Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Mikroskoobipreparaatide valmistamine ja vaatlemine

Õppematerjal:

Käesolev lühijuhend, praktikumide lisamaterjalid ning ülevaade „Uuritavatest mikroobidest“.

Eeskätt tuleb tutvuda teemadega:

Mikroorganismide morfoloogiliste tunnuste uurimine ja

Antimikroobsed lahendused,

Ülevaates „Uuritavatest mikroobidest“ tuleks keskenduda bakteritele ja pärmidele.

2. praktikum:Toimub 3. õppenädalal. Töö sisu:

Tutvumine mikroskoobi ehituse ja tööpõhimõttega.

Aseptiliste töövõtete tundmaõppimine.

Kuivsüsteemi objektiividega töötama õppimiseks valmistatakse pärmidest laialisurutud tilga meetodil kaks preparaati:

pagaripärmi suspensioonist ja

kaldagaril kasvatatud pärmikultuurist.

Õli-immersioonsüsteemi objektiiviga töötamise õppimiseks valmistatakse 2 kuumfikseeritud ja lihtvärvitud bakteripreparaati.

3. praktikum:Toimub 4. õppenädalal.

Töö sisu: bakterite biokeemiliste karakteristikute uurimine (Grami järgi värvimine ja katalaasi test).

Kasutades eelmises praktikumis omandatud aseptilisi töövõtteid, valmistatakse kuumfikseeritud preparaadid 5−6 uuritavast bakterist ja erineva gramreaktiivsusega võrdluskultuuridest. Samade bakteritega tehakse katalaasi test.

1

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Praktikumide lõppedes peab üliõpilane:

1. Tundma valgusmikroskoobi ehitust ja oskama seda kasutada:

Aru saama mikroskoobi iga osa funktsioonist,

Oskama seada mikroskoopi töökorda,

Oskama preparaati teravustada, kasutades kuiv- ja immersioonsüsteemi objektiive,

Oskama reguleerida iiris-diafragmat preparaadi optimaalse valgustatuse saamiseks.

2. Olema omandanud aseptilise töö võtted.

3. Oskama valmistada mikroskoobipreparaate:

elusrakkudest preparaati „laialisurutud tilk“,

kuumfikseeritud preparaate ja neid värvida (lihtvärvimine ja Grami järgi värvimine).

4. Tõlgendama mikroskoobis nähtut:

Eristama mikroskoobipreparaatides pärme bakteritest,

Eristama baktereid nende gramreaktiivsuse järgi grampositiivseteks, gramnegatiivseteks või gramvarieeruvateks.

Kirjeldama bakterite raku- ja grupimorfoloogiat Grami järgi värvitud preparaatides.

5. Mõistma katalaasi testi põhimõtet.

2

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Praktilise töö käik2. praktikum:

Pagaripärmi suspensioonist ja kaldagaril (või Petri tassil) ettekasvatatud pärmikultuurist valmistatakse preparaadid (laialisurutud tilk). Mikroskopeeritakse kuivsüsteemiga.

Kahest vedel- või tardsöötmel ettekasvatatud bakterikultuurist valmistatakse kuumfikseeritud ja lihtvärvitud (metüleensinine või fuksiin) preparaadid, mida vaadeldakse õli-immersioonsüsteemiga. Värvimiseks tilgutatakse fikseeritud preparaadile värvi lahust, lastakse sel 30 sekundit kuni 1 minut mõjuda ning värvi jääk loputatakse kraaniveega. Preparaadil lastakse õhu käes kuivada. Mikroskopeeritakse õhkkuiva preparaati.

3. praktikum:

5−6 kaldagaril või Petri tassil ettekasvatatud uuritavast kultuurist valmistatakse kuumfikseeritud ja Grami järgi värvitud preparaadid, mida uuritakse-õli immersioonsüsteemiga. Igale preparaadiklaasile valmistatakse preparaat ka tuntud gramreaktiivsusega indikaatorliikidest (Sarcina sp – G+; E. coli – G-).

Uuritakse bakterite katalaasi produtseerimise võimet.

NB!

Mikrobioloogilises töös tuleb kasutada aseptilisi töövõtteid, vältimaks uuritavate kultuuride ja keskkonna saastumist. Mikroskoobipreparaatide tegemisel tuleb biomass lähtekultuuri saastamata mikroskoobi esemeklaasile kanda.

Mikroskoobipreparaatide valmistamine

Esemeklaasi ettevalmistus:

Esemeklaas puhastatakse vajaduse korral etanooliga.

Kuumutatakse põletileegis.

Asetatakse vanni kohale hoidikule.

