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Synthetische Biologie und Nanosysteme* ausgewählte Beispiele *

Vorlesungsreihe "Biophysik der Systeme"2008-02-06

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Ausrichtung der Forschung

SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese

Mikrofluidik

Fortschritte in

VerständnisVerständnis AnwendungAnwendung

Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle

Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren

de novo Design biologischer Systeme

induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus

selbstorganisierte StrukturenDNA/RNA als Template

gerichtete EvolutionProtein Engineering

Erweiterung des genetischen Codesnicht-natürliche Aminosäuren

logische biochemische Netzwerkemolekulare Biocomputer

Metabolic Pathway EngineeringSynthese/Abbau chemischer

Substanzen

DNA Maschinen

Ausrichtung der Forschung

SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese

Mikrofluidik

Fortschritte in

VerständnisVerständnis AnwendungAnwendung

Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle

Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren

de novo Design biologischer Systeme

induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus

selbstorganisierte StrukturenDNA/RNA als Template

gerichtete EvolutionProtein Engineering

Erweiterung des genetischen Codesnicht-natürliche Aminosäuren

logische biochemische Netzwerkemolekulare Biocomputer

Metabolic Pathway EngineeringSynthese/Abbau chemischer

SubstanzenSeminar 12.12.07

DNA Maschinen

Beispiel 1:

Chemotaxis in E. coli

bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor

Umdesign Signalweg

Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)

CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY:ermöglicht Rotation gegen UZS ◊ Mobilität

WT

CheZ

geradlinigeFortbewegung

Taumeln


Riboswitches kontrollieren die Genexpression abhängig von Liganden


CheZ kombiniert mit Riboswitch:◊ Mobilität abhängig von Ligandenkonzentration


konzentrationsabhängige Mobilität◊ Migration entlang Gradienten zu höherer Konzentration ("Pseudotaxis")

Beispiel 2:

Lichtgesteuerte Expression in E. coli

bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor

Neudesign Rezeptor


Phytochrom: Chimäre aus 2 Modulen- extrazellulärer Photorezeptor (Cph1 aus Cyano-Bakterium Synechocystis)- intrazellulärer Regulator (EnvZ aus E. coli, zuständig für osmotische Regulation)

Transformation in EnvZ E. colifür die Synthese von PCB in E. coli:ho1 und pcyA Gene aus Synechocystis

EnvZ

Cph1

on off

Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)


SelektionChimäre Cph8 mit hohem hell-dunkel "Kontrast"

+EnvZ

Belichtungszeit: 4h bei 37°C



◊ räumliche Kontrolle der Genexpression◊ Auflösung: 108 Bakterien (Pixel) pro square inch


Beispiel 3:

Gerichtete Evolution

bestehendes Protein

veränderte Funktionalität

Mutation Selektionsdruck

verbesserte VarianteAusgangsprotein


Erzeugung der Bibliothek (107-1010)- Mutagenese einer Oligonukleotid-Kassette- fehleranfällige PCR

Umklonierung in Plasmid und Transformation z.B. in E. coliGenpool

Kopplung von Phenotyp und Genotyp- Affinität: Phage display oder Yeast cell display - Funktionalität: E. coli, in vitro Kompartimentisierung

Selektion und Screening- Affinität: über Antigen- Funktionalität: FACS (fluorescent activated cell sorting)

Antigen


in vitro Kompartimentisierung:Wasser-in-Öl-(in-Wasser) Emulsionen

◊ kleine Reaktionsvolumina: hohe Konzentration, schnelle Kinetik

◊ 1010 pro ml: hoher Durchsatz

◊ Selektionsdruck frei wählbar

◊ kompatibel mit Mikrofluidik,FACS: 107 pro h

Mastrobattista et al., Chem. Biol. 12: 1291 (2005)

Gerichtete Evolution: Anwendungen

typischerweise 6-12 Runden

Biokatalysatoren

- veränderte Substratspezifität- veränderte/verbesserte Enantioselektivität- erhöhte Aktivität (50x) in unnatürlichem Reaktionsmilieu- erhöhte Thermostabilität (+15°C)

Antikörper

- Affinitätssteigerung 10-100x- Affinität für neues Antigen: 100-1000x schlechter als in der Natur

Beispiel 4:

