TERAPIA TARGET

MOLECOLARE

Terapia target molecolare: razionale

Molteplici difetti genetici coinvolti nell’oncogenesi

Troppi target per una terapia molecolare efficace ?

! Interazione/interdipendenza di molte vie di trasduzione del segnale

! Riduzione del vantaggio proliferativo con l’inibizione di una singola via di trasduzione del segnale aberrante

Leucemia Mieloide Cronica

• Incidenza 1-2 casi ogni 100.000 abitanti per anno

Diagnosi facile:• quadro ematologico caratteristico• marcatore citogenetico specifico

Cromosoma Philadelphia

22

1960 - Nowell P.C. & Hungerford D.A

C lin ica l C o u rse : P h ases o f C M L

C h ro n ic ph ase

M ed ian 4 –6 yea rss tab iliza tion

A cce le ra ted p h ase

M ed ian du ra tionup to 1 yea r

B las tic p h ase (b last c ris is )

M ed ian su rv iva l3–6 m on ths

T erm ina l phase

A d van ced p h ases

C hair o f H em ato log y, B rescia U niversity

Ph+MyeloidProgenitors

Ph+Lymphoidprogenitors

Ph+B-cellsT-cell

Ph-positiveStem Cell My

Ph-negativeStem Cell

Ph-translocation BCR/ABL rearrangement

Ph-translocation BCR/ABL rearrangement

ClonalExpansion

La traslocazione che da origine al cromosoma Ph avviene in una cellula staminale totipotente

ProliferationExpansion Sometimes, Lymphoid

blast crisis

Ly

B cellT cell

Ph+SCPh+SC Ph+SC

Ph + progenitors & mature cells

Ph-translocation / BCR-ABL rearrangement

NormalSC

NormalSC

EXPANSION OF THE Ph + STEM CELL COMPARTMENT EXPANSION OF THE Ph + STEM CELL COMPARTMENT

CMLCML

Il cromosoma Philadelphia è il marcatore caratteristico della LMC (presente in più del 95% dei casi),

ma si ritrova anche:• in circa il 30% delle LLA dell’adulto • nel 2% delle LMA

22

bcr

abl

9

Conseguenze molecolari della traslocazione che determina la comparsa del Cromosoma

Philadelphia

Ph

bcr-bl

9+

SH3 SH2 SH1 NLS DNA Actin binding binding

Schema del gene ABLe dei suoi domini funzionali

1a

Myr

1b

Attività tirosin-kinasica

Parte che migra sul cromosoma 22

Gene espresso in tutti i tessuti, la cui funzione nella cellula normale non è esattamente nota

? Riparo DNA ? Controllo ciclo cellulare e apoptosi ? Interazione con TP53

Gene BCR: qual è la sua funzione?

Dimerization Domain

Serine/threonine rich domain (SH2 bind.)

dbl-likedomain

GAPrac

domain

m-bcr µ -bcrM-bcr

Exon 1 Exon 3/8 Exon 17/22

Proteina bcr regione ad attività serina-treonina chinasica (dimeri)regione x passaggio GTP→GDP→attivazione fattori trascrizioneresidui tirosinici x autofosforilazione (legame a Grb2, adattatore per Ras) trasduttore

di segnale

Punti di rottura sul cromosoma 22

e1 e6 e13 e14 e19(b2) (b3)

e20

Gene BCR

Gene ABL

a2

m- bcr M-bcr µ-bcr

M-bcr M-bcr P210 P210

µ-bcr µ-bcr P230P230

m-bcr m-bcr P190P190 LLA

CML, LLA

CML, CNL

Tipi di gene ibrido BCR-ABLche si possono formare

BCRBCR ABLABLTK

BCRBCR ABLABLTK

BCRBCR ABLABLTK

Autophosphorylation of BCR-ABL

ABL

Tyr

BCR

Autophosphorylation by dimerization

ABL

Tyr

BCR

Bcr-Abl

PPATPP

Fosforilazione di proteine bersaglio da parte di BCR-ABL

ProteinaTir

ProteinaPTir

P

Trasduzione del segnale

NUCLEO

Ciclo Cellulare

BCR/ABL

RAS

1-Stimolo alla proliferazione

4-Diminuzione della funzione di ABL a livello nucleare:

instabilità genomica

Paxillin

F-actin

2-Diminuzionedell’adesione alla

matrice del midollo osseo

ABL

3- Inibizione della apoptosi

Processi attivati dalla presenza di BCR-ABL nelle cellule del sangue dalla conseguente attivazione dell’attività tirosin chinasica di ABL

