Synteza związków znakowanych i ich zastosowanie w chemii organicznej,

biochemii i medycynie

Część II

Prof. dr hab. Marianna Kańska

Metody syntezy związków znakowanych izotopami

1. Prosta synteza chemiczna.

2. Synteza na drodze wymiany izotopowej.

3. Synteza metodą atomów odrzutu.

4. Synteza w wyniku rozpadu β (beta).

5. Biosynteza.

6. Syntezy metodami enzymatycznymi.

W praktyce podstawowe znaczenie ma prosta synteza chemiczna, biosynteza, synteza metodą wymiany izotopowej i metody enzymatyczne.

Właściwości syntezy związków znakowanych

Synteza związków znakowanych ma swoje specyficzne właściwości.

1. Substancją wyjściową do syntezy nie jest dowolny, najbardziej odpowiedni związek, lecz związek otrzymywany w procesie produkcji izotopu.

2. Ilości substancji stosowane do syntezy są małe, ponieważ ilości izotopu promieniotwórczego jest ograniczona, a rozcieńczenie substancją nieaktywną jest niepożądane, gdyż prowadziłoby do zmniejszenia aktywności właściwej.

3. Ze względu na mikroskalę należy stosować specjalne techniki.

4. Podczas reakcji występują efekty radiacyjne.

5. Czas syntezy powinien być krótki.

Właściwości syntezy związków znakowanych (c. d.)

6. Nie powinno być reakcji ubocznych.

7. Syntezę należy prowadzić w warunkach odpowiadającym przepisom BHP.

8. Należy opracować warunki syntezy na związkach nieaktywnych tzn. przeprowadzić syntezę zimną.

a) W celu opracowania warunków syntezy.

b) W celu ustalenia totalnej wydajności:

- chemicznej,- radiochemicznej.

Jednostki

tradycyjne: 1 Ci = 3,7 x 1010 rozp./sec

1 mCi = 3,7 x 107 rozp./sec

1 µCi = 3,7 x 104 rozp./sec

w układzie SI: 1 Bq = rozp./sec i wielokr. np. MBq = 106 Bq, GBq = 109 Bq

W wyniku pomiaru w otrzymujemy wynik w CPM (count per minute) lub w DPM (decay per minute).

Aktywność właściwa

Aktywność na jednostkę masy np. mCi/mg, MBq/gAktywność molowa jest to aktywność przypadająca na jeden mol, milimol, mikromol. Np. mCi/mole, DPM/mmole, MBq/mmol

Okres połowicznego rozpadu - T1/2

Jest to czas po upływie którego aktywność próbki zmniejsza się o połowę.

Synteza metodą wymiany izotopowej

• Wymianę izotopową stosuje się do otrzymywania związków organicznych znakowanych izotopami wodoru, węgla, siarki i fluorowców.

• W celu przeprowadzenia syntezy należy zapewnić kontakt pomiędzy wymieniającymi się substancjami, a następnie je rozdzielić.

• Metodą wymiany izotopowej można otrzymać takie związki, które nie można zsyntezować na drodze klasycznej syntezy organicznej.

• Metodą wymiany izotopowej tylko w bardzo rzadkich przypadkach można znakować związek w ściśle określonym miejscu.

Nomenklatura związków znakowanych

Stosuje się nazewnictwo związków zgodnie z regułami Konwencji Genewskiej. Podaje się przy tym położenie danego izotopu w cząsteczce. Korzysta się przy tym z niepełnego symbol chemicznego izotopu (14C, 13C, 125I, 2H, 3H itd.). Dla izotopów wodoru jest dopuszczalne użycie zamiast

2H – D (deuter) i 3H – T (tryt)

Gdy pozycja izotopu jest nieokreślona używa się następujących oznaczeń, jak np.

Kwas 14C-propionowy

Kwas 3H-ascorbinowy

Nomenklatura związków znakowanych c.d.

W przypadku związków znakowanych izotopami wodoru lub węgla, gdzie atomy

danego izotopu są rozmieszczone w sposób przypadkowy po całym pierścieniu,

dopuszcza się jeszcze inny sposób zapisu.

COOH

NH2

[ring -14C]-L-fenyloalanina

COOH

NH2

[U- 14C]-L-fenyloalanina (U-uniformely)

Gdy atomy 14C są w przypadkowy sposób rozmieszczone w całej cząsteczce to:

Nomenklatura związków znakowanych c.d.

