Tesis Felipe Completa autoguardado (I.G)v3

Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias

Escuela de Biología Marina

Profesor Patrocinante: Dr. Iván Gómez O.

Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias

Profesor Co-Patrocinante: Dra. Pirjo Huovinen Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias

“ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN DE FLOROTANINOS A NIVE L ESTRUCTURAL Y ESTACIONAL EN Lessonia nigrescens y Lessonia trabeculata”

Tesis de Grado presentada como

Parte de los requisitos para optar al Título de Biólogo Marino.

EDUARDO FELIPE RAMIREZ KUSCHEL VALDIVIA - CHILE 2014

ii

Si tomare las alas del alba

Y habitare en el extremo del mar,

Aun allí me guiará tu mano,

Y me asirá tu diestra.

iii

AGRADECIMIENTOS

Agradezco al Dr. Iván Gómez por patrocinar la presente tesis, por su tiempo,

paciencia y sentido crítico de cada una de las aristas del presente trabajo. Igual manera

agradezco a la Dr. Pirjo Huovinen por sus correcciones y buena disposición siempre para

mi persona

Agradecimientos al Laboratorio de Fotobiología de la Universidad Austral de Chile

por prestarme el espacio para desarrollarme como Biólogo, a Marcela por enseñarme mi

primero en mis inicios en la Ecofisiología de Algas, a María José, Ignacio, Jeannette,

Constanza por el cariño y amistad.

A mis amigos, Edison, Ricardo, Horacio, Paula por prestarme un hombro cuando

lo necesite y por hacer mi vida en la Universidad una experiencia única. Agradecimientos

especiales para Edgardo por enseñarme que la base de la ciencia es trabajo duro, de

todos los días.

A mis hermanos, Jaime y Carol que son las personas más importante en mi vida,

por darme dos sobrinas preciosas e iluminarme cuando la oscuridad cubría todo, para

ustedes todo mi amor y gratitud por siempre.

A mis Padres, que dejaron de apoyarme, de sostenerme en los momentos de

flaqueza y por ser mi ejemplo de voluntad y firmeza frente a la Vida

Finalmente al proyecto FONDECYT Nº Proyecto 1090494 por financiar la presente tesis.

iv

INDICE

1. RESUMEN ................................................................................................................ 1

1.1 Abstract .......................................... ...................................................................... 3

2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 5

2.1 Radiación UV y su impacto en los organismos marinos ................................. 5

2.2 Sustancias Fotoprotectoras ........................ ....................................................... 7

2.3 Principales características de los florotaninos ... ............................................. 9

2.3.1 Localización y funciones de los florotaninos ............................................. 12

2.4 El rol fotoprotector de los florotaninos ante UV: r ecientes evidencias ........ 16

2.4.1 Los florotaninos en Laminariales: el factor morfo-funcional ...................... 16

2.5 Hipótesis ......................................... ................................................................... 19

2.6 Objetivo General .................................. .............................................................. 19

2.6.1 Objetivos específicos ................................................................................ 20

3. MATERIAL Y MÉTODOS ................................ ....................................................... 21

3.1 Área de estudio y recolección de muestras ......... ........................................... 21

3.2 Diseño experimental de exposición a radiación UV .. ..................................... 22

3.3 Análisis Químico de Florotaninos .................. .................................................. 25

3.3.1 Extracción y preservación del material biológico ...................................... 25 3.3.2 Determinación de Florotaninos ................................................................. 27 3.3.3 Obtención del extracto .............................................................................. 28 3.3.4 Análisis de florotaninos solubles ............................................................... 29 3.3.5 Análisis de florotaninos insolubles ............................................................ 31 3.3.6 Análisis de florotaninos mediante el método colorimétrico. ...................... 33

4. RESULTADOS ........................................ ............................................................... 36

v

4.1 Concentración de Florotaninos solubles medidos en i nvierno y verano ..... 36

4.1.1 Lessonia nigrescens: ................................................................................ 36 4.1.2 Lessonia trabeculata ................................................................................. 42

4.2 Concentración de Florotaninos Insolubles medidos du rante invierno y

verano ............................................ ............................................................................... 46

4.2.1 Lessonia nigrescens: ................................................................................ 46 4.2.2 Lessonia trabeculata: ................................................................................ 52

4.3 Patrones longitudinales en la concentración de flor otaninos ....................... 59

4.4 Correlación entre florotaninos solubles e insoluble s .................................... 61

5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 65

5.1 Efecto de la radiación UV sobre la concentración de florotaninos ............... 65

5.2 Efecto de la estacionalidad ....................... ........................................................ 66

5.3 Diferencias Morfo-funcionales ..................... .................................................... 70

6. CONCLUSIONES ................................................................................................... 74

7. BIBLIOGRAFÍA ...................................... ................................................................ 76

vi

INDICE DE FIGURAS

Figura 1.

