1. Introducere

1.1. Mioglobina

Mioglobina este localizată in celulele musculare şi are ca funcţie preluarea oxigenului din

sânge şi stocarea acestuia pană la momentul la care este consumat în aceste celule în vederea

producerii de energie.

In mioglobină, hemul este înconjurat de un lanţ polipeptidic, care se împachetează în

spaţiu pentru închide în interiorul său fierul, limitând accesul potenţialilor liganzi dinspre

exterior. Mai mult, sistemul imidazolic aparţinând catenei laterale a uneia dintre histidinele din

lanţul polipeptidic se coordinează la fier, care ajunge astfel să fie pentacoordinat, cu o singură

poziţie de coordinare liberă; această poziţie liberă este menţinută special pentru legarea

oxigenului molecular.

Mioglobina este o hemoproteina, structural şi funcţional foarte similar cu hemoglobina, o

proteină care constă dintr-un lanţ polipeptidic relativ mic, de 153 reziduuri aminoacizi care

conţine un hem cu un atom de fier.

Hemul este pigmentul propriu-zis a hemoglobinei şi gruparea prostetică a acesteia, în

timp ce globina, alcătuită în special din aminoacizii lizină şi histidină, constituie partea proteică a

macromoleculei. Hemul respirator se formează doar în jurul fierului bivalent (ion feros - Fe2+),

ionul feric (Fe3+) fiind incapabil de a fixa oxigenul gazos.

Mioglobina şi hemoglobina au trăsături similare, un examplu: ambele existe în formele:

deoxi-, în care fierul este complet redus la forma Fe+2, oxi-, formată prin reacţia oxigenului

(HbO2 , MbO2) şi met- în care fierul este oxidat la Fe+3 şi nu reacţionează cu oxigenul. Când

oxigenul reacţionează cu forma redusa (deoxi-) este favorizată şi oxidarea Fe+2 la Fe+3 (forma

met), care se suprapune peste adiţia reversibilă a oxigenului la forma deoxi.

1.2. Spectrometria UV-VIS Metoda se bazează pe interacţiunea radiaţiilor UV-Vis de regulă din domeniul spectral

120 – 900 nm cu proba. Domeniul spectral 120 – 400 nm este domeniul ultraviolet (sub 190 nm

domeniul UV de vid), iar domeniul 400 – 800 nm domeniul vizibil.

Se bazeaza pe trimiterea unui fascicul luminos prin proba de interes, si pe determinarea in

ce măsură proba absoarbe această lumină, responsabili de aceasta absorbţie fiind electronii din

straturile de valenţă ale moleculelor din probă, care, absorbind lumina, sunt promovaţi pe orbitali

de energie superioară, anterior liberi.

Interacţiunea poate avea loc cu atomii, ionii şi moleculele din probă sau pot avea loc

interacţiuni pe baza proprietăţilor optice ale probelor de a reflecta, dispersa şi de roti planul

luminii polarizate.

Elemente componente ale unui spectrofotometru sunt:

• Sursa primară de radiaţie;

• Dispozitivul de monocromare a radiaţiei şi selectare lungime de undă (monocromatoare

sau policromatoare);

• Detectorul optic;

• Sistemul de condiţionare a semnalului (amplificatorul);

• Sistemul de citire şi afişare rezultat;

Legea lui Lambert – Beer descrie relaţia de legătură dintre absorbanţă, grasimea stratului

absorbant de probă (grosimea cuvei) şi concentraţia speciilor absorbante.

A=b*c*l

2. Materiale şi metodeSe prepara solutii tampon pentru valorile de pH 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, concentratiile

acestora fiind de 200 mM. Soluţiile tampon se prepară în apa de ultrapura. Soluţiile se

etichetează şi se depozitează în sticle, de preferinţă închise la culoare. Soluţiile se depozitează la

rece dar trebuie aduse la temperatura camerei înainte de fiecare experiment. Se va verifica (şi

ajusta, dacă este cazul) pH-ul la începutul fiecărei şedinţe săptămânale, dacă soluţia respectivă

urmează să fie folosită.

