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Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici e marcatura degli acidi nucleici Tecniche di base della biologia molecolare, che permettono non solo di identificare e quantificare sequenze specifiche di DNA e di RNA, ma di studiarne l’organizzazione, la localizzazione intra-cellulare, l’espressione, ecc. L’ibridazione di acidi nucleici immobilizzati su supporti solidi è la pietra miliare dei metodi di rivelazione dei geni e dei prodotti genici che ha rivoluzionato la nostra comprensione della struttura dei geni, dell’organizzazione del genoma e del controllo dell’espressione dei geni Il DNA bersaglio (complessa ed eterogenea popolazione di molecole di acido nucleico normalmente immobilizzate su supporto solido) La sonda (popolazione omogenea di molecole a sequenza nota marcate) La prima di queste tecniche, il Southern blotting, fu sviluppato da Ed Southern nel 1975 per identificare all’interno di un gel, frammenti di DNA complementari ad una determinata sequenza di DNA.

Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici e marcatura degli acidi nucleici

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Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici e marcatura degli acidi nucleici - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici  e  marcatura degli acidi nucleici

Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici e

marcatura degli acidi nucleici

Tecniche di base della biologia molecolare, che permettono non solo di identificare e quantificare sequenze specifiche di DNA e di RNA, ma di studiarne l’organizzazione, la localizzazione intra-cellulare, l’espressione, ecc.

L’ibridazione di acidi nucleici immobilizzati su supporti solidi è la pietra miliare dei metodi di rivelazione dei geni e dei prodotti genici che ha rivoluzionato la nostra comprensione della struttura dei geni, dell’organizzazione del genoma e del controllo dell’espressione dei geni

Il DNA bersaglio (complessa ed eterogenea popolazione di molecole di acido nucleico normalmente immobilizzate su supporto solido)

La sonda (popolazione omogenea di molecole a sequenza nota marcate)

La prima di queste tecniche, il Southern blotting, fu sviluppato da Ed Southern nel 1975 per identificare all’interno di un gel, frammenti di DNA complementari ad una determinata sequenza di DNA.

Il metodo è diventato molto importante dopo lo sviluppo del clonaggio molecolare, che ha reso possibile una miriade di sonde specifiche per i geni. Successive tecniche analoghe per lo studio di RNA e proteine sono state chiamate Northern e Western blotting, rispettivamente.

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Tecnica sonda/bersaglio Tipo di marcatura _______________________________________________________________Southern blotting DNA su DNA DNA o oligonucleotidi

radioattivi o fluorescenti

Northern blotting DNA su RNA “ “

Western blotting proteine su proteine anticorpi coniugati ad enzimi o chemioluminescenti

Fasi sperimentali:

1. Il DNA da analizzare è digerito con enzimi di restrizione e risolto per elettroforesi su gel di agarosio.

2. I frammenti di DNA sono denaturati in una soluzione alcalina (NaOH 0,5M, NaCl 1M) e poi il gel è immerso in un tampone di neutralizzazione, per riportare il pH a valori simili a quello del tampone di trasferimento (questo passaggio è necessario quando si usa la nitrocellulosa perché essa viene distrutta da un pH alcalino).

Per il trasferimento di frammenti di grosse dimensioni il gel può essere immerso in HCl 0,25N per 10 min prima della denaturazione; il trattamento acido depurina il DNA*che durante il trattamento basico è idrolizzato a livello dei siti depurinati. Questo trattamento assicura che tutti i frammenti sono trasferiti velocemente dal gel al filtro.

* Per depurinazione si intende la perdita di una base azotata purinica(A o G) da un nucleotide per rotturadel legame glisosidico)

Southern blotting

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3. Il DNA è trasferito per capillarità (blotting) dal gel su una membrana di nitrocellulosa (solo acici nucleici a singolo filamento) o di nylon (filtro).

Il legame degli acici nucleici a una membrana di nitrocellulosa comporta interazioni idrofobiche, legami idrogeno e ponti salini

4. BakingDopo il trasferimento, i frammenti di DNA sono fissati sul filtro per impedirne il distacco, mediante trattamento a 80°C (nitrocellulosa) o trattamento ai raggi UV che creano legami crociati tra i residui di Timina del DNA e i gruppi amminici della membrana di nylon.