Combinación de grupos acetato (modificado por Waterman y Mole, 1994). 8

Figura 2.

Ciclización de una cadena tricetida para formar floroglucinol, adaptado por Waterman & Mole, 1994.

9

Figura 3.

Estructuras de floroglucinol (i) y florotaninos [tetrafucol A (ii), tetrafloroetol B (iii), fucodifloroetol (iv), tetraflorohatol A (v), tetraisofuhalol (vi), florofucofuroeckol (vii)] (modified after Ragan & Glombitza, 1986).

10

Figura 4.

Microscopía electrónica de transmisión indicando fisodes de algas Laminariales; A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata.

11

Figura 5.

El modelo de un polímero de florotanino siendo enlazado covalentemente a la pared celular vía ácido algínico. 12

Figura 6. Ubicación geográfica de los sitios de recolección de macroalgas 20

Figura 7. Diagrama proceso de aclimatación de algas recolectadas 22

Figura 8.

Estructura morfológica y partes del talo de A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata. 23

Figura 9.

Esquema del sistema de incubación termorregulado, donde se indica la disposición de los tratamientos (lámparas y flitros) utilizados para la exposición del material biológico.

24

Figura 10.

Estado de humedad de la sílica gel. A) sílica de indicador azul seca. B) sílica ya saturada de agua. 26

Figura 11.

Cortes distintivos para cada parte del talo después del proceso de secado en silica gel. a) Fronda, b) Estipe, c) Rizoide.

26

vii

Figura 12. Extracto de Lessonia trabeculata 29

Figura 13.

Proceso análisis de florotaninos mediante Folin-Ciocalteu protocolo modificado por Koivikko et al (2005). 30

Figura 14.

Determinación de florotaninos mediante el método de modificado por Koivikko. et al, (2005) y Gómez & Huovinen (2010). A) Extracto florotaninos incubados en NaOH, B) extractos post método colorimétrico Folín-Ciocalteau

31

Figura 15.

Instrumental de laboratorio para análisis de florotaninos. A) Termo para nitrógeno líquido, B) Balanza electrónica, C) Shaker refrigerado, D) Vortex , E) Centrifuga, F) Espectrofotómetro (Scinco).

32

Figura 16.

Curva de calibración de floroglucinol obtenida mediante el método colorimétrico de Folin-Ciocalteau modificado por Koivikko (2009).

34

Figura 17.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de fronda en Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B Verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

37

Figura 18.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

39

Figura 19.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B Verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

41

viii

Figura 20.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de fronda de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (Junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

43

Figura 21.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de estipes de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (Junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

44

Figura 22.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

46

Figura 23.

Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

48

Figura 24.

Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (Mayo de 2007) y B verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

50

ix

Figura 25.

Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (Mayo de 2007) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

52

Figura 26.

Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de fronda de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (Junio de 2008) y B verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

54

Figura 27.

Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

56

Figura 28.

Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

58

Figura 29.

Concentraciones de florotaninos insolubles para 3 estructuras del talo (Fronda, Estipe, Rizoide), durante invierno y verano, donde: A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata. Valores corresponden a promedio ± error estándar (n = 3).

60

Figura 30.

Concentraciones de florotaninos solubles para 3 estructuras del talo (Fronda, Estipe, Rizoide), durante invierno y verano, donde: A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata. Valores corresponden a promedios ± error estándar (n = 3).

60

x

Figura 31.

Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia nigrescens medidos en invierno en distintas partes del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

61

Figura 32.

Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia nigrescens determinados en verano para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

62

Figura 33.

Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia trabeculata determinados en invierno para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

63

Figura 34.

Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia trabeculata determinados en verano para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

64

Figura 35.