Podobnie dla związków znakowanych izotopami wodoru

COOH

NH23H

[ring-3H]-L-fenyloalanina

Związki równomiernie (niespecyficznie) 14C lub izotopami wodoru

otrzymuje się głównie metodami klasycznej syntezy chemicznej lub w

wyniku biosyntezy. Wówczas w pożywce dla bakterii lub glonów

znajduje się 14CO2 lub woda trytowana, HTO lub deuterowana - DHO

lub D2O.

Nazewnictwo specyficznie znakowanych związków

Rozpatrzymy to na przykładzie L-fenyloalaniny

COOH

NH2

[1-14C]-L-fenyloalanina – [114-C]-L-Phe

COOH

NH2 * = 14C

[3-14C]-L-Phe

COOH

NH2

3H

3H

[2’,6’-3H2]-L-Phe

Nazewnictwo specyficznie znakowanych związków c.d.

COOH

NH2

3H HCOOH

NH2

H 3H

[3R-3H]-L-Phe [3S-3H]-L-Phe

Związki znakowane podwójnie

3H14COOH

Kwas 3-fenylo-[3-3H, 1-14C]-prop-2-enowylub

Kwas [3-3H, 1-14C]-cynamonowy

Wymiana izotopowa

Metoda wymiany izotopowej jest szeroko stosowana do otrzymywania związków organicznych znakowanych izotopami stabilnymi lub radioaktywnymi. Polega ona na zapewnieniu kontaktu między dwoma wymieniającymi się substancjami. Stosuje się przy tym podwyższoną temperaturę, katalizatory itp. Tą metodą nie zawsze otrzymuje się związki znakowane selektywnie Głównie stosuje się wymianę izotopowa do otrzymania związków znakowanych izotopami fluorowców lub wodoru. Fluorowce (Cl2, Br2, I2), kwasy fluorowcowodorowe (HCl, HBr, HI) oraz ich sole alkaliczne łatwo wchodzą w reakcję wymiany z fluorowco-pochodnymi węglowodorów. Wymianę prowadzi się w roztworze lub w stanie stopionym. I tak np.

RX + X2 R X + XX

C2H5Br + Ag82Br → C2H582Br + AgBr

Wymiana izotopowa c. d.

Za pomocą Li36Cl otrzymuje się chlorki alkilowe (butylu, heksylu) oraz 36Cl-chlo-robenzen

Cl + Li36Cl∆

CuO36Cl + LiCl

Otrzymywanie związków znakowanych 14C

CH314COONa + CH3COCl → CH3COONa + CH3

14COCl

14CO2 + KCN → K14CN + CO2

Otrzymywanie związków znakowanych 35S

(NH4)2CS + 35S → (NH4)2C35S + Stiomocznik

C6H5SH + 35S → C6H5 35SH + S

Znakowanie izotopami wodoru

Otrzymanie związków organicznych znakowanych izotopami wodoru w miejscach labilnych (gdy atom wodoru jest związany z atomem azotu tlenu, siarki) nie stanowi problemu, gdyż wymiana następuje szybko podczas prostego kontaktu np. z wodą deuterowaną czy trytowaną. Jednak związki znakowane w miejscach labilnych nie przedstawiają większej wartości w badaniach chemicznych, ze względu na odwrotną wymianę izotopową i stratę atomów znaczonych.

Wymiana atomów trytu czy deuteru w pozycjach trwałych (tj. związanie go z atomem węgla w szkielecie cząsteczki) następuje w specyficznych warunkach. Wymiana może przebiegać w podwyższonej temperaturze, w warunkach katalizy kwaśnej lub zasadowej, często też stosuje się jako katalizator sole platynowców.

Metoda Wiltzbacha

Do wprowadzenia trytu w skład cząsteczki stosuje się pewien rodzaj wymiany izotopowej zwanej Wiltzbacha metodą. Związek organiczny poddawany znakowaniu, rozpylony jest w postaci cieńkiego filmu na ścianach naczynia, poddaje się działaniu gazowego 100% trytu. W wyniku rekcji rozpadu jednego atomu trytu w cząsteczce gazowej powstaje

bardzo reaktywne indywiduum: T T β −

Τ 3He

które wchodzi w reakcje ze związkiem poddawanym znakowaniu, RH wg reakcji:

Τ 3He

T + 3He

RX+ RT + 3He + H

Wadą tej metody jest jej niespecyficzność, otrzymuje się [U-3H]-RH. Ze względu na czas prowadzenia syntezy trzeba uwzględnić straty związane z radiolizą RH oraz opracować metody oczyszczenia RX od produktów radiolizy.