Calea aleasa pentru prepararea solutiilor de pH dorit a fost pregatirea solutiei uneia dintre

componente, la concentratia dorita, si ajustarea ulterioara a pH-ului cu un acid sau o baza dupa

caz, monotorizandu-se cu pH-metrul.

Pentru a calcula cantitatea necesară de materiale solide, utilizate în prepararea soluţiilor

tampon se foloseşte relaţiile:

n=c ∙V

n= mM , n reprezentant numarul de moli,

c = 200 mM ( 0.2 M )

V = 250 ml

m=M ∙200 ∙250[mM ]=0.05 ∙M

Macetat = 136 g

Mfosfat = 138.011 g

Mborat = 202 g

MCAPS = 221 g

Mglicina = 75.07 g

Tabel 1

pH Material pKa Cantitatea [g] Apă [ml]

2 Fosfat 2.15 6.9 250

3 Glicina 2.35 3.753 250

4Acetat

4.766.8

250

5 4.76 250

6

Fosfat

7.20

6.9

250

7 7.20 250

8 7.20 250

9Borat

9.2310.1

250

10 9.23 250

11 CAPS 10.40 11.05 250

12Fosfat

12.336.9

250

13 12.33 250

Se prepară soluţiie tampon dupa cantităţiile prevăzute în Tabelul 1.

pH-ul se ajustează cu ajutorul unui pH metru, al cărui electrod se ţine în CCl4, şi înainte de

folosire se spală bine cu apă ultrapură, după care se calibrează cu o soluţie tampon (de calibrare),

care are un pH constant la o temperatură dată.

• Soluţia tampon cu pH=2;

pHinitial = 5.76 + HCl => pH=2;

• Soluţia tampon cu pH=3;

pHinitial = 6 + HCl => pH=3;

• Soluţia tampon cu pH=4;

pHinitial = 8.26 + HCl => pH=4;

• Soluţia tampon cu pH=5;

pHinitial = 8.56 + HCl => pH=5;

• Soluţia tampon cu pH=6;

pHinitial = 5.27 + NaOH => pH=6;

• Soluţia tampon cu pH=7;

pHinitial = 5.55 + NaOH => pH=7;

• Soluţia tampon cu pH=8;

pHinitial = 5.33 + NaOH => pH=8;

• Soluţia tampon cu pH=9;

pHinitial = 9.29 + HCl => pH=9;

• Soluţia tampon cu pH=10;

pHinitial = 9.28 + NaOH => pH=10;

• Soluţia tampon cu pH=11;

pHinitial = 4.6 + NaOH => pH=11;

• Soluţia tampon cu pH=12;

pHinitial = 5.27 + NaOH => pH=12;

• Soluţia tampon cu pH=13;

pHinitial = 5.20 + NaOH => pH=13;

Soluţiile tampon se păstrează închise, ferite de lumină şi de căldură.

Solutia de mioglobina se pastreaza, preferabil, in concentratii de 1-5 mM. Peste

mioglobina ferica adaugam apa pura, pe urma se agita cu grija si asteptam sa se aseze solutia.

Extragerea probelor din solutiile stoc se va face tot timpul cu varfuri noi, utilizandu-se pipete

Eppendorf. In acest caz, solutia de mioglobina are concentratia de 1 mM si se pastreaza

obligatoriu in frigider. Pentru prepararea solutiei de mioglobina s-a realizat un amestec

echimolar (1:1) de mioglobina din inima de cal si apa ultrapura.

Inainte de fiecare utilizare se verifica concentratia solutiei pentru a avea reproductibilitate

in metoda utilizata. Pentru aceasta se verifica absorbanţa la pH=7, deoarece acest pH este cel mai

apropiat de pH-ul fiziologic. In cuva se pune 700 µl de soluţie tampon, cu care se face Baseline-

ul. După ce a fost stabilita linia de zero, se scoate cuva din spectrometru, se adaugă peste 5 µl

mioglobina şi traseaza spectrul. Se stabileste astfel, lungimea de unda la care absorbanta solutiei

este maxima.

