym ausC. roseus in Nicotiana tabacum als Oligo-Histidin-Fusionsprotein exprimiert (vgl. 2.4).

Die computergestützten Sequenzdaten gaben Hinweise auf mögliche posttranslationaleModifikationen des pflanzlichen Proteins, wie Glykosylierungen, Phosphorylierungen oderMyristylierungen (vgl. 2.2.1). Solche Modifikationen können in eukaryotischen Proteinenessentiell für die physiologische Funktion sein. Zelluläre Modifikations- oderProzessierungsmechanismen sind in E. coli als Expressionswirt jedoch nicht vorhanden(Frommer und Ninnemann, 1995), so daß das native Pflanzenprodukt bislang nichtidentifizierte strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaften aufweisen kann. Bei derExpression eukaryotischer Proteine im bakteriellen Wirt ist ferner zu beachten, daß in E. colidie korrekte Knüpfung strukturgebender Disulfidbrücken und die Einlagerung prosthetischerGruppen nicht gewährleistet werden kann. Hinweise auf prosthetische Gruppen undposttranslationale Modifikationen in der APS-Reduktase werden in Kapitel 3.3.3 diskutiert.

Hinsichtlich der subzellulären Verteilung war über die computergestützten Daten und denChloroplastenimport in vitro hinaus der Nachweis einer stromären APS-Reduktase in situerforderlich. Die eindeutige Lokalisierung der nativen APS-Reduktase erscheint angesichtseiner möglichen Coexistenz mit der APS-Kinase im selben Zellkompartiment substantiell fürein Verständnis der APS-reduzierenden Funktion in vivo.In den Arbeiten von Wiesmann (1999) und Staudinger (2000) zur immunologischenDarstellung sulfatassimilierender Enzyme in Pflanzenmaterial wurde versucht, eine native APS-Reduktase in situ nachzuweisen. Die von Wiesmann beschriebenen Immunreaktionen desα:AR Serums (vgl. 2.3.2) mit 45 und 34 kDa großen Polypeptiden in Zellextrakten ausC. roseus oder N. tabacum sowie im Stroma von P. sativum (Prior et al., 1999) konnten durcheine Anreicherung der Immunglobuline eines unabhängigen Serums von Staudinger (2000)nicht bestätigt werden. Eine zweifelsfreie Detektion der APS-Reduktase oder orthologerProteine in anderen Pflanzenspezies konnte jedoch auch mit angereicherten Immunglobulinennicht erzielt werden. Dies legt die Vermutung nahe, daß die native APS-Reduktase in planta inKonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze der verfügbaren Antikörper vorliegt. DieseAnnahme erscheint verständlich, wenn man berücksichtigt, daß im pflanzlichen

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Zellmetabolismus ein Verhältnis von Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelstoffwechsel von600 : 20 : 1 zugrunde liegt (Anderson, 1980) und ein Großteil der Proteine demSekundärstoffwechsel zugeschrieben wird. Demnach entfiele deutlich weniger als 1/600 desZellproteins auf den gesamten Schwefelstoffwechsel und läßt daher in vivo nur eine äußerstgeringe Menge an sulfatassimilierenden Enzymen erwarten.

Durch die konstitutive Expression der APS-Reduktase aus C. roseus im Tabak wurde nicht nurein Zugang zum nativen Pflanzenprodukt ermöglicht, sondern auch eine Grundlage geschaffenzur Klärung der Frage nach der physiologischen Relevanz des Enzyms für die assimilatorischeSulfatreduktion der höheren Pflanzen. Diese Frage kann in Hinblick auf die Existenz derpflanzlichen APS-Kinase bislang nicht ausreichend beantwortet werden.Transgene Pflanzen haben sich als geeignet erwiesen, die physiologische Essenz pflanzlicherGenprodukte zu untersuchen (Theologis, 1994, Newbigen et al., 1995, Herbers undSonnewald, 1996). Dabei kann eine Modulation der verfügbaren Enzymmenge in der Pflanzedurch ihren Einfluß auf die Stoffwechseledukte und -produkte oder den Phänotyp Hinweise aufdie Relevanz, Wirkung und Kontrolle der untersuchten Genprodukte im entsprechendenBiosyntheseweg liefern. Zu einigen Enzymen der pflanzlichen Cystein-Biosynthese liegensolche Untersuchungen bereits vor (Saito et al., 1994b, Blaszczyk et al., 1999, Hatzfeld et al.,1998, Pilon-Smits et al., 1999). Eine Überexpression der APS-Reduktase in planta könnte indiesem Zusammenhang künftig Erkenntnisse zum Stellenwert dieses Enzyms für den Fluß desSulfatschwefels ins Cystein liefern.

3.3.1 Etablierung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Nicotianatabacum durch binäre Plasmid-Konstrukte für die APS-Reduktase

Voraussetzung für eine erfolgreiche in planta Expression der APS-Reduktase aus C. roseuswar sowohl ein qualifiziertes Transformationssystem als auch ein geeigneter Wirt.In der vorliegenden Arbeit wurde zur Übertragung der cDNA par ins Genom von N. tabacumein Transformationssystem aus dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV2260 als„Genfähre“ und Derivaten des Vektors pBINAr(Kan) etabliert (vgl. 2.4.1 - 2.4.2).Der Transfer pflanzlicher cDNA mit ähnlichen Kombinationen aus Agrobakterien undPlasmidkonstrukten, die auf den binären Vektor pBIN19 (Bevan, 1984) zurückgehen, hattesich bereits mehrfach bewährt (Höfgen und Willmitzer, 1990, Flachmann und Kühlbrandt,1996, Shintani et al., 1997, Hatzfeld et al., 1998).

A. tumefaciens wurde als „Genfähre“ verwendet, weil damit ein hoher Prozentsatz transgenerPflanzen erzielt werden kann, die meist nur eine Kopie der übertragenen DNA enthalten.Dennoch fand man auch hier mehrere Kopien pro Pflanze (Gelvin et al., 1983), so daß einetrans-Inaktivierung nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden kann und bei derTransformandenanalyse berücksichtigt werden muß (Flavell, 1994).Bei der Wahl des binären Vektors pBINAr(Kan) zur Herstellung der Plasmid-Konstrukte fürdie APS-Reduktase (vgl. 2.4.1) war ausschlaggebend, daß durch den in Pflanzen fastuneingeschränkt aktiven 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (35S-CaMV) eine

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konstitutive Transkription der par-cDNA erfolgen konnte, und damit eine Überexpression derAPS-Reduktase möglich war. Von Flachmann und Kühlbrandt (1996) wurde beispielsweiseeine vom 35S-CaMV-Promotor gesteuerte Überexpression des Lichtsammel-Proteins LCHII inN. tabacum erzielt. Die in dieser Arbeit genutzten binären Vektor-Plasmide pBINAr1.R.2.1,pBINAr2.N.2.13 und pBINAr 3.2.17 waren so konstruiert, daß eine Lokalisation der APS-Reduktase im Tabakchloroplasten bzw. -cytosol möglich war, und die transgene APS-Reduktase durch eine Oligo-Histidin-Fusion in planta identifizierbar und isolierbar war.Für die Verwendung von Nicotiana tabacum als Wirtsorganismus zur heterologen Expressionder APS-Reduktase aus C. roseus sprach, daß dieser Organismus bereits in vielen Fällenerfolgreich durch die „leaf-disc“-Methode transformiert wurde. Ferner wird die Regenerationtransformierten Gewebes im allgemeinen als unproblematisch angesehen (Übersicht in: Birch,1997). Im Gegensatz zu A. thaliana liefert die Tabakpflanze durch Habitus und Größe fernergroße Mengen an transgenem Material zur Isolierung des rekombinanten Fremdproteins undermöglicht überdies auch eine organ- bzw. gewebespezifische Untersuchung der Expression.Die heterologe Expression der cDNA par in N. tabacum konnte gegenüber einer homologenExpression in C. roseus die Häufigkeit einer Cosupression verringern, die in vielen Fällen zumvölligen „Gene silencing“ führen kann und damit einer Antisense-Expression gleichkommt(Napoli et al., 1990, Grierson et al., 1991, Kumpatla et al., 1998).Die etablierte Technik, die nur eines geringen Gewebekulturaufwandes bedarf, lieferteinnerhalb von vier bis sechs Wochen die ersten Kanamycin-toleranten Kalli und darausregenerierte Pflanzen.

3.3.2 Selektion von transgenen, APS-Reduktase überproduzierenden Tabakpflanzen

Zur Identifizierung von Tabaktransformanden, die die APS-Reduktase aus C. roseus ingrößeren Mengen exprimieren waren nacheinander folgende Fragen zu beantworten: 1). ist dieT-DNA der verwendeten binären Vektorplasmide im Genom von N. tabacum integriert, undsind diese Pflanzen frei von Agrobakterien, 2). wird die rekombinante cDNA par in plantatranskribiert, und welche Pflanzen enthalten die größte Menge an mRNA für die rekombinanteAPS-Reduktase, und 3). wird von der mRNA eine funktionsfähige APS-Reduktase translatiert,und können auf Proteinebene Überproduzierer nachgewiesen werden?

Zur Klärung der ersten Fragestellung wurde in dieser Arbeit ein auf der Polymerase-Kettenreaktion basierendes Testsystem aus drei spezifischen Oligonukleotidpaaren erarbeitet(vgl. 2.4.3), das den Nachweis der genomischen Integration ermöglichte und gleichzeitigsicherstellte, daß die transgenen Pflanzen frei von Agrobakterien waren. DieIntegrationsanalyse erfolgte erst nach mindestens dreimaliger, vegetativer Vermehrung derKanamycin-resistenten Pflanzen, um eine transiente Expression auszuschließen. Eine transienteExpression tritt meist beim direkten Gentransfer in Pflanzen auf wurde aber auch bei derTransformation mit A. tumefaciens bereits beobachtet (Jansen und Gardner, 1989, Vancanneytet al., 1990). Sie wird von vielen Faktoren beeinflußt und ist ursächlich auf die Stabilität derübertragenen DNA zurückzuführen (Jongsma et al., 1987, Morota und Uchimiya, 1988), dieerst allmählich von pflanzlichen DNAsen abgebaut wird.

Diskussion 69

In allen drei Tranformandengruppen wurden mit einer Effizienz von 50 - 65 % echteTransformanden selektioniert. Es wurden ferner Kanamycin-tolerante Klone identifiziert, indenen keine T-DNA nachgewiesen werden konnte. Von Jordan und McHughen (1988) wirdbeschrieben, daß bei der Pflanzentransformation nicht jeder Antibiotikum-resistente Kallusausschließlich transgene Sproße hervorbringt.Die in der vorliegenden Arbeit etablierte PCR-Methode zur Identifizierung echterTransformanden erlaubte ein Durchmustern einer Vielzahl von Pflanzen mit weitausgeringerem Arbeitsaufwand im Vergleich zur Transformandenanalyse durch Southern-Blotting.Da eine Amplifizierung der selektierbaren Marker (nptII und nptIII) bzw. eines Haushaltsgensaus N. tabacum (tob71) als Kontrolle erfolgte, war die Technik unabhängig von der Strukturder transferierten par-cDNA auf alle drei Transformandengruppen anzuwenden. Eine Aussagezur integrierten Kopienzahl oder dem Integrationsort konnte dabei nicht getroffen werden.Letzteres scheint künftig besonders für Pflanze T3.3 mit „panaschierten“ Blättern erforderlich,um Aufschluß über den genetischen Hintergrund dieses Phänotyps zu erhalten.

Hinsichtlich der zweiten Frage hatte sich die Northern-Analyse mit Digoxygenin-markiertenSonden als wenig sensitiv zur Untersuchung der Transkriptmenge für die rekombinante APS-Reduktase erwiesen. Daher erfolgte die Quantifizierung der mRNA durch die relative RT-PCR(vgl. 2.4.4). Diese Methode erlaubte ein nichtradioaktives Durchmustern einer Vielzahlunterschiedlicher Proben bei nur mäßigem Zeitaufwand und benötigte nur geringe Mengen anGesamt-RNA. Die relative RT-PCR ermöglichte durch die lineare Coamplifizierung dercDNAs für die (His)6- bzw. (His)10-APS-Reduktase und die interne Kontrolle Aktin1 über diePCR-Produktmenge einen Vergleich der Transkriptmengen für die rekombinante APS-Reduktase in den Transformanden einer Gruppe (ET1, ET2 oder ET3). Diese Art der relativenQuantifizierung wird in der Literatur vermehrt zum Vergleich der Transkriptmenge einesbestimmten Gens in verschiedenen Proben eingesetzt (Gaudette und Crain, 1991, Frye et al.,1989, Flemming et al., 1996) und führte in dieser Arbeit zur Identifizierung vonÜberproduzierern in allen drei Transformandengruppen. Es wurden auch solche Kloneidentifiziert, in denen trotz der genomischen Integration der T-DNA keine mRNA für dietransgene APS-Reduktase nachgewiesen wurde. Hier könnte auf eine Cosuppression odertrans-Inaktivierung geschlossen werden (Übersicht in: Flavell, 1994).

In Bezug auf die dritte Frage wurde in der vorliegenden Arbeit die Translation der(His)6-APS-Reduktase durch kongruente Immunsignale mit angereicherten α:APS-ReduktaseIgGs sowie monoklonalen Penta-His Antikörpern in Proteinextrakten transgenerTabakpflanzen der ET1-Gruppe nachgewiesen (vgl. 2.4.5). Die Signifikanz der Immunsignaleals APS-Reduktase wird dadurch gestützt, daß die unabhängigen Antikörper übereinstimmendeImmunpräzipitate lieferten, und die immunologisch untersuchten Klone, in denen eineLokalisation der APS-Reduktase im Chloroplasten angenommen wird, eine im Vergleich zumWildtyp deutlich erhöhte spezifische APS-Reduktase-Aktivität aufwiesen (vgl. 2.4.6). Ob dieÜberexpression der APS-Reduktase den Phänotyp der Pflanze T1.14 (kleinwüchsig,gestauchte Internodien) bedingt, kann bisher nicht beantwortet werden.Die Immunsignale werden im folgenden Kapitel in Verbindung mit der Aufreinigung dertransgenen APS-Reduktase diskutiert. Hinweise auf eine Prozessierung der APS-Reduktase in

Diskussion 70

Reduktase- und Cofaktor-Domäne können aus den detektierten Immunsignalen nichtgewonnen werden.In Extrakten der ET2- und ET3-Transformanden konnte weder ein immunpositives Proteinidentifiziert noch eine erhöhte APS-Reduktase-Aktivität gemessen werden. Dies könntebedeuten, daß eine Translation der Transkripte für eine cytosolische APS-Reduktase nichtmöglich ist. Dahingehend sind posttranskriptionelle und/oder posttranslationelle Prozessedenkbar, die eine Translation der mRNA unterbinden oder die Stabilität des Genproduktesbeeinflussen. Von Sullivan und Green (1993) werden solche Mechanismen bei einer geringenAkkumulation von Fremdproteinen in transgenen Pflanzen in Betracht gezogen. Bei einerExpression der APS-Reduktase in Cytosol wäre durch die Existenz cytosolischer ATP-Sulfurylasen (Renosto et al., 1993, Klonus et al., 1994) das Substrat zur Sulfitbildunggegeben. Allerdings sind bislang aus höheren Pflanzen nur plastidäre Sulfitreduktasenmolekular charakterisiert worden (Brühl et al., 1996, Bork et al., 1998). Es ist vorstellbar, daßin ET2- und ET3-Transformanden eine Selektion gegen die Sulfitbildung stattfindet, weil eineMetabolisierung des hochreaktiven Produktes SO3

2- nicht erfolgen kann.

3.3.3 Eigenschaften der angereicherten, in planta exprimierten APS-Reduktase ausCatharanthus roseus

Die in der ET1.25-Transformande von N. tabacum exprimierte (His)6-APS-Reduktase ausC. roseus konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Metallaffinitätschromatographie(IMAC) 18fach angereichert werden (vgl. 2.4.6).Im Immunoblot der Fraktionen dieser Aufreinigung wurden im Eluat mit den α:AR IgGs, denPenta-His Antikörpern sowie dem α:AR Serum übereinstimmende Immunsignale detektiert,die auf ihre Identität als APS-Reduktase schließen lassen. Das apparente Molekulargewicht derimmunpositiven Proteine weicht mit 52 und 50 kDa vom erwarteten Wert (44,9 kDa) für einim Chloroplasten gereiftes Produkt ab und findet auch keine Entsprechung in dem in E. coliexprimierten (His)6-Referenzprotein. Die apparente Größe der in planta exprimierten APS-Reduktase kann unter folgenden Aspekten interpretiert werden:1). Es hat keine Prozessierung der transgenen APS-Reduktase stattgefunden. Dasimmunpositve 52 kDa große Polypeptid könnte dabei als ungespaltene APS-Reduktase miteinem berechneten Molekulargewicht von 52,4 kDa gedeutet werden. Das Immunsignal bei50 kDa wäre in diesem Fall als Abbauprodukt des Proteins zu verstehen.2). Die Prozessierung der APS-Reduktase erfolgte an unerwarteter Stelle. Die Immunsignalewären in dieser Hinsicht als Translationsprodukt und Spaltprodukt zu interpretieren.3). Die Proteinreifung der APS-Reduktase wurde in der erwarteten Weise vollzogen. Fürdiesen Standpunkt sprechen die in silico und in vitro Daten zur Lokalisation der APS-Reduktase (vgl. 3.2.1). Wird die apparente Größe des Referenzproteins (48 kDa) alsGrößenstandard für eine prozessierte APS-Reduktase in planta zugrunde gelegt, so sind dieImmunsignale bei 52 und 50 kDa durch posttranslationale Modifikationen der APS-Reduktaseund einen proteolytischen Abbau des modifizierten Polypeptids erklärbar.Unter Berücksichtigung dieser Größen des Pflanzenproduktes können die Immunsignale imWestern-Blot der Extrakte transgener Tabakpflanzen (vgl. 2.4.5) bei 45 und 55 kDa

Diskussion 71

dahingehend gedeutet werden, daß das Laufverhalten der (His)6-APS-Reduktase in derSDS-PAGE eventuell durch die in großen Mengen im Rohextrakt vorhandene Ribulose-1´-5´-bisphosphat-Carboxylase (MW 52 kDa) beeinträchtigt wird. Dies konnte auch für dasgereinigte Referenzprotein in Gegenwart eines Proteinextraktes aus N. tabacum festgestelltwerden. Die Zustandsform der in in planta exprimierten APS-Reduktase kann durch einekünftige Sequenzierung der gereinigten, immunpositiven Polypeptide geklärt werden. Dieimmunologische Untersuchung isolierter Chloroplasten und ihrer Kompartimente wirdweiteren Aufschluß zur suborganellen Lokalisation und Prozessierung der APS-Reduktasegeben.

Durch die IMAC wurde in dieser Arbeit ein Eluat mit einer spezifischen APS-Reduktase-Aktivität von 15,5 mU mg-1 gewonnen. Die Aktivität der in planta exprimiertenAPS-Reduktase aus C. roseus ist demnach im Vergleich zum bakteriell synthetisiertenReferenzprotein etwa 140fach geringer. Dabei ist zu bedenken, daß keine homogenePräparation vorlag. Wird die Gesamtaktivität im Rohextrakt um die Aktivität derWaschfraktion bereinigt, die vermutlich auf eine orthologe APS-Reduktase in N. tabacumzurückzuführen ist, so kann auf die Totalaktivität der transgenen (His)6-APS-Reduktasegeschlossen werden (25,29 mU). Wird diese Größe auf die eluierte Proteinmenge (0,0133 mg)bezogen, so liegt mit 1,9 U mg-1 ein Wert vor, der der Aktivität der bakteriell exprimierten(His)6-APS-Reduktase (2,2 U mg-1) entsprechen würde. Wird bei dieser Kalkulationberücksichtigt, daß die transgene APS-Reduktase nur einen Anteil des Proteins iminhomogenen Eluat ausmachte, wäre für ein homogenes, pflanzlich exprimiertes Enzym miteiner größeren spezifischen Aktivität zu rechnen.Durch die Aufreinigung war jedoch ein Verlust von 95 % der Gesamtaktivität zu verzeichnen.Da im Säulendurchlauf der IMAC keine Sulfitbildung meßbar war, und auch im Western-Blotkein Immunsignal detektiert wurde, scheint dieser Verlust durch eine ineffiziente Interaktionder (His)6-APS-Reduktase mit der Affinitätsmatrix bei der IMAC eher unwahrscheinlich.Ferner wurde durch höhere Imidazol-Konzentrationen (200 mM) keine weitereAPS-Reduktase-Aktivität eluiert, so daß auch eine unvollständige Elution des Fusionsproteinsnicht anzunehmen ist.Der Aktivitätsverlust könnte indes darauf hinweisen, daß das rekombinante Pflanzenproduktinstabil ist und/oder zur APS-Reduktion möglicherweise eines Cofaktors bedarf, der durch dieInteraktion mit der Affinitätsmatrix bei einer Vielzahl der Proteinmoleküle nicht erhalten bleibt.Im Eluat lägen danach vermehrt inaktive Enzymmoleküle und nur wenige aktive Spezies vor.Dies könnte auch die geringe, auf die Proteinmenge bezogene Aktivität begründen. Für dieaktuell von Suter und Mitarbeitern (2000) isolierte APS-Reduktase aus L. minor wird dieExistenz eines Cofaktors vorgeschlagen.Ein Cofaktor würde neben den posttranslationalen Modifikationen das Pflanzenprodukt vonder bakteriell exprimierten APS-Reduktase unterscheiden. Durch die erfolgreiche Expressionder (His)6-APS-Reduktase aus C. roseus in N. tabacum war ein Zugang zu diesem in plantasynthetisierten Protein geschaffen. Die Überexprimierer stehen im weiteren für eineHomozygotierung und die anschließende biochemische und molekulare Analyse desPflanzenproduktes, seiner subzellulären Verteilung und der physiologischen Bedeutung für diepflanzliche Sulfatassimilation zur Verfügung.