PIK3-AKT

JAK-STAT

MYC

Progressione della Leucemia Mieloide Cronica

Ph+

Ph+Ph+

Ph+Ph+

Ph+Ph+

Ph+

Ph+ Ph+Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+Ph+

Ph+

Ph+

Ph1

Ph1

Ph1

Ph1Ph1

Ph1

Ph1Ph1

Ph1Ph1

Ph1Ph1

Ph1Ph1

Ph1Ph1

Ph1

Ph1

Ph1

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+Ph+

Ph+

Ph+Ph+

Ph+Ph+

Ph+Ph+

NN

NN

N

N

N

N

N

N

N

NN

N

N

N

NN

Ph+

N

N

N

NN

N

N

N N N

NN

NN

NN

N

NN

N

N

N

N

N

NN

NN

N

NN

NN

N

N

N

NN

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NN

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph+

Ph1

ANNI1 2 3 4 5

Clone indifferenziato,crisi blastica

Accumulo didifetti genetici addizionali

NUCLEO

Ciclo Cellulare

ABL

Nella LMC, c’è instabilità genomica

Radiazioni->danno genetico

Rb, p53

Blocco in G1

inibizione della funzione di ABL a livello nucleare ?

UnstablePh-positiveStem Cell

Second event: Ph-chromosome translocation

Second event: Ph-chromosome translocation

First event:Unknow genetic lesion

First event:Unknow genetic lesion

UnstableStem Cell

Bcr-Abl

Meccanismo d’azione del Gleevec (STI 571)

ProteinaTir

PPATP

P

STI

Leucemia acuta a promielociti

RAR

PML

NCorHD

PML-RARα

RAR

PML

NCor

HD

PML-RARα

ATRA

Via estrinseca dell’apoptosi

Via intrinseca dell’apoptosi

Major apoptotic signalling pathways

Regolatori dell’apoptosi: Bcl-2 family

Proteine Bcl-2 come target molecolari

iperespressione resistenza ad apoptosida CHT o RT e s. immune

Inibizione temporanea

non tossica per cellulenormali

inibizioneno up-regulation di altreproteine anti-apoptosi

Terapia target molecolare anti-Bcl2

Oligonucleotidi antisenso liposomiali (ASODN) linfoma non Hodgkin, leucemie acute refrattarie

Molecole antagoniste e altri inibitori

Oligonucleotidi antisenso: meccanismo d’azione

ANTICORPI

MONOCLONALI

Elementi da considerare per la costruzione di un Anticorpo Monoclonale

1. Scelta dell’antigene bersaglio2. Immunogenicità dell’anticorpo3. Durata della vita media di un anticorpo4. Interazione tra anticorpo e funzioni effettrici del sistema immunitario del paziente5. Coniugazione con tossine o radionuclidi

Murine variable

regions

S SS S

CDR

CarbohydrateFcRI binding domain

Clq binding domain

Human constant regions

Rituximab

Hinge

Antibody-Drug Conjugates (ADCs)

ADC are MAbs linked to cell-killing drugsHigh affinity and selectivity of Ab to tumor cells

MAbs enter or are internalized within cellsCell factors or environment cause the drug to be released

from the MAbReleased drugs kills the cell

Very specific cell killing. Much different than chemotherapy where all cells are exposed to drug.

Toxin

XX

Toxin

Cancer cellexpressing tumor antigen

Toxin+

Intracellular breakdown of Antibodylinked toxin complex

Calcichemicin intercalates into DNA