A = ε · b · c

b = 1 cm

A = 1.383663

ε = 188

c= Aε ∙b

=1.3836631 ∙188

=7.36 ∙10−3mM

Deoarece în cuvă am pus 5 µl de mioglobina şi 700 µl de soluţie stoc, concentraţia

iniţială se calculează după ecuaţia:

C1 · V1 = C2 · V2

C1=7.36 ∙10−3 ∙705

5=1.038mM

Concentraţia soluţiei tampon va fi 50 mM. Domeniul de realizare a spectrului UV-Vis

pentru o proteină este de obicei 260-800 nm, insa de multe ori pentru mioglobină şi alte

hemoproteine se înregistrează spectrul doar în domeniul 400-750 nm. Pentru o proteină se va

observa întotdeauna un maxim în jur de 280 nm, datorat materialului proteic. Alături de acesta,

proteine ca mioglobina prezintă cofactori sau grupări prostetice cu absorbanţa în domeniul

vizibil. Un spectru UV-VIS ideal are absorbanţele cuprinse în intervalul 0.1-1 unităţi.

Pentru a determina absorbanţele soluţiile tampon se diluează de 3 ori ( 1 soluţie tampon :

3 apă ultrapură), se pune 700 µl, cu care se face linia de zero, după care se adaugă 5 µl

mioglobină, şi se înregistrează spectrul. Absorbanţele se citesc la lungimile de unda, la care s-a

stabilit ca apare maximul de absorbtie.

280 330 380 430 480 530 580 630 6800

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

pH = 2pH = 3pH = 4pH = 5pH = 6pH = 7pH = 8pH = 9pH = 10pH = 11pH = 12pH = 13

Lungimea de unda

Abso

rban

ta

Fig. 2. Spectrul UV-VIS al mioglobinei la pH = 2÷ 13 (Domeniul 280-650 nm)

La pH = 2 ÷ 4 proteina se denaturează, rupandu-se legaturile de hidrogen din structura.

Când are loc creşterea pH-ului se obţin benzi asemănătoare cu spectrul mioglobinei,

deoarece pH-ul se apropie de pH-ul fiziologic. Se observă o bandă intensă (banda Soret) la,

aproximativ, 410-430 nm, care in mediu acid sunt mai intense, iar în mediu bazic mai putin.

La pH bazic Fe este hexacoordinat, şi are loc o acumulare de OH -. Dacă la Fe se leagă

OH- acesta devine de spin jos, iar când face legătură cu apa, acesta devine de spin înalt.

Influenţa pH-ului asupra mioglobinei

450 470 490 510 530 550 570 590 610 630 6500

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

pH = 2pH = 3pH = 4pH = 5pH = 6pH = 7pH = 8pH = 9pH = 10pH = 11pH = 12pH = 13

Lungimea de unda

Abso

rban

ta

Fig. 3. Influenţa pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 ÷ 13 ( 450-650 nm)

580 590 600 610 620 630 640 6500

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Punctul izosbestic

pH = 2pH = 3pH = 5pH = 6pH = 7pH = 8pH = 9 pH = 10pH = 11pH = 12pH = 4pH = 13

Lungimea de unda

Abso

rban

ta

Fig. 4. Influenţa pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 ÷ 13 ( 580-650 nm)

In intervalul de 450 – 650 nm se observă suprapunerea benzilor pe la aproximativ 620

nm, ceea ce sugereaza existenta Fe in 2 forme de oxidare, in functie de pH diferind ligandul si

tiupl spinului.

La pH< 5 scade absorbanta şi la fel şi concentraţia mioglobinei, dar la pH > 8 are loc

creşterea absorbanţei, deci şi creşterea concentraţiei mioglobinei (absorbanta este direct

proportionala cu concentratia conform legii lui Lambert-Beer). La lungimi de undă mai mari

decat 700 nm mioglobina nu mai absoarbe.