Erweiterung des genetischen Codes

Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine

Erweiterung des genetischen Codes

Standard-Code

stellenspezifisch,cotranslational

anstatt dernatürlichen AS

Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher AminosäurenWang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)

Anforderungen:- orthogonales tRNA-Codon Paar- orthogonale aminoacyl-tRNA-Synthetase- nnAS im Cytosol


amber stop codon (UAG) supression- orthogonales tyrosyl-tRNA/tyrosyl-RS Paar aus Methanococcus janaschii- gerichtete Evolution der tRNA in E. coli mit negativ/positiv-Selektion- gerichtete Evolution der Substratspezifität der RS


Fluorescein

?

Beispiel 5:

DNA Computing

Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen

mithilfe von DNA Sequenzen

DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)

Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph

Existiert ein Weg von 0 nach 6, der alle Knoten genau einmal durchläuft?


Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph

Algorithmus

1. Generation zufälliger Wege

2. Auswahl Pfade von 0 nach n

3. Auswahl Pfade mit n Knoten

4. Auswahl Pfade, die alle Knoten durchlaufen

5. "wahr" / "falsch"


Knoten und Kanten20mer DNA

Algorithmus

1. Ligation

2. PCR mit Primer O0 und O6

3. Agarose-Gel: Bande mit 140bp

4. Affinitätsselektion von ssDNA mit O1,…,O5

5. Probe: PCR mit O0 / O1, O0 / O2,…, O0 / O6

2

1

3

Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)

boolsche Logik"0": niedrige Konzentration"1": hohe Konzentration

in out

AND

Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)

Logische biochemische NetzwerkeZhang et al., Science 318: 1121 (2007)

Signalverstärkung- kinetisch inhibiert (Zeitskala Experiment)- Katalysator (Input) beschleunigt Reaktion um 104

- Entropie-getrieben

Beispiel 6:

DNA Maschinen

Spielerei?

DNA Maschinen

DNA-Läufer entlang DNA-Schiene

Unidirektionalität durch

Zerstörung der SchieneZugabe der Treibstoffsträngein definierter Reihenfolge

Restriktionsenzym

Passivierung der Schienedurch Treibstoffstränge

Treibstoff

Treibstoff

Abfall

Yin et al., Nature 451: 318 (2008)Bath & Turberfield, Nat. Nanotech. 2: 275 (2007)

Beispiel 7:

DNA/RNA Strukturen

Die Doppelhelix als spezialisierter Legobaustein

nm-Abmessungen, Sequenzspezifität,Persistenzlänge ~50nm

regelmäßige Strukturen: DNAFeldkamp & Niemeyer, Angew. Chem. Int. Ed. 45: 1856 (2006)

SchleifeninduzierenBiegung

regelmäßige Strukturen: RNAChworos et al., Science 306: 2068 (2004)

RNA-Doppelhairpin-Quadrant als Puzzleteil

Verschmelzen durch langsames Abkühlen

30°C, 30min 50°C ◊ 4°C, 16h

3-dimensionale Strukturen

Goodman et al., Science 310: 1661 (2005)Shih et al., Nature 427: 618 (2004)

Aldaye & Sleiman, JACS 129: 13376 (2007)

beliebige Strukturen in 2D: DNA-Origami

7 kb lange virale Einzelstrang DNA + viele kurze (30 b) Helferstränge◊ eindeutige Struktur

Rothemund, Nature 440: 297 (2006)


- hohe Flexibilität- hohe Ausbeute- kurze Abkühlzeit (75min)



Funktionalisierungenan Helfersträngen


zur RNA Detektion Probe

Ke et al., Science 319: 180 (2008)

zur Positionierung von - Quantendots- Goldpartikeln- Proteinen

weiterführende Infos

Synthetische Biologie Übersichtsartikel- Brenner & Sismour, Nat. Rev. Gen. 6: 533 (2005) - Drubin et al., Genes Dev. 21: 242 (2007)

Internationales SB Meetinghttp://www.syntheticbiology3.ethz.ch/index.htm

Wettbewerb iGEM 2006http://www.igem2006.com/

Ribosome EngineeringPeter Schultz Lab, http://schultz.scripps.edu/

Logische Biochemische NetzwerkeFritz Simmel Lab, TUMDieter Braun Lab, LMU

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