Synteza związków znakowych trytem

Tryt na skalę przemysłową otrzymuje się:- w postaci trytku uranu- w postaci wody trytowej- trytu

Tryt w trytku uranu nie zawiera protu (jest preparatem beznośnikowym).Woda trytowa jest rozcieńczana wodą zwykłą, aby uniknąć znacznego rozkładu wody trytowej pod wpływem własnego promieniowania (autoradioliza). Tryt wprowadza się w skład cząsteczek organicznych metodą prostej syntezy chemicznej następującymi metodami:

1. Uwodornienie za pomocą trytu cząsteczkowego.2. Uwodornienie za pomocą wodorku litowo-glinowego.3. Hydroliza za pomocą wody trytowej.4. Hydratacja.

Synteza związków znakowych trytem c.d.

• Atomy wodoru związane z tlenem, azotem, siarką w cząsteczkach organicznych są ruchliwe (labilne).

• Wprowadzenie trytu na miejsce ruchliwego (labilnego) wodoru w cząsteczce jest niepożądane, gdyż podczas badań taki atom trytu zostaje utracony w wyniku wymiany izotopowej z rozpuszczalnikiem.

• Związki takie nie mogą być wykorzystane do badania mechanizmu reakcji i kinetyki.

• Trudno ruchliwy (nielabilny) wodór występuje w węglowodorach i grupach węglowodorowych.

• Dlatego też podstawowym zadaniem przy wprowadzeniu atomu trytu w skład cząsteczek jest otrzymanie węglowodorów i ich pochodnych.

Synteza związków znakowych trytem c.d.

Węglowodory znakowane trytem otrzymuje się:

• Przez uwodornienie węglowodorów nienasyconych gazowym trytem w obecności katalizatora.

• Przez redukcję dwutlenku węgla gazowym trytem.

Z wody trytowej:

• otrzymuje się [3H]-metan w wyniku rozkładu węgliku glinu przez HTO, • [3H]- acetylen w wyniku rozkładu acetylenku wapnia przez HTO.

• Z odczynnika Grignarda w wyniku rozkładu przez HTO otrzymuje się różnego rodzaju węglowodory alifatyczne oraz cykliczne.

Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca”

Metoda polega na reakcji tzw. atomów odrzutu z otaczającymi je cząsteczkami. Atom odrzutu (posiadający dużą energię kinetyczną) powstaje w wyniku rozpadu promieniotwórczego. Wówczas z jądra atomu wylatuje lekka cząsteczka (neutron, elektron, α-cząstka) a jądro powstającego pierwiastka jest “odrzucane” w stronę przeciwną otrzymując równoważną porcje energii kinetycznej. Atomy odrzutu, w wyniku reakcji jądrowej, są też wzbudzone na powłokach elektronowych, a więc bardzo reaktywne. Do znakowania związków trytem wykorzystuje się reakcję:

6Li(n, α)3H

W reaktorze sole litu (Li2CO3, Li2SO4, LiF) w mieszaninie ze związkiem organicznym napromieniowuje się w strumieniu wolnych neutronów. W trakcie syntezy 30-50% atomów trytu stabilizuje się w postaci wodoru cząsteczkowego, H3H, 10-50% podstawia wodór w związku organicznym, a reszta stabilizuje się w postaci innych związków.

Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca” c.d.Znakowanie węglem

Do znakowania 14C stosuje się związki zawierające azot, lub mieszaniny związków organicznych z substancjami zawierającymi azot. Wykorzystuje się reakcję:

14N(n,p)14C

Ze względu na duży ciężar, nie wszystkie atomu 14C opuszczają cząsteczkę.

Przy znakowaniu siarką stosuje się reakcję:

35Cl(n,p)35S

Przy znakowaniu fluorowcami , korzysta się z reakcji:

MX(n, γ)M+1X

Atomy odrzutu fluorowców podstawiają atomy wodoru lub grupy atomów w związkach organicznych. Tak otrzymuje się związki znakowane 38C, 82Br, 128I.

Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca” c.d.Zalety metody

Możliwość otrzymania związku w jednym etapie. Odpada wiele żmudnych, wieloetapowych syntez.

• Uniwersalność metody.• Możliwość otrzymania związków beznośnikowych.• W jednym procesie można otrzymać dużą ilość związku.• Z dobrą wydajnością otrzymuje się związki znakowane izotopami krótkożyciowymi.