Zusammenfassung 72

4 Zusammenfassung

Bei der assimilatorischen Sulfatreduktion der höheren Pflanzen war die sulfitbildende Reaktionaufgrund fehlender molekularer Daten zu einer Adenosin-5´-phosphosulfat (APS)-Sulfotransferase oder einer 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS)-Reduktase bislanguneindeutig. Das Genprodukt einer in diesem Zusammenhang isolierten cDNA par ausCatharanthus roseus (Uhrig, 1996) gab trotz Homologien zu mikrobiellen PAPS-ReduktasenHinweise auf eine Sulfitbildung aus APS. In der vorliegenden Arbeit wurde daspar-Genprodukt strukturell und funktionell untersucht, um zur Klärung der Reaktionsfolge derpflanzlichen Sulfatassimilation beizutragen.

Das 464 Aminosäuren umfassende par-Genprodukt kann strukturell in ein N-terminalesTransitpeptid, eine PAPS-Reduktase-homologe Core-Domäne und eine C-terminale Extensionmit Übereinstimmungen zur Thioredoxin-ähnlichen Domäne der Proteindisulfid-Isomerase(PDI) unterteilt werden.Die Funktion des Transitpeptids wurde durch den Import des in vitro translatierten Proteins inintakte Chloroplasten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß das Translationsprodukt indie Chloroplasten importiert und hier zum maturen Protein prozessiert werden kann.Das um das Transitpeptid deletierte par-Genprodukt wurde als Fusion mit einem Histidin-Dekapeptid in Escherichia coli exprimiert (Par∆1), gereinigt und biochemisch charakterisiert.Anhand der steady state Analyse des rekombinanten Proteins kann das par-Genprodukt alspflanzliche APS-Reduktase beschrieben werden, die die Glutathion (GSH)-abhängigeReduktion von APS zu freiem Sulfit und AMP katalysiert [Km(APS) = 2,5 µM, Km(GSH) =3 mM, Vmax = 2,6 U mg-1]. Die Übereinstimmungen in den biochemischen Eigenschaften dieserAPS-Reduktase und der seit langem beschriebenen APS-Sulfotransferase sprechen dafür, daßes sich um die gleichen Enzyme handelt. Da im Chloroplasten GSH-Konzentrationen von3 - 10 mM vorliegen, kann GSH in vivo als Elektronendonor einer APS-Reduktion imPlastiden fungieren. Aufgrund der thermodynamischen und kinetischen Voraussetzungen derAPS-Synthese sowie der effizienten APS-Phosphorylierung durch die APS-Kinase ist dieReduktion von APS in diesem Zellkompartiment mit der Effizienz der rekombinantenAPS-Reduktase (8,4 x 105 [M s]-1) in vivo jedoch noch unklar.Die Mutagenese des Cystein317 im konservierten Motiv ECGLH der APS-Reduktase bewirktedie vollständige Inaktivierung des Enzyms. Dieses Cystein ist wahrscheinlich funktionell an derKatalyse der APS-Reduktion beteiligt. Da die rekombinante APS-Reduktase keineprosthetischen Gruppen enthält, ist in Analogie zur PAPS-Reduktase aus E. coli eineBeteiligung dieser Aminosäure an einer elektronentransferierenden Struktur zu vermuten.Die Untersuchungen zur Funktion der Core-Domäne des Enzyms (Par∆2) zeigten, daß dieDeletion der Thioredoxin-ähnlichen PDI-Domäne zum Aktivitätsverlust führte. DieAPS-Reduktase-Aktivität konnte durch exogenes Thioredoxin (Trx) wiederhergestellt werden.Die Affinität der Core-Domäne zum APS blieb dabei unverändert. Diese Befunde lassen daraufschließen, daß in der APS-Reduktase die Umsetzung von APS in der Core-Domäne erfolgt,und die C-terminale Extension als intramolekularer, redoxaktiver Cofaktor an der Elektronen-übertragung vom GSH auf APS beteiligt ist. Die Oxidoreduktase-Aktivität der APS-Reduktaseklassifiziert diese Cofaktor-Domäne mit dem Aminosäuremotiv APWCRFC als Mitglied der

Zusammenfassung 73

Thioredoxin-Superfamilie. Die vorhergesagte Sekundär- und Tertiärstruktur der Core-Domänezeigt eine große Ähnlichkeit zur PAPS-Reduktase aus E. coli. Anhand der Übereinstimmungenzur Nukleotidbindenische im bakteriellen Enzym kann eine ähnliche Substratbindung postuliertwerden. Die Aminosäure Glutamin220 wurde im 3D-Modell der Core-Domäne als Ursachestruktureller Unterschiede zur PAPS-Reduktase identifiziert. Die Mutagenese dieses Resteszeigte jedoch keinen Einfluß auf die ausschließliche Substratspezifität für APS. Anhand derin vitro Daten kann die APS-Reduktase entsprechend ihrer strukturellen Gliederung funktionellin eine Reduktase- und eine Cofaktor-Domäne unterteilt werden. Die Reduktase-Funktion derCore-Domäne in vitro konnte durch die funktionelle Komplementation Cystein-auxotropherMutanten von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae in vivo nicht bestätigt werden.

Zur Klärung offener Fragen zu der Funktion, der suborganellen Verteilung und derphysiologischen Relevanz der APS-Reduktase in vivo wurden transgene Tabakpflanzenerzeugt, die das Protein aus C. roseus überexprimieren.Hierzu wurden binäre Plasmidkonstrukte erstellt, die den Agrobakterien-vermittelten Transferder genetischen Information für die APS-Reduktase ins Tabakgenom ermöglichten. DieExpressionskassetten in der T-DNA dieser Plasmide konnten unter der Kontrolle des35S-Promotors des Blumenkohlmosaikvirus (35S-CaMV) eine Überexpression derAPS-Reduktase als Oligo-Histidin-Fusion und deren Lokalisation im Tabakchloroplasten- odercytosol bewirken. Nach der Regeneration der selektionierten Kalli und der daraus gebildetenPflanzen wurde mit Hilfe der PCR die Integration der T-DNA ins Pflanzengenom verifiziert.Durch die relative RT-PCR konnten Transformanden mit erhöhtem mRNA-Gehalt für dietransgene APS-Reduktase identifiziert werden. Das Genprodukt wurde immunologisch undenzymatisch nur in solchen Überproduzierern detektiert, in denen durch die vorhandeneTransitsequenz eine Lokalisation im Chloroplasten möglich war (ET1-Transformanden). Indiesen Überproduzierern konnte durch unabhängige Antikörper (α:APS-ReduktaseImmunglobuline und monoklonale Penta-His IgGs) erstmalig die APS-Reduktase inPflanzenmaterial nachgewiesen werden. Die immunpositive Proteinmenge der (His)6-APS-Reduktase war dabei mit einer im Vergleich zum Wildtyp bis zu 16fach erhöhtenAPS-Reduktase-Aktivität korrelierbar und beweist die erfolgreiche Überexpression destransgenen Proteins in Nicotiana tabacum.Die ersten Analysen der Reinigung der transgenen (His)6-APS-Reduktase durch Metall-affinitätschromatographie lassen auf Unterschiede des Pflanzenproduktes zum bakteriellexprimierten Protein schließen. Anhand der apparenten Größe in der SDS-PAGE könnenposttranslationale Modifikationen der Polypeptidkette angenommen werden. Bei der Reinigungwar ein Aktivitätsverlust von 95 % zu verzeichnen, der durch ein Herauslösen eines Cofaktorsim Pflanzenprodukt bedingt sein könnte. Durch die Überexpression in planta sind dieVoraussetzungen zur Charakterisierung dieses Pflanzenproduktes geschaffen. Die in vitroDaten zum bakteriell exprimierten Protein sprechen aber heute bereits für eine direkteBeteiligung der APS-Reduktase an der assimilatorischen Sulfatreduktion der höheren Pflanzen.

Material und Methoden 74

5 Material und Methoden

5.1 Geräteliste

Gene Pulser™ Biorad, Hercules, USAFlüssigkeits-Szintillationszähler LKB Wallac, Amersham/Pharmacia, Freiburg1219 RackbetaGelelektrophoresezubehör

Glasplatten und Zubehör UniversitätswerkstattSpannungsgeber EA-3049 Amersham/Pharmacia, FreiburgSemidry Elektrotransferkammer Schleicher & Schuell, Dassel

Inkubationsschüttler G 25 New Brunswick Scientific,Edison, USA

pH-Meter 522 WTW, WeilheimPhotometer

Zeiss PMQ II Spektrophotometer, Carl Zeiss, Jenaautomatischer Probenwechsler,Polycom 6-Kanal-SchreiberU-3210 Spektrophotometer Hitachi, Japan

Sterilbank, BSB 4 A Gelaire Flow Laboratories,Meckenheim

Waagen (Mettler H 20 T, Mettler P 1200 N) Mettler, Zürich, SchweizZentrifugen

Biofuge R13 Heraeus SepatechEppendorfzentrifuge 5414, 5414 S Sigma, MünchenSorvall RC-5B, Rotor: GSA Du Pont Instruments,

Bad HomburgRotoren: GS 3, SS 34 Kontron, Eching

Alle weiteren Geräte entsprachen dem üblichen Laborstandard.

5.2 Feinchemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien

Acrylamid Amersham/Pharmacia, FreiburgAgarose Biozym, Hess. OldenburgAlkalische Phosphatase aus Kalbsthymus (CIP) Amersham/Pharmacia, FreiburgAntibiotika

Ampicillin, Tetracyclin Roche, Mannheimβ-Baktyl Reusch Pharmaceutics, Bonn Cefotaxime Duchefa, Haarlem, NLKanamycin (Zellkultur-getestet), Rifampicin,Chloramphenicol Sigma, München

Material und Methoden 75

Bakto-Agar, Bakto-Pepton, Hefeextrakt,Rindfleischextrakt, BitekTM-Agar Difco Laboratories, Detroit,

USA5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Biomol, HamburgCyclisches 2´-3´-Cytidin-Monophosphat Sigma, München2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP) Fluka, Buchs, SchweizDigoxigenin-11-dUTP, Dig-DNA-Detection Kit Roche, MannheimDithiothreitol (DTT) Fluka, Buchs, SchweizDNA-Größenstandard (λ-DNA EcoRI/HindIII) MBI Fermentas, LitauenGlutathion (reduziert und oxidiert) Sigma, MünchenHormone für die Kallusbildung:

6-Benzylaminopurin (BAP)α-Naphtylessigsäure (NAA) Sigma, München

Isopropyl-ß-D-thiogalaktosid (IPTG) Biomol, HamburgMurashige-Skoog-Salze (MS-Salze) Gibco BRL, Paisley, GB4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) Biomol, HamburgN, N-Methylenbisacrylamid Amersham/Pharmacia, FreiburgPhenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma, MünchenPolyethylenglykol 3500 und 6000 J.T. Baker, Deventer, NL PonceauS Sigma, MünchenRestriktionsenzyme Roche, MannheimRinderserumalbumin (BSA) Serva, HeidelbergSaccharose Sigma, MünchenSterilfilter GB002 (0,45 µm Porengröße) Schleicher & Schüll, Dassel[35S]-Sulfat Amersham/Pharmacia, FreiburgSzintillationslösung Quicksafe A Zinsser Analytic, FrankfurtT4-DNA-Ligase und ATP Biozym, Hess. OldendorfTris-(hydroxymethyl)-aminomethan Waldeck, MünsterVitamine für Tabakpflanzen:

Glycin, Myo-Inositol, NicotinsäurePyridoxinhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid Sigma, München

Whatman-Papier 3MM Schleicher & Schüll, Dassel

Weitere an dieser Stelle nicht aufgeführte Chemikalien und Enzyme werden an entsprechenderStelle im Methodenteil beschrieben oder wurden von verschiedenen Herstellern inAnalysequalität bezogen.

5.3 Bakterien- und Hefestämme

Bakterienstämme:

E. coli TG 1: supE, thi, hsd∆5, ∆(lac-proAB), F`[traD36, proAB, lacIq, lacZ∆M15] (Gibson, 1984)

Material und Methoden 76

E. coli BL21(DE3) pLysS: F- ompT, hsdSB(rB-mB

-), gal, dcm (DE3), pLysS (Novagen,Abingdon, USA)

E. coli XL-1-Blue MRF`: ∆(mcrA)183, ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1,recA1, relA1, gyrA96, lac-, F’[proAB, lacIq, lacZ∆M15,Tn10(tetr)] (Stratagene, La Jolla, USA)

E. coli JM109: recA1, supE44, endA1, nsdR17, gyrA96, relA1, thi ∆(lac-proAB) (Bachmann, E. coli Genetic Stock Center)

E. coli JM96 FAK: thr-1, leuB6, trp-1, hisG1, cysH56, argH1, thi-1, ara13, lacY1,gal-6, malA1, xyl-7, mtl-2, strA9, tonA2 λR, λ-, supE44, hsdR2durch P1-Transduktion von zjj-202::Tn10 (tetR) (Krone et

al., 1991)A. tumefaciens GV2260: rif R, enthält das Ti-Plasmid pGV2260 mit vollständiger vir-Region

und ampR (Deblaere et al., 1985)

Hefestämme:

S. cerevisiae CC362-6A (MET16): Mata, his3, leu2, ura3, met16 (Masselot und Robicon-Szulmajster, 1975)

S. cerevisiae CC366-6B (MET14): Mata, his3, ura3, met14 (Masselot und Robicon-Szulmajster, 1975)

S. cerevisiae D273-10b: Matα (ATCC 24657)

Die Stämme S. cerevisiae CC362-6A und CC366-6B wurden freundlicherweise von Frau Dr.Yolande Surdin-Kerjan (Laboratoire d`Enzymologie du Centre National de la RechercheScientifique, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France) zur Verfügung gestellt. S. cerevisiaeD273-10b wurde dankenswerterweise von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. W. H. Kunau(Medizinische Fakuktät, Institut für Physiologische Chemie, Ruhr-Universität Bochum)gestellt.

5.4 Pflanzenmaterial

Nicotiana tabacum Pflanzen: Nicotiana tabacum (L.) var. Samsun NN (SNN)

Die sterilen N. tabacum SNN Pflanzen wurden freundlicherweise von Prof. Dr. W. Frommer(Botanisches Institut, Eberhard-Karls-Universität Tübingen) zur Verfügung gestellt.

5.5 Klonierungs- und Expressionsvektoren

pBS II KS+ : 2.961 Bp großer pBluescript-II-KS+-Plasmidvektor (Stratagene, La Jolla, USA)

pYPGE15: 6.400 Bp großer Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor (Brunelli und Pall, 1993)

Material und Methoden 77

pBTac1 : 4.585 Bp großer Expressionsvektor, enthält einen starken trp-lac (tac)-Promotor (Boer et al., 1983)

pET16b: 5.711 Bp großer Expressionsvektor für (His)10-Fusionsproteine (Novagen,Abingdon, USA)

pBINAr(Kan) : 12.495 Bp großes pBIN19-Derivat (pBIN19: binärer Vektor; Bevan, 1984, Frisch et al., 1995), enthält eine Expressionskassette für die konstitutive Expression von Genen in Pflanzen. Die Kassette (Höfte et al., 1991) ist ein769 Bp großes EcoRI/HindIII-Fragment, das den Blumenkohlmosaikvirus(CaMV) 35S-Promoter, einen pUC18 Polylinker und den Octopin-Synthase(OCS)-Terminator mit Polyadenylierungssignal enthält (Höfgen undWillmitzer, 1990)

5.6 Plasmide

pCrpar1:pBluescript-II-SK--Derivat, enthält ein 1.452 Bp großes Fragment mit der 5`-verkürzten,cDNA par aus C. roseus. Am 5`-Ende ist die Erkennungssequenz für die Restriktions-endonuklease EcoRI verändert, am 3`-Ende liegt eine XhoI-Schnittstelle vor (vgl. 2.1,Uhrig, 1996).pCrpar2:pBluescript-II-SK--Derivat, enthält ein 1.538 Bp großes EcoRI/XhoI-Fragment mit der5`-verkürzten cDNA par aus C. roseus (vgl. 2.1, Uhrig, 1996).pCrpar4:pBluescript-II-SK--Derivat, enthält ein 1.767 Bp EcoRI/XhoI Fragment mit der vollständigencDNA par aus C. roseus (vgl. 2.1, Uhrig, 1996).pET16bpar∆1:1.258 Bp großes BamHI/BglII Fragment aus pCrpar2 im Vektor pET-16b zur Expression derN-terminal um 70 Aminosäuren deletierten APS-Reduktase aus C. roseus als (His)10-Fusionsprotein (Par∆1) (Uhrig, 1996).pYPGEpar∆1:1.431 Bp großes BamHI/XhoI PCR-Fragment mit der 5`-verkürzten cDNA par für dieN-terminal um 77 Aminosäuren deletierte APS-Reduktase aus C. roseus im Shuttle-VektorpYPGE15 (Prior, 1996, vorherige Bezeichnung: pYPGE-par-del1).pYPGEcysH:1.204 bp großes EcoRI/XhoI Fragment mit dem Strukturgen cysH für die PAPS-Reduktaseaus E. coli im Shuttle-Vektor pYPGE15 (Prior, 1996).pYPGEakn:1.019 bp großes BglII/XhoI Fragment mit der cDNA akn für die APS-Kinase aus A. thalianaim Shuttle-Vektor pYPGE15 (Prior, 1996).pUB5:1.183 Bp großes EcoRI/HindIII Fragment mit dem Strukturgen cysH für die PAPS-Reduktaseaus E. coli im Vektor pBTac1 (Berendt, 1995).

Material und Methoden 78

PBSSKactin1:770 Bp großes EcoRI/XhoI Fragment mit der cDNA actin1 im Vektor Bluescript-II-SK-. DiecDNA resultiert aus dem tob71-Gen für Aktin1 aus N. tabacum (ACC U60490) und wurdefreundlicherweise von Dr. Joachim Uhrig (Max Planck Institut für Züchtungsforschung, Köln)zur Verfügung gestellt.

In dieser Arbeit hergestellte Plasmide:

Die an dieser Stelle angeführte PCR sowie die Overlap-extension PCR erfolgte nach denAngaben in Kapitel 5.10.5, die Oligonukleotide sind Kapitel 5.7 zu entnehmen, dieKlonierungstechniken (Restriktion und Ligation) wurden nach Kapitel 5.10.4 durchgeführt, dieSequenzierung erfolgte gemäß Kapitel 5.10.9.

pET16bparMutE5:1.258 Bp großes BamHI/BglII PCR-Fragment mit einer mutierten cDNA par im VektorpET16b zur Expression einer N-terminal um 70 Aminosäuren deletierten, mutierten (E317→G)APS-Reduktase aus C. roseus als (His)10-Fusionsprotein.Herstellung: 1). Overlap-extension PCR (Matrize und Oligonukleotide vgl. 5.10.5), 2).Restriktion des PCR-Produktes durch die Endonukleasen BamHI und BglII, 3). Ligation mitdem BamHI restringierten Vektor pET16b, 4). Sequenzierung des Konstruktes mit denOligonukleotiden PRpET16b-Term und T7.pET16bparMutQ7:1.258 Bp großes BamHI/BglII PCR-Fragment mit einer mutierten cDNA par im VektorpET16b zur Expression einer N-terminal um 70 Aminosäuren deletierten, mutierten (Q220→L)APS-Reduktase aus C. roseus als (His)10-Fusionsprotein.Herstellung: 1). Overlap-extension PCR (Matrize und Oligonukleotide vgl. 5.10.5), 2).Restriktion des PCR-Produktes durch die Endonukleasen BamHI und BglII, 3). Ligation mitdem BamHI restringierten Vektor pET16b, 4). Sequenzierung des Konstruktes mit denOligonukleotiden PRpET16b-Term und T7.pET16bpar∆2:747 Bp großes BamHI PCR-Fragment der 5´- und 3`-verkürzten cDNA par im VektorpET16b zur Expression der Aminosäuren P77 bis G322 der APS-Reduktase aus C. roseus als(His)10-Fusionsprotein.Herstellung: 1). Amplifizierung der 5´- und 3`-verkürzten cDNA par durch PCR (Matrize:pCrpar4, Oligonukleotide: PRparMetBam und PRparBamDel, Primeranlagerung: 50 °C), 2).Restriktion des PCR-Produktes durch die Endonuklease BamHI, 3). Ligation mit dem BamHIrestringierten Vektor pET16b, 4). Sequenzierung des Konstruktes mit den Oligonukleotiden T7

und pET16b-Term.pKSpar∆2:747 Bp großes BamHI Fragment aus pET16bpar∆2 im Vektor pBluescript-II-KS+, kodiert fürdie Aminosäuren P77 bis G322 der APS-Reduktase aus C. roseus als lacZ-Fusion.Herstellung: Subklonierung des BamHI-Fragments aus dem Plasmid pET16bpar∆2 inpBluescript-II-KS+ im Leserahmen des lacZ-Gens.