Efecto de la estacionalidad sobre el tiempo de respuesta y concentración de florotaninos solubles medidos en extractos de fronda expuesta a tratamiento UV-B (PAR+UV-A+UV-B) para A) Lessonia trabeculata y B) Lessonia nigrescens

68

xi

INDICE DE TABLAS

Tabla 1.

Curva de calibración de Florotaninos. Expresado en miligramos de floroglucinol correspondientes a cada absorbancia según la dilución correspondiente.

33

Tabla 2.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PA y P) y Tiempo de la exposición (0, 2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en extractos de frondas de Lessonia nigrescens medidos en invierno y verano. Los valores son promedio (n=3 ± E.E).

36

Tabla 3.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamiento de radiación (PAB, PAR y P) y Tiempo de la exposición a radiación (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en estipe de Lessonia nigrescens medida en invierno y verano

38

Tabla 4.

Análisis de ANOVA de 2 vías y Test de Tukey sobre los efectos de la estacionalidad tratamiento de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en rizoide de Lessonia nigrescens medidos en invierno y verano. Los valores son promedio n=3 ± E.E.

40

Tabla 5.

Análisis de ANOVA de 2 vías y Test de Tukey en relación al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en extractos de frondas de Lessonia trabeculata medido en invierno y verano.

42

Tabla 6.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en estipe de Lessonia trabeculata medidos en invierno y verano

43

Tabla 7.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en rizoide de Lessonia trabeculata medidas en invierno y verano.

45

xii

Tabla 8.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en fronda de Lessonia trabeculata medidos en invierno y verano.

47

Tabla 9.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en estipes de Lessonia nigrescens medidos en invierno y verano.

49

Tabla 10.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en rizoides de Lessonia nigrescens medida en invierno y verano.

51

Tabla 11.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en fronda de Lessonia trabeculata medida en invierno y verano.

53

Tabla 12.

Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en estipe de Lessonia trabeculata medida en invierno y verano.

55

xiii

ABREVIATURAS

RUV: Radiación Ultravioleta PS: Peso Seco TDO: Teoría de Defensa Optima PS II: Fotosistema II RUVB: Radiación ultravioleta B Co2: Dióxido de Carbono DNA: Acido desoxirribonucleico KJ: Kilo-Joule Mg phl g-1 PS: Miligramos de floroglucinol por gramos de peso seco PAR: Radiación fotosintéticamente activa PSU: Unidades prácticas de salinidad UV-B: Radiación ultravioleta B UV-A: Radiación ultravioleta A µmol: micro mol °C: grados Celsius RUBISCO: Ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa-oxigenasa nm : Nanómetro ROS: Especies reactivas de oxigeno NAOH: Hidróxido de Sodio

1

1. RESUMEN

El ambiente intermareal somete a un alto stress fisiológico a las especies que allí habitan,

debido a los ritmos mareales, incremento de temperatura y exposición a radiación UV

(RUV). Las algas intermareales han desarrollado mecanismos de fotoprotección que

reducen los efectos de una prolongada exposición a altas dosis de RUV, en los periodos

de bajamar. Particularmente las algas pardas presentan altos de niveles de florotaninos,

compuestos fenólicos que han sido sugeridos como compuestos fotoprotectores. En el

presente estudio, en el laboratorio, se evaluaron los efectos de estacionalidad, y

exposición a distintos tipos de radiación (UV-B, UV-A, PAR), sobre la síntesis y

acumulación de florotaninos solubles e insolubles a lo largo del talo (fronda, estipe,

rizoide), tanto de Lessonia nigrescens (intermareal) como de Lessonia trabeculata

(submareal). Los resultados indicaron que en L. nigrescens, los florotaninos solubles

disminuyen desde los rizoides hacia las frondas priorizando las estructuras de soporte

(rizoide), al contrario en L. trabeculata, la distribución de florotaninos fue inverso,

priorizando las frondas. Esto sugiere que los procesos morfo-funcionales de ambas algas,

son distintos y relativos a las estrategias adaptativas del lugar que habitan. Así mismo, L.

nigrescens expuesta a UV-B mostro tasas de inducción de florotaninos superiores

(aumentando hasta 8 veces su concentración), comparado con L. trabeculata, donde la

inducción fue mínima. Esto demuestra la distinta incidencia de RUV en la respuesta

fisiológica, de especies litorales con distintos grados de stress lumínico. En conclusión la

síntesis de florotaninos en las algas inter y submareales está condicionadas por distintas

estrategias adaptativas, referidas al hábitat, historia y grados de exposición a radiación

2

UV, componentes morfo-funcionales determinados por la acción del oleaje (diferentes en

sistemas intermareales y submareales), así como el impacto de los herbívoros.

