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VOL. 11 (1953) SHORT COMMUNICATIONS, PRELIMINARY NOTES TENEUR EN ADt~NOSINE TRIPHOSPHATE (ATP) DE E. COLI APRF.S IRRADIATION U.V. par D. KANAZIR* ET M. ERRERA Laboratoire de Morphologie animale, Universitd libre de Bruxelles (Belgique) 45z Divers travaux r4cents ont montr6 une action des rayons X sur le couplage des phosph0rylations aux oxydations a-4. Dans le cas de la rate, une diminution des phosphorylations s'observe, chez le rat, une heure d6jX apr6s une dose 16thale de rayons X 1. Dans le cas de E. coli B/r, la synth6se d'ATP n'est pas influenc6e au cours des 9o minutes qui suivent l'irradiation, mais on observe une 61imination d'ATP dans le milieu de culture ~. Comme I'ATP paratt avoir une certaine influence sur l'induction par les U.V. de E. coli B filamenteuses s, il nous a sembl4 utile d'6tudier l'influence de ce rayonnement sur le m6tabolisme de cette substance dans le cas des bact4ries sensibles (E. coli B) et r4sistantes (E. coli B/r) £ divers types d'agents chimiques et physiques. Comme nous l'avons d4j~ fait remarquer v et comme vient de le pr4ciser KELNER 8, tout effet fondamental pour la cellule dolt se manifester d6s la fin de l'irradiation. Irradiation de E. coll. Les bact4ries sont cultiv6es sur un milieu synth6tique d4j~ d4crit ~, pauvre en phosphore; elles sont irradi4es soit en fin de croissance, soit en phase logarithmique. Avant Fir- radiation, la suspension bact4rienne est dilu4e g l'aide de NaCI 9O]oo de mani~re 5. obtenir une densit4 optique de o.2oo au spectrophotom~tre Coleman Universel, module 14, ~ 7oo m# (filtre P.C.5). L'irradiation est effectu4e & l'aide d'une lampe Mineralight dormant approximativement 19' IO ~ ergs/mm~/min h 3 ° cm. Une irradiation de 2o secondes en phase logarithmique laisse environ 20 % de E. coli B survivants. L'ATP est dos4 suivant la technique de STaEHLER ~ qui consiste ~ mesurer, ~ l'aide d'un photo- multiplicateur d'61ectrons, la luminescence d'extraits d'organes lumineux de Photinus pyralis (nous remercions vivement les Drs McELRoV et STREIJLER pour leur g6n4reux envoi de ce mat4riel). La luminescence est proportionnelle g la concentration du syst~me en ATP. Le dispositif que nous avons utilis4 permet de mesurer ais4ment des quantit4s de l'ordre de io-~y d'ATP. Les bactdries sont r4colt6es ~ des temps variables apr~s l'irradiation, centrifug4es et le culot est port4 ~. 4bullition pendant io minutes dans un tampon au phosphate de pH 7.4. La suspension bact4rienne totale est utilis4e pour le dosage; un aliquot de celle-ci est dilu4 et sa densit6 optique, mesur4e ~. 70o m# (Beckmann) de mani~re £ ramener tous les rdsultats g une population bact4rienne arbitrairement choisie. A titre d'indication, i mg de E. coli s4ch4 contient~ o.o 5 y d'ATP g la fin de la croissance. Bactdries irradides en fin de croissance. Apr~s l'irradiation, les bact4ries sont additionn6es d'un m~me volume de milieu de culture et raises dans une 4tuve g 37 ° en agitant continuellement. On observe une augmentation de la dur4e du temps de latence d'autant plus considdrable que l'irradiation est plus prolong6e. M~me pour de fortes irradiations (Fig. I), la synth~se d'ATP observ4e pendant la phase de latence n'est pas interrompue et les valeurs observ4es pour les cellules irradi6es sont souvent sup6rieures ~ celles obtenues dans le cas des cellules tdmoins. Cependant, Mors que chez les bactdries non irradides, cet ATP est utilis4 au cours de la croissance, chez les bact6ries irradi4es la teneur en ATP diminue 6galement et tout se passe comme si cette r4serve d'4nergie 4tait gaspill4e. E. coli B ~o~ . 0.2 d" KJ°y - ...... o.1.'-- , , , 0 6o Q 0 60 120 t80 250 rain. •o 0.4 O O T4moins ×-- × Irradi4s * Boursier de l'Institut E. co/i B/r -~_--.o --I / 6'0 1~ ,~o 24 ~o :~o ,~o ~o 5',o~,i,. Fig. i 40 ~ L., i 0 2f heure: ATP des t4moins + + ATP des irradi4s des Recherches sur la structure de la Mati~re, Belgrade. 3I

Teneur en adénosine triphosphate (ATP) de E. Coli aprés irradiation U.V

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VOL. 11 (1953) SHORT COMMUNICATIONS, PRELIMINARY NOTES

T E N E U R E N A D t ~ N O S I N E T R I P H O S P H A T E ( A T P ) D E E . C O L I

A P R F . S I R R A D I A T I O N U . V .