Material und Methoden 79

pYPGEpar∆2:750 Bp großes BamHI PCR-Fragment der 5´- und 3`-verkürzten cDNA par im Shuttle-VektorpYPGE15 zur Expression der Aminosäuren P77 bis G322 der APS-Reduktase aus C. roseus inS. cerevisiae.Herstellung: 1). Amplifizierung der 5`- und 3`- deletierten cDNA par durch PCR (Matrize:pCrpar4, Oligonukleotide: PRparMetBam und PRpar∆Stop, Primeranlagerung: 55°C) 2).Restriktion des PCR-Produktes durch die Endonuklease BamHI , 3). Ligation mit dem BamHIrestringierten Vektor pYPGE15, 4). Sequenzierung des Konstruktes mit den OligonukleotidenPRparSeq1 und PRparSeq2.pBS1.R.2:1.423 Bp großes BamHI PCR-Fragment mit einer 3`-modifizierten cDNA par im VektorpBluescript-II-KS+. Die cDNA kodiert für die APS-Reduktase aus C. roseus mit einemC-terminalen Histidin-Hexapeptid.Herstellung: 1). Amplifizierung der 3`-modifizierten cDNA par durch PCR (Matrize: pCrpar4,Oligonukleotide PRpar4Bam und PRpar6HisBam, Primeranbindung: 45°C), 2). Restriktiondes PCR-Produktes mit der Endonuklease BamHI, 3). Ligation mit dem BamHI restringiertenVektor pBluescript-II-KS+, 4). Sequenzierung des Konstruktes mit den Oligonukleotiden T3,PRparSeq2, PRparSeqA258-D264, PRparSeq3 und T7.pBINAr1.R.2.1:1.423 Bp BamHI Fragment mit der 3`-modifizierten cDNA par aus pBS1.R.2 im binärenVektor pBINAr(Kan).Herstellung: Subklonierung des BamHI-Fragments aus pBS1.R.2 in pBINAr(Kan).pBS2.N.2: 1.185 Bp großes BamHI PCR-Fragment mit einer 5`-verkürzten und 3`-modifizierten cDNApar im Vektor pBluescript-II-KS+. Die cDNA kodiert für die N-terminal um 77 Aminosäurendeletierte APS-Reduktase aus C. roseus mit einem C-terminalen Histidin-Hexapeptid.Herstellung: 1). Amplifizierung der 5`-verkürzten und 3`-modifizierten cDNA par durch PCR(Matrize: pBS1.R.2, Oligonukleotide: PRparMetBam und T7, Primeranbindung: 50°C), 2).Restriktion des PCR-Produktes mit der Endonuklease BamHI, 3). Ligation mit dem BamHIrestringierten Vektor pBluescript-II-KS+, 4). Sequenzierung des Konstruktes mit den PrimernT3, PRparSeqA258-D264, PRparSeq3 und T7.pBINAr2.N.2.13 : 1.185 Bp großes BamHI Fragment der 5`-verkürzten und 3`-modifizierten cDNA par auspBS2.N.2 im Vektor pBINAr(Kan).Herstellung: Subklonierung des BamHI-Fragments aus pBS2.N.2 in pBINAr(Kan).pBS3.2:1.325 Bp großes KpnI PCR-Fragment mit einer 5`-verkürzten cDNA par im VektorpBluescript-II-KS+. Die cDNA kodiert für die N-terminal um 70 Aminosäuren deletierte APS-Reduktase aus C. roseus mit einem N-terminalen (His)10-Fusionspeptid.Herstellung: 1). Amplifizierung der 5`-verkürzten cDNA par durch PCR (Matrize:pET16bpar∆1, Oligonuleotide: PR5´pETKpn und PR3parKpn, Primeranbindung: 55°C), 2).Restriktion des PCR-Produktes mit der Endonuklease KpnI, 3). Ligation mit dem KpnIrestringierten Vektor pBluescript-II-KS+, 4). Sequenzierung mit den Primern PR5´pETKpnund PR3parKpn.

Material und Methoden 80

pBINAr3.2.17:1.325 Bp großes KpnI Fragment mit einer 5`-verkürzten cDNA par aus pBS3.2 im binärenVektor pBINAr(Kan)Herstellung: Subklonierung des KpnI-Fragments aus pBS3.2 in pBINAr(Kan).pBTac 2.N.2.3:1.182 Bp großes BamHI Fragment aus pBS2.N.2 im Vektor pBTac1 zur Expression einerN-terminal um 77 Aminosäuren deletierten APS-Reduktase aus C. roseus mit C-terminalemHistidin-Hexapeptid.Herstellung: Subklonierung des BamHI-Fragments aus pBS2.N.2 in pBTac1.

5.7 Oligonukleotide und Sonden

Für die Herstellung und Sequenzierung der Plasmidkonstrukte, die ortsgerichtetenMutagenesen und die Analyse transgener Tabakpflanzen durch PCR bzw. RT-PCR wurdenverschiedene cDNA- oder genspezifische Oligonukleotide und vektorhomologe Primer bei denFirmen Eurogentec (Belgien), Amersham/Pharmacia (Freiburg) und MWG Biotech(Ebersberg) synthetisiert. Unterstrichene Bereiche kennzeichnen Erkennungssequenzen fürRestriktionsendonukleasen. Basenfehlpaarungen sind fett/kursiv gedruckt. Ein Start- oderStopcodon ist durch eckige Klammern markiert.

par-homologe Oligonukleotide (APS-Reduktase aus C. roseus):

PRparSeq1: 24mer:5`-CCCACTGAAAGCAATAGCTATATC-3`

PRparSeq2: 24mer:5`-GATATAGCTATTGCTTTCAGTGGG-3`

PRparSeqA258-D264: 18mer:5`-CTAATGTGGAAGGAAAGG-3`

PRparSeq3: 23mer:5`-GCTGGTTCTGGTGTAAAAGTTGG-3`

PRparC317G: 33mer:5`-GCCAAAGCAAAGGAAGGTGGGTTACACAAAGGG-3`

PRparC137Grev: 33mer:5`-CCCTTTGTGTAACCCACCTTCCTTTGCTTTGGC-3`

PRparQ220L5`: 24mer:5`-GGATCACTGGGCTGAGGAAAGATC-3`

PRparQ220L3`: 24mer:5`-GATCTTTCCTCAGCCCAGTGATCC-3`

PRparMetBam: 38mer:5`-CACACAGGATCCA[ATG]CCCGAGGTTGAAGAGAAAGTTG-3`

PRparBamDel: 24mer:5`-CACACAGGATCCCCTTTGTGTAAC-3`

Material und Methoden 81

PRpar∆Stop: 36mer:5`-GTGTGTGGATC[CTA]CCCTTTGTGAACCCACATTCC-3`

PRpar4Bam: 28mer:5`-CACACAGGATCCTGGAA[ATG]GCTTTGGC-3`

PRpar6HisBam: 56mer:5`-GTGTGGATCC[TCA]GTGATGGTGATGGTGATGTCGCAGGGC

ATTAACAAAAGCCATC-3`PR3 parKpn: 29mer:

5`-GTGTGTGGTACCGGGAT[TCA]TCGCAGGGC-3`PRparEnd: 24mer:

5`-[TCA]TCGCAGGGCATTAACAAAAGC-3`

actin1/tob71-homologe Oligonukleotide (Aktin1 aus N. tabacum):

PRactinfwd: 19mer:5`-GCTCCACGAGCTGTATTCC-3`

PRactinrev: 21mer:5`-AGTTCCTGTTCATAGTCGAGA-3`

pBluescript-II-KS/SK- bzw. pET16b-homologe Oligonukleotide:

T3: 20mer:5`-TAACCCTCACTAAAGGGAAC-3`

T7: 18mer:5`-AATACGACTCACTATAGG-3`

PRpET16b-Term: 18mer:5`-GCTAGTTATTGCTCAGCG-3`

PR5`pETKpn: 30mer:5`-CACACAGGTACCGGAGATATACC[ATG]GGCC-3`

PRpETpar10His: 25mer:5`-ACC[ATG]GGCCATCATCATCATCATC-3`

pBINAr(Kan)-homologe Oligonukleotide:

PRnptIIIBac1: 23mer:5`-CATATCCAATTCGGCTAAGCGGC-3`

PRnptIIIBac2: 23mer:5`-CCGTCGATACTATGTTATACGCC-3`

PRnptIIPla1: 22mer:5`-AAGATGGATTGCACGCAGGTTC-3`

PRnptIIPla2: 22mer:5`-CATTTCGAACCCCAGAGTCCCG-3`

Material und Methoden 82

Digoxigenin-(Dig)-markierte Sonden:

CrparDig-Sonde:767 Bp große Sonde, gewonnen über PCR (vgl. 5.10.5) mit der Matrize pCrpar4 (vgl. 5.6)und den Oligonukleotiden PRparMetBam und PRparBamDel (s. o.), Anbindungstemperaturder Oligonukleotide: 50°C, Markierung über Digoxigenin-Desoxyuridintriphosphat(Dig-dUTP, vgl. 5.10.7), Nachweisgrenze im Dot-Blot (vgl. 5.10.8): 60 pg pCrpar4.

NtactinDig-Sonde:605 Bp große Sonde, gewonnen über PCR (vgl. 5.10.5) mit der Matrize pBSSKactin1 (vgl.5.6) und den Oligonukleotiden PRactinfwd und PRactinrev (s. o.), Anbindungstemperatur derOligonukleotide: 58°C, Markierung über Digoxigenin-Desoxyuridintriphosphat (Dig-dUTP,vgl. 5.10.7), Nachweisgrenze im Dot-Blot (vgl. 5.10.8): 50 pg pBSSKactin1.

5.8 Bakterien- und Hefeanzucht

Anzucht von Escherichia coli in Voll- und Minimalmedien:

Luria-Bertani-Medium (LB) (Sambrook et al., 1989):10 g/l NaCl, 10 g/l Baktotrypton, 5 g/l Hefe-Extrakt pH 7.5(mit 2 N NaOH)

Vogel-Bonner-Medium (VBB) (Vogel und Bonner, 1956):20 g/l Glukose, 20 µM Thiamin-HCl, 1x VBB-Salze (s. u.),1 % (v/v) SL4 (s. u.)

• VBB-Salze: 10 mg MgSO4, 100 g Citronensäure x H2O, 500 g K2HPO4

(50x) wasserfrei, 175 g Na(NH4)HPO4 x 4 H2O ad 1 l mit A. dest.• SL 4: 500 mg EDTA, 200 mg FeSO4 x 7 H2O, 100 ml SL 6 (s. u.)

ad 1 l mit A. dest.• SL6: 100 mg ZnSO4 x 7 H2O, 30 mg MnCl2, 300 mg H3BO3,

200 mg CoCl2 x 6 H2O, 10 mg CuCl2 x 2 H2O, 20 mg NiCl2 x6 H2O, 30 mg Na2MoO4 x 2 H2O ad 1 l mit A. dest.

Dem VBB-Minimalmedium wurden zur Kultivierung von E. coli JM96 FAK (vgl. 5.3)Aminosäuren in folgenden Konzentrationen zugesetzt:

0,16 g/l Histidin, 0,18 g/l Arginin, 0,12 g/l Threonin, 0,132 g/lLeucin, 0,21 g/l Tryptophan und 0,12 g/l Cystein

Für Festmedien wurden o. a. Lösungen 1,5 % (w/v) Bakto-Agar zugesetzt.Sämtliche Medienkomponenten wurden entweder autoklaviert (20 min, 121 °C, 1 barÜberdruck) oder bei Hitzeempfindlichkeit sterilfiltriert (45 µm Porenweite, Einmalfilter,

Material und Methoden 83

Schleicher & Schuell). Zur Selektion einer Antibiotikaresistenz wurden 100 mg/l Ampicillin,10 mg/l Tetracyclin, 20 mg/l Kanamycin bzw. 50 mg/l Chloramphenicol eingesetzt.

Die Anzucht von E. coli Bakterienzellen in kleinen Kulturvolumina (ca. 3 ml) erfolgte insterilen Greiner-Gefäßen in einem Horizontal-Inkubationsschüttler (New Brunswick Scientific,Edison, New Jersey) bei 37 °C mit 200 - 250 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 16 - 18 h.Die Kulturen wurden jeweils mit einer Einzelkolonie oder 50 µl einer Flüssigstammkulturangeimpft. Bei größeren Kulturvolumina (10 - 300 ml) wurden zur Anzucht sterile Schikanen-erlenmeyerkolben verwendet, die mit einer über Nacht gewachsenen Vorkultur 1 %ig (v/v)angeimpft wurden. Für Anzuchten im großen Maßstab wurde ein 3 l Fermenter (Meredos,Göttingen) verwendet, wobei den hierin angezogenen Kulturen 1,5 % Glycerin zugesetztwurde. Für Bakterienstämme mit induzierbarem Plasmid mit T7lac-Promotor bzw. tac-Promotor (pET16b- bzw. pBTac-Derivate, vgl. 5.6) wurden die Kulturen bei einer OD595

(optische Dichte bei λ = 595 nm) von 0,5 - 0,7 mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid(IPTG) versetzt und für 2 - 3 h weiter bei 37 °C inkubiert. Zur langfristigen Lagerung vonBakterienzellen wurden 30 %ige (v/v) Glycerinkulturen angelegt und bei -80 °C gelagert.

Anzucht von Agrobacterium tumefaciens GV2260:

YEB-Medium: 0,5 % (w/v) Rindfleischextrakt, 0,1 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v)Baktopepton, 0,5 % (w/v) Saccharose, 0,49 g/l MgSO4

Die Verfestigung des YEB-Mediums erfolgte durch Zugabe von 1,5 % (w/v) Bakto-Agar.Nach dem Autoklavieren (s. o.) wurden dem Medium 100 mg/l Ampicillin, 100 mg/lRifampicin bzw. 20 mg/l Kanamycin zugesetzt.Agrobakterien wurden entweder auf Platten oder in Flüssigkultur (2 - 20 ml) bei 28 °C für2 Tage propagiert.

Anzucht von Saccharomyces cerevisiae in Voll- und Minimalmedien:

YPD: 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Bakto-Pepton, 20 g/l Glukose

Minimalmedium: 2 % (w/v) Glukose, 6 % (v/v) Salzlösung (s. u.), 20 mg/l HistidinpH 6.0 mit 1 N KOH

Für Festmedien wurde obigen Lösungen 1,5 % (w/v) Bakto-Agar zugegeben. Nach demAutoklavieren wurden dem abgekühlten Minimalmedium 0,625 % (v/v) der hitzelabilenVitaminlösung (s. u) zugesetzt. Zur Anzucht der APS-Kinase-defizienten HefemutanteSaccharomyces cerevisiae MET14 und der PAPS-Reduktase-defizienten Mutante MET16(vgl. 5.3) wurden dem Minimalmedium außerdem 20 mg/l Methionin und 30 mg/l Cysteinbeigefügt. Für S. cervisiae MET16 wurden zusätzlich 30 mg/l Leucin verwendet. Einemögliche Komplementation dieser Mutanten wurde durch deren wiedererlangteCysteinprototrophie auf Minimalmedium ohne Cystein und Methionin überprüft.

Material und Methoden 84

• Salzlösung (bezogen auf 19 l Endvolumen): a) Salze: 2500 g (NH4)2SO4, 500 g K2HPO4,250 g MgSO4 x 6 H2O, 50 g NaCl, 50 g CaCl2, b) Spurenelemente: 250 mg H3BO3, 200 mgZnSO4 x 7 H2O, 200 mg MnSO4 x H2O, 100 mg Na2MoO4, 100 mg FeCl3, 50 mg KJ,20 mg CuSO4

• Vitaminlösung (bezogen auf 1 l Endvolumen): 1000 mg Inosit, 200 mg Calcium-pantothenat, 200 mg Nikotinsäure, 200 mg Pyridoxal-HCL, 200 mg Thiaminhydrochlorid,100 mg p-Aminobenzoesäure, 100 mg Riboflavin, 1 mg Biotin, 1 mg Folsäure

Die Kultivierung von S. cerevisiae Zellen erfolgte in geeignetem Anzuchtmedium bei 30 °Cund guter Belüftung für 16 - 36 h in Submerskulturen. Dabei betrug das Kulturvolumenmaximal 1/10 des Gefäßvolumens. Vorkulturen (ca. 10 ml) wurden mit Einzelkolonien oder10 µl einer Stockkultur beimpft, über Nacht angezogen und dienten als Ausgangsmaterial zurErstellung größerer Flüssigkulturen. Die auf Festagarplatten kultivierten Hefezellen wurdennach dem Ausplattieren 2 - 14 Tage bei 30 °C inkubiert. Zur langfristigen Lagerung dieserZellen wurden 15 %ige (v/v) Glycerinkulturen angelegt und bei -80 °C gelagert.

5.9 Pflanzenanzucht

Nicotiana tabacum Samsun NN (SNN) Pflanzen:

Murashige & Skoog Medium (MS) (Murashige und Skoog, 1962):4,31 g/l MS-Salzmischung (Gibco, Paisley, Schottland), 0,5 % (v/v)Vitamin-Stocklösung (200fach, s. u. ), 20 g/l Saccharose

Selektionsmedium: 4,31 g/l MS-Salzmischung, 0,5 % (v/v) Vitamin-Stocklösung (200fach,s. u.), 16 g/l D-Glukose

Der pH-Wert wurde jeweils mit 1 N KOH auf 5.7 - 5.8 eingestellt. Zur Verfestigung wurdeden Medien 6,5 g/l BitekTM-Agar hinzugefügt. Die Sterilisation erfolgte für 20 min bei 121 °Cund 1 bar Überdruck.

Vitaminlösung (200fach): 0,1 g/l Nikotinsäure, 0,1 g/l Pyridoxin-HCl, 0,02 g/l Thiamin-hydrochlorid, 0,4 g/l Glycin, 20 g/l Myo-Inositol

Nach dem Autoklavieren wurden den auf ca. 50 °C abgekühlten Nährmedien gegebenfallsAntibiotika bzw. Hormone in folgenden Konzentrationen zugesetzt:

500 mg/l β-Baktyl bzw. Cefotaxime, 50 mg/l Kanamycin 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphtylessigsäure (NAA)

Die Anzucht von Nicotiana tabacum (L.) var. Samsun NN Pflanzen erfolgte unterKurztagbedingungen (9 h Licht, 15 h Dunkel) bei 24 - 26°C bzw. 18°C im Dunkel.Die Pflanzen wurden als Sterilkulturen in Klimakammern auf festem MS-

Material und Methoden 85

Medium (s. o.) in 500 ml Weckgläsern angezogen. Die Vermehrung der Pflanzen erfolgtevegetativ, indem der apikale Teil des Pflanzensprosses alle 4 – 6 Wochen in frisches Mediumüberführt wurde.

5.10 Molekularbiologische Methoden

5.10.1 Herstellung und Tansformation kompetenter Zellen

Die Präparation und Transformation kompetenter E. coli Zellen erfolgte entweder durch dieRbCl-Methode (Protokoll 3, Hanahan, 1985) mit anschließender Transformation nach einemStandardprotokoll von Sambrook (Sambrook et al., 1989) oder durch Elektroporation (Doweret al., 1988) mit dem „Gene Pulser“ (Biorad) unter folgenden Bedingungen: Spannung:2,5 kV, Kapazität: 25 µF, Widerstand: 200 , Zeitkonstante: 4,5 - 4,7 ms. Für dieTransformation von E. coli BL21(DE3) pLysS wurde die Methode von Chung und Miller(1989) verwendet.

Zur Transformation von S. cerevisiae wurde eine „Schnellmethode“ nach Rose (1992)angewendet.

Für die Transformation von A. tumefaciens wurden 20 ml YEB-Medium mit Rifampicin undAmpicillin (vgl. 5.8.) mit einer A. tumefaciens Einzelkolonie beimpft und für. 2 Tage bei 28°Cbis zur stationären Phase angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3000 g, 15 min,4°C ) geerntet. Das Sediment wurde anschließend 7 mal mit jeweils 1 Volumen eiskaltem,sterilem Wasser gewaschen und schließlich in 1/20 Volumen 10 % (v/v) Glycerin (sterilfiltriert)resuspendiert. Die Zellen wurden in 45 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und indieser Form bis zu ihrem Gebrauch gelagert (verändert nach Neumann et al., 1982).Zur Transformation dieser kompetenten Zellen wurden ca. 2 µg Plasmid-DNA mit 40 µl derobigen Zellsuspension vermischt, für 2 - 3 min auf Eis inkubiert und anschließend in eineeiskalte Elektroporation-Küvette (2 mm, PEQlab, Erlangen) überführt. Die Elektroporationerfolgte mit dem „Gene Pulser“ bei 2,5 kV, 25 µF und 400 Ω. Zur Regeneration dertransformierten Zellen wurde dem Ansatz sofort nach dem elektrischen Impuls 1 ml YEB-Medium ohne Antibiotika zugegeben. Nach 1stündiger Inkubation im Schüttler bei 28°Cwurde das Volumen der Probe durch Zentrifugation (Tischzentrifuge: 4000 rpm, 4 min,Raumtemperatur) auf 0,1 ml reduziert. Die transformierten Zellen wurden auf einemSelektivmedium mit Rifampicin, Ampicillin und Kanamycin (vgl. 5.8) ausplattiert (verändertnach Mersereau et al, 1990).

Material und Methoden 86

5.10.2 Agrobakterien-vermittelte Transfomation von Nicotiana tabacum Pflanzen(verändert nach Rogers et al., 1986)

Erstellung der Cokultur:

Für die Transformation von N. tabacum-Pflanzen wurden die Agrobakterien des StammesA. tumefaciens GV2260 (vgl. 5.3) mit einem pBINAr(Kan)-Derivat (vgl. 5.6) transformiert(vgl. 5.10.1). Diese Transformanden wurden über 2 Tage bei 28°C als 15 ml Kultur angezogen(vgl. 5.8), durch Zentrifugation (3000 g, 5 min, 4°C) geerntet und in 30 ml YEB-Medium (vgl.5.8) resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde in eine sterile Petrischale überführt.Für die Transformation war verwundetes Pfanzengewebe zu verwenden. Dazu wurden Blättervon steril herangezogenen N. tabacum Sprossen (vgl. 5.4) entrippt und in ca. 0,5 x 0,5 cmgroße Stücke geschnitten. Die Blattstücke wurden in die obige Agrobakterien-Suspensionüberführt und für 3 - 5 min mit der Blattunterseite nach oben darin belassen. Die Blattstückewurden darauffolgend mit der Blattoberseite nach oben dicht nebeneinander auf MS-Agarplatten ohne Antibiotika (vgl. 5.9) gelegt und 2 Tage im Dunkeln bei Raumtemperaturinkubiert.

Selektion und Regeneration von Gewebestücken:

Nach der Cokultur-Phase wurden die Blattstückchen auf Agarplatten mit einemSelektionsmedium überführt, welches Hormone zur Induktion der Kallusbildung undAntibiotika enthielt (vgl. 5.9). β-Baktyl bzw. Cefotaxime diente dabei der Abtötung derAgrobakterien, Kanamycin zur Selektion transformierter N. tabacum Zellen. DieSelektionsplatten wurden unter Kurztagbedingungen (9 h Licht, 15 h Dunkel) bei 25°C bzw.18°C inkubiert und alle 7 - 11 Tage erneuert bis ein deutliches Kallusgewebe erkennbar wurde.Diese Kalli wurden in 0,5 l Weckgläser mit Selektionsmedium inklusive Hormonen undAntibiotika überführt und unter Kurztagbedingungen weiter inkubiert bis auf den Kalli eineSproßbildung erkennbar war. Dabei wurde das Nährmedium ebenfalls alle 7 – 10 Tageerneuert. Von jedem Kallus wurde anschließend ein Erstsproß abgeschnitten und in 0,5 lWeckgläser mit MS-Festmedium inklusive Kanamycin und β-Baktyl bzw. Cefotaximeüberführt. Sproße, die Wurzeln ausbildeten, wurden nach 4 – 6 Wochen durch Abschneidendes Apikalteils in frisches MS-Festmedium mit Kanamycin und β-Baktyl bzw. Cefotaximeumgesetzt und weiterhin vegetativ vermehrt.