Steriilvee (füsioloogilise lahuse) kandmine esemeklaasile:

Külviaas steriliseeritakse leegis.

Steriilveega (füsioloogilise lahusega) katseklaas avatakse läbi leegi (vatikork võetakse klaasilt parema käe väikeses sõrmega, kuumutades katseklaasi suud leegis (NB! Vatikorki ei tohi panna lauale või suruda katseklaasi poolset osa pihku!).

Külviaasaga võetakse tilk steriilvett.

Steriilvee tilk kantakse puhtale esemeklaasile.

Katseklaasi suuet ja korki kuumutatakse ning katseklaas kaetakse leegi kohal korgiga.

Külviaas steriliseeritakse leegis. (Vajaduse korral korratakse tegevust!)

3

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

(Steriilvee võib aseptika reegleid järgides kanda esemeklaasile ka steriilse pipetiga.)

Vedelsöötmes kasvanud kultuuri korral kantakse samu põhimõtteid järgides esemeklaasile rakususpensioon ning järelikult jääb steriilvee kandmise etapp ära.

Preparaadi valmistamine:

NB! Preparaadid tuleb kindlasti markeerida! Kirje kantakse esemeklaasi alumisele küljele.

Külviaas steriliseeritaks leegis (hallitused – 2 külvinõela või külviaas ja -nõel).

Külvimaterjali nõu avatakse. (Katseklaas avatakse ja suletakse läbi leegi sarnaselt eelkirjeldatuga, Petri tassi paotatakse minimaalselt ning suletakse kohe pärast proovi võtmist.)

Steriilse (NB! Leegis kuumutatud ja jahutatud! – võib ettevaatlikult jahutada katseklaasis või Petri tassi kaane vastu) külviaasaga võetakse veidi mikroorganismi kultuuri (koloonia või osa sellest). (Hallitused – haaratakse ettevaatlikult veidi mütseeli). NB! Kaasa ei tohi võtta tardsöödet!

Külvimaterjali nõu suletakse aseptika reegleid järgides (katseklaasi suue tõmmatakse läbi leegi).

Mikroobikultuur kantakse esemeklaasil olevasse veetilka. Bakterid, pärmid – suspendeeritakse nii, et saaks ühtlaselt õhukese umbes 1 cm diameetriga preparaadi. Hallitused –seeneniite püütakse eoskandjaid vigastamata ettevaatlikult veetilgas lahutada.

Külviaas steriliseeritakse hoolikalt.

Märgpreparaat (laialisurutud tilk)

(seened, bakterid elusrakkude uurimisel)

Preparaat kaetakse puhastatud katteklaasiga ja mikroskopeeritakse kohe (kuivab kiiresti ja muutub seega tarvitamiskõlbmatuks).

NB! Mikroskopeeritakse objektiivi suurendusega kuni 40x ilma õlita

Kuumfikseeritud preparaat, nn äigepreparaat (bakterid)

Preparaadil lastakse õhu käes kuivada (NB! võib õrnalt soojendada, kuid mitte leegis keetes kuivaks aurutada!).

Õhkkuiv preparaat fikseeritakse, tõmmates esemeklaasi (NB! Preparaadi pool ülevalpool!) 3 korda aeglaselt läbi põletileegi. Kontrollitakse temperatuuri – käeseljale asetatud esemeklaas peab nahka kergelt kõrvetama. Ei maksa kuumutada liiga õrnalt (preparaat ei fikseeru) ega liiga tugevasti (mikroobide struktuur ja grupimorfoloogia võivad muutuda).

Värvitakse vastavalt etteantud metoodikale ja mikroskopeeritakse õli-immersioon-süsteemiga.

Preparaat asetatakse mikroskoobi esemelauale, kinnitatakse klambritega ja mikroskopeeritakse. Pärmirakkude preparaadi puhul kasutatakse 40X suurendusega objektiivi, bakteripreparaatide puhul on soovitav esmalt uuritav piirkond 40X

4

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

suurendusega üles otsida. Mikroskopeerimiseks kasutatakse 100X suurendusega objektiivi ja õli-immersioonsüsteemi.

Mikroskoobis nähtu jäädvustatakse grafiitpliiatsiga joonistades protokollivihikusse. Olulised näitajad on rakkude suurus, kuju, vastastikune paiknemine. NB! Konsulteeri õppejõuga, veendumaks, et leitud on õige kujutis. Nähtut võib täiendavalt ka fotografeerida.

Vaatlust lõpetades suurendatakse tuubuse ja objekti vahekaugust, preparaat eemaldatakse ja asetatakse ettenähtud anumasse.