In domeniul de pH în care proteina nu este denaturată, pH>4, se poate defini o constantă

pKa (logaritm zecimal din constanta de aciditate), care indică punctul de de echivalenţă dintre Fe

în stare de spin înalt sau jos. Pentru determinarea pKa-ului, se foloseşte un program de tip excel

reprezentându-se grafic absorbanţa în funcţie de pH, valoarea acesteia fiind determinată din

grafic, in acest caz punctul de echivalenta coincide cu acest pKa. Din grafic se poate vedea ca

pKa = 9.

2 4 6 8 10 12 140.015

0.017

0.019

0.021

0.023

0.025

0.027

0.029

0.031

pKa

pKa

Fig. 5. Determinarea pKa (absorbanta in functie de pH)

Influenţa unui agent reducător (ditionit de sodiu) asupra mioglobinei

Se prepară o soluţie de mioglobină la pH = 7; 10; 12, cu concentraţie de 20 mM. La

soluţii cu pH = 7 şi 10 se adaugă ditionit de sodiu, iar cu pH = 12 dioxid de tiouree.

Soluţiile tampon se diluează 1:5, folosindu-se apa ultrapura. Se pun în cuvă 700 µl din

această soluţie şi trage Baseline-ul, după care se pun 5 µl mioglobină şi se înregistrează spectrul.

Pentru urmărirea efectului unui agent reducător se adauga si câteva cristale de ditionit de sodiu în

cuvă şi se înregistrează încă odată spectrul.

370 420 470 520 570 6200

0.5

1

1.5

2

2.5

ph = 7pH = 7 cu ditionitpH = 10pH = 10 cu ditionitpH = 12pH = 12 cu tiouree

Lungimea de unda

Abso

rban

ta

Fig. 6. Efectul ditionitului de sodiu şi dioxidului de tiouree asupra concetraţiei mioglobinei

In cazul probei la pH = 7 s-a observat scăderea absorbanţei şi benzile se deplasează spre

vizibil. In cazul spectrului formei ferice maximul de absorbtie apare la 410 nm, iar în cazul

formei feroase apare la 430 nm, iar aceeasta scazand de la 0.9881132 la 0.6654195.

470 490 510 530 550 570 590 610 630 6500

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

pH = 7 cu ditionitpH = 7pH = 10pH = 10 cu ditionitpH = 12pH = 12 cu tiouree

Lungimea de unda

Abso

rban

ta

Fig. 7. Efectul ditionitului de sodiu şi dioxidului de tiouree asupra concetraţiei mioglobinei

Din spectrul inregistrat se poate observa ca la pH = 10 nu apar schimbări semnificative

faţă de pH = 7.

La pH = 12 se observă două peakuri la bandă fără dioxid de tiouree, iar cu agentul

reducător se observă doar un singur peak. Are loc o creştere a absorbanţei, de la 0.7285849 la

1.08099.

Dozarea activităţii peroxidazice printr-o metodă spectrofotometrică

Peroxidaza este o enzimă din clasa oxidoreductazelor ce catalizează oxidarea unor

substraturi organice pe seama reducerii apei oxigenate:

peroxidaza + H2O2 + substrat -> peroxidaza + H2O + substrat oxidat

Prepararea soluţiei de ascorbat

Mascorbat = 176.12 g/mol

200 mM = 0.2 M = 0.2 mol/l

n= mM

m = n · M = 0.2 · 176.12 = 25.224 g

25.224 g ............................1000 ml

x......................................1 ml

x = 0.0252 g

Soluţia de ascorbat de 200 mM se prepară prin dizolvarea 0.0252 g în 1 ml de soluţie

tampon pH = 5.

Se verifică concentraţia soluţiei de ascorbat prin spectrometrie UV-VIS. Se traseaza

Baseline-ul cu solutie tampon de pH=5, apoi se adauga ascorbatul si se inregistreaza spectrul.

A ~ 1 la λ = 290 nm

Prepararea soluţiei de peroxid

Se ia 50 µl de peroxid, peste care adauga 1 ml de apă ultrapură.

Se verifică concentraţia, când se face Baseline-ul cu apă ultrapură, după care se adauga

50 µl soluţie de peroxid şi se traseaza spectrul.