5.10.3 Präparation von Nukleinsäuren

Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien:

Zur Plasmidpräparation aus Bakterienzellen im kleinen Maßstab wurde das Wizard™ MiniprepDNA Purification System (Promega, Mannheim) eingesetzt. Die Präparation von Plasmid-DNA im mittleren Maßstab und zur Sequenzierung erfolgte mit Hilfe von Qiagen-tip 100Säulen (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers.

Material und Methoden 87

Präparation von Gesamt-DNA aus Tabakblättern:

Die Isolierung von Gesamt-DNA aus Tabak erfolgte ausgehend von 100 - 200 mgBlattmaterial mit dem PUREGENE® DNA Isolation Kit (Gentra Systems, Minneapolis, USA)nach den Angaben des Herstellers. Abweichend vom Protokoll wurde das Ausgangsmaterialvor Zugabe der Zelllyselösung in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. Auf dieseWeise konnten jeweils 1,5 - 2 µg Tabak-DNA isolierten werden.

Präparation von Gesamt-RNA aus Pflanzenmaterial:

Zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus Tabakblättern im kleinen Maßstab wurde das RNeasyPlant Mini Kit (Qiagen, Hilden) verwendet.Ausgehend von 80 - 100 mg in flüssigem Stickstoff gefrorenem, zermörsertem Blattmaterialwurden 24 - 50 µg Gesamt-RNA gewonnen. 9 µg dieser Gesamt-RNA wurden anschließendmit 9 U RQ1 RNase-freier DNase (Promega, Mannheim) nach Angaben des Herstellersinkubiert. Der Reaktionsansatz wurde danach mit RNase-freiem Wasser auf 100 µl aufgefüllt.Durch zweimalige Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und zweiweitere Extraktionen mit Chloroform:Isoamlylalkohol (24:1) konnte die DNase aus demAnsatz entfernt werden. Die RNA wurde im weiteren mit 1/10 des Ansatzvolumens 5 MAmmoniumacetat und 3 Volumen 100 %igem Ethanol versetzt. Die für 2 Stunden bei -80°Cgefällte RNA wurde nach einem Waschschritt mit 70 %igem Ethanol in 20 µl RNase-freiemWasser resuspendiert und konnte für die RT-PCR (vgl. 5.10.6) verwendet werden.Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Tabakblättern im großen Maßstab erfolgte verändertnach Chomczynski und Sacchi (1987). Das Pflanzenmaterial wurde dazu in flüssigemStickstoff eingefroren, mit einem Mörser zerrieben und anschließend in GTC-Puffer(4M Guanidinisothiocyanat, 25 mM Na-Citrat pH 7.0, 0,5 % (w/v) N-Laurylsarkosin, 100 mMβ-Mercaptoethanol) aufgenommen. Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten gemäß Uhrig(1996). Die so gewonnene RNA konnte für Northern-Blots genutzt werden.

5.10.4 Klonierungstechniken und Agarosegelelektrophorese

Standardtechniken wie Restriktionen mit Endonukleasen, Ligationen und Modifizierungen vonDNA-Enden sowie die Agarosegelelektrophorese von DNA und die denaturierendeAgarosegelelektrophorese von RNA wurden gemäß Sambrook et al. (1989) durchgeführt. DieElution von DNA aus Agarosegelen erfolgte mit Hilfe des Nucleospin Extract Kit(Macherey/Nagel, Düren) nach Angaben des Herstellers.

5.10.5 Amplifizierung von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Standard-PCR:Die Standard-PCR erfolgte nach der Methode von Mullis und Faloona (1986). Die Ansätzeenthielten 10 - 50 ng Plasmid DNA als Matrize, den vom Hersteller angegebenen

Material und Methoden 88

Reaktionspuffer, 0,1 - 0,2 mM Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP´s), 10 - 50 pmol jedesOligonukleotids, 1,5 - 2,5 U Biotherm-DNA-Polymerase (Genecraft, Münster) oder 2,5 - 5 UPfu-DNA-Polymerase (Stratagene, Amsterdam Zuidoost, NL). Die Reaktion wurde im TRIO-Block (Biometra) durchgeführt. Die Denaturierungstemperatur betrug 92 - 94 °C. Nach einerersten Denaturierung für 3 - 5 min erfolgte in den weiteren Zyklen eine Denaturierung für1 min. Die Primeranlagerung erfolgte, wenn nicht anders angegeben, für 1 min. DieHybridisierungstemperatur der Oligonukleotide variierte in Abhängigkeit ihrer Länge undHomologie zur eingesetzten DNA-Matrize und ist an entsprechener Stelle bei derPlasmidherstellung (vgl.5.6) oder unten angegeben. Die Primerverlängerung wurde bei 72°Cdurchgeführt. Die Elongationszeit wurde anhand der zu erwartenden Produktgröße ermittelt,wobei die Prozessivität der verwendeten Polymerase zugrunde gelegt wurde. Im letzten PCR-Zyklus wurde die Elongation auf 3 - 5 min ausgedehnt.

Overlap-extension PCR:Für die gerichtete Mutagenese wurde die Overlap-extension PCR (Ho et al., 1989, Horton undPease, 1991) durchgeführt.Zum Austausch des Cystein317 in der APS-Reduktase aus C. roseus gegen einen Glycinresterfolgte die PCR mit dem Oligonukleotidpaar PRparC317G und PRparC317Grev und denPrimern T3 und T7 (vgl. 5.7). Als Matrize für die PCR (Primeranlagerung: 50°C) wurde dasPlasmid pCrpar2 (vgl. 5.6) verwendet. Die eingefügte Mutation wurde durch Sequenzierungdes erstellten Plasmids pETparMutE5 mit den Oligonukleotiden PRpET16b-Term und T7

(vgl. 5.7) überprüft.Für die Mutagenese von Glutamin220 wurde eine Overlap-extension PCR mit denOligonukleotidpaaren PRparQ220L5` und PRparQ220L3` sowie T3 und T7 (vgl. 5.7,Primeranlagerung: 50°C) durchgeführt. Als Matrize diente wiederum das Plasmid pCrpar2.Die erfolgreiche Mutagenese wurde durch Sequenzierung des Plasmids pETparMutQ7 mit denoben angegebenen Oligonukleotiden verifiziert.

PCR zur Untersuchung der genomischen Integration transferierter DNA aus pBINAr(Kan)-Derivaten:Für die PCR wurden jeweils etwa 100 ng Gesamt-DNA aus N. tabacum (vgl. 5.10.3) alsMatrize genutzt und mit einem Reaktionsmix für mehrere Ansätze versetzt [1 xReaktionspuffer, 1,5 U Biotherm DNA-Polymerase (Genecraft, Münster), 100 µM dNTPs,0,5 µM jedes Oligonukleotids (vgl. 5.7)]. Für die Primeranlagerung wurden folgendeBedingungen gewählt:

Oligonukleotidpaar Hybridisierungtemperatur Anlagerungsdauer

PRnptIIPla1PRnptIIPla2

65°C 30 s

PRnptIIIBac1PRnptIIIBac2

58°C 30 s

PRactinfwdPRactinrev

60°C 60 s

Material und Methoden 89

5.10.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)

Aus apikalen N. tabacum Transformanden- bzw. Wildtypblättern 6 Wochen alter Pflanzenwurde die Gesamt-RNA präpariert und mit RNase-freier DNase behandelt (vgl. 5.10.3). DieRNA-Isolierung erfolgte immer nach Beendingung der 15stündigen Dunkelphase derPflanzenanzucht (vgl. 5.9). Die Integrität der RNA wurde vor der reversen Transkriptiondurch Ethidiumbromidfärbung im Agarosegel überprüft.Für die cDNA-Synthese wurden durch die retrovirale SUPERSCRIPT™ II RNase H- ReverseTranskriptase (Gibco BRL, Paisley, Schottland) jeweils 1,4 µg DNase behandelte Gesamt-RNA mit jeweils 2 pmol der genspezifischen 3`-Primer (vgl. 2.4.4) nach den Angaben desHerstellers revers transkribiert. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms und einer anschließendenInkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die zur cDNA komplementäre RNA mit2 U RNaseH (MBI Fermentas, Litauen) abgedaut (20 min, 37°C).In der folgenden PCR wurden 2 µl dieser Erststrang-Synthese als Matrize eingesetzt. DieAmplifizierung der cDNA erfolgte im PCR-Ansatz gemäß dem Protokoll der Firma Gibco fürdie retrovirale SUPERSCRIPT™ II RNase H- Reverse Transkriptase mit 10 - 15 pmol derjeweiligen Amplifizierungsprimer (vgl. 2.4.4) und 2,5 U Biotherm-DNA-Polymerase(Genecraft, Münster).

5.10.7 Markierung von DNA mit Digoxigenin-Desoxyuridintriphosphat

Die nicht-radioaktive Markierung von DNA erfolgte mit dem „DIG-DNA-Labelling andDetection Kit“ (Roche, Mannheim) nach Angaben des Herstellers.Die Markierung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten wurde in der PCR (vgl. 5.10.5) unterVerwendung eines Desoxythymidin-5´-triphosphat- (dTTP) : Digoxigenin-11-desoxyuridin-5´-triphosphat (Dig-11-dUTP) -Gemisches im Verhältnis 5 : 1 vorgenommen.

5.10.8 Northern-Blot, Dot-Blot und Detektion von DNA/RNA- bzw. DNA/DNA-Hybriden

Für Northern-Blots wurde 15 - 30 µg Gesamt-RNA (vgl. 5.10.3) in denaturierenden 1 %igen(w/v) Agarosegelen mit Formaldehyd (vgl. 5.10.4) aufgetrennt. Die aufgetrennte RNA wurdedurch Kapillarkräfte auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und hier durch 2stündigesBacken bei 80°C immobilisiert (Sambrock et al., 1980).Alle Hybridisierungs- und Waschschritte sowie der Farbnachweis mit den Substraten4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP)erfolgten nach den Angaben im „Dig System User`s Guide for Filter Hybridisation“ (Roche,Mannheim).Die Dot-Blots zur Bestimmung der Sondenempfindlichkeit wurden wie im „Dig System User`sGuide for Filter Hybridisation“ beschrieben durchgeführt.

Material und Methoden 90

5.10.9 Sequenzierung von DNA

Die Sequenzierung doppelsträngiger Plasmide erfolgte nach der Didesoxy-KettenabbruchMethode von Sanger (Sanger et al., 1977) mit vektor- oder par-homologen Oligonukleotiden(vgl. 5.7) und wurde von der Firma Seqlab (Göttingen) durchgeführt.

5.10.10 In vitro Transkription, in vitro Translation und Chloroplastenimport

Zur in vitro Transkription wurde das Plasmid pCRpar4 (vgl. 5.6) mit der Endonuklease XhoIlinearisiert (vgl. 5.10.4). Die Transkription erfolgte mit der T3 RNA-Polymerase (MBIFermentas, Litauen) für 2 h bei 37°C (Muckel und Soll, 1996). Die anschließende in vitroTranslation wurde unter Verwendung von [35S]-Cystein und [35S]-Methionin im Reticulocyten-Lysat (Amersham/Pharmacia, Freiburg) ohne Magnesiumacetat nach Waegemann und Soll(1991) durchgeführt. Das in vitro synthetisierte par-Genprodukt (Precursor) wurde zumImport in intakte Erbsenchloroplasten gemäß Lübeck et al. (1997) verwendet. Abweichendvon diesem Protokoll wurden Choroplasten äquivalent zu 50 µg Chlorophyll im 100 µl Import-Mix eingesetzt. Die Anbindung des Precursor-Proteins an die Chloroplasten erfolgte bei 4°Cfür 5 min im Dunkeln, der Import bei 25°C für 10 min im Licht. Zur Entfernung von Proteinen,die an die Chloroplastenoberfläche gebunden aber nicht, oder nicht vollständig importiertwurden, wurden die Importansätzte mit der Protease Thermolysin nach Lübeck undMitarbeitern (1997) nachbehandelt.Die in vitro Transkription, in vitro Translation und der Chloroplastenimport wurdenfreundlicherweise von Frau Dr. Lisa Heins, AG Prof. Dr. Jürgen Soll, Botanisches Institut derChristian-Albrechts-Universität zu Kiel durchgegeführt.

5.11 Rekombinante Proteinexpression in Escherichia coli, Zellaufschluß undProteinreinigung

5.11.1 Native Reinigung bakteriell exprimierter (His)10- und (His)6-Fusionsproteine

Zur Expression von (His)10-Fusionsproteinen rekombinanter pET16b-Vektoren in E. coliBL21(DE3) pLysS wurde in Anlehnung an die Vorschrift im „pET System Manual“ (Novagen1/95) verfahren. Die induzierten Expressionskulturen (vgl. 5.8) wurden nach einerWachtumszeit von 2 - 3 h geerntet (10.000 g, 4 °C, 15 min), in einem geeigneten VolumenAufschlußpuffer (AP: 20 mM Tris/HCl pH 8.0, 100 mM NaCl) resuspendiert und mittels einer„French press“ (Ribi Press, Sorvall, 20.000 psi, 5 - 15 °C) aufgeschlossen. DurchZentrifugation (20.000 g, 4 °C, 20 min) wurden die löslichen Proteine von Zelltrümmern undunlöslichen Bestandteilen getrennt. Das Pellet wurde anschließend erneut in AP resuspendiertund nochmals zentrifugiert (20.000 g, 4 °C, 20 min). Der bakterielle Rohextrakt wurde zurSäulenchromatographie an einer Talon™-Affinitätsmatrix (PT 1320-1, Clontech, Palo Alto,USA) eingesetzt (IMAC). Nach einem Waschschritt mit 50 mM Imidazol (in AP) konnte beieiner Imidazol-Konzentration von 200 mM (in AP) das jeweilige (His)10-Fusionsprotein eluiert

Material und Methoden 91

werden. Die Fusionsproteine wurden anschließend mit 50 % (v/v) Glycerin versetzt undbei - 80 °C gelagert.Zur bakteriellen Expression und Reinigung der vom Plasmid pBTac2.N.2.3 (vgl. 5.6) kodierten(His)6-APS-Reduktase wurde wie oben beschrieben verfahren. Bei der IMAC wurde nacheinem Waschschritt mit 15 mM Imidazol (in AP) zur Ablösung unspezifisch gebundenerProteine das (His)6-Fusionsprotein bei einer Imidazol-Konzentration von 50 mM (in AP)eluiert.Die gereinigte (His)10-PAPS-Reduktase (Lillig et al., 1999) wurde freundlicherweise vonChristopher H. Lillig, AG Dr. J. D. Schwenn, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum zur Verfügung gestellt.

5.11.2 Gewinnung von Gesamtprotein aus Bakterienlysaten für die SDS-PAGE

Zur Gewinnung von Gesamtprotein bakterieller Zelllysate für die SDS-PAGE (vgl. 5.12.2)wurden pro Slot eines 12-Taschenminigels 0,3 OD einer Bakterienkultur (vgl. 5.8)abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in Aufschlußpuffer (60 mM Tris/HClpH 6.8, 20 mM DTT, 1 % (w/v) SDS) resuspendiert und für mindestens 5 min bei ca. 80°Cgekocht. Anschließend wurden die lysierten Zellen in der Tischzentrifuge zentrifugiert(14.000 rpm, 10 min, Raumtemperatur). Der gewonnene Überstand, der die löslichenBestandteile enthielt, konnte für die Elektrophorese verwendet werden.

5.11.3 Proteinextraktion aus Saccharomyces cerevisiae Zur Gewinnung eines Proteinextraktes aus S. cerevisiae im kleinen Maßstab wurden dieHefezellen in Eppendorfgefäßen durch Zentrifugation (Tischzentrifuge 13.000 rpm, 1 min,4°C) geerntet und in eiskaltem Aufschlußpuffer (50 mM Tris/HCl pH 8.0, 100 mM NaCl,0,5 mM EDTA) resuspendiert. Der Aufschluß erfolgte durch mehrmaliges Vortexen mitGlasperlen, wobei die Probe zwischenzeitlich immer wieder auf Eis abgekühlt wurde. Dielöslichen Proteine wurden durch eine anschließende Zentrifugation (Tischzentrifuge 13.000rpm, 15 min, 4°C) erhalten und konnten zur Aktivitätsmessung (vgl. 5.14.2) verwendetwerden. 5.11.4 Proteinextraktion aus Pflanzenmaterial

Zur Bewahrung der Enzymaktivitäten wurden für die Extraktion der Proteine ausschließlichgekühlte Geräte und Puffer verwendet.

Isolierung löslicher Proteine aus Blättern von Nicotiana tabacum:

Die Präparation der löslichen Proteine aus apikalen Blättern 6 Wochen alter Tabakpflanzenerfolgte jeweils nach Beendigung der 15stündigen Dunkelphase der Pflanzenanzucht (vgl. 5.9).

Material und Methoden 92

Hierzu wurde das Blattmaterial mit 1 Volumen Aufschlußpuffer (50 mM Tris/HCl pH 8.0,10 mM β-Mercaptoethanol, 0,001 % Triton X-100) und 1,25 mM PMSF versetzt. DerZellaufschluß erfolgte mittels eines Potters. Zelltrümmer und andere unlösliche Bestandteilewurden durch eine zweimalige Zentrifugation (25.000 g, 30 min, 4°C) abgetrennt. Der sogewonnene Rohextrakt wurde mit pulverisiertem Ammoniumsulfat (75 %) über 20 min auf Eisgefällt. Nach Zentrifugation (25.000 g, 20 min, 4°C), Resuspendierung des Pellets in 1/3 desAusgangsvolumens 50 mM Tris/HCl pH 8.0 sowie erneuter Zentrifugation (25.000 g, 20 min,4°C) konnte der Überstand zur Aktivitätsmessung (vgl. 5.14.2) und SDS-PAGE (vgl. 5.12.2)verwendet werden. Für die Verwendung zur IMAC wurde das Pellet derAmmoniumsulfatfällung in 50 mM Tris/HCL pH 8.0 und 100 mM NaCl aufgenommen.

5.11.5 Aufreinigung von rekombinanten (His)6-Proteinen aus Extrakten transgenerTabakpflanzen

Die Aufreinigung rekombinanter (His)6-Proteine aus Extrakten transgener Tabakpflanzenerfolgte gemäß Kapitel 5.11.1. Die gewonnene Proteinlösung (vgl. 5.11.3) wurde zur IMACauf einen Proteingehalt von 2 - 2,5 mg ml-1 eingestellt.

5.12 Proteinbiochemische Methoden

5.12.1 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde nach Bradford (1976) mit Coomassie Brilliant Blue G 250(Serva, Heidelberg) durchgeführt. Als Eichprotein diente Rinderserumalbumin. Alternativwurde die Absorption des Proteins bei den Wellenlängen λ = 260 und 280 nm bestimmt(Warburg und Christian, 1941). Für geringe Proteinkonzentrationen wurde das BCA ProteinAssay Reagent von Pierce (Rockford, IL, USA) verwendet.

5.12.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde wie beiLaemmli (1970) beschrieben durchgeführt. Die 12,5 %igen Minigele (1,5 x 50 x 90 mm)wurden mit einer konstanten Spannung von 80 - 140 V für 1 - 2 h betrieben. Nach erfolgterGelelektrophorese wurden die Proteine entweder auf Nitrocellulose transferiert (vgl. 5.13.1)oder direkt mit Coomassie-Brillant-Blue R-250 (Serva, Heidelberg) angefärbt. AlsGrößenstandard diente eine 10 kDa Leiter (200 - 10 kDa, Gibco, Paisley, Schottland) oder derDalton Mark VII-L Proteinstandard (Sigma, München).

Material und Methoden 93

5.13 Immunologische Methoden

5.13.1 Transfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen (Western-Blot)

Western-Blot nach Towbin (Towbin et al., 1979):

Der von Towbin beschriebene Transfer von Proteinen auf Blotmembranen wurde zurimmunologischen Detektion rekombinant exprimierter Genprodukte in Proteinextrakten ausE. coli verwendet. Bei dieser Methode wurde der Proteinextrakt zunächst durch SDS-PAGE(vgl. 5.12.2) aufgetrennt und mittels einer „Semi-dry-Elektrotransferkammer“ auf eineNitrocellulosemembran (BA-S 85, Schleicher & Schüll, Dassel) überführt. Das SDS-Gel wurdezuvor für 5 - 10 min in Transfer-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8.3, 150 mM Glycin, 20 % (v/v)Methanol, 0,01 % (w/v) SDS) bei Raumtemperatur äquilibriert. Der Transfer erfolgte beikonstanter Spannung (10 V) und 100 mA für 1 h.

Modifizierter Western-Transfer mit einem diskontinuierlichen Puffersystem nach Michov(1995):

Diese von Wiesmann (1999) etablierte, effiziente Transfer-Methode wurde zum immuno-logischen Nachweis von Proteinen in Pflanzenextrakten eingesetzt.Bei diesem Verfahren wurde zur Überführung von aufgetrennten Proteinen in Gelen auf dieOberfläche von Membranen (s.o.) ebenfalls eine „Semi-Dry-Elektrotransferkammer“verwendet. Hierzu erfolgte zunächst die Benetzung der Anodenplatte mit A. dest. und dieBefeuchtung der auf Gelgröße zugeschnittenen Filterpapiere (Whatman-Papier) undTransferschwämme mit Anoden- und Kathodenpuffer (s.u.). Anschließend wurden1 Blotmembran, 1 Cellophanmembran und das Gel mit den elektrophoretisch getrenntenProteinbanden für 3 - 4 min in Anodenpuffer äquilibriert. Auf die Anodenplatte des Blotterswurden nacheinander 3 Lagen Filterpapier, 1 Transferschwamm, 2 Lagen Filterpapier, dieNitrocellulosemembran, das SDS-Gel, die Cellophanmembran, 1 Lage Filterpapier mitAnodenpuffer und darauffolgend 2 Lagen Filterpapier, 1 Transferschwamm und 1 LageFilterpapier in Kathodenpuffer aufgelegt. Der Transfer erfolgte bei 12 V für 1,5 h.