Mikroskoobipreparaadi valmistamisel kasutatavate aseptiliste töövõtete näide on toodud joonisel 1.

Joonis 1. Kuumfikseeritud mikroskoobipreparaadi valmistamine

5

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Grami järgi värvimise tehnika

Valmistatakse kuumfikseeritud preparaadid. Iga esemeklaasi ühes otsas on kontrolliks Gram-negatiivne E. coli, teises Gram-positiivne Sarcina sp. kui kindla gramreaktiivsusega indikaatorliigid. Nende vahel 1–4 uuritavat bakterit. NB! Esemeklaasi kummassegi otsa tuleb jätta ~1,5 cm vaba ruumi.

Kuumfikseeritud preparaat asetatakse vanni kohale hoidikule.

Preparaadile kantakse1 minutiks kristallviolett või gentsiaanviolett (sisuliselt sünonüüm).

Värv pestakse voolava veega hoolikalt maha (võib kasutada kolvis-keeduklaasis olevat kraanivett).

Preparaadile kantakse 1 minutiks peits (Lugoli lahus).

Preparaati pestakse kraaniveega.

Preparaadile kantakse 30 sekundiks värvitustaja (96% etanool, etanool-eetri segu vmt). NB! Kriitiline etapp!

Preparaati pestakse (kiiresti) kraaniveega.

Preparaadile kantakse 30 sekundiks safraniini või karboolfuksiini lahus (Pfeifferi fuksiin). Preparaati pestakse kraaniveega.

Preparaat kuivatatakse õhkkuivaks.

Mikroskopeeritakse õli-immersioonsüsteemiga.

NB! Vastutusrikkaim etapp on etanooli vmt värvitustajaga pesemine. Kui pesta liiga kaua, kaotavad ka grampositiivsed mikroobid lilla värvuse, kui liiga lühikest aega, võivad gramnegatiivsed rakud värvuse säilitada.

Võrdluspreparaatidest peab E. coli värvuma roosakaspunaseks, Sarcina sp. tumevioletseks.

Võrreldes uuritava preparaadi värvust kontrollpreparaatide omaga, saame määrata mikroorganismi gramreaktiivsuse.

NB! Võrrelda tuleb rakkude värvumist. Mitte lasta ennast segada rakkude suuruse, kuju vmt erinevustest.

Joonisel 2 kujutatakse indikaatorliikide värvumist.

6

Sarcin E.

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Joonis 2. E. coli ja Sarcina sp. värvumine Grami järgi värvides

Töö mikroskoobiga

Mikroskoop koosneb:

Uuritavat objekti nähtavaks muuta võimaldavast optilisest osast:

Objektiivid ja okulaarid suurendavad objekti.

Valgusallikas, diafragma ja kondensor võimaldavad preparaati valgustada.

Optilist süsteemi fikseerivast mehhaanilisest osast:

Statiiv: alus ehk jalg toetab kogu süsteemi, sh tuubusehoidjat.

7

1. Escherichia coli (Gram –)

2. Sarcina sp. (Gram +)

Jalg

Valgusallikas

Makrokruvi

Mikrokruvi

Statiiv

Objektiivirevolver

Diafragma

Kondensor

Tuubus

Esemelaud

Objektiivid (4 tk)

Okulaarid

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Tuubuses paiknevad okulaar ja objektiivid. 3−4 erineva suurendusega objektiivi paiknevad revolvris, mida pöörates saab valida sobiva suurenduse. NB! Objektiivi vahetamiseks tuleb pöörata revolvrit, mitte haarata objektiivist!

Esemelaud fikseerib preparaadi.

Makro- ja mikrokruvi võimaldavad reguleerida objektiivi ja preparaadi vahekaugust. NB! põhitöö (preparaadi ja objektiivi vahekauguse reguleerimine nähtava kujutiseni) tehakse ära makrokruviga. Purunemisohtlikku mikrokruvi kasutatakse vaid täpsustamiseks s. o. kujutise täpseks fokusseerimiseks.

Mikroskoobis nähtava pildi kvaliteet oleneb mikroskoobi suurendusest ja lahutusvõimest.

Mikroskoobi kogusuurendus = objektiivi suurendus x okulaari suurendus

Objektiivide ja okulaaride suurendus oleneb läätsede kumerusest. Mida suurem on kumerus, seda väiksem on fookuskaugus ja seda suurem on läätse suurendus.