3

1.1 Abstract

The intertidal environment exerts high physiological stress on species that live in that

ecosystem, due to tidal rhythms, increased temperature and exposure to UV radiation

(UVR). Intertidal seaweeds have developed photoprotective mechanisms that can reduce

the effect of exposure to high UVR doses, especially during the low tide period.

Particularly, brown algae show high levels of phlorotannins, phenolic compounds that

have been suggested as efficient photoprotective compounds. The present study,

evaluated seasonally, the effects of the exposure to different solar radiation wavelenghts

(UV-B, UV-A, PAR), on the concentration of soluble and cell-wall bound (insoluble)

phlorotannins along different thallus parts (fronds, stipes, rhizoid), of Lessonia nigrescens

(intertidal species) and Lessonia trabeculata (subtidal species). The results showed the

phlorotannins distribution in L. nigrescens decreased from rhizoid to fronds, with a

tendency to a higher phlorotannin allocation to attachment mechanic structures (rhizoids).

In contrast, the concentration gradient of phlorotannins in L. trabeculata was in

the opposite direction, i.e. fronds accumulated the highest phlorotannins concentrations

indicating a differential allocation to photosynthetic structures (fronds). It therefore

suggests that intra-thallus phlototannin signatures respond to different morpho-functional

process in both algae, which have evolved as adaptive environmental strategies.

Likewise, L. nigrescens exposed to UV-B radiation showed higher induction rates of

phlorotannins compared to L. trabeculata. These results demonstrate that the differential

UVR physiology depend not only on the history of exposure to the light stress in littoral

zone, but also on morpho-functional processes. In this case the differences in

4

phlorotannin contents and their variations between and L. nigrescens (a intertidal species)

and L. trabeculata (a subtidal especies) are defined probably by various biological and

physical constraints, e.g. degrees of seasonal exposure to UVR, morpho-functional

adaptations to cope with water movement (different in intertidal and subtidal

assemblages), grazing pressure, etc.

5

2. INTRODUCCIÓN

El aumento del stress ambiental debido al incremento en los niveles de Radiación

Ultravioleta (RUV), causado por la disminución de la capa de ozono en ambos

Hemisferios, ha generado interés por el impacto que estos cambios tienen sobre las

comunidades de organismos marinos costeros (Bischof et al. 2007). La RUV tiene

distintas características que la hace nociva para los organismos y por lo tanto su

incremento tiene como consecuencia cambios adaptativos y conductuales en diversos

organismos, no solo de sistemas terrestres sino también los acuáticos.

2.1 Radiación UV y su impacto en los organismos mar inos

La radiación ultravioleta (RUV) es una fracción de la radiación solar que proviene desde

el sol y desde siempre ha influenciado la vida de los ecosistemas acuáticos (Karsten

2008). Esta es filtrada por la capa de ozono compuesta de O3 que se ubica en la

estratosfera, cuya función es absorber la totalidad de la UV-C y parte de la UV-B que

puedan alcanzar la biosfera. La influencia antropogénica a través de la emisión de

sustancias halogenadas volátiles (CFCS, Clorofluorocarbonos) durante décadas, ha

resultado en una acumulación de esos compuestos, que producto de su alta reactividad

química a niveles de estratosfera destruyen fácilmente la capa de ozono. Esta es una

particularidad bien reflejada en la fuerte declinación en la capa de ozono sobre la

Antártica cada primavera, la cual puede contar con más de un 75% de reducción, un

6

fenómeno conocido públicamente como el agujero de ozono. (Wessel et al. 1998,

Whitehead et al. 2000).