Anodenpuffer: 4,68 g/l Tris, 1,145 ml/l Ameisensäure, 0,29 g/l SDS, 0,05 g/l NaN3, 20 % (v/v) Methanol

Kathodenpuffer: 2,1 g/l Tris, 3,01 g/l Taurin, 0,29 g/l SDS, 0,05 g/l NaN3, 20 % (v/v)Methanol

5.13.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen

Zum Nachweis elektrophoretisch transferierter Proteine auf einer Nitrocellulosemembran (vgl.5.13.1) mittels polyklonaler Antikörper wurde die Membran zunächst für ca. 2 min mit einerFärbelösung (0,2 % (w/v) PonceauS, 3 % (v/v) TCA) angefärbt, um die Effizienz der

Material und Methoden 94

Übertragung zu überprüfen, und den Größenstandard zu markieren. Nach Entfärbung mitA. dest. erfolgte die Absättigung freier Proteinbindestellen für 16 - 18 h bei 4°C inBlocklösung (PBS [s.u.], 2 % (v/v) Tween 80, 2 % (w/v) Milchprotein).

Immunologische Detektion des par-Genproduktes aus C. roseus:

Zur Detektion der APS-Reduktase aus C. roseus wurden folgende polyklonale Antikörperbzw. -seren verwendet: • α:AR Serum [α:ARS, Antigen: Par∆1-Protein aus C. roseus, Nachweisgrenze im Western-

Blot nach Towbin (vgl. 5.13.1): 150 ng gereinigtes Par∆1-Protein in einer 3.000fachenVerdünnung] (vgl. 2.3.2.)

• α:AR Immunglobuline (α:ARIgG): Durch Immunaffinitätschromatographie aus einemunabängigen α:AR Serum angereichte IgGs [Nachweisgrenze im modifizierten Western-Blot-Verfahren (vgl. 5.13.1): 10 ng gereinigtes Par∆1-Protein in einer 500fachenVerdünnung] (Staudinger, 2000)

Die Bindung der primären Antikörper erfolgte für 4 h bei Raumtemperatur in Blocklösung. Diejeweils verwendete Antikörperverdünnung ist im entsprechenden Ergebnisteil angegeben. DieEntfernung der ungebundenen Antikörper erfolgte durch einen 10minütigen Waschschritt, demdrei 5minütige Waschschritte mit PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,5 mMKH2PO4 pH 7.4) inklusive 0,05 % Tween 80 und 200 mM EDTA folgten. Die Inkubation mitdem sekundären Antikörper (Alkalische Phosphatase-gekoppelte Ziege-anti-KaninchenImmunglobuline, Sigma, München) erfolgte für 2 h bei einer Verdünnung von 1 : 7.500 inAntikörperverdünnungslösung (1 x PBS, 2 % (w/v) PEG 6.000, 0,05 % (v/v) Nonidet P-40).Die anschließende Entfernung ungebundener Antikörper sowie die kolorimetrische Detektionmit den Farbsubstraten NBT und BCIP (vgl. 5.10.8) wurde nach den Angaben im „Dig SystemUser`s Guide for Filter Hybridisation“ (Roche, Mannheim) durchgeführt.Bei Verwendung eines Peroxidase-gekoppelten Ziege-anti-Kaninchen Sekundärantikörpers(Sigma, München) wurde dieser in einer Verdünnung von 1 : 5.000 inAntikörperverdünnungslösung eingesetzt. Nach 2stündiger Inkubation in der sekundärenAntikörperlösung wurde die Membran 3 x 5 min in PBS und zuletzt 1 x 5 min in TBS (10 mMTris/HCl pH 7.4, 100 mM NaCl) gewaschen. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität derPeroxidase erfolgte mit folgender Färbelösung: 1,2 ml 2 % (w/v) 4-Chlor-1-naphtol (inMethanol), 4 ml Methanol, 4 ml Tris/HCl pH 7.4, ad 40 ml mit destilliertem H2O. Die Reaktionwurde durch Zugabe von 30 µl H2O2 gestartet.

Immunologische Detektion von Oligo-Histidin-Fusionsproteinen:

Zum Nachweis von (His)10- und (His)6-Fusionsproteinen wurde ein monoklonaler Penta-HisAntikörper (Qiagen, Hilden) verwendet (Nachweisgrenze nach Herstellerangaben: 2 ng einesgereinigten (His)6-Fusionsproteins). Nach der Absättigung freier Proteinbindestellen inBlocklösung (s. o.) wurde die Membran 2 x für 10 min in TBST-Puffer (10 mM Tris/HClpH 8.0, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20) mit 0,2 % Triton X-100 und 1 x für 10 min in

Material und Methoden 95

TBST gewaschen. Die Inkubation mit dem Penta-His Antikörper erfolgte für 4 h in BSA-Lösung (3 % Rinderserumalbumin in TBST). Ungebundener Antikörper wurde durch3 Waschschritte (2 x 10 min in TBST + 0,2 % Triton X-100, 1 x 10 min in TBST) entfernt.Der sekundäre Antikörper (Phosphatase-gekoppelte Kaninchen-anti-Maus Immunglobuline,Sigma, München) wurde in einer 1 : 20.000 Verdünnung (2 h, in BSA-Lösung) eingesetzt.Nach vier 10minütigen Waschschritten in TBST + 0,2 % Triton X-100 erfolgte diekolorimetrische Detektion mit NBT und BCIP (s. o.).

5.14 Enzymatische Analysen

5.14.1 Synthese der radioaktiven Nukleotide [35S]-3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat und [35S]-Adenosin-5´-phosphosulfat

Die Synthese des [35S]-3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS) erfolgte nach derMethode von Schriek und Schwenn (1986) mit Hilfe der hochgereinigten, salzfreien EnzymeATP-Sulfurylase, Pyruvat-Kinase, Pyrophosphatase (Sigma, München; Roche, Mannheim) undder rekombinanten (His)10-APS-Kinase aus Arabidopsis thaliana (Schiffmann, 1998). NachAktivierung der (His)10-APS-Kinase (15 - 30 min, 25 °C, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 µMThioredoxin [Trx]) wurde die Reaktion durch Zugabe der ATP-Sulfurylase gestartet und für16 - 18 h bei 25 °C inkubiert (50 mM Triethanolamin pH 7.6, 2 mM Na2SO4, 4 - 8 mM MgCl2,1 mCi trägerfreies [35S]- Na2SO4, 10 mM KCl, 5 mM Phosphoenolpyruvat, 2 - 4 mM ATP(pH 7.0), 1 mM DTT, 1 µM Thioredoxin1 aus E. coli (MBI Fermentas, Litauen), 40 UPyrophosphatase, 40 U Pyruvat-Kinase, 1 U (His)10-APS-Kinase, 10 U ATP-Sulfurylasead 5 ml).[35S]-Adenosin-5´-phosphosulfat (APS) wurde durch Behandlung des synthetisierten[35S]-PAPS mit der 3´-Nuklease P1 aus Penicillium chrysogenum (Roche, Mannheim)gebildet. Die Trennung und Reinigung der beiden radioaktiv markierten Nukleotide erfolgte aneiner DEAE EMD 650S-Matrix (Amersham/Pharmacia, Freiburg) gemäß Jender und Schwenn(1984).Die Synthese der radioaktiven Nukleotide wurde von Christopher Lillig (AG Schwenn,Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität) Bochum durchgeführt.

5.14.2 Bestimmung der Adenosin-5´-phosphosulfat (APS)-Reduktase und 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS)-Reduktase-Aktivität

Die APS-Reduktase- sowie die PAPS-Reduktase-Aktivität wurde über die Bildung des säure-flüchtigen [35S]-SO3

2- aus [35S]-APS bzw. [35S]-PAPS bestimmt (Schwenn und Schriek, 1987).Der Reaktionsansatz (100 µl) enthielt 1 - 100 ng gereinigtes (His)10- oder(His)6-Fusionsprotein bzw. 1 - 8 µg eines bakteriellen Proteinrohextraktes (vgl. 5.11.1) oder5 - 100 µg eines Pflanzenextraktes (vgl. 5.11.3), 100 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM Na2SO3,0,5 M Na2SO4 (nicht für PAPS-Reduktase-Aktivität), 2 - 15 µM [35S]-APS bzw. [35S]-PAPS(spezifische Radioaktivität: 1,7 kBq/nmol), 50 µM - 20 mM DTT oder GSH und alternativ

Material und Methoden 96

2 - 50 µM Thioredoxin1 (MBI Fermentas, Litauen) oder Glutaredoxin1 aus E. coli bzw.ThioredoxinH3 aus A. thaliana. Glutaredoxin1 wurde freundlicherweise von Dr. Frederikcslund (Harvard Medical School, Boston, USA) zur Verfügung gestellt. ThioredoxinH3 wurdedankenswerterweise von Prof. Yves Meyer (Université UMR, Perpignan, Frankreich) gestellt.Nach einer Inkubationszeit von 3 - 5 min bei 25°C wurde die Reaktion durch Zugabe von100 µl Aceton gestoppt.

Zur Bestimmung von steady-state Konstanten wurde bei der Reaktion berücksichtigt, daßmaximal 10 - 15 % des eingesetzten Substrats APS umgesetzt wurden. Die Konstanten wurdenaus 3 unabhängigen Messungen mit Enzym einer Präparation ermittelt und sind im Ergebnisteilmit ihrer Standardabweichung angegeben. Alle dort angegebenen Geraden-Funktionenunterliegen einer linearen Regression. Offensichtlich abweichende Meßpunkte wurden hierbeinicht berücksichtigt. Geradenfunktionen, deren Regressionskoeffizient R2 ≤ 0.98 war, wurdenebenfalls außer acht gelassen.

5.14.3 Insulindisulfid-Reduktionstest

Beim Insulin handelt es sich um ein heterodimeres Protein aus einer A- und einerB-Polypeptidkette, die durch intermolekulare Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Beider Reduktion des Insulins durch Thiolreagenzien fällt der unlösliche B-Strang desHeterodimers als weißer Niederschlag aus. Die dadurch bedingte Trübung desReaktionsansatzes kann durch photometrische Messung verfolgt werden, da die Extinktion bei650 nm dieser Tübung proportional ist.

Die Herstellung der Insulinstocklösung sowie die Reduktion des Insulindisulfids erfolgtengemäß dem Protokoll von Holmgren (1979).Der Reaktionsansatz (600 µl) enthielt 83 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.0, 1,7 mM EDTA,140 µM Rinderinsulin (Sigma, München), 0,83 mM DTT und 0,38 µM gereinigtes (His)10-Fusionsprotein (vgl. 5.11.1) bzw. 0,2 µM E. coli Thioredoxin1 (MBI Fermentas, Litauen).Das zu testende Protein wurde in einem 100 µl Ansatz für 5 min mit 5 mM DTT auf Eisinkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe frisch verdünnter (1 : 10) Insulin-Lösung(1 mg ml-1 in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.0, 2 mM EDTA) gestartet. Die Trübung desReaktionsansatzes wurde im Zeiss PMQ II Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von650 nm verfolgt. Alle Messungen erfolgten bei Raumtemperatur.

5.14.4 Reaktivierung reduzierter, denaturierter RibonukleaseA

Die reduzierte, denaturierte RNaseA (Sigma, München) wurde gemäß Crouy-Chanel et al.(1995) präpariert.Zur Reaktivierung der reduzierten, denaturierten RNaseA gemäß Akiyama et al. (1992) wurdediese in einer Konzentration von 0,07 mg ml-1 in Redoxpuffer (0,2 mM DTT, 0,3 mMoxidiertes Glutathion (GSSG), 3,3 mM MgCl2, 15 mM Tris/Acetat pH 8.0) in Gegenwart von

Material und Methoden 97

10 µM gereinigtem (His)10-Fusionsprotein (vgl. 5.11.1) auf Eis inkubiert. Nach 5, 20, 35, 55und 70 min wurden dem Reaktionsgemisch jeweils 80 µl entnommen und mit 1,12 mlcyclischem 2´-3´-Cytidin-Monophosphat (CMP; 0,8 mg ml-1 in Tris/HCl pH 7.4) versetzt.Nach 5minütiger Vorinkubation bei Raumtemperatur wurde die von aktiver RNaseAkatalysierte Hydrolyse von CMP im Zeiss PMQ II Spektrophotometer bei einer Wellenlängevon 296 nm verfolgt (Blackburn, 1979).

5.14.5 Bestimmung der Diaphorase-Aktivität

Die Diaphorase katalysierte, NADH-abhängige Reduktion von 2,6-Dichlorphenolindophenol(DCPIP) wurde photometrisch durch die Extinktionsabnahme bei einer Wellenlänge von600 nm bestimmt.Der Reaktionsansatz enthielt 83,3 mM Kaliumphosphat pH 5.9, 0,05 mM EDTA, 1,53 mMDCPIP, 0,67 mg ml-1 Rinderserumalbumin, 0,2 mM NADH und bis zu 1,15 µM gereinigtes(His)10-Fusionsprotein (vgl. 5.11.1) bzw. 12,4 nM Diaphorase aus Schweineherz (Roche,Mannheim). Die Messung erfolgte bei Raumtemperatur über 20 min.

5.15 Abbildungen

Die Abbildungen der vorliegenden Arbeit wurden digital bearbeitet und sind in ihrem Inhaltidentisch mit den Orginaldaten

Literatur 98

6 Literatur

ABOLA, A. P., WILLITS, M. G., WANG, R. C., LONG, S. R. (1999): Reduction ofAdenosine-5´-phosphosulfate instead of 3´-Phosphoadensine-5´-phosphosulfate in cysteinebiosynthesis by Rhizobium meliloti and other members of the family Rhizobiaceae. J. Bac.181, 5280 - 5287

ABRAMS, W. A., SCHIFF, J. A. (1973): Studies of sulfate utilization by algae, 11. Anenzyme-bound intermediate in the reduction of Adenosine-5'-phosphosulfate (APS) by cell-freeextracts of wild type Chlorella and mutants blocked for sulfate reduction. Arch. Microbiol. 94,1 - 10

AKIYAMA, Y., KAMITANI, S., KUSUKUWA, N., ITO, K. (1992): In vitro catalysis ofoxidative folding of disulfide-bonded proteins by Escherichia coli dsba (ppfa) gene product.J. Biol. Chem. 267, 22440 - 22445

ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z.,MILLER, W., LIPMAN, D. J. (1997): Gapped-BLAST and PSI-BLAST: a new generation ofprotein database search programs. Nucl. Acids Res. 25, 3389 - 3402

ANDERSEN, C. L., MATTHEY-DUPRAZ, A., MISSIAKAS, D., RAINA, S. (1997): A newEscherichia coli gene, dsbG, encodes a periplasmatic protein involved in disulfide formation,required for recycling DsbA/DsbB and DsbC redox proteins. Mol. Microbiol. 26, 121 - 132

ANDERSON, J. W. (1980): Assimilation of inorganic sulfate to cysteine. In: The Biochemistryof Plants 5, Miflin, L. (ed.), Academic Press Inc., 203 - 225

ANDERSON, J. W. (1990): Sulfur metabolism in plants. In: The Biochemistry of Plants 16,Miflin, L. (ed.), Academic Press Inc., 327 - 381

ARA, T., SEKIYA, J. (1996): Purification and characterization of APS-Sulfotransferase fromspinach leaves. Abstracts Third Workshop on Sulphur Metabolism in Higher Plants 12,Newcastle, UK,

ARZ, H. E., GISSELMANN, G., SCHIFFMANN, S., SCHWENN, J. D. (1994): A cDNA foradenylyl sulphate (APS)-kinase from Arabidopsis thaliana. Biochim. Biophys. Acta 1218,447 - 452

BAIROCH, A., BUCHLER, P., HOFMANN, K. (1995): The PROSITE database, its status in1995. Nucl. Acids Res. 24, 189 - 196

BALHARRY, G. J. E., NICHOLAS, D. J. D. (1970): ATP-sulfurylase in spinach leaves.Biochim. Biophys. Acta 220, 513 - 524

BARDWELL, J. C. A. (1994): Building bridges: disulphide bond formation in the cell.Mol. Microbiol. 14, 199 - 205

Literatur 99

BASSHAM, D. C., CREIGHTON, A. M., KRANAUCHOV, I., HERRMANN, R. G.KLÖSGEN, R. B., ROBINSON, C. (1994): Mutations at the stromal processing peptidasecleavage side of a thylakoid lumen protein precursor affect the rate of processing but not thefidelity. J. Biol. Chem. 269, 16062 - 16066

BENNING, C. (1998): Biosynthesis and function of the sulfolipid sulfoquinovosyldiacylglycerol. Annu. Rev. Physiol. Plant. Mol. Biol. 49, 53 - 75

BERENDT, U., HAVERKAMP, T., PRIOR, A., SCHWENN, J. D. (1995): Reactionmechanism of thioredoxin:3´-phospho-adenylylsulfate reductase investigated by site-directedmutagenesis. Eur. J. Biochem. 233, 347 - 356

BERGMANN, L., RENNENBERG, H. (1993): Glutathione metabolism in plants. In: Sulfurnutrition and assimilation in higher plants. De Kok et al. (eds.), SPB Academic Publ., TheHague, 107 - 123

BEVAN, M. (1984): Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl. AcidsRes. 12, 8711 - 8721

BICK, J. A., LEUSTEK, T. (1998): Plant sulfur metabolism - the reduction of sulfate tosulfite. Curr. Opin. Biol. 1, 240 - 244

BICK, J. A., ASLUND, F., CHEN, Y., LEUSTEK, T., (1998): Glutaredoxin function for thecarboxy-terminal domain of the plant type 5´-adenylylsulfate reductase. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95, 8404 - 8409

BICK, J. A., DENNIS, J. J., ZYLSTRA, G. J., NOWACK, J., LEUSTEK, T. (2000):Identification of a new class of 5´-Adenylylsulfate (APS) reductases from sulfate-assimilatingbacteria. J. Bac. 182, 135 - 142

BIRCH, R. G. (1997): Plant transformation: Problems and strategies for practical application.Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297 - 326

BLACKBURN, P. (1979): Ribonuclease inhibitor form human placenta: Rapid purification andassay. J. Biol. Chem. 254, 12484 - 12487

BLASZCZYK, A., BRODZIK, R., SIRKO, A. (1999): Increased resistance to oxidative stressin transgenic plants overexpressing bacterial serine acetyltransferase. Plant J. 20, 237 - 243

BOER, H. A. DE (1983): The tac promotor: a functional hybrid derived from the trp and lacpromotors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 21 - 25

BORK, P., KOONIN, E. V. (1994): A P-loop-like motif in a widespread ATPpyrophosphatase domain: implications for the evolution of sequence motifs and enzymeactivity. Proteins 20, 347 - 355

BORK, C., SCHWENN, J. D., HELL, R. (1998): Isolation and characterisation of a gene forassimilatory sulfite reductase from Arabidopsis thaliana. Gene 212, 147 - 153

Literatur 100

BRADFORD, M. M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72,284 - 254

BRÜHL, A., HAVERKAMP, T., GISSELMANN, G., SCHWENN, J. D. (1996): A cDNAclone from Arabidopsis thaliana encoding plastidic ferredoxin:sulfite reductase. Biochim.Biophys. Acta 1295, 119 - 124

BRUNELLI, J. P., PALL, M. L. (1993): A series of Yeast Shuttle Vectors for expression ofcDNAs and other DNA sequences. Yeast 9, 1299 - 1308

BRUNOLD, C. (1990): Reduction of sulfate to sulfide. In: Sulfur nutrition and sulfurassimilation in higher plants. De Kok et al. (eds.), SPB Academic Publ., The Hague, 21 - 35

BRUNOLD, C. (1993): Regulatory interaction between sulfate and nitrogen metabolism. In:Sulfur nutrition and assimilation in higher plant. Regulatory, agricultural and environmentalaspects. De Kok et al. (eds.), SPB Academic Publ., The Hague, 61 - 76

BRUNOLD, C., SUTER, M., LAVANCHY, P. (1987): Effect of high and low sulfateconcentrations on adenosine-5´-phosphosulfate sulfotransferase activity from Lemna minor.Physiol. Plant. 70, 168 - 174

CHEONG, J. J., KWON, H. B., GOODMAN, H. M. (1996): A cDNA encoding ArabidopsisHAL2-like (AHL) protein. Plant Physiol. 111, 652

CHEREST, H., SURDIN-KERJAN, Y. (1991): Genetic analysis of a new mutation conferringcystein auxotrophy in Saccharomyces cerevisiae: Updating of the sulfur metabolism pathway.Genetics 130, 51 - 58

CHOMCZYNSKI, P., SACCHI, N. (1987): Single step method of RNA isolation byguanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156 - 159

CHOU, P. Y., FASMAN, G. D. (1978): Prediction of the secondary structure of proteins fromtheir amino acid sequence. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47, 45 - 148

CHUNG, T. C., NIEMELA, S. L., MILLER, R. H. (1989): One-step preparation ofcompetent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2172 - 2175

CLARKSON, D.T., HAWKESFORD, M. C., DAVIDIAN, J. C. (1993): Membrane and long-distance transport of sulfate. In: Sulfur nutrition and assimilation in higher plants: Regulatory,agrigultural and enviromental aspects. De Kok et al. (eds.), SBP Academic Publ., The Hague,3 - 11

CLINE, K., HENRY, L., LI, C., YUAN, J. (1993): Multiple pathways for protein transport intoand across the thylakoid membrane. EMBO J. 12, 4105 - 4114