Okulaarid paiknevad vabalt tuubuse ülemises osas ning koosnevad kahest läätsest – esemele suunatud koondavast ja silmale suunatud pealäätsest. Okulaari suurendus on kirjas okulaari peal (reeglina, 7×, 10× või 15×). Okulaarid suurendavad objektiivi poolt antud kujutist, kuid ei too ise nähtavale täiendavaid detaile.

Binokulaarmikroskoobil on kaks okulaari, mis võimaldab kujutist vaadelda kahe silmaga.

Revolvris paiknevaid vahetatavaid objektiive jaotatakse vastavalt nende suurendusele: 4–40 kordse suurendusega on kuivobjektiivid ‒ objektiivi ja preparaadi vahel on õhk ja

90–100 kordse suurendusega on immersioonobjektiivid – objektiivi ja preparaadi vahele pannakse õli.

Suure suurendusega immersioonobjektiivide lääts on väga kumer ning seetõttu saab moonutustevabalt kasutada vaid selle keskmist osa. Moonutuse vältimiseks sukeldatakse objektiivi lääts õlitilka. Nii satub kondensorit läbinud valguskiirte kimp peaaegu täielikult objektiivi, mis suurendab preparaadi vaatevälja valgustatust.

Mikroskoobi suurendust piirab lahutusvõime – minimaalne kaugus preparaadi kahe punkti vahel, mille kujutist võib antud mikroskoobi abil selgelt eristada. Mida väiksem on see kaugus, seda suurem on mikroskoobi lahutusvõime.

Mikroskoobi lahutusvõimet saab leida valemi abil:

Kus:

D – vähim kaugus preparaadi kahe punkti vahel, λ – valguskiirte lainepikkus, A1 – objektiivi läätse apertuur, A2 – kondensori läätse apertuur, 0,61 – numbriline koefitsient.

Numbriline apertuur on läätse valgusekogumise võime: valguskoonuse suurus, mida objektiiv on võimeline vastu võtma.

8

0,61 λD = ———————

A1 + A2

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Mida suurem on numbriline apertuur, seda suurem on nurk, millelt objektiiv on suuteline valguskiiri koguma.

Mikroskoobi lahutusvõimet saab suurendada numbrilist apertuuri suurendades, kasutades preparaadi ja objektiivi läätse vahel keskkondi, mille murdumisnäitaja on suurem kui 1,0 (õhu murdumisnäitaja). Vee murdumisnäitaja on 1,33, immersioonõlil 1,52 ja klaasil 1,52. Kuna õli murdumisnäitaja on klaasi omaga praktiliselt sama, kaetakse suurte suurendustega töötamisel fikseeritud preparaat spetsiaalse immersioonõli tilgakesega ning objektiiv sukeldatakse mikroskopeerimiseks õlitilka. See muudab süsteemi preparaat + objektiiv homogeenseks ja väldib valguse hajumist.

Valgusmikroskoobis saab vaadelda objekte, mis on suuremad kui 1/3 valguskiirte lainepikkusest. Kasutades nähtavat valgust lainepikkuse vahemikus 0,4–0,7 μm, võib mikroskoobis näha osakesi suurusega 0,2 μm, mis ongi mikroskoobi lahutusvõime. Et sellise suurusega objekte silmale nähtavaks muuta, on vaja 1000-kordset suurendust. Sellist suurendust nimetatakse tinglikult kasulikuks.

Lahutusvõimet mõjutab ka preparaadi valgustatus, mida saab muuta kondensori ja diafragma asendit reguleerides.

Valgustiks on kaasaegsetes mikroskoopides sisseehitatud lamp, mille säästmiseks saab valgustugevust regulaatori abil vastavalt vajadusele muuta. Töötamise ajaks keeratakse valgustus maksimumtasemele, töö vaheajal miinimumrežiimile. Sisse-väljalülitamisnuppu kasutatakse vaid tööd alustades ja lõpetades.

Preparaadi paremaks valgustamiseks kasutatakse vahetult esemelaua all paiknevat kahest või kolmest läätsest koosnevat kondensorit, mis koondab valguskiired väikesele pinnale.

Preparaadi valgustatust reguleeritakse diafragmade abil. Kasutatakse iirisdiafragmat, mis kujutab endast metallplaadikestest ringi. Küljel paiknevat kangi liigutades lähevad plaadikesed kokku või eemalduvad, mille tõttu ringi tsentris olev ava suureneb või väheneb.

Diafragma kinnitub kondensori külge ja paikneb kondensori ja valgusallika vahel. Diafragmaga ei reguleerita valguse intensiivsust vaid objektile langeva ja objektiivi siseneva valguskoonuse suurust. Diafragma asendit reguleeritakse vastavalt kasutatavale läätsede süsteemile.