pa r

D. K A N A Z I R * ET M. E R R E R A

Laboratoire de Morphologie animale, Universitd libre de Bruxelles (Belgique)

45z

Divers t r a v a u x r4cents on t mon t r6 une ac t ion des r ayons X sur le couplage des p h o s p h 0 r y l a t i o n s aux oxyda t ions a-4. D a n s le cas de la rate, une d iminu t ion des phospho ry l a t i ons s 'observe , chez le ra t , une heure d6jX apr6s une dose 16thale de r ayons X 1. D a n s le cas de E. coli B/r, la syn th6se d ' A T P n ' e s t pas influenc6e au cours des 9o m i n u t e s qui s u i v e n t l ' i r radiat ion, ma i s on observe une 61imination d ' A T P dans le mil ieu de cu l tu re ~. C omme I 'ATP para t t avoi r une cer ta ine influence sur l ' i nduc t ion par les U.V. de E. coli B f i l amenteuses s, il nous a sembl4 uti le d '6 tud ie r l ' inf luence de ce r a y o n n e m e n t sur le m6tabo l i sme de cet te subs t ance dans le cas des bact4r ies sensibles (E. coli B) et r4s i s tan tes (E. coli B/r) £ divers t ypes d ' a g e n t s ch imiques et phys iques . C o m m e nous l ' avons d4j~ fai t r e m a r q u e r v et c o m m e v ien t de le pr4ciser KELNER 8, t o u t effet f o n d a m e n t a l pour la cellule dol t se man i f e s t e r d6s la fin de l ' i r radiat ion.

Irradiation de E. coll. Les bact4r ies son t cul t iv6es sur u n milieu syn th6 t i que d4j~ d4crit ~, p a u v r e en phosphore ; elles son t irradi4es soit en fin de croissance, soit en phase loga r i thmique . A v a n t Fir- radia t ion, la suspens ion bac t4r ienne es t dilu4e g l 'a ide de NaCI 9O]oo de mani~re 5. ob ten i r une densi t4 op t ique de o.2oo au spec t ropho tom~t re Co leman Universel , module 14, ~ 7oo m # (filtre P.C.5) . L ' i r rad ia t ion est effectu4e & l 'a ide d ' u n e l ampe Minera l ight do rman t a p p r o x i m a t i v e m e n t 19' IO ~ e rgs /mm~/min h 3 ° cm. Une i r radia t ion de 2o secondes en phase loga r i t hmique laisse env i ron 20 % de E. coli B su rv ivan t s .

L ' A T P est dos4 s u i v a n t la t echn ique de STaEHLER ~ qui consis te ~ mesurer , ~ l 'a ide d ' u n pho to- mul t ip l i ca t eu r d'61ectrons, la luminescence d ' ex t r a i t s d ' o rganes l u m i n e u x de Photinus pyralis (nous remerc ions v i v e m e n t les Drs McELRoV et STREIJLER pour leur g6n4reux envoi de ce mat4riel) . La luminescence es t propor t ionnel le g la concen t ra t ion du sys t~me en ATP. Le disposi t i f que nous avons utilis4 p e r m e t de mesu re r a i s4ment des quan t i t 4 s de l 'ordre de i o - ~ y d ' A T P . Les bactdr ies son t r4colt6es ~ des t e m p s var iab les apr~s l ' i r radiat ion, centr i fug4es et le culot es t port4 ~. 4bulli t ion p e n d a n t io m i n u t e s da ns un t a m p o n au p h o s p h a t e de p H 7.4. La suspens ion bac t4r ienne to ta le es t util is4e pour le dosage; u n a l iquo t de celle-ci est dilu4 et sa densi t6 opt ique, mesur4e ~. 70o m # (Beckmann) de mani~re £ r a m e n e r t o u s les rdsu l ta t s g une popu la t ion bac t4r ienne a r b i t r a i r e m e n t choisie. A t i t re d ' ind ica t ion , i m g de E. coli s4ch4 c o n t i e n t ~ o.o 5 y d ' A T P g la fin de la croissance.

Bactdries irradides en fin de croissance. Apr~s l ' i r radiat ion, les bact4r ies son t addi t ionn6es d ' u n m~me vo lume de milieu de cu l ture et raises dans une 4 tuve g 37 ° en a g i t a n t con t inue l l ement . On observe une a u g m e n t a t i o n de la dur4e du t e m p s de la tence d ' a u t a n t p lus considdrable que l ' i r rad ia t ion es t p lus prolong6e. M~me pour de fortes i r rad ia t ions (Fig. I), la syn th~se d ' A T P observ4e p e n d a n t la phase de la tence n ' e s t pas i n t e r r o m p u e et les va leur s observ4es pou r les cellules irradi6es son t souven t sup6r ieures ~ celles ob tenues dans le cas des cellules tdmoins . Cependan t , Mors que chez les bactdries non irradides, cet A T P est util is4 au cours de la croissance, chez les bact6r ies irradi4es la t eneu r en A T P d iminue 6ga lement et t o u t se passe c o m m e si ce t te r4serve d '4nergie 4 ta i t gaspill4e.