Wady

• Nie można otrzymać związków specyficznie znakowanych.• Trudności w wydzieleniu i oczyszczeniu znakowanych związków.• Synteza musi być prowadzona w silnym strumieniu neutronów (kanał reaktora

Synteza związków znakowanych 14C

Substratem do tej syntezy jest Ba14CO3, który otrzymuje się w reaktorze w wyniku napromieniowania azotku berylu. Wykorzystuje się reakcję jądrową:

14N(n, p)14C

Z Ba14CO3 otrzymuje się pięć podstawowych związków będących substratami do dalszej syntezy. Są to: 14CO2; K14CN; NH2

14CN (cyjanoamid); 14C2H2; 14CH3OH

14CO2 otrzymuje się przez rozkład Ba14CO3:

Ba14CO3HClO4

lub H2SO4

14CO2

14C-cyjanoamid otrzymuje się działając amoniakiem na Ba14CO3 w temp. 850oC:

Ba14CO3NH3

850 CoNH2

14CN

Synteza związków znakowanych 14C c. d.

14C-acetylen otrzymuje się przez redukcję Ba14CO3 magnezem i rozkład

wodą powstałego 14C-węglika baru:

Ba14CO3Mg

∆Ba14C2

14C2H2H2O

14C-metanol otrzymuje się przez redukcję 14CO2 przy pomocy LiAlH4:

14CO214CH3OH

LiAlH4

Synteza 14C-alkanówSynteza 14C-metanu

14CO2H2kat.

14CH4

14CO2LiAlH4

14CH4

14CH3OH14CH3I 14CH3MgI

MgHI

H+

Synteza [1,2-14C2]-propanu14C2H2

14C2H414C2H5I 14C2H5MgI

14C2H5COOH14CH314CH2CH2OH

14CH314CH2CH2OTs

14CH314CH2CH3

Cr+2, H+

RT

HI Mg

CO2LiAlH4

p-MeC6H4SO3H NaBH4

[1,2-14C2]-propan

Synteza 14C-alkanówSynteza 14C-metanu

14CO2H2kat.

14CH4

14CO2LiAlH4

14CH4

14CH3OH14CH3I 14CH3MgI

MgHI

H+

Synteza [1,2-14C2]-propanu14C2H2

14C2H414C2H5I 14C2H5MgI

14C2H5COOH14CH314CH2CH2OH

14CH314CH2CH2OTs

14CH314CH2CH3

Cr+2, H+

RT

HI Mg

CO2LiAlH4

p-MeC6H4SO3H NaBH4

[1,2-14C2]-propan

Synteza aminokwasów deuterowanych lub trytowanych w pozycji α

(inkorporacja deuteru lub trytu z rozpuszczalnika)

Do syntezy gdzie A = D lub TCOOHC

A

NH2

R2

korzysta się z dekarboksylacji aminokwas dwukarboksylowego w środowisko HTO i stężonego HCl lub stężonego DCl (D2O).

R C NHCH(COOR1)2

O+ R2X

EtONa

EtOH, absR C NH-CR2(COOR1)2

O

+ HX+ HX

D2O, DCl

HTO, HClC

A

NH2

R2 COOH

1

Powstający carboanion RCONH-C(-)(COOR1)2 w reakcji z R2X daje produkt 1. Deacetylację i dekarboksylację 1 prowadzi się pod chłodnicą zwrotną ogrzewając 1 w ciągu 4 - 5 h w D2O (lub HTO) w obecności DCl lub D2SO4 (albo HCl lub H2SO4)

Dekarboksylacji ⊕NH3CR2(COOH)2 w D2O (lub HTO) do końcowego aminokwasu towarzyszy inkorporacja deuteru (lub trytu) ze środowiska reakcji w pozycję α.

