Quali agenti selettivi sono solitamente sfruttate le esigenze nutrizionali (capacità di metabolizzarespecifici substrati), la capacità di resistere alla presenza di antibiotici o altre molecoleantimicrobiche, la capacità di sopravvivere a bassi pH o elevate concentrazioni di sali o zuccheri…

TERRENI SELETTIVI: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione di uno specificomicrorganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita deglialtri microrganismi

TERRENI DI COLTURA: classificazione in base alla funzione

EsempiSalmonella-Shigella Agar (SS-agar): utile all’isolamento dei batteri patogeni Gram negativi deigeneri Salmonella e Shigella; questo terreno inibisce la crescita della maggior parte dei batteri acausa dell'elevata concentrazione di sali biliari e di citrato di sodio

Bifidobacterial Selective Medium: utile all’isolamento dei bifidobatteri; contiene come agentiselettivi il sale litio cloruro, l’acido propionico e alcuni antibiotici a cui i bifidobatteri sononaturalmente resistenti

campione contenente il microrganismo da studiare (un alimento, del suolo, un tampone

faringeo o cutaneo, un campione fecale, etc…)

Il terreno selettivo sfavorisce (o impedisce) la crescita dei batteri che non voglio isolare

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ESEMPIO

TERRENI DISCRIMINATIVI: rendono possibile alle colonie di un datomicrorganismo di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciutoe distinto a prima vista dalle colonie degli altri microrganismi

Agar sale mannite: contiene lo zucchero MANNITOLO (come unica fonte di carbonio) erosso fenolo (indicatore di pH); permette di discriminare gli stafilococchi patogeni(Staphylococcus aureus) dagli altri stafilococchi (per es. Staphylococcus epidermidis)

LA CRESCITA DEL MICRORGANISMO DAUNA COLORAZIONE GIALLA poichè lafermentazione del mannitolo produce acidi chefanno virare il colore dell’indicatore di pH(rosso fenolo) al giallo; esempio: S. aureus

LA CRESCITA DEL BATTERIO NONCAMBIA IL COLORE DEL TERRENO: ilbatterio non fermenta il mannitolo; lecolonie batteriche rimangono del coloreiniziale del terreno; esempio: S. epidermidis

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TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni liquidi in cui lapresenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita innumero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle speciecompetitrici

Terreno di coltura al selenio per l’isolamento delle salmonelle dalle feci

ESEMPIO

In questo esempio, dopo circa 6/8 ore il numero di cellule del batterio di interesse sarà dimolto cresciuto rispetto al numero di cellule degli altri microrganismi (il batterio di interesse èstato arricchito!)

Batterio che voglio isolare (per es. Salmonella typhi)

Altri microrganismi presenti nel campione

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estratto di malto 20 g

saccarosio 40 g

estratto di lievito 5 g

acqua dist. 1000 ml

peptone 5 g

estratto di carne 1 g

estratto di lievito 2 g

sodio cloruro 5 g

acqua dist. 1000 ml

PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA

- pesata dei vari costituenti

- dissoluzione in acqua

- sterilizzazione in autoclave

Terreno di coltura NUTRIENT (terreno COMUNE)

Terreno di coltura BRODO MALTO o AGAR MALTO

Idrolizzato di proteine del latte, della carne o della soia con pepsina

per BATTERI nutrizionalmente poco esigenti

per LIEVITI E MUFFE5

TERRENO MRS (per lattobacilli)

de Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI

Peptone from casein 10.0g;

meat extract 8.0g;

yeast extract 4.0g;

D(+)-glucose 20.0g;

dipotassium hydrogen phosphate 2.0g;

Tween® 80 1.0g;

di-ammonium hydrogen citrate 2.0g;

sodium acetate 5.0g;

magnesium sulfate 0.2g;

manganese sulfate 0.04g;

agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g

acqua dist. 1000 ml

Sono microrganismi esigenti dal puntodi vista nutrizionale (detti per questoFASTIDIOSI); affinché possano esserecoltivati, quindi, necessitano di unterreno colturale più ricco in nutrienti

6N.B.: meglio usare il termine MICROBIOTA!

CONCETTO DI STERILITÀ

L’AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione (assai più efficace del CALORE secco)

STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente, (comprese le endospore di Bacillus e Clostridium)

In un laboratorio di microbiologia la sterilità DEVE essere assoluta. Nelleindustrie alimentari è un concetto statistico (si pensi alle leggi di BIGELOW,che rappresentano la cinetica della distruzione termica dei microrganismi)

Il più usato ed efficace mezzo per sterilizzare è il CALORE

PERCHÉ? Principalmente perché le proteine (e quindi anche gli enzimi) denaturano

Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è:

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L’AUTOCLAVE

- il vapore deve poter entrare in contatto con le soluzioni (tappi di cotone; bottiglie aperte)

- P/T minori e tempi maggiori per limitare il danno ai composti organici (imbrunimento, caramellizzazione)

N.B.: Molti zuccheri e gli antibiotici devono essere sterilizzati perfiltrazione (cut-off del filtro di 0,45 o 0,22 µm) perché altrimenti ilcalore dell’autoclave distruggerebbe queste molecole

- Il ciclo di sterilizzazione prevede una sovrapressione di 1 atm (≡121°C) per un tempo di15 min(oppure 20 min x ¾ atm ≡ 116°C; oppure 30 min x ½ atm ≡ 111°C)

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Lavorare in sterilità

Si lavora con fiamma ossidante (azzurra, più calda, più stabile),NON si lavora con la fiamma riducente (gialla, instabile)

Becco Bunsen

riducente ossidante

PipettaSpatola

Ansa

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LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA Consiste nel trasferire sterilmente le cellule del microrganismo allo studio in un brodo

colturale o in una piastra di terreno colturale agarizzato

Semina per SPATOLAMENTO

Semina per STRISCIO (non adatta per metodi quantitativi!)

Semina per INGLOBAMENTO

O INCLUSIONE

Trasferimento in sterilità di cellule nel terreno liquido con ansa o pipetta

INOCULO IN BRODO

SEMINA DI TERRENO SOLIDO

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Semina a striscio per l’isolamento di una coltura pura(compiuta con ansa su piastra contenente terreno colturale agarizato)

https://www.youtube.com/watch?v=0heifCiMbfY

INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI

Incubazione a 37°C per 36-48 h

I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con cui si sta lavorando

Esempi:

Geobacillus stearothermophilusG+, anaerobio facoltativo, termofilo

Bifidobacterium bifidumG+, anaerobio stretto, mesofilo

Incubazione a 60°C per 8-12 h

Agitatore

Giara di anaerobiosi

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Gas-pak per l'allevamento colturale di batteri anaerobi: si notino la giara a chiusura ermetica, la busta generatrice di

anaerobiosi e la cartina indicatrice di anaerobiosi

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Determinazione della carica microbica

MISURAZIONE DIRETTA

CONTA TOTALE AL MICROSCOPIO

(con camere di conta)

CONTA VITALE(piastramento di diluizioni seriali)

MISURAZIONE INDIRETTA

- Misura della conducibilità (conduttimetro)

- Misura della variazione dipH (per es. per un batteriolattico che cresce conmetabolismo fermentativoproducendo acido lattico)

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- Misura della torbidità (spettrofotometro)