5. Ibridazione. Dopo la fissazione del DNA, il filtro è posto in una soluzione contenente la sonda marcata (DNA, RNA, oligo), la cui sequenza è complementare al frammento da identificare Se la sonda è a doppio filamento deve essere denaturata prima di essere aggiunta alla miscela Le interazioni tra la sonda e il suo filamento complementare porterà alla formazione di legami idrogeno che permettono la formazione di una doppia elica. Le condizioni di ibridazione sono scelte in modo da massimizzare la quantità di sonda legata al DNA bersaglio, limitando al tempo stesso il legame non specifico con altri frammenti di DNA o con il filtro stesso (segnale di fondo).

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6. Dopo l’ibridazione, il filtro è lavato più volte per eliminare la sonda in eccesso e per rimuovere la sonda legata in modo aspecifico (differenti condizioni di stringenza).

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DNA and RNA blotting

23S16S

5S

Total RNA loaded on denaturating agarose gel

DenaturationDNA alkali treatmentRNA formaldehyde gel

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Controllo della stringenza

Stringenza: specificità con cui una sonda si ibrida alla sequenza bersaglio.Una stringenza elevata si ottiene aumentando la temperatura e diminuendo la salinità (forza ionica) del tampone.

La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita’ dell’ibrido che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare.La Tm e’ critica per determinare la temperatura ottimale alla quale condurre l’ibridazione.

Per sonde più lunghe di 100 bp:

Tm = 81,5 °C + 16,6 log M + 0,41 (% C+G)

Per oligonucleotidi ( 20 basi):

Tm = 4 °C (numero di G +C) + 2°C (numero A +T)

Componenti dei tamponi di ibridazione

Destran solfato e polimeri simili che agiscono da “riempitivi, cioè riducono il volume di reazione e aumentano la velocità e l’efficienza d’ibridazione;

Detergenti (SDS) o agenti bloccanti (Denhardt) che diminuiscono la percentuale di legame non-specifico tra sonda e membrana;

Agenti denaturanti (formammide e urea) che diminuiscono la temperatura di denaturazione dell’ibrido; l’aggiunta di queste sostanze permette di abbassare la temperatura d’ibridazione;

DNA eterologo (DNA di salmon sperm) che satura i siti di legame sulla membrana che potrebbero interagisce con la sonda (riduce i segnali aspecifici).

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Northern blotting analysis

A

B

fis

0

0.6

1.2

Arb

.Uni

ts

+ _virF virB+ _ virG

+ _ icsB+ _ cpxR

+ _

C

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DNA labeling1) Random primer

Denaturation (boil 5’)Hexaprimers added

DNA synthesis with Klenow polymerase (1 hour at 37°C) and a mix of four dNTPs containing [32P]dATP

Hybridization

Labeled probe

Denaturation (boil 5’)

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2) Nick translation

DNA degradation

Add 32P-dATP or 32P-CTP

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G-3’

CTTAA-5’

End-labeling

5’-GGG

3’-CCC

1- Fill-in reaction dTTP +

[32P]dATP + Klenow fragment

EcoRISmaI

5’3’ 5’

3’5’ protruding end 3’ protruding end

(PstI, SacI, KpnI, BglI)

dGTP + dTTP + dCTP + [32P]dATP + Klenow fragment

X

GAATT-3’

CTTAA-5’

5’-GGG

3’-CCCEcoRISmaI

2- Kinase reaction

DNA fragment

CIP or BAP5’……NpNpNpG

3’……NpNpNpCpTpTpA

5’…..pNpNpNpG

3’……NpNpNpCpTpTpAp

Polynucleotide Kinase + [32P]ATP

* *

5’…..pNpNpNpG

3’……NpNpNpCpTpTpAp

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Marcatura non radioattiva Marcatura con BiotinaSi basa sull’incorporazione nel DNA di un analogo di un nucleotide contenente la biotina, una vitamina (biotina-7-dATP, biotina-14-dATP), mediante nick translation o random priming. Dopo ibridazione, la sonda marcata con biotina può essere rilevata mediante il legame forte e specifico con la streptavidina, coniugata con fosfatasi alcalina o perossidasi. Il complesso può essere evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o chemiluminescente.

La streptavidina è una proteina extra-cellulare del batterio Streptomyces avidinii, costituita da 4 subunità identiche, ciascuna delle quali lega una molecola di biotina.