CRAM, W. J. (1990): Uptake and transport of sulfate. In: Sulfur nutrition and sulfurassimilation in higher plants.: Fundamental, enviromental and agricultural aspects. Rennenberget al. (eds.), SBP Academic Publ., The Hague, 3 - 11

Literatur 101

CROUY-CHANEL, A. DE, KOHIYAMA, M., RICHARME, G. (1995): A novel function ofEscherichia coli chaperone DnaJ. J. Biol. Chem. 270, 22669 - 22672

DEBLAERE, R., BYTEBIER, B., DE GREVE, H., DEBOECK, F., SCHELL, J., VANMONTAGU, M., LEEMANS, J. (1985): Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors forAgrobacterium-mediated gene transfer into plants. Nucl. Acids Res. 13, 4777 - 4788

DOWER, W. J., MILLER, J. F., RAGSDALE, C. W. (1988): High efficiency transformationof Escherichia coli by high-voltage electroporation. Nucl. Acids Res. 16, 6127 - 6145

DROUX, M., MARTIN, J., SAJUS, P., DOUCE, R. (1992): Purification and characterizationof O-acetylserine-(thiol)-lyase from spinach chloroplasts. Arch. Biochem. Biophys. 295,379 - 390

EMANUELSSON, O., NIELSEN, H., HEIJNE, G. (1999): ChloroP, a neural network-basedmethod for predicting chloroplast transit peptides and their lceavage sites. Protein Sci. 8,978 - 984

EMANUELSSON, O., NIELSEN, H., HEIJNE, G. (1999): Predicting subcellular localizationof proteins based on their N-terminal amino acid sequence. Eingereicht

FISCHER, D., BARRET, C., BRYSON, K., ELOFSSON, A., GODZIK, A., JONES, D.,KARPLUS, F., KELLEY, L. A., MACCALLUM, R. M., PAWOWSKI, K., ROST, B.,RYCHLEWSKI, L., STERNBERG, M. J. (1999): CAFASP-1: Critical assessment of fullyautomated structure prediction methods. In: Proteins: Structure, function and genetics 3,209 - 217

FLACHMANN, R., KÜHLBRANDT, W. (1996): Cristallization and idenfication of anassembly defekt of recombinant antenna complexes produced in transgenic tobacco plants.Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 14966 - 1491

FLAVELL, R. B. (1994): Inactivation of gene expression in plants as a consequence ofspecific sequence duplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3490 - 3496

FLEMMING, A. J., MANZARA, T., GRUISSEM, W., KUHLEMEIER, C. (1996):Flourescent imaging of GUS activity and RT-PCR analysis of gene expression in the shootapical meristem. Plant J. 10, 745 -754

FLÜGGE, U. T., FISCHER, K., GROSS, A., SEBALD, A., LOTTSPEICH, K.,ECKERSKORN, C. (1989): The triose phosphate-3-phosphoglycerate-phosphat translocatorfrom spinach chloroplasts: Nucleotide sequence of a fullength cDNA clone and import of thein vitro synthesized precursor protein into chloroplasts. EMBO J. 8, 39 - 46

FOYER, C. H., HALLIWELL, B. (1976): The presence of glutathion and glutathion reductasein chloroplasts: A proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta 133, 21 - 25

FRANKHAUSER, H., BRUNOLD, C. (1978): Locatization of adenosine-5´-phosphosulfatesulfotransferase in spinach leaves. Planta 142, 285 - 289

Literatur 102

FREEDMAN, R. B., HIRST, T. R., TUITE, M. F. (1994): Protein disulfide isomerase:building bridges in protein folding. Trends Biochem. Sci. 19, 331 - 336

FRISCH, D. A., HARRIS-HALLER, L. W., YOKUBAITIS, N. T., THOMAS, T. L.,HARDIN, S. H., HALL, T. C. (1995): Complete sequence of the binary vector BIN19.PMB 27, 405 - 409

FRISHMAN, D., ARGOS, P. (1995): Kowledge-based protein secondary structureassignment. Proteins 23, 566 - 579

FROMMER, W. B., NINNEMANN, O. (1995): Heterologous expression of genes in bacterial,fungal, animal and plant cells. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 419 - 444

FRYE, R. A., BENZ, C. C, LIU, E. (1989): Detektion of amplified oncogenes by differentialpolymerase chain reaction. Oncogene 4, 1153 - 1157

GAUDETTE, M. F., CRAIN, W. R. (1991): A simple method for quantifying specific mRNAsin small numbers of early mouse embryos: Nucl. Acids Res. 19, 1879 - 1884

GAVEL, Y., HEIJNE, G. (1990): A conserved cleavage site motif in chloroplast transit peptides.FEBS letters, 261, 455 - 458

GELVIN, S. B., KARCHER, S. J., DIRITA, V. L. (1983): Methylation of the T-DNA inAgrobacterium tumefaciens and in several crown gall tumors. Nucl. Acids Res. 11, 159 - 174

GIBSON, T. J. (1984): Studies on the Epstein-Barr virus genome. Ph. D. thesis, CambrigdeUniversity, England

GILBERT, H. F. (1998): Protein disulfide isomerase. Methods Enzymol. 290, 26 - 50

GILHAM, D. J., DODGE, A. D. (1986): Hydrogen peroxide scavening systems with peachloroplasts. A quantitative study. Planta 167, 246 - 251

GISSELMANN, G (1993): Molekulare Biologie der Sulfitreduktion in phototrophenOrganismen. Dissertation, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universtiät Bochum

GISSELMANN, G., KLAUSMEIER, P., SCHWENN, J. D. (1993): The ferredoxin:sulfitereductase gene from Synechococcus PCC7942. Biochim. Biophys. Acta 1144, 102 - 106

GONZALES-PORQUÉ, P., BALDESTEN, A., REICHARD, P. (1970): The involvement ofthe thioredoxin system in the reduction of methionine sulfoxide and sulfate. J. Biol. Chem.245, 2371 - 2374

GRIERSON, D., FRAY, R. G., HAMILTON, A. J., SMITH, C. J. S., WATSON, C. F.(1991): Does co-suppression of sense genes in transgenic plants involve antisense RNA?Trends Biotechnol. 9, 122 - 123

Literatur 103

GUTIERREZ-MARCOS, J. F., ROBERTS, M., CAMPBELL, E. I., WRAY, J. L. (1996):Three members of a novel small gene-family from Arabidopsis thaliana able to complementfunctionally an Escherichia coli mutant defective in PAPS reductase activity encode proteinswith a thioredoxin-like domain and „APS reductase“ activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,13377 - 13382

HALFORD, W. P. (1999): The essential prerequisites for quantitative RT-PCR. Nat. Biotech.17, 835

HANAHAN, D. (1985): Techniques for transfomation of Escherichia coli. In: DNA-cloning 1.Glover, D. M.(ed.), IRL Press, Oxford, 109 - 135

HANSEN, J. E., LUND, O., TOLSTRUP, N., GOOLEY, A. A., WILLIAMS, K. L.,BRUNAK, S. (1998): Prediction of mucin type O-glycosylation sites based on sequencecontext and surface accessibility. Glyc. J. 15, 115 -130

HATZFELD, Y., CATHALA, N., GRIGNON, C., DAVIDIAN, J. C. (1998): Effect of ATPsulfurylase overexpression in bright yellow 2 tobacco cells. Plant Physiol. 116, 1307 - 1313

HAVERKAMP, T., SCHWENN, J. D. (1999): Structure and function of a cysBJIH genecluster in the purple sulfur bacterium Thiocapsa roseopersicina. Microbiol. 145, 115 - 125

HEINZ, E. (1993): Recent investigations on biosynthesis of the plant sulfolipid. In: Sulfurnutrition and sulfur assimilation in higher plants. De Kok et al. (eds.), SPB Academic Publ.,The Hague, 163 -178

HEISS, S., SCHÄFER, H. J., HAAG-KERWER, A., RAUSCH, T. (1999): Cloning sulfurassimilation genes of Brassica juncea L.: cadmium differentially affects the expression of aputative low-affinity sulfate transporter and isoforms of ATP sulfurylase and APS reductase.Plant. Mol. Biol. 39, 847 - 857

HELL, R. (1997): Molecular physiology of plant sulfur metabolism. Planta 202, 138 - 148

HELL, R., BORK, C., BOGDANOVA, N., FROLOV, I., HAUSSCHILD, R. (1994):Isolation and characterisation of two cDNAs encoding for compartment specific isoforms ofO-Acetylserin-(thiol)-lyase from Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. 351, 257 - 262

HERBERS, K., SONNEWALD, U. (1996): Manipulating metabolic partitioning in transgenicplants. Trends Biotechnol. 14, 198 - 205

HIGGINS, D. G., SHARP, P. M. (1988): CLUSTAL: a package for performing multiplesequence alignments on a microcomputer. Gene 73, 237 - 244

HO, S. N., HUNT, H. D., HORTON, R. M., PULLEN, J. K., PEASE, L. R. (1989): Site-directed mutagenesis by overlap-extension using the polymerase chain reaction. Gene 77,51 - 59

HODSON, R. C. (1968): Studies of sulfate utilization by algae 6. PAPS as an intermediate inthiosulfate formation from sulfate by cell-free extracts of Chlorella. Plant Physiol. 43,563 - 569

Literatur 104

HODSON, R. C., SCHIFF, J. A. (1971): Studies of sulfate utilization by algae 9. Fractionationof a cell-free system from Chlorella into two activities necessary for the reduction of adenosine3´-phosphate 5´-phosphosulfate to acid volatile radioactivity. Plant Physiol. 47, 300 - 305

HÖFGEN, R., WILLMITZER, L. (1990): Biochemical and genetic analysis of different patatinisoforms expressed in various organs of potato (Solanum tuberosum). Pl. Sci. 66, 221 - 230

HÖFTE, H., FAYE, L., DICKINSON, C., HERMAN, E. M., CHRISPEELS, M. J. (1991):The protein-body proteins phytohemagglutinin and tonoplast intrinsic protein are targeted tovacuoles in leaves of transgenic tobacco. Planta 184, 431 - 437

HOFMANN, K., STOFFEL, W. (1993): A database of membrane spannig proteins segments.Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166

HOLMGREN, A. (1979): Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfide bydithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem. 254, 9627 - 9632

HOLMGREN, A. (1989): Thioredoxin and glutaredoxin systems. J. Biol. Chem. 264, 13963 -13966

HOPPE, W., SCHWENN, J. D. (1981): In vitro biosynthesis of the plant sulfolipid: On theorigin of the sulphonate head group. Z. Naturforsch. 36, 820 - 826

HORTON, R. M., PEASE, L. R. (1991): Recombination and mutagenesis of DNA using PCR.In: Direct mutagenesis. McPherson, M. J. (ed.), IRL Press, Oxford, 217 - 247

JAIN, A., LEUSTEK, T. (1994): A cDNA clone for 5´-adenylylphosphosulfate kinase fromArabidopsis thaliana. Plant Physiol. 105, 771 - 772

JANSSEN, B. J., GARDNER, R. C. (1990): Localized transient expression of GUS in leafdiscs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Mol. Biol. 14, 61 - 72

JENDER, H. G., SCHWENN, J. D. (1984): Purification and properties ofATP:adenylylsuphate-3´-phosphotransferase from Chlamydomonas reinhardtii CW 15. Arch.Microbiol. 138, 9 - 14

JONGSMA, M., KOORNEEF, M., ZABEL, P., HILLE, J. (1987): Tomato protoplasttransformation, physical linkage and recombination of exogenous DNA sequences. Plant Mol.Biol. 8, 383 - 394

JORDAN, M. C., McHUGHEN, A. (1988): Interactions of Agrobacterium tumefaciens withsoybean leaf explants in tissue cultures. Plant Cell Rep. 7, 285 - 287

JULLIEN, D., CROZATIER, M., KAS, E. (1997): cDNA sequence and expression pattern ofthe Drosophila melanogaster PAPS synthetase gene: a new salivary gland marker. Mech. Dev.68, 179 - 186

KABSCH, W., SANDER, C. (1983): Dictionary of protein secondary structure: patternrecognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers 22, 2577 - 2637

Literatur 105

KANNO, N., NAGAHISA, E., SATO, M., SATO, Y. (1996): Adenosine-5´-phosphosulfatesulfotransferase from marine macroalga Porphyra yezoensis Ueda (Rhodophyta): stabilization,purification, and properties. Planta 198, 440 - 446

KELLEY, L. A., MACCALLUM, R., STERNBERG, M. J. E. (1999): Recognition of remoteprotein homologies using three-dimensional information to generate a position specific scoringmatrix in program 3D-PSSM. In: RECOMB 99, proceedings of the third annual conference oncomputational molecular biology. Istrail et al. (eds.), The Association for ComutingMachinery, New York, 218 - 225

KLEPPINGER-SPARACE, K. F., MUDD, J. B. (1990): Biosynthesis of sulfoquinovosyl-diacylglycerol in higher plants. Use of adenosine-5´-phosphosulfate and adenosine-3´-phosphate 5´-phosphosulfate as precursors. Plant Physiol. 93, 256 - 263

KLONUS, D., HÖFGEN, R., WILLMITZER, L., RIESMEIER, J. W. (1994): Isolation andcharacterization of two cDNA clones encoding ATP-sulfurylases from potato bycomplementation of a yeast mutant. Plant J. 6, 105 - 112.

KOBAYASHI, K., YOSHIMOTO, A. (1982): Studies on yeast sulfite reductase IV. Structureand steady state kinetics. Biochim. Biophys. Acta 705, 348 - 356

KREDICH, N. M. (1971): Regulation of L-cysteine biosynthesis in Salmonella typhimurium.J. Biol. Chem. 246, 3474 - 3484

KREEGIPUU, A., BLOM, N., BRUNAK, S. (1999): Phosphobase, a database ofphosphorylation sites: release 2.0. Nucl. Acids Res. 27, 237 - 239

KRONE, F. A., WESTPHAL, G., SCHWENN, J. D. (1991): Characterisation of the genecysH and its product phosphoadenylylsulfate reductase from Escherichia coli. Mol. Gen.Genet. 225, 314 - 319

KUMPATLA, S. P., CHANDRASEKHARAN, M B., IYER, L. M., Li, G., HALL, T. C.(1998): Genome intruder scanning and modulation systems and transgene silencing. TrendsPlant Sci. 3, 97 - 104

KURIMA, K., SINGH, B., SCHWARTZ, N. B. (1999): Genomic organisation of the mouseand human genes encoding ATP sulfurylase/adenosine 5´-phosphosulfate kinase isoforms SK2.J. Biol. Chem. 274, 33306 - 33312

KYTE, J., DOOLITTLE, H. (1982): A simple method for displaying the hydrophobiccharacter of a protein. J. Mol. Biol. 157, 105 - 132

LAEMMLI, U. K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature 227, 680 - 685

LAPPARTIENT, A. G., VIDMAR, J. J., LEUSTEK, T., GLASS, A. D. M., TOURAINE, B.(1999): Inter-organ signaling in plants: regulation of ATP sulfurylase and sulfate transportergene expression in roots mediated by phloem-translocated compound. Plant J. 18, 89 - 95

Literatur 106

LEE, M., LEUSTEK. T. (1998): A kinase from Arabidopsis thaliana: genomic organisation,expression and kinetic analysis of the recombinant enzyme. Biochem. Biophys. Res. Comm.247, 171 - 175

LEUSTEK, T. (1996): Molecular genetics of sulfate assimilation in plants. Physiol. Plant. 97,411 - 419

LEUSTEK, T., MURILLO, M., CERVANTES, M. (1994): Cloning of a cDNA encodingATP-sulfurylase from Arabidopsis thaliana by functional expression in Saccharomycescerevisiae. Plant Physiol. 105, 897 - 902

LEUSTEK, T., SAITO, K. (1999): Sulfate transport and assimilation in plants. Plant Physiol.120, 637 - 643

LI, J., SCHIFF, J. A. (1991): Purification and properties of adenosine-5´-phosphosulphatesulfotransferase from Euglena. Biochem. J. 274, 355 - 360

LI, H., DEYRUP, A., MENSCH, J. R., DOMOWICZ, M., KONSTANTINIDIS, A. K.,SCHWARTZ, N. B. (1995): The isolation and characterization of cDNA encoding the mousebifunctional ATP sulfurylase-adenosine 5´-phosphosulfate kinase. J. Biol. Chem. 270,29453 - 29459

LILLIG, C. H., PRIOR, A., SCHWENN, J. D., ASLUND, F., RITZ, D., VLAMIS-GARDIKAS, A., HOLMGREN, A. (1999): New thioredoxins and glutaredoxins as electrondonors of 3´-phosphoadenylylsulfat reductase. J. Biol. Chem. 274, 7695 - 7698

LINEWEAVWER, H., BURK, D. (1934): The determination of enzyme dissociationconstants. J. Americ. Chem. Soc. 56, 658-666

LOGAN, H. M., CATHALA, N., GRIGNON, C., DAVIDIAN, J.-C. (1996): Cloning of acDNA encoded by a member of the Arabidopsis thaliana ATP-sulfurylase multigene family.J. Biol. Chem. 271, 12227 - 12233

LÜBECK, J., HEINS, L., SOLL, J. (1997): A nuclear-coded chloroplast inner envelopemembrane protein uses a soluble sorting intermediate upon import into the organelle. J. CellBiol. 137, 1279 - 1286

LUNN, E. J., DROUX, M., MARTIN, J., DOUCE, R. (1990): Localization of ATP-sulfurylase and O-acetylserine-(thiol)-lyase in spinach leaves. Plant Physiol. 94, 1345 - 1352

MANSILLA, M. C., MENDOZA, D. (1997): L-cysteine biosynthesis in Bacillus subtilis:Identification, sequencing and functional characterization of the gene coding Phosphoadenyly-sulfate sulfotransferase. J. Bac. 179, 976 - 981

MARTIN, W., BRINKMANN, H., SAVONNA, C., CERFF, R. (1993): Evidence for achimeric nature of nuclear genomes: eubacterial origin of eucaryotic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8692 - 8696

Literatur 107

MASSELOT, M., ROBICON-SZULMAJSTER, H. DE (1975): Methionine Biosythesis inSaccharomyces cerevisiae: Genetic Analysis of Auxotrophic mutants. Mol. Gen. Genet. 139,121-132

MATSUBAYASHI, Y., SAKAGAMI, Y. ( 1996): Phytosulfokine, sulfated pepitdes thatinduce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93, 7623 - 7627

MACRAE, I. J., SEGEL, I. (1999): Adenosine 5´-phosphosulfate (APS) kinase: diagnosingthe mechanism of substrate inhibition. Arch. Biochem. Biophys. 361, 277 - 282

MACRAE, I. J., SEGEL, I. H., FISHER, A. J. (2000): Crystal structure of Adenosine 5´-phosophosulfate kinase from Penicillim chrysogenum. Biochemistry 39, 1613 - 1621

MERSEREAU, M., PAZOUR, G. J., DAS, A. (1990): Efficient transformation ofAgrobacterium tumefaciens by electroporation. Gene 90, 149- 151

MICHAELIS, L., MENTEN, M. L. (1913): Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochem. Z. 49,333 - 369

MICHOV, B. (1995): Blotting der Proteine. In: Elektrophorese: Theorie und Praxis. Gruyter,W. (ed.), Berlin, New York, 270 - 281

MIYAZAKI, J. H., YANG, S. F. (1987): The methionine salvage pathway in relation toethylene and polyamine synthesis. Physiol. Plant. 69, 366 - 370

MOROTA, H., UCHIMIYA, H. (1988): Inheritance and structure of foreign DNA inprogenies of transgenic tobacco obtained by direct gene transfer. Theor. Appl. Genet. 76,161 - 164

MUCKEL, E., SOLL, J. (1986): A protein import receptor of chloroplasts is inserted into theouter envelope membrane by a novel pathway. J. Biol. Chem. 271, 23846 - 23852

MULLIS, K. B., FALOONA, F. (1986): Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: thepolymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Quant. Biol. 51, 263 - 273

MURASHIGE, T., SKOOG, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473 - 497

MURILLO, M., LEUSTEK, T. (1995): Adenosine-5´-triphosphate-sulfurylase fromArabidopsis thaliana and Escherichia coli are functionally equivalent but structurally andkinetically divergent: Nucleotide sequence of two Adenosine-5´-triphosphate-sulfurylasecDNAs from Arabidopsis thaliana and analysis of a recombinant enzyme. Arch. Biochem.Biophys. 323, 195 - 204

NAKAI, K., KANEHISA, M. ( 1992): A knowledge base for predicting localization sites ineukaryotic cells. Genomics 14, 897 - 911

Literatur 108

NAPOLI, C., LEMIEUX, C., JORGENSEN, R. (1990): Introduction of a chimeric chalconesynthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.Plant Cell 2, 279 - 289

NEUMANN, E., SCHAEFER-RIDDER, M., WANG, Y., HOFSCHNEIDER, P. H. (1982):Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1,841 - 845

NEWBIGEN, E., SMYTH, D. R., CLARKE, A. E. (1995): Understanding and controllingplant development. Trends Biotechnol. 13, 338 - 343

NIEHAUS, A., GISSELMANN, G., SCHWENN, J. D. (1992): Primary structure of theSynechococcus PCC 7942 PAPS reductase gene. Plant Mol. Biol. 20, 1179 - 1183

NIEHRS, C., BEISSWANGER, R., HUTTNER, W. (1994): Protein tyrosine sulfation, 1993 -an update. Chem.-Biol. Interact. 92, 257 - 271

OSSLUND, T., CHANDLER, C., SEGEL, I. H. (1982): ATP-sulfurylase from higher plants.Plant Physiol. 70, 39 - 45.