E. coli B

~o~ .

0.2 d"

KJ°y - . . . . . .

o . 1 . ' - - , , , 0

6o

Q

0 60 120 t80 250 rain.

• o 0.4

O O T4moins × - - × Irradi4s

* Boursier de l ' I n s t i t u t

E. co/i B/r

- ~ _ - - . o - - I / 6'0 1~ ,~o 24 ~o :~o ,~o ~o 5',o~,i,.

Fig. i

4 0 ~

L.,

i 0 2f heure:

• • A T P des t4moins + + A T P des irradi4s

des Reche rches sur la s t ruc tu re de la Mati~re, Belgrade.

3I

452 S~ORT COMMUNICATIONS, PRELIMINARY NOTES VOL. l l (I953)

Pour des doses plus faibles, la p6riode de latence augmente peu et la vitesse de croissance est 16g~re- ment ralentie; ces effets ne peuvent s 'expliquer par un d6ficit en ATP, cette substance paraissant subir un m6tabolisme normal.

Bactdries irradides au cours de la phase logarithmique. Des bact6ries qui ont 6t6 cultiv6es jusqu'& at teindre une densit6 optique de l 'ordre de 0.350 sont dilu6es au moyen de NaC1 9O/oo de mani~re

obtenir une densitd optique de 0.20o. Apr~s l ' i rradiation (3 ° sec ~ 3 ° cm) on leur ajoute 2 fois leur volume de milieu de culture et on les incube comme pr6c~demment. On observe, dans le cas des deux souches bact6riennes, que la croissance n 'es t pas ar%t6e, mais seulement ralentie. Pendant ce temps, la teneur en ATP des cellules t6moins d6croit progressivement au cours de la croissance; celle des cellules irradi6es, au contraire, reste stat ionnaire pendant un certain temps, plus long, semble-t-il, dans Ie cas des E. coli B (Fig. 2). Au cours de la croissance des bact6ries irradi6es, la synth6se du cytoplasme neuf (poids sec) et celle de l'acide ribonucMique restent proportionnelles

la vitesse de multiplication cellulaire s. Par contre, la synth6se d'acide d6soxyribonucl6ique est inhib6e, du moins dans le cas de E. eoli B/r (KELNER ~) ; cette inhibition n 'est pas due au manque de r6serves 6nerg6tiques, comme en t6moignent nos r6sultats; l ' irradiation entraine au contraire, semble-t-il, un ralent issement darts l 'utilisation des r6serves 6nerg6tiques de la cellule. Puisque la synth~se des prot6ines et celle de l'acide ribonucl6ique ne sont pas arr6t6es, il est tr6s vraisemblable que ce que r o n observe n 'est pas un blocage de l 'utilisation de I 'ATP, mais plut6t l '6tablissement d 'un 6tat de r6gime entre la synth~se et l 'utilisation.

5 a5

~ o ~

,~, 0.2

O.O8 (3.O7

E. con B E. coil B/r

/ / - - - - . ; ; . . . . . . . . . .

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120 180 240 rain. Z4,heure$

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Fig. 2

O - - - - O T6moins × × Irradi6s • • ATP des t6moins

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80 ~,

e o ~: 4O3

0

+ - - - - + ATP des irradi6s

Notons enfin que la technique utilis6e n 'est peut-6tre pas absolument sp6cifique de I 'ATP; on ne peut exclure la possibilit6 que les cons t i tuants dos6s dans le pr6sent travail soient sous forme non diffusible. En effet, le surnageant des suspensions bact6riennes chauff6es est moins actif que la suspension totale. I1 n 'es t donc pas exclu qu'il y ait blocage des m6canismes de t ransfer t de l'6nergie dans la cellule.

B I B L I O G R A P H I E

1 l~. L. POTTER ET F. H. BETTEL, Federation Proc., I I (1952) 270. 2 E. MAXWELL ET G. ASHWELL, Arch. Biochem. Biophys. , 43 (1953) 389 • 3 G. ASHWELL ET J. HICKMAN, Proc. Soc. Expt l . Biol. Med., 80 (1952) 407 . 4 D. W. VAN BEKKUM, H. J. JONGEPIER, H. T. M. •IEUWERKERK ET J . A. COHEN, Trans. Faraday

Soc., (sous presse). 5 D. BILLEN, B. L. STREHL~R, G. E. STAPLETON ET ]~. BRIGHAM, Arch. Bioehem. Biophys. , 43 (1953) i. e M. ERRERA, Brit . J . Radiol. , (sous presse). 7 M. ERRERA, Ann . Soc. Roy. Sci. mddic, natur., 5 (1952) 65.

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Regu le 3 juin 1953