E’ il 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) in presenza di nitroblu tetrazolio cloruro (NBT). La fosfatasi alcalina rimuove il gruppo fosfato del BCIP, producendo un molecola che dimerizza in condizioni ossidanti

Biotina-oligo

Substrato cromogenico BCIP/NBT della fosfatasi alcalina

per formare il 5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-indaco, un prodotto insolubile indaco. Il colore indaco è amplificato dall’aggiunta di NBT. Il NTB viene ridotto dall’indolil e produce un colorante blu intenso NBT formazano.

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Nonradioactive DNA probe

BiotinTargetDNA

Probe

Biotin-labeled nucleotides are incorporated into the DNA probe by random primer or nick translation methods

Streptavidin

Biotin-labelledalkaline phosphatase or peroxidase

Substrate

Light-emittingproduct or chromogenic substrates change color

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Marcatura con Digossigenina

La digossigenina (DIG) è uno steroide cardiotonico isolato da Digitalis purpurea, una pianta erbacea. Il metodo si basa sull’incorporazione della digossigenina-11-dUTP nel DNA mediante nick translation o random priming. La sonda così marcata viene rivelata da un sistema immuno-enzimatico che usa un anticorpo diretto contro la digossigenina (anti-DIG) coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così un complesso che può essere evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o chemiluminescente della fosfatasi alcalina.La specificità dell’ anti-DIG per la DIG fornisce un’alta sensibilità di rilevazione.

Dig-dUTP

Deossiuridina trifosfato che mediante un bracciospaziatore porta legata la digossigenina).

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Cutting and joining DNA moleculesAfter a restriction endonuclease cuts DNA fragments can be joined.

Features of Bacteriophage T4 DNA LigasePolypeptide of MW=68.000

Requires ATP (the E.coli enzyme requires NAD+). The cofactor forms an enzyme-AMP complex.

The complex binds to the nick and catalyzes the formation of a covalent bond in the phosphodiester chain.

The optimum temperature for ligation of DNA is 37°C but at this temperature the hydrogen-bounded joint between the sticky ends is unstable (the reaction is usually carried out at 15°C).

Substrate: This enzyme is active on double strand DNA with blunt ends or complementary cohesive ends that base pair to bring together 3’-OH and 5’-phosphate termini.

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An enzyme-AMP complex binds to a nick bearing 3’-OH and 5’-P groups.

The AMP reacts with the phosphate group which is attacked by the 3’-OH.

Application of alkaline phosphatase treatment to prevent recircularization of vector plasmid without insertion of foreign DNA.

AMP

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Using DNA linkers

A decameric linker molecule containing an EcoRI site is joined by T4 DNA ligase to both ends o a blunt-ended foreign DNA. Cohesive ends are then generated by EcoRI.

Cloning a cDNA

1) mRNA is copied into double-stranded cDNA and SalI linkers (S) are added.

2) The hairpin loop formed by self-priming of the second strand synthesis is removed by S1 nuclease.

3) EcoRI linkers are the ligated to the duplex molecule and cohesive termini are generated by restriction with SalI and EcoRI.

4) The cDNA plus linkers is then ligated into a vector cut with the same two enzymes.

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Sintesi di code omopolimeriche con terminal transferasi

Le estremità 3’ protrudenti, quali quelle generate dalla esonucleasi del fago lambda o da alcuni enzimi di restrizione (PstI) sono i substrati migliori per l’azione dell’enzima terminal transferasi.

Formazione di molecole circolari

Saldatura di frammenti prodotti mediante PCRLe polimerasi termostabili usate per amplificare il DNA possiedono attività di terminal transferasi. La Taq aggiunge un dATP all’estremità 3’ del prodotto di amplificazione.

-Metodo del T/A cloning.

-DNA polimerasi I (attività 3’-5’ eso).

-Incorporazione di sequenze extra al 5’ dei primers.

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Schema della costruzione di un plasmide ricombinante, e della successiva propagazione (amplificazione operata dalle cellule batteriche).

DNA donatore

Frammenti di restrizione

Vettore ricombinante contenente l’inserto 1 oppure il 2

Trasformazione

Replicazione e divisione cellulare

Clone del frammento 2 del donatore

Clone del frammento 1 del donatore

Siti di taglio degli enzimi di restrizione