PAGE, R. D. M. (1996): An application to display phylogenetic trees on personal computersComput. Appl. Biosci. 12, 357 - 358

PENG, Z., VERMA, D. P. S. (1995): A rice HAL2-like gene encodes an Ca2+-sensitive3´(2´),5´-diphosphonucleoside 3´(2´)-phosphohydrolase and complements yeast met22 undEscherichia coli cysQ mutations. J. Biol. Chem. 270, 29105 - 29110

PIGIET, V. P., SCHUSTER, B. J. (1986): Thioredoxin-catalyzed refolding of disulfid-containing proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7643 - 7647

PILON-SMITS, E. A., HWANG, S., MEL LYTLE, C., ZHU, Y., TAI, J. C., BRAVO, R. C.,CHEN, Y., LEUSTEK, T., TERRY, N. (1999): Overexpression of ATP sulfurylase in IndianMustard leads to increased selenate uptake, reduction and tolerance. Plant Physiol. 119,123 - 132

PRIOR, A. (1996): Charakterisierung der Thioredoxin:PAPS-Reduktase durchKomplementation pro- und eukaryotischer Mutanten. Diplomarbeit, Lehrstuhl für Biochemieder Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum

PRIOR, A., UHRIG, J. F., HEINS, L., WIESMANN, A., LILLIG, C. H., STOLTZE, C.,SOLL, J., SCHWENN, J. D. (1999): Structural and kinetic properties of adenylyl sulfatereductase from Catharanthus roseus cell cultures. Biochim. Biophys. Acta 1430, 25 - 38

QUINTERO, F. J., GARCIADEBLAS, B., RODRIGUEZ-NAVARRO, A. (1996): The SAL1gene of Arabidopsis, encoding an enzyme with 3´(2´),5´-biphosphate nucleotidase and inositolpolyphosphate 1-phosphatase activities, increases salt tolerance in yeast. Plant Cell 8,529 - 537

RENNENBERG, H. (1987): The fate of excess sulfur in higher plants. Annu. Rev. PlantPhysiol. 35, 121 - 153

Literatur 109

RENOSTO, F., SEUBERT, A., SEGEL, I. H. (1984): Adenosin 5´-phosphosulfate kinasefrom Penicillium chrysogenum. J. Biol. Chem. 259, 2113 - 2123

RENOSTO, F., SEUBERT, A., KUNDSON, P., SEGEL, I. H. (1985): APS-kinase fromPenicillium chrysogenum. J. Biol. Chem. 260, 1535 - 1544

RENOSTO, F., PATEL, H. C., MARTIN, R. L., THOMASSIAN, C., ZIMMERMANN, G.,SEGEL, I. H. (1993): ATP sulfurylase from higher plants: kinetic and structuralcharacterization of the chloroplast and cytosol enzymes from spinach leaf. Arch. Biochem.Biophys. 307, 272 - 285

ROBBINS, P. W., LIPMAN, F. (1958): Separation of two enzymatic phases in active sulfatesynthesis. J. Biol. Chem. 229, 686 - 690

ROGERS, S. G., HORSCH, R. B., FRALEY, R. T. (1986): Gene transfer in plants:production of transformed plants using Ti plasmid vectors. Methods Enzymol. 118, 627 - 640

ROLLAND, N., DROUX, M., DOUCE, R. (1992): Subcellular distribution of O-acetylserine-(thiol)-lyase in cauliflower (Brassica oleracea L.) inflorescence. Plant Physiol. 98, 927 - 935

ROLLAND, N., DROUX, M., LEBRUN, M., DOUCE, R. (1993): O-acetylserine-(thiol)-lyasefrom spinach (Spinacia oleraceae L.). Leaf cDNA cloning, characterization, andoverexpression in E. coli of the chloroplast isoform. Arch. Biochem. 300, 213 - 222

RÖMER, S., D`HARLINGUE, A., CAMERA, B., SCHANTZ, R., KUNTZ, M. (1992):Cysteine synthase from Casicum annuum chromoplasts. Characterization and cDNA cloning ofan up-regulated enzyme during fruit development. J. Biol. Chem. 267, 17966 - 17970

ROSE, H., (1992): Rapid transformation of Yeast. In: The Red Book Bulletin „Never CloneAlone“. Current Protocols in Molecular Biology 20. Ausubel et al. (eds.), Greena PublishingAssociates and Wiley-Interscience, New York

ROSENTHAL, E., LEUSTEK, T. (1995): A multifunctional Urechis caupo protein, PAPS-synthetase, has both ATP sulfurylase and APS kinase activities. Gene 165, 243 - 248

ROST, B. (1996): PHD: predicting one-dimensional protein sturcture by profile based neuralnetworks. Methods Enzymol. 266, 525 - 539

ROST, B., SANDER, C. (1993): Prediction of protein structure better than 70 % accurancy.J. Mol. Biol. 232, 584 - 599

ROST, B., SANDER, C. (1994): Combing evolutionary information and neural networks topredict protein secondary structure. Proteins 19, 55 - 72

ROST, B., SANDER, C., SCHNEIDER, P. (1994): PDH- an automatic mail server for proteinsecondary structure prediction. Comput. Appl. Biosci. 10, 53 - 60

Literatur 110

SAITO, K., KUROSAWA, M., TATSUGUCHI, K., TAKAGI, Y., MURAKOSHI, I. (1994a):Isolation and characterization of a cDNA that encodes a putative mitochondria-localiziedisoform of cysteine synthase (O-acetylserine-(thiol)-lyase) from Spinacia oleracea. J. Biol.Chem. 269, 28187 - 28192

SAITO, K., KUROSAWA, M., TATSUGUCHI, K., TAKAGI, Y., MURAKOSHI, I. (1994b):Modulation of cysteine biosynthesis in chloroplasts of transgenic tobacco overexpressingcysteine synthase (O-Acetylserin-(thiol)-lyase). Plant Physiol. 106, 887 - 895

SAMBROOK, J., MANIATIS, T., FRITSCH, E. F. (1989): Molecular cloning, a laboratorymanual 1 - 3. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York

SANGER, F., NICKLEN, S., COULSEN, A. R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467

SATISHCHANDRAN, C., HICKMAN, Y. N., MARKHAM, G. D. (1992): Characterizationof the phosphorylated enzyme intermediate formed in the adenosin-5´-phosphosulfate kinasereaction. Biochemistry 31, 11684 - 11688

SAVAGE, H., MONTOYA, G., SVENSSON, C., SCHWENN, J. D., SINNING, I. (1997):Crystal structure of phosphoadenylyl sulphate (PAPS) reductase: a new family of adeninenucleotide α-hydrolases. Structure 5, 895 - 906

SCHIFF, J. A., STERN, A. I., SAIDA, T., LI, J. (1993): Some molecular aspects of sulfatemetabolism in photosynthetic organisms. In: Sulfur nutrition and sulfur assimilation in higherplants. De Kok et al. (eds.), SPB Academic Publ., The Hague, 21 - 35

SCHIFFMANN, S. (1998): Struktur und Funktion der rekombinanten Adenosin-5´-phosphosulfat Kinase aus höheren Pflanzen. Dissertation, Lehrstuhl für Biochemie derPflanzen, Ruhr-Universität Bochum

SCHIFFMANN, S., SCHWENN, J. D. (1994): APS-sulfotransferase activity is identical tohigher plant APS-kinase. FEBS Letters 355, 229 - 232

SCHIFFMANN, S., SCHWENN, J. D. (1998): Isolation of cDNA clones encodingAdenosine-5´-phosphosulfate (APS)-kinase (EC 2.7.1.25) from Catharanthus roseus(Accession No. AF044285) and an isoform (akn2) from Arabidopsis thaliana (Accession No.AF043351). Plant Physiol. 117, 1125 - 1126

SCHMIDT, A. (1973): Sulfate reduction in a cell-free-system of Chlorella. Arch. Microbiol.93, 29 - 52

SCHMIDT, A. (1976): The adenosine-5´-phosphosulfate sulfotransferase from spinach(Spinacea oleracea L.). Stabilization, partial purification and properties. Planta (Berl.) 130,257 - 263

SCHMIDT, A. AND JÄGER, K. (1992): Open questions about sulfur metabolism in plants.Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43, 325 - 349

Literatur 111

SCHRIEK, U., SCHWENN, J. D. (1986): Properties of purified APS-Kinase fromEscherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 145, 32 - 38

SCHÜRMANN, P. (1995): Ferredoxin:thioredoxin systems. Methods Enzymol. 252, 274 - 283

SCHWENN, J. D. (1989): Sulfate assimilation in higher plants: a thioredoxin-dependentPAPS-reductase from spinach leaves. Z. Naturforsch. 44, 504 - 508

SCHWENN, J. D. (1994): Photosynthetic sulphate reduction. Z. Naturforsch. 49, 531 - 539

SCHWENN, J. D. (1997): Assimilatory reduction of inorganic sulphate. In: Sulphurmetabolism in higher plants. Cram et al. (eds.), Backhuys Publishers, Leiden, The Netherlands,39 - 58

SCHWENN, J. D., TREBST, A. (1976): Photosynthetic sulfat reduction by chloroplasts. In:The intact chloroplast 9. Barber, J., (ed.), Elsevier/North-Holland Biomedical Press,Amsterdam, 315 - 334

SCHWENN, J. D., JENDER, H. G. (1980): Revesed phase High-Performance-Liquid-Chromatograhie of adenine nucleotides: Applications to the kinetics of an adenosine3´-phosphate 5´-phosphosulfate sulphotransferase from plants. J. Chromatogr. 193, 285 - 290

SCHWENN, J. D., JENDER, H. G. (1981): A kinetic investigation of the APS-kinase fromChlamydomonas reinhardtii CW15. Phytochemistry 20, 601 - 604

SCHWENN, J. D., SCHRIEK, U. (1984): A new role for the thioredoxin in assimilatorysulphate reduction: Activation of the adenylylsuphate kinase from green alga Chlamydomonasreinhardtii CW15. FEBS letters 170, 76 - 80

SCHWENN, J. D., SCHRIEK, U. (1987): PAPS-reductase from Escherichia coli:Characterization of the enzyme as probe for thioredoxins. Z. Naturforsch. 72, 93 - 102

SCHWENN, J. D., DEPKA, B., HENNIES, H. H. (1976): Assimilatory sulfate reduction inchloroplasts: Evidence for the participation of both stromal and membrane-bound enzymes.Plant Cell Physiol. 17, 165 - 176

SCHWENN, J. D., KRONE, F. A., HUSMANN, K. (1988): Yeast PAPS reductase: propertiesand requirements of the purified enzyme. Arch. Microbiol. 150, 313 - 319

SETYA, A., MURILLO, M., LEUSTEK, T. (1996): Sulfate reduction in higher plants:Molecular evidence for a novel 5´-adenylylphosphosulfate (APS) reductase. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93, 13383 - 13388

SEUBERT, P. A., RENOSTO, F., KNUDSON, P., SEGEL, I. H. (1985):Adenosintriphosphate sulfurylase from Penicillium chrysogenum: steady state kinetics, andequilibrium binding studies. Arch. Biochem. Biophys. 240, 509 - 523

SHINTANI, D., ROESLER, K., SHORROSH, B., SAVAGE, L., OHLROGGE, J. (1997):Antisense and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves. Plant Physiol. 114,881 - 886

Literatur 112

SIEGEL, L. M., DAVIS, P. S. (1974a): Reduced nicotinamid dinucleotide phosphate sulfitereductase IV: The Escherichia coli hemoflavoprotein subunit structure and dissociation intohemoprotein and flavoprotein components. J. Biol. Chem. 249, 1587 - 1598

SIEGEL, L. M., DAVIS, P. S. (1974b): Reduced nicotinamid dinucleotide phosphate sulfitereductase of enterobacteria III: The Escherichia coli hemoflavoprotein: catalytic parametersand the sequence of electron flow. J. Biol. Chem. 249, 1572 - 1586

SIEGEL, L. M. (1975): Biochemistry of the sulfur cycle. In: Metabolic pathways VIII.Metabolism of sulfur compounds. Greenberg, D. M. (ed.), Academic Press, 217 - 286

SMITH, F. W., EALING, P. M., HAWKESFORD, M. J., CLARKSON, D. T. (1995): Plantmembers of a family of sulfate transporters reveal functional subtypes. Proc. Natl. Acad. SciUSA, 92, 9373 - 9377

SMITH, F. W., HAWKESFORD, M. J., EALING, P. M., CLARKSON, D. T.,VANDENBERG, P. J., BELCHER, A. R., WARRILOW, A. G. (1997): Regulation ofexpression of a cDNA from barley roots encoding a high affinity sulphate transporter. Plant J.12, 875 - 884

STAUDINGER, M. (2000): Molekulare Grundlagen der Sulfitbildung in Pflanzen.Diplomarbeit, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum

SUIKO, M., FERNANDO, P. H., SAKAKIBARA, Y., K UDO, H., NAKAMURA, T., LIU,M. C. (1997): Characterization of bovine heart sulfotransferase catalyzing the sulfation oftyrosine-containing peptides. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 43, 485 - 490

SULLIVAN, M., GREEN, P. (1993): Post-transcriptional regulation of nuclear encoded genesin higher plants: The role of mRNA stability and translation. Plant Mol. Biol. 23, 1091 - 11104

SUTER, M., BALLMOOS, P. VON, KOPRIVA, S., OP DEN CAMP, R., SCHALLER, J.,KUHLEMEIER, C., SCHÜRMANN, P., BRUNOLD, C. (2000): Adenosine 5´-phosphosulfate sulfotransferase and adenosine 5´-phosphosulfate reductase are identicalenzymes. J. Biol. Chem. 275, 930 - 936

TAKAHASHI, H., SASAKURA, N., NOJI, M., SAITO, K. (1996): Isolation andcharacterisation of a cDNA encoding a sulfate transporter from Arabidopsis thaliana. FEBSLett. 392, 95 - 99

TAKAHASHI, H., YAMAZAKI, M., SASAKURA, N., WATANABE, A., LEUSTEK, T.,DE ALMEIDA-ENGLER, J., ENGLER, G., VAN MONTAGU, M., SAITO, K. (1997):Regulation of sulfur assimilation in higher plants: A sulfate transporter induced in sulfate-starved roots plays a central role in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,11102 - 11107

TAMURA, H., MORIOKA, Y., HOMMA, H., MATSUI, M. (1997): Construction andexpression of chimeric rat liver hydroxysteroid sulfotransferase isoenzymes. Arch. Biochem.Biophys. 341, 309 - 314.

Literatur 113

THAUER, R. K., JUNKERMANN, K., DECKER, K. (1977): Energy conservation inchemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriol. Rev. 41, 100 - 180

THEOLOGIS, A. (1994): Control of ripening. Curr. Opin. Biotechnol. 5, 152 - 157

THOMAS, D., BARBAY, R., SURDIN-KERJAN, Y. (1990): Gene-enzyme relationship in thesulfate assimilation pathway of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 265, 15518 - 15524

TOWBIN, H., STAEHELIN, T., GORDON, J. (1979): Electrophoretic transfer of proteinsfrom polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 - 4364

TSANG, M. L. S. (1981): Assimilatory sulfate reduction in Escherichia coli: identification ofthe alternate cofactor for adenosine 3´-phosphate 5´-phosphosulfate reductase as glutaredoxin.J. Bacteriol. 146, 1059 - 1066

TSANG, M. L. S., SCHIFF, J. A. (1978a): Assimilatory sulfate reduction in an Escherichiacoli mutant lacking thioredoxin activity. J. Bacteriol. 134, 131 - 138

TSANG, M. L. S., SCHIFF, J. A. (1978b): Studies of sulfate utilization by algae 18.Identification of glutathione as a physiological carrier in assimilatory sulfate reduction byChlorella. Plant Sci. Lett. 11, 177 - 183

UHRIG, J. (1996): Strukturgene, Regulation und physiologische Basis des Sulfatstoffwechselsin Zellkulturen höherer Pflanzen. Dissertation, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum

VANCANNEYT, G., SCHMIDT, R., O´CONNOR-SANCHEZ, A., WILLMITZER, L.,ROCHA-SOSA, M. (1990): Construction of an intron-containing marker gene: splicing of theintron in transgenic plants and its use in monotoring early events in Agrobacterium-mediatedplant transformation. Mol. Gen. Genet. 220, 245 - 250

VARIN, L., MARSOLAIS, F., RICHARD, M., ROULEAU, M. (1997): Biochemistry andmolecular biology of plant sulfotransferases. FASEB J. 11, 517 - 525

VIDMAR, J. J., SCHJOERRING, J. K., TOURAINE, B., GLASS, A. D. (1999): Regulationof the hvst1 gene encoding a high-affinity sulfate transporter from Hordeum vulgare. PlantMol. Biol. 40, 883 - 892

VOGEL, H. J., BONNER, D. M. (1956): Acetylornithinase of Escherichia coli: practicalpurification and some properties. J. Biol. Chem. 218, 97 - 106

VRIEND, G. (1990): WHATIF: a molecular modeling and drug design program. J. Mol.Graph. 8, 52 - 56

WAEGEMANN, K., SOLL, J. (1991): Characterization of the protein import apparatus inisolated outer envelopes of chloroplasts. Plant J. 1, 149 - 158

WARBURG, O., CHRISTIAN, W. (1941): Isolierung und Kristallisation des GärungsfermentsEnolase. Biochem. Z. 310, 384 - 421

Literatur 114

WIESMANN, A. (1999): Molekulare Parameter der Expression Sulfat assimilierender Enzymeaus höheren Pflanzen und Zellkulturen. Diplomarbeit, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen,Ruhr-Universität Bochum

WILKINS, M. R., LINDSKOG, I., GASTEIGER, E., BAIROCH, A., SANCHEZ, J. C.,HOCHSTRASSER, D. F., APPEL, R. D. (1997): Detailed peptide characterization usingPEPTIDEMASS - a world-wide-web accessible tool. Electrophoresis 18, 403 - 408

WILLIAMS, C. H. R. (1995): Mechanism and structure of thioredoxin reductase fromEscherichia coli. FASEB J. 9, 1267 - 1276

WRAY, J. L., CAMPBELL, E. I., ROBERTS, M. A., GUTIERREZ-MARCOS, J. F. (1998):Redefining reductive sulfate assimilation in higher plants: a role for APS reductase, a newmember of the thioredoxin superfamily? Chemico-Biol. Interact. 109, 153 - 167

YAMAGUCHI, Y., NAKAMURA, T., HARADA, T., KOIZUMI, N., SANO, H. (1999):Differential accumulation of transcripts encoding sulfur assimilation enzymes upon sulfurand/or nitrogen deprivation in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63,762 - 766

Anhang 115

7 Anhang

7.1 Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Klons Crpar4 ausCatharanthus roseus

Das Startkodon (A119TG) sowie das Opal-Stopkodon (T1511GA) sind fett gedruckt.

1 AAT TCGGCACGAG 14 AAAAAAACAT CATAGCAAAA TTCACCAAGC CCAGAAATCC AAAAACCTTC TGATTAGCAT 74 TGCAAATCTT TGTGTTCTTT CTTGATTCTT AGAGAATTTC TGGAA ATGGC TTTGGCTTTC 1 M1 A L A F 134 ACTTCTTCAA CTGCAATTCA TGGCTCTCTG TCTTCTTCAT TTGAACAAAC AAAAGCAGCA 6 T S S T A I H G S L S S S F E Q T K A A 194 GCGGCGCAGT TTGGTTCATT TCAGCCTTTG GATCGGCCAC ATACTATATC ACCTTCGGTG 26 A A Q F G S F Q P L D R P H T I S P S V 254 AATGTTTCTC GTAGACGTTT GGCCGTTAAG CCAATTAACG CTGAGCCTAA AAGGAATGAG 46 N V S R R R L A V K P I N A E P K R N E 314 TCAATTGTCC CCTCCGCAGC AACCACCGTT GCTCCCGAGG TTGAAGAGAA AGTTGATGTG 66 S I V P S A A T T V A P E V E E K V D V 374 GAAGACTATG AGAAATTGGC TGATGAGCTT CAAAATGCCT CTCCTCTTGA GATCATGGAC 86 E D Y E K L A D E L Q N A S P L E I M D 434 AAGTCCCTGG CTAAGTTTGG CAATGATATA GCTATTGCTT TCAGTGGGGC CGAAGACGTT 106 K S L A K F G N D I A I A F S G A E D V 494 GCCTTGATAG AGTATGCACA CTTGACTGGT CGACCATTCA GAGTATTTAG CTTGGACACA 126 A L I E Y A H L T G R P F R V F S L D T 554 GGGAGATTGA ATCCGGAGAC ATATAAATTT TTTGATACGG TTGAGAAACA GTATGGAATT 146 G R L N P E T Y K F F D T V E K Q Y G I 614 CATATTGAGT ACATGTTTCC TGATGCTGTC GAAGTTCAGG CTTTAGTTAG GAGCAAGGGG 166 H I E Y M F P D A V E V Q A L V R S K G 674 CTTTTTTCTT TCTACGAAGA TGGCCACCAA GAGTGCTGCC GGGTGAGGAA GGTCAGGCCC 186 L F S F Y E D G H Q E C C R V R K V R P 734 CTGCGAAGAG CCCTTAAGGG ATTACGCGCA TGGATCACTG GGCAGAGGAA AGATCAGTCT 206 L R R A L K G L R A W I T G Q R K D Q S 794 CCTGGCACTA GGTCTGAAAT TCCAGTTGTC CAGGTTGACC CTGTTTTTGA AGGAATGGAT 226 P G T R S E I P V V Q V D P V F E G M D 854 GGTGGTGTAG GCAGCTTGGT GAAGTGGAAT CCTGTGGCTA ATGTGGAAGG AAAGGATATC 246 G G V G S L V K W N P V A N V E G K D I 914 TGGAACTTCC TCCGAGCCAT GGATGTGCCG GTGAACACAT TGCACTCACA AGGTTATGTC 266 W N F L R A M D V P V N T L H S Q G Y V 974 TCAATTGGCT GTGAGCCGTG CACGAGGCCA GTCCTTCCAG GGCAGCACGA GAGGGAAGGA 286 S I G C E P C T R P V L P G Q H E R E G 1034 AGGTGGTGGT GGGAAGATGC CAAAGCAAAG GAATGTGGGT TACACAAAGG GAATATCAAG 306 R W W W E D A K A K E C G L H K G N I K 1094 GAGGAAACTC TGAATAATAA TGGGAATGGA GCTGTTAATG GAAATGGAAG TGATACTATT 326 E E T L N N N G N G A V N G N G S D T I 1154 GCTGATATCT TTGATACCAA TAATGTAACG AGCTTGAGTA GGCCTGGGAT TGAGAATTTG 346 A D I F D T N N V T S L S R P G I E N L 1214 CTGAAGTTGG AGGAAAGGAG AGAGGCATGG CTAGTTGTAC TTTACGCACC TTGGTGCCGT 366 L K L E E R R E A W L V V L Y A P W C R 1274 TTTTGCCAGG CAATGGAAGG ATCATATCTT GAATTGGCAG AAAAGTTGGC TGGTTCTGGT 386 F C Q A M E G S Y L E L A E K L A G S G 1334 GTAAAAGTTG GAAAGTTTAA GGCAGACGGT GATCAGAAGG CATTTGCACA GCAAGAATTG 406 V K V G K F K A D G D Q K A F A Q Q E L 1394 CAGCTGAATA GCTTCCCTAC AATTCTTTTC TTCCCAAAGC ACTCATCTAA GCCCATAAAA 426 Q L N S F P T I L F F P K H S S K P I K 1454 TATCCATCAG AGAAGAGGGA TGTAGACTCA TTGATGGCTT TTGTTAATGC CCTGCGATGA 446 Y P S E K R D V D S L M A F V N A L R * 1514 ATCCCGTTTA AGGTTTTAAG TGCAGGAAGA TCTTCCTGGG TTTAGTCCAT AAAGCCTTTT 1574 CGCCTTCTGA ACAATTTGAA GGAGGAAAAT GTATACATGG CGGATAAAAG TGGTGTCCGA 1634 AGTTGATTAG TTTTCAACTT CTTCTGGACT TTGTAGTATA CTGCTACTAG TAATATCTAC 1674 ATTTCTTTTT CTTGTATACA AATCGGACCC ATACGTAAAT TTTTCCCCTT GTTTAAAAAA 1754 AAAAAAAAAA AAAC