Töö käik:

Preparaat asetatakse esemelauale ja fikseeritakse klambritega.

Valgusti lülitatakse sisse ja reguleeritakse maksimumi lähedale.

Reguleeritakse kondensori asendit ja iirisdiafragma ava suurust.

Õli-immersioonsüsteemiga töötades peaks kondensor paiknema praktiliselt vastu preparaati, väiksema suurenduse korral madalamal (asendit reguleeritakse, kuni vaateväli kergelt tumeneb).

9

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Diafragma peaks tööd alustades olema täielikult avatud. Teravustades reguleeritakse diafragma asendisse, mil pilt kergelt tumeneb.

Kasutades väikese suurendusega kuivobjektiivi, leitakse plaadijuhtija abil vaadeldav piirkond. Väikesemõõtmeliste objektide (bakterid!) või detailide vaatlemist jätkatakse suurema suurendusega objektiiviga.

Teravustamiseks ehk fookustamiseks vähendatakse makrokruvi pöörates preparaadi ja objektiivi vahekaugust, tegevust kõrvalt jälgides. Õli-immersioonsüsteemi puhul surutakse objektiiv preparaati katvasse õlitilka. Edasi suurendatakse makrokruvi pöörates ettevaatlikult preparaadi ja objektiivi vahekaugust, kuni preparaat on selgelt nähtav. Pildi täpsemaks teravustamiseks võib kasutada mikrokruvi.

Tööd lõpetades:

Valgusti keeratakse miinimumrežiimile ja lülitatakse välja.

Immersioonobjektiiv puhastatakse dietüüleetri või eetri-etanooli seguga õlist.

Kondensor langetatakse, revolvrit pöörates keeratakse ette kõige väiksema suurendusega objektiiv. Tuubuse ja esemelaua vahekaugust reguleeritakse nii, et objektiiv sukeldatakse esemelauas olevasse avavusse, kuhu on asetatud pehme kuiv lapikene.

Mikroskoop kaetakse tolmukattega ja asetatakse ettevaatlikult oma kohale.

Töövaheajal hoitakse mikroskoopi tolmu, otsese päikesevalguse ja kuumuse eest kaitstult.

Läätsi puhastatakse läätsepuhastuspaberiga. Tolmu pühitakse kuivalt; pärast õli-immersioonsüsteemiga töötamist puhastatakse objektiive dietüüleetriga või eetri-etanooli seguga (vahekorras 70:30). Läätsede sisepindasid puhastab vajaduse korral spetsialist.

10

Mikrobioloogia praktikumid. Lühijuhend

Katalaasi test

Katalaas-positiivsed mikroobid toodavad ensüümi katalaas, mis lagundab vesinik peroksiidi veeks ja hapnikuks.

Lisades mikroorganisme sisaldavale keskkonnale H2O2, annab katalaasi produtseerimisest tunnistust hapniku eritumisest tingitud intensiivne mullitamine.

Katalaasi test on üks olulisematest klassikalistest mikroorganismide eristamiseks kasutatud testidest:

Katalaas-positiivsed (st katalaasi tootvad) on aeroobid ja fakultatiivsed anaeroobid, kes saavad kasutada hapnikku kui terminaalset elektronide aktseptorit.

Katalaas-negatiivsed on anaeroobid ja fermenteerivad fakultatiivsed anaeroobid, kes ei kasuta hapnikku kui terminaalset elektronide aktseptorit (näiteks streptokokid, laktobatsillid).

Test võimaldab näiteks eristada:

Gram-positiivseid kokke: stafülokokid ja mikrokokid on katalaas-positiivsed, streptokokid ja enterokokid aga katalaas-negatiivsed.

Gram-positiivsetest kepikestest on klostriidid katalaas-negatiivsed, batsillid aga katalaas-positiivsed.

Testi kasutatakse sugukonna Enterobacteriaceae tuvastamiseks (on katalaas positiivsed, näiteks E. coli).

Testi läbiviimiseks viiakse mikroorganismide suspensiooni puhtale esemeklaasile ning sellele tilgutatakse 3% H2O2 lahust.

Katalaas-positiivsete mikroobide puhul on täheldatav intensiivne mullitamine, katalaas-negatiivsete mikroobide puhul on hapniku eritumisest tingitud mullitamine minimaalne või puudub. Tagasihoidlikku gaaside eritumist võivad põhjustada ka muud bakterite eritatud ensüümid.

NB! Ära kasuta H2O2 lisamiseks metallist külviaasa: võib anda vale-positiivse tulemuse, lisaks kahjustub metall.

11