Como consecuencia del daño inducido por la UV en las moléculas o componentes

ultraestructurales de los organismos vivos, todos los procesos fisiológicos son

potencialmente deteriorados. Por ejemplo, en la fotosíntesis puede haber inhibición de

traslado de energía dentro del centro de reacción de PS II, el fraccionamiento de agua, o

en la captación de luz. Además, enzimas como Rubisco y ATPasa son altamente

sensitivas a la acción de la radiación UV-B (Bischof et al. 2002). Las consecuencias

comunes de UV-B en la función fotosintética es la disminución o completa inhibición de

la fijación de CO2 y por lo tanto, con consecuencias para la producción primaria. Esto

tiene muchos efectos negativos sobre macroalgas tales como reducción del crecimiento

reproducción y productividad (Dring et al. 1996, Aguilera et al. 1999), inhibición de la

actividad fotosintética, especialmente en especies de aguas profundas (Larkum & Wood

1993, Hanelt et al. 1997, Bischof et al. 1998, Gómez & Figueroa 1998). Sin embargo, los

efectos de la RUVB sobre los organismos que habitan los ecosistemas acuáticos

dependerán fuertemente de las propiedades ópticas de la columna de agua (Holm-

Hansen et al. 1997, Hanelt et al. 2001). Debido a que la irradiación UV que alcanza la

superficie del agua es influenciada por varios factores atmosféricos, tales como; latitud,

altitud, elevación del sol en la estación, hora de exposición en el día, condiciones

climáticas (nubes, niebla), ozono y concentraciones de aerosoles, su incidencia final es

altamente variable (Bischof et al. 2007). Por ejemplo, el hielo marino es probablemente

el factor más importante afectando las algas bentónicas en las zonas polares no solo con

7

respecto a la menor cantidad de luz en invierno (Teixidó et al. 2007), sino también porque

las algas bentónicas sufren un estrés considerable durante el deshielo en la primavera

temprana, cuando ellas son de pronto expuestas a alta radiación solar (Aguilera et al.

2002, Bischof et al. 2002). A su vez en los sistemas costeros la RUVB es fuertemente

atenuada debido a la materia orgánica disuelta (DOM) que es transportada desde los

ecosistemas terrestres (Kirk 1994). Así, las macroalgas de sistemas costeros se

encuentran fuertemente protegidas frente a la RUVB, ya que los blooms fitoplanctónicos,

importe de material desde los ríos, resuspensión de sedimentos, productos exudados por

las macroalgas y acción antropogénica, todos estos factores aumentan la absorción y

dispersión de la radiación en la zona costera superficial (Franklin & Forster 1997). Pero

no todas las algas poseen la protección de la columna de agua, algunas como el fucoide

Sargassum y especies que presentan estructuras de flotación (aerocistos como en

Macrocystis, Nereocystis y Cystosphaera) flotan sobre el mar y pueden ser expuestas por

largos periodos en el día a la radiación solar directa. Hay otras que están expuestas en

lapsos de tiempo cuando baja la marea (Franklin & Forster 1997).

2.2 Sustancias Fotoprotectoras

Todos los organismos fototróficos expuestos a radiación solar han debido adaptarse a

este factor, y lo han incorporado como una parte sustancial de sus ciclos de vida. La

síntesis de una efectiva pantalla contra la RUV contribuye a prevenir el daño directo e

indirecto en biomoléculas esenciales (Bischof et al. 2006, Pavía 1997). Esto puede

también ahorrar energía metabólica al organismo mediante la reducción de la necesidad

8

de activar constantemente mecanismos de protección y reparación (por ejemplo

reparación de DNA dañado vía fotoliasas o mecanismos antioxidantes (Karsten et al.

2009).

Entre las sustancias fotoprotectoras más conocidas se encuentran los

aminoácidos tipo micosporinas (MAAS), que consisten en anillos aminociclohexenos o

aminociclohexeniminas (Karentz et al. 1997) Estos compuestos se encuentran en

algunas microalgas, varias algas rojas (Rhodophyta) y en algunas cianobacterias (Jeffrey

et al. 1999 , Deneb 2001). Estas sustancias, en general, exhiben su máxima absorción

de energía en el rango de la UV-B, sin embargo la mayoría de las más o menos 20 MAAS

que han sido descritas en algas absorben en los rangos de UV-A (Cockell & Knowland

1999, Deneb 2001, Shick & Dunlap 2002). Aparentemente, las MAAS tienen como

propósito la función de un escudo pasivo que disipa la energía de las ondas cortas en

forma de calor inofensivo, sin generar reacciones fotoquímicas (Bandaranayake 1998).