Synteza [2-3H]-L-fenyloalaniny

CH2(COOH)2HTO

CHTCOOT

COOTHO

COOH

COOH

NH2

TPAL, NH4

+

pH 10

T

kwas[2-3H]-cynamonowy

[2-3H]-L-Phe

Enzymatyczna synteza L-tryptofanu i 5’-hydroksy-L-tryptofanu znakowanego izotopami wodoru w pozycji α

COOHNH2

S

R = -H or -OH

NH

RTPase (EC 4.1.99.1)

+NH

COOH

NH2R

D2O (HTO lub DTO)

D/T

(5'-R)-indol S-metyl-L-cysteina (5'-R)[2- D/ T]-L-Trp

Synteza [3R-3H]-L-fenyloalaniny

(PhCO)2HTOKCN

PhCTO CH2(COOH)2

COOH

PAL

COOH

NH2

H

benzil kwas[3-3H]-cynamonowy

[3R-3H]-Phe

T T

Synteza [3S-3H]-L-fenyloalaniny

COOH

NH2H

COOH

pH 10

[2S-3H]-L-Phe

PAL, NH4+, HTO

T

Synteza kwasu [1-14C]-cynamonowego

[1 -14C]cinnamic acid

ClCH2COOH ClCH2COONa

N

NaOH K 14CN

14CCH2COONa

14 OONa NaOHC

COONa

HCl

14C

COOH

OOHCaCl2

14C OO

COOCa

H+14C

COOH

OOH

14COOHO H

Synteza kwasu [2-14C]-cynamonowego

COOH

COOH

14CH2

O H

COOH

- CO2- H2O

14CH

kwas [2-14C]-cynamonowy

Synteza kwasu [3-14C]-cynamonowego

5 3

2

1

pH 8.7

H2CCOOH

COOH

YADH

14

LiAlH4

H3O+14CO2

MgBr14COOH

14COOMgBr

14CH2OH

O

HC

COOH

14C

kwas [3-14C]-cynamonowy

4

Synteza L-fenyloalaniny i L-tyrozyn znakowanych 14C w łańcuchu bocznym

[1-14C]-, [2-14C]- lub [3-14C]-L-Tyr

[1-14C]-, [2-14C]- lub [3-14C]-L-Phe kwas [1-14C]-, [2-14C]- lub [3-14C]-cynamonowy

COOHPAL

pH 10 NH3

COOH

NH3

COOH

HO

pH 6.8

* = 14C label

4'-monooksygenaza-L-fenyloalaninowa

Synteza [1-14C]-L-tryptofanui 5’-hydroksy-[1-14C]-L-tryptofanu

tryptophanase

NH

NH2R

R = H or OH

NH

R

OGPT

D-AAO/catalase

NH2

14COOH 14C

14COOH

OOH

[1-14C]-alanina kwas [1-14C]-pirogronowy

[1-14C]-L-Trp lub5'-OH-[1-14C]-L-Trp

Metody syntezy aldehydu [1- 14C ]-benzoesowego

HCl, SnCl2

HCl

NaCl, AlCl3∆ T

NH3

SOCl2

chinolina

HCN

MeOH

NH2NH2

PhSO2Clpirydyna

H2OH2SO4

Na2CO3

HOCH2CH2OH

H2O

N14C

COOH

OH

O

14CONHNHSO2Ph

N14C

CN

14CHO

14COCl

14CONHNN2

14COOMe

14CH=NH.HCl

14COOH

14CCl=NH

14CN

14CONH2

Syntezy aldehydu benzoesowego selektywnie znakowanego 14C.

14COOH14C 14CSOCl2 CH3OH

NH2NH2

14C14C14CNa2CO3

(CH2OH)2 C5H5NC6H5SO2Cl

OOCH3

ONHNH2ONHNHSO2PhHO

OCl

HCl

SnCl2

HCl

HCl14CH NH.14C 14CCl NHH2O

14COCl 14CONH2 14CNNH3

ogrzewanie. AlCl3NaCl

HO

Syntezy aldehydu benzoesowego selektywnie znakowanego 14C.

COOHN+

14CHO

H2SO4

H2O

NCN

14CHO HC6H5

+14COCl

HCNchinolina

OC6H514C

CN

H

N

Otrzymywanie benzaldehydu znakowanego równomiernie atomami 14C

CH3 CHO

H2SO4

Ce(SO4)2

Rozszczepienie dibenzylu do aldehydu i kwasu benzoesowego

DCN++CO2

-

D2O C

CN

O C

O..-

CO

D

C O C

CN

D O

C C

OO

CN

-

+ CN -C C

O O

Synteza kwasu [1-14C]-malonowego.

3. HCl

1. NaOH, ∆ Τ2. CaCl2

HCl14COOH

COOHN14CCH2COONa

o0 C

ClCH2COONaNa14CN

Synteza kwasu [1-14C]-cynamonowego poprzez reakcję Grignard’a

Et2O

BrMg

14CO2Ba14CO3

HOO14C