Anhang 116

7.2 Nukleotidsequenz des cDNA-Klons Crpar1 aus Catharanthus roseus

1 AATTGTCC CCTCCGCAGC AACCACCGTT GCTCCCGAGG TTGAAGAGAA AGTTGATGTG 59 GAAGACTATG AGAAATTGGC TGATGAGCTT CAAAATGCCT CTCCTCTTGA GATCATGGAC 119 AAGTCCCTGG CTAAGTTTGG CAATGATATA GCTATTGCTT TCAGTGGGGC CGAAGACGTT 179 GCCTTGATAG AGTATGCACA CTTGACTGGT CGACCATTCA GAGTATTTAG CTTGGACACA 239 GGGAGATTGA ATCCGGAGAC ATATAAATTT TTTGATACGG TTGAGAAACA GTATGGAATT 299 CATATTGAGT ACATGTTTCC TGATGCTGTC GAAGTTCAGG CTTTAGTTAG GAGCAAGGGG 359 CTTTTTTCTT TCTACGAAGA TGGCCACCAA GAGTGCTGCC GGGTGAGGAA GGTCAGGCCC 419 CTGCGAAGAG CCCTTAAGGG ATTACGCGCA TGGATCACTG GGCAGAGGAA AGATCAGTCT 479 CCTGGCACTA GGTCTGAAAT TCCAGTTGTC CAGGTTGACC CTGTTTTTGA AGGAATGGAT 539 GGTGGTGTAG GCAGCTTGGT GAAGTGGAAT CCTGTGGCTA ATGTGGAAGG AAAGGATATC 599 TGGAACTTCC TCCGAGCCAT GGATGTGCCG GTGAACACAT TGCACTCACA AGGTTATGTC 659 TCAATTGGCT GTGAGCCGTG CACGAGGCCA GTCCTTCCAG GGCAGCACGA GAGGGAAGGA 719 AGGTGGTGGT GGGAAGATGC CAAAGCAAAG GAATGTGGGT TACACAAAGG GAATATCAAG 779 GAGGAAACTC TGAATAATAA TGGGAATGGA GCTGTTAATG GAAATGGAAG TGATACTATT 839 GCTGATATCT TTGATACCAA TAATGTAACG AGCTTGAGTA GGCCTGGGAT TGAGAATTTG 899 CTGAAGTTGG AGGAAAGGAG AGAGGCATGG CTAGTTGTAC TTTACGCACC TTGGTGCCGT 959 TTTTGCCAGG CAATGGAAGG ATCATATCTT GAATTGGCAG AAAAGTTGGC TGGTTCTGGT 1019 GTAAAAGTTG GAAAGTTTAA GGCAGACGGT GATCAGAAGG CATTTGCACA GCAAGAATTG 1079 CAGCTGAATA GCTTCCCTAC AATTCTTTTC TTCCCAAAGC ACTCATCTAA GCCCATAAAA 1139 TATCCATCAG AGAAGAGGGA TGTAGACTCA TTGATGGCTT TTGTTAATGC CCTGCGATGA 1199 ATCCCGTTTA AGGTTTTAAG TGCAGGAAGA TCTTCCTGGG TTTAGTCCAT AAAGCCTTTT 1259 CGCCTTCTGA ACAATTTGAA GGAGGAAAAT GTATACATGG CGGATAAAAG TGGTGTCCGA 1319 AGTTGATTAG TTTTCAACTT CTTCTGGACT TTGTAGTATA CTGCTACTAG TAATATCTAC 1379 ATTTCTTTTT CTTGTATACA AATCGGACCC ATACGTAAAT TTTTCCCCTT GTTTAAAAAA 1439 AAAAAAAAAA AAAC

7.3 Nukleotidsequenz des cDNA-Klons Crpar2 aus Catharanthus roseus

1 AATTC GGCACGAGCG 16 GCACGAGCGG CACGAGCAGC AACCACCGTT GCTCCCGAGG TTGAAGAGAA AGTTGATGTG 76 GAAGACTATG AGAAATTGGC TGATGAGCTT CAAAATGCCT CTCCTCTTGA GATCATGGAC 136 AAGTCCCTGG CTAAGTTTGG CAATGATATA GCTATTGCTT TCAGTGGGGC CGAAGACGTT 196 GCCTTGATAG AGTATGCACA CTTGACTGGT CGACCATTCA GAGTATTTAG CTTGGACACA 256 GGGAGATTGA ATCCGGAGAC ATATAAATTT TTTGATACGG TTGAGAAACA GTATGGAATT 316 CATATTGAGT ACATGTTTCC TGATGCTGTC GAAGTTCAGG CTTTAGTTAG GAGCAAGGGG 376 CTTTTTTCTT TCTACGAAGA TGGCCACCAA GAGTGCTGCC GGGTGAGGAA GGTCAGGCCC 436 CTGCGAAGAG CCCTTAAGGG ATTACGCGCA TGGATCACTG GGCAGAGGAA AGATCAGTCT 496 CCTGGCACTA GGTCTGAAAT TCCAGTTGTC CAGGTTGACC CTGTTTTTGA AGGAATGGAT 556 GGTGGTGTAG GCAGCTTGGT GAAGTGGAAT CCTGTGGCTA ATGTGGAAGG AAAGGATATC 616 TGGAACTTCC TCCGAGCCAT GGATGTGCCG GTGAACACAT TGCACTCACA AGGTTATGTC 676 TCAATTGGCT GTGAGCCGTG CACGAGGCCA GTCCTTCCAG GGCAGCACGA GAGGGAAGGA 736 AGGTGGTGGT GGGAAGATGC CAAAGCAAAG GAATGTGGGT TACACAAAGG GAATATCAAG 796 GAGGAAACTC TGAATAATAA TGGGAATGGA GCTGTTAATG GAAATGGAAG TGATACTATT 856 GCTGATATCT TTGATACCAA TAATGTAACG AGCTTGAGTA GGCCTGGGAT TGAGAATTTG 916 CTGAAGTTGG AGGAAAGGAG AGAGGCATGG CTAGTTGTAC TTTACGCACC TTGGTGCCGT 976 TTTTGCCAGG CAATGGAAGG ATCATATCTT GAATTGGCAG AAAAGTTGGC TGGTTCTGGT 1036 GTAAAAGTTG GAAAGTTTAA GGCAGACGGT GATCAGAAGG CATTTGCACA GCAAGAATTG 1096 CAGCTGAATA GCTTCCCTAC AATTCTTTTC TTCCCAAAGC ACTCATCTAA GCCCATAAAA 1156 TATCCATCAG AGAAGAGGGA TGTAGACTCA TTGATGGCTT TTGTTAATGC CCTGCGATGA 1216 ATCCCGTTTA AGGTTTTAAG TGCAGGAAGA TCTTCCTGGG TTTAGTCCAT AAAGCCTTTT 1276 CGCCTTCTGA ACAATTTGAA GGAGGAAAAT GTATACATGG CGGATAAAAG TGGTGTCCGA 1336 AGTTGATTAG TTTTCAACTT CTTCTGGACT TTGTAGTATA CTGCTACTAG TAATATCTAC 1396 ATTTCTTTTT CTTGTATACA AATCGGACCC ATACGTAAAT TTTTCCCCTT GTTTACTTGA 1456 GAGTACGTTT CATCCTCATC AACTCTGATA CTATATTCAT TGAAAATTTG AAAGGCAAAC 1516 GCCTCTTCTG CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA C

Anhang 117

7.4 Primärstrukturvergleich der APS-Reduktase aus Catharanthus roseus mitProteinen der EMBL-Datenbank

Primärsequenzvergleich der APS-Reduktase aus C. roseus (C.r.) mit dem Protein PRH26 ausA. thaliana (A.t.PRH26, U53865), einer APS-Reduktase aus A. thaliana (A.t.APR1,AF016282), dem cysH-Homolog von B. subtilis (B.s., U76751), der PAPS-Reduktase ausS. cerevisiae (S.c., U25840) und der PAPS-Reduktase aus E. coli (E.c., P18754).Aminosäuren, die in allen Sequenzen identisch sind, sind fett gedruckt. Die Motive ECGLHund CXXC sind grau unterlegt.

A.t.APR1 MAMSVNVSSSSSSGIINSRFGVSLEPKVSQIGSLRLLDRVHVAPVSLNLSGKRSSSVKPL 60 A.t.PRH26 MALAINVSSSSSSAISSSSF-PSSDLKVTKIGSLRLLNRTNVSAASLSLSGKRSS-VKAL 58C.r. MALAF-TSSTAIHGSLSSSF-EQTKAAAAQFGSFQPLDRPHTISPSVNVSRRRLA-VKPI 57 A.t.APR1 NAEPKTKDSMIPLAATMVAEIAEEVDVVEIEDFEELAKKLENASPLEIMDKALEKYGNDI 120A.t.PRH26 NVQSITKESIV------ASEVTEKLDVVEVEDFEELAKRLENASPLEIMDKALEKFGNDI 112C.r. NAEPKRNESIVP--SAATTVAPEVEEKVDVEDYEKLADELQNASPLEIMDKSLAKFGNDI 115B.s. ----------------------MLTYDNWEEPTITFPEDDPYKGALSVLKWAYGHYGDQL 38S.c. ---------------MKTYHLNNDIIVTQEQLDHWNEQLIKLETPQEIIAWSIVTFPHLF 45E.c. ------------MSKLDLNALNELPKVDRILALAETNAELEKLDAEGRVAWALDNLPGEY 48 A.t.APR1 AIA-F-S- AEDVALIEYAHLTGRPFRVFSL GRLNPE YRFFDAVEKHYG----IRIE 173A.t.PRH26 AIA-F-S- AEDVALIEYAHLTGRPYRVFSL GRLNPE YRLFDTVEKHYG----IRIE 165C.r. AIA-F-S- AEDVALIEYAHLTGRPFRVFSL GRLNPE YKFFDTVEKQYG----IHIE 168B.s. VYAC--SF IEGIVLIDLIYKVKKDAEIVFL GLHFKE YETIERVKERYP----GLNI 92S.c. QTTAFGLT LVTIDMLSKLSEKYYMPELLFI LHHFPQ LTLKNEIEKKYYQPKNQTIH 105E.c. VLSS--SF IQAAVSLHLVNQIRPDIPVILT GYLFPE YRFIDELTDKLK----LNLK 102 A.t.APR1 YMFPDSVEVQGLVRSKGLFSFYEDGHQECCRVR R LRR LKG--LKAWIT Q KD SP 231A.t.PRH26 YMFPDAVEVQALVRNKGLFSFYEDGHQECCRIR R LRR LKG--LRAWIT Q KD SP 223C.r. YMFPDAVEVQALVRSKGLFSFYEDGHQECCRVR R LRR LKG--LRAWIT Q KD SP 226B.s. ILKKPDLTLEEQAEEHGDK-LWEREPNQCCYLR V LRE LQ---DISLAF L RD GP 150S.c. VYKPDGCESEADFASKYGDFLWEKDDDKYDYLA E AHR YKELHISAVFT R KS GS 165E.c. VYRATESAAWQEARYGKLWEQGVEGIEKYNDIN E MNR LKELNAQTWFA L RE SG 162 A.t.APR1 GT SEIPVVQVDPVFEGWMVEFGSLV WN VANVEGNDVWNFLRTMDVPVNT HAA I 291A.t.PRH26 GT SEIPVVQVDPVFEGLDGGVGSLV WN VANVEGNDVWNFLRTMDVPVNT HAA V 283C.r. GT SEIPVVQVDPVFEGMDGGVGSLV WN VANVEGKDIWNFLRAMDVPVNT HSQ V 286B.s. -S ANTNFLNKDEKFK--------SV VC HYPLTWKDIWRYTSRNELDYNP HDQ P 201S.c. -A SQLSIIEIDELNG--------IL IN LINWTFEQVKQYIDANNVPYNE LDL R 216E.c. -S ANLPVLAIQRGVF---------- VL IIDWDNRTIYQYLQKHGLKYHP WDE L 211 A.t.APR1 I CEPC KAVLPGQHEREGRWWWEDAKAK L KGNVKENSD----DAKVNGESKSAVA 347A.t.PRH26 I CEPC RAVLPGQHEREGRWWWEDAKAK L KGNIKENTNG---NATANVNGTASVA 340C.r. I CEPC RPVLPGQHEREGRWWWEDAKAK L KGNIKEETLNNNGNGAVNGNGSDTIA 346B.s. I CAPC SPAFTAEDLRSG--RWNGMAKT L E------------------------- 234S.c. I DYHS QPVKEGEDERAG--RWKGKAKT I EASRFAQFLKQDA------------- 261E.c. V DTHT RKWEPGMAEEET--RF-FGLKR L EG------------------------ 244 A.t.APR1 DIFKSENLVTLSRQGIENLMKLENRKEPWIVVLYAPWCPFCQAMAS-YDELADKLAGSGI 406A.t.PRH26 DIFNSENVVNLSRQGIENLMKLENRKEAWIVVLYRPWCPFCQAMEASFDELADKLGGSGV 400C.r. DIFDTNNVTSLSRPGIENLLKLEERREAWLVVLYAPWCRFCQAMEGSYLELAEKLAGSGV 406 A.t.APR1 KVAKFRADGDQKEFAKQELQLGSFPTILVFPKNSSRPIKYPSEKR-VLSL---------- 455A.t.PRH26 KVAKFRADGDQKDFAKKELQLGSFPTILVFPKNSSIPIKYPSEKRDVDSLTSFLNLVR-- 458C.r. KVGKFKADGDQKAFAQQELQLNSFPTILFFPKHSSKPIKYPSEKRDVDSLMAFVNALR-- 464

G DT TG DT TG DT TG DT TG DT TG DT T

KV P A G R QKV P A G R QKV P A G R QKV P A G R QKV P A G R QKV P A G R Q

R K P L GY S R K P L GY S R K P L GY S R K P L GY S R K P L GY S R K P L GY S

G T ECG HG T ECG HG T ECG HG T ECG HG T ECG HG T ECG H

Anhang 118

7.5 Agrobakterien-freie Nicotiana tabacum Transformanden mit genomischerIntegration der T-DNA der Plasmide pBINAr1.R.2.1, pBINAr2.N.2.13 undpBINAr3.2.17 (ET: echte Transformanden)

Transformanden-gruppe

Plasmid Transformanden

ET1 pBINAr1.R.2.1 ET1.1, ET1.2, ET1.3, ET1.6, ET1.7, ET1.8,

ET1.12, ET1.13, ET1.14. ET1.15, ET1.17,

ET1.18, ET1.19, ET1.20, ET1.21, ET1.22,

ET1.23, ET1.24, ET1.25, ET1.27, ET1.28,

ET1.29, ET1.30, ET1.31, ET1.35, ET1.37,

ET1.39. ET1.40, ET1.42, ET1.45, ET1.46,

ET1.47, ET1.51, ET1.52, ET1.53, ET1.54,

ET1.55, ET1.57, ET1.58, ET1.59, ET1.60,

ET1.61, ET1.64, ET1.66, ET1.67, ET1.69,

ET1.70

ET2 pBINAr2.N.2.13 ET2.3, ET2.5, ET2.6, ET2.8, ET2.9, ET2.10,

ET2.11, ET2.12, ET2.17, ET2.18, ET2.20,

ET2.21, ET2.22, ET2.23, ET2.25, ET2.27,

ET2.28, ET2.32, ET2.35, ET2.36, ET2.38,

ET2.40, ET2.41, ET2.42, ET2.43, ET2.44,

ET2.47, ET2.48, ET2.49, ET2.50, ET2.51,

ET2.52, ET2.54, ET2.58, ET3.63, ET2.64,

ET2.66, ET2.67

ET3 pBINAr3.2.17 ET3.0, ET3.2, ET3.3, ET3.4, ET3.5, ET3.8,

ET3.9, ET3.11, ET3.13, ET3.14, ET3.15,

ET3.18, ET3.19, ET2.22, ET3.25, ET3.28,

ET3.30, ET3.31, ET3.32, ET3.33, ET3.34,

ET3.35, ET3.40, ET3.42, ET3.55, ET3.63,

ET3.64, ET3.66, ET3.67, ET3.68, ET1.71,

ET3.74, ET3.80, ET2.82, ET3.83, ET3.84,

ET3.85, ET3.87, ET3.89, ET3.90, ET3.91,

ET3.95

Anhang 119

7.6 Relative Intensitäten (I) der RT-PCR-Signale für die par-cDNA zur internenactin1-cDNA-Kontrolle (100 %) in ET1-, ET2- und ET3-Transformanden vonNicotiana tabacum

In jeder Gruppe wurden die Klone mit dem größten prozentualen Verhältnis alsÜberexprimierer ausgewählt (fett gedruckt), - : keine mRNA nachweisbar.

ET1-Transformanden

I (par)[%]

ET2-Transformanden

I (par)[%]

ET3-Transformanden

I (par)[%]

ET1.1 329 ET2.3 132 ET3.0 23

ET1.2 88 ET2.9 271 ET3.3 164

ET1.3 830 ET2.10 413 ET3.13 19

ET1.6 209 ET2.11 402 ET3.14 11

ET1.7 603 ET2.12 137 ET3.15 47

ET1.14 557 ET2.20 214 ET3.19 43

ET1.15 268 ET2.25 436 ET3.22 66

ET1.17 381 ET2.27 249 ET3.25 39

ET1.20 84 ET2.28 45 ET3.28 153

ET1.24 - ET2.32 - ET3.30 95

ET1.25 556 ET2.35 66 ET3.42 214

ET1.28 301 ET2.41 32 ET3.74 21

ET1.29 328 ET2.42 174 ET3.83 28

ET1.40 76 ET2.43 162 ET3.85 16

ET1.45 54 ET2.47 37 ET3.90 16

ET1.47 314 ET2.51 620 ET3.95 13

ET1.52 95 ET2.52 246

ET1.55 308 ET2.63 326

ET1.57 543 ET2.64 40

ET1.64 446 ET2.67 236

ET1.66 372

ET1.70 263

Veröffentlichungen

PRIOR, A., UHRIG, J. F., HEINS, L., WIESMANN, A., LILLIG, C. H., STOLTZE, C.,SOLL, J., SCHWENN, J. D. (1999): Structural and kinetic properties of adenyly sulfatereductase from Catharanthus roseus cell cultures. Biochim. Biophys. Acta 1430, 25 - 38

LILLIG, C. H., PRIOR, A., SCHWENN, J. D., ASLUND, F., RITZ, D., VLAMIS-GARDIKAS, A., HOLMGREN, A. (1999): New thioredoxins and glutaredoxins as electrondonors of 3´-phosphoadenylylsulfat reductase. J. Biol. Chem. 274, 7695 - 7698

BERENDT, U., HAVERKAMP, T., PRIOR, A., SCHWENN, J. D. (1995): Reactionmechanism of thioredoxin:3´-phosphoadenylylsulfate reductase investigated by site-directedmutagenesis. Eur. J. Biochem. 233, 347 - 356

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Antje Maria Prior

Geburtsdatum: 20. Oktober 1967

Geburtsort: Hemer

Schul- und Berufsausbildung

1974 - 1978 Albert-Schweitzer-Grundschule Lendringsen

1978 - 1987 Städt. Walram-Gymnasium Menden, Abschluß: Abitur

1987 - 1990 Ausbildung zur Bankkauffrau bei der Volksbank Menden eG

Studium

10/1990 - 09/1996 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

Abschluß: Diplom, Note „sehr gut“

Thema der Diplomarbeit: „Charakterisierung der Thioredoxin:

PAPS-Reduktase durch Komplementation pro- und

eukaryotischer Mutanten“

Angefertigt am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen

Betreuer der Arbeit: PD Dr. J. D. Schwenn

Seit Oktober 1996 Anfertigung der Dissertation mit dem Thema „Struktur und

Funktion einer pflanzlichen Adenosin-5´-phosphosulfat-

Reduktase aus Catharanthus roseus (L.)“ am Lehrstuhl für

Biochemie der Pflanzen

Betreuer der Arbeit: PD Dr. J. D. Schwenn

10/1996 - 09/1999 Stipendiatin des Graduiertenkollegs „Biogenese und

Mechanismen komplexer Zellfunktionen“

Berufliche Tätigkeit

15.01.1990 - 30.09.1990 Anstellung als Bankkauffrau bei der Volksbank Menden eG

Seit Oktober 1999 Im Rahmen der Dissertation Anstellung als wissenschaftliche

Mitarbeiterin von PD Dr. J. D. Schwenn am Lehrstuhl für

Biochemie der Pflanzen