Otros compuestos con propiedades fotoprotectoras son los carotenoides cuyas función

principal es actuar como a un pigmento accesorio y adicionalmente como protección

contra el especies reactivas de oxigeno (ROS) (Cockell & Knowland 1999).

Por último una clase de compuestos que han recibido importante atención de los

ecólogos en las últimas décadas son los taninos. Estos son compuestos fenólicos, que

actúan como defensa química en las plantas, ya sea contra efectos tóxicos directos

(Steinly & Berenbaum 1985) o como mecanismos de protección para la planta. Los

taninos pueden ser divididos en 3 tipos; condensados, hidrolizables y florotaninos. En

9

plantas superiores los taninos condensados se encuentran asociados a la producción de

lignina (Rohner & Ward 1997), los taninos hidrolizables se encuentran en algunas algas

verdes y angiospermas. Por último, un grupo especial de compuestos fenólicos llamados

florotaninos, los cuales han sido extraídos exclusivamente de algas pardas (Ragan &

Glombitza 1986; Waterman & Mole), 1994). Debido a su localización periférica en células

y tejidos de algas, así como su capacidad para absorber en rangos cercano a UV-B, se

los ha incorporado recientemente en el grupo de sustancias fotoprotectoras con posible

función ante altos niveles de UV.

2.3 Principales características de los florotaninos

Los Florotaninos son metabolitos exclusivos de algas pardas (Ragan & Glombitza 1986).

Su función más conocida es como sustancias antiherviboría y antimicrobiana, pero

además se les asocia con otras propiedades tales como adhesión y solidificación de la

pared celular (Schoenwaelder 2002, Amsler & Fairhead 2005). En adición, los

florotaninos absorben radiación UV principalmente UVC y parcialmente UVB con una

máxima de 195 nm y 265 nm (Ragan & Glombitza 1986, Pavia 1997) y poseen una alta

actividad antioxidante (Cruces et al. 2012).

Los florotaninos son dehidro-oligomeros o dehidro-polimeros de floroglucinol. Sus

unidades monoméricas están conectadas mediante enlaces arilo-arilo y el éter diarilo

permiten diferenciar varios subgrupos (Glombitza & Pauli 2003). Cuando los anillos

aromáticos están conectados solo por enlaces arilo-arilo, se llaman fucoles (Fig.1, ii ). Los

floretoles son formados solamente por enlaces éter-arilo (Fig.1, iii ). Fuhaloles se

10

producen cuando unidades de floroglucinol que están conectadas en posición para y orto

con puentes de éter, contienen un grupo OH adicional en cada tercer anillo (Fig.1).

Cuando existe al menos una sección de tres anillos con un elemento de dibenzodioxina

substituido por uno grupo phenoxil en C-4, el grupo es nombrado eckoles (Fig.1 ),

carmaloles son derivados de floroetoles conteniendo un segmento de dibenzodioxin.

Endofucophlorethols e isofuhalols son pequeños, discretos y con grupos especializados

(Fig.1, vi ).

Figura 1. Estructuras de floroglucinol (i) y florotaninos [tetrafucol A (ii), tetrafloroetol B (iii), fucodifloroetol (iv), tetraflorohatol A (v), tetraisofuhalol (vi), florofucofuroeckol (vii)] (modified after Ragan & Glombitza 1986).

11

Se cree que los florotaninos son biosintetizados en la vía metabólica del acetato-

malonato, también conocido como la vía del policétido, en un proceso que puede requerir

la síntesis de un complejo enzima policetido (Arnold & Targett 2002). La biosíntesis de

florotaninos se inicia con dos moléculas de acetil-coenzima A que son convertidas en

malonil co-enzima A (Fig.2 ), a través de la adición de dióxido de carbono. Esto convierte

el grupo acetil-metil en metileno altamente reactivo, esto ayuda al proceso de

polimerización sin que sea necesaria una alta inversión de energía. En pasos avanzados

de la síntesis, el dióxido de carbono, cuál se agregó como un activador, se pierde.

Figura 2 . Combinación de grupos acetato (modificado por Waterman y Mole, 1994).