A = 2.62111

b = 1 cm

ε = 41

A = ε · b · c

c= Ab∙ ε

=2.6211141∙1

=0.0639M=36mM

Pentru a prepara soluţia cu concentraţia dorită (50 mM), soluţia necesară pentru determinare se calculează cu formula:

C1 · V1 = C2 · V2

10 · 64 = 50 · x => x = 12.8 ml

480 500 520 540 560 580 600 620 6400

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

Influenta ascorbatului

pH = 6pH = 8pH = 6 cu H2O2pH = 8 cu H2O2pH = 6 cu H2O2 si ascorbatpH = 8 cu H2O2 si ascorbat

Lungimea de unda

Abso

rban

ta

Fig. 8. Influenţa ascorbatului asupra mioglobinei, în soluţii cu pH = 6 şi 8

Prin adăugarea apei oxigenate Fe(II) oxideaza la Fe(III). La pH = 6 după adăugarea

ascorbatului intensitatea benzii scade, ceea ce înseamnă, că fierul tinde să revine la starea de

oxidare initiala. In cazul probei la pH = 8 banda reprezintă două maxime, după adăugarea

ascorbatului, care înseamnă că forma ferică la pH=8 este mai stabilă decât cea feroasa.

Se studiază comportamentul mioglobinei la pH = 6, când se adaugă peroxidază în

diferite concentraţii.

Soluţia tampun cu pH = 5

[µl]Mioglobina [µl] Ascorbat [µl] Peroxid [µl]

982.6 15.38 2 0

980 15.38 2 2

970 15.38 2 10

960 15.38 2 20

948 15.38 2 32

Se prepară soluţiile dupa datele intabelate.

In cuvă se pune soluţia tampon, cu care inregistreaza punctul zero, după care se adauga

ascorbatul şi peroxidul şi se porneşte reacţia. După aproximativ 5 secunde se deschide

spectrometrul, se adauga rapid cantitatea de mioglobină, se agită şi se măsoară în continuare

spectrul.

Vpanta se citeşte din panta dreptei, reprezentându-se mai intai grafic absorbanţa în funcţie de timp,

pentru fiecare concentraţie.

Peroxid [µM] vpanta vcalc Vmax 0.05 Vteoretic Diferenta Suma

      Km 600      0 0 0.0000     0.000 0 0.00018 kcat

100 0.0055 0.0157     0.007 7.25771E-05   0.004167500 0.0083 0.0236     0.023 8.24878E-07  

1000 0.0124 0.0353     0.031 1.64907E-05  1600 0.0161 0.0458     0.036 8.99375E-05  

0 200 400 600 800 100012001400160018000.00000.00500.01000.01500.02000.02500.03000.03500.04000.04500.0500

Curba de saturare pentru peroxid

Curba de saturare pentru peroxidLogarithmic (Curba de saturare pentru peroxid)Polynomial (Curba de saturare pentru peroxid)

Conc. Peroxid

Vite

za

Dupa utilizarea opţiunii SOLVER, se obtin urmatoerele date:

Peroxid [µM] vpanta vcalc Vmax 0.05965 Vteoretic Diferenta Suma

      Km 600      0 0 0.0000     0.000 0 7.3E-05 kcat

100 0.0055 0.0157     0.009 5.09878E-05   0.004971500 0.0083 0.0236     0.027 1.20991E-05  

1000 0.0124 0.0353     0.037 3.88374E-06  1600 0.0161 0.0458     0.043 6.07605E-06  

0200

400600

8001000

12001400

16001800

0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.050

Curba de saturare pentru peroxid

Curba de saturare pentru peroxidLogarithmic (Curba de sat-urare pentru peroxid)Polynomial (Curba de sat-urare pentru peroxid)

Conc. Peroxid

Vite

za

Concluzii

Mioglobina la pH < = 4 se denaturează, la pH>5 este stabilă

La pH = 6 forma oxidată a mioglobinei este mai puţin stabilă decât la pH = 8