El resultado de polimerización es una cadena de “policetidos” consistente en una

sección acida y la coenzima se pierde. La cadena del policétido es transformada por

un anillo intermolecular cerrando y eliminando el agua para producir un sistema de

anillo hexaciclico (Fig.3 ). Un tricetido el producto de ciclización, no es estable y así

experimenta una transformación (La tautomerisación) en una forma aromática más

12

estable, el floroglucinol (Fig.3) consistente en tres grupos fenólicos del hidroxil

(Waterman & Mole 1994). Los demás elementos de la biosíntesis son desconocidos.

2.3.1 Localización y funciones de los florotaninos

Los Florotaninos en algas pardas se localizan en estructuras llamadas fisodes, vesículas

rodeadas por membrana, también se acumulan florotaninos en su fracción insoluble

depositadas en la pared celular, las cuáles se acumulan en la periferia del zigoto a

primera hora del desarrollo y es secretado en la pared primaria del cigoto (Schoenwaelder

& Clayton 1998). En la germinación, el fisode se acumula en el rizoide. Los fisodes,

conjuntamente con otros componentes de la pared, contribuyen al desarrollo de la pared

de la celular (Schoenwaelder & Wiencke 2000).

Figura 3. Ciclización de una cadena tricetida para formar floroglucinol, adaptado por Waterman & Mole 1994.

Floroglucinol Tricétido

13

Figura 4 . Microscopía electrónica de transmisión indicando fisodes de algas Laminariales; A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata. De donde salio imagen

Su asignación en el talo de las algas pardas, que concentra las células

metabólicamente más activas en el exterior de las capas epidermales (Tugwell & Branch

1989, Schoenwaelder 2002), concuerda con su rol en la defensa contra diferentes

factores ambientales. Particularmente su fracción soluble secuestrada en estas vesículas

ha sido tradicionalmente asociada con defensa química anti-herbivoría (Steinberg 1989,

Targett & Arnold 1998) y antifouling (Sieburth & Conovert 1965). Sin embargo, tras el

descubrimiento que estos compuestos están formando parte de conjugados en la pared

celular (Strack 1997), se ha conocido ahora que ellos tienen una función estructural

(compuestos primarios) (Schoenwaelder & Clayton 1998).

A) B)

14

Figura 5 . El modelo de un polímero de florotanino siendo enlazado covalentemente a la pared celular vía ácido algínico, basado en Algal Chemical Ecology, Charles D. Amsler 2007

Cuando los fisodes toman contacto con la membrana celular, los florotaninos son

secretados desde las células formando finalmente un complejo con el ácido algínico

(Schoenwaelder & Clayton 1998, Arnold & Targett 2003) (Fig. 5 ). El ácido algínico,

alginatos (polisacaridos carboxilados y sales de ácido algínico), y fucanos (los

polisacáridos sulfatados) comprenden hasta un 40 % del peso seco del talo (Mabeau &

Kloareg 1987, Van den Hoek et al. 1995, Schoenwaelder & Clayton 1998), han sugerido,

basado en estudios microscópicos, que los florotaninos son presumiblemente un

componente estructural integral de la pared celular en algas pardas. Hay pocos datos

cuantitativos sobre la unión de la pared celular (florotaninos acomplejados en la pared

celular) fenoles o sus roles funcionales (Strack et al. 1989, Peng et al. 1991, Viriot et al.

Enlace / Oxidación (Peroxidasa)

15

1993).Una posibilidad es que los compuestos fenólicos están unidos a la pared de la

célula durante la maduración de la planta (Peng et al. 1991).

Los florotaninos tienen un papel putativo en la reproducción de algas pardas,

apareciendo en la superficie de los cigotos recién fertilizados (Schoenwaelder & Clayton

1998) dónde pueden prevenir fertilizaciones múltiples inhibiendo el movimiento de los

espermatozoides. Los florotaninos exudados son también conocidos por ayudar a formar

la barrera del zigoto (Schoenwaelder & Clayton 1998).

La acción como metabolitos secundarios de los florotaninos solubles han sido

ampliamente estudiada especialmente por su importante rol en la protección del talo

contra herbívoros (Geiselman & McConnell 1981, Pavia & Toth 2000), patógenos (Ragan

& Glombitza 1986) y epifitos El contenido de fenoles puede variar debido a una serie de

factores ambientales, tanto abióticos como bióticos. Se ha determinado variaciones

geográficas y estacionales (Rönnberg & Ruokolahti 1986, Targett et al. 1992, Steinberg

1995, Van Alstyne et al. 1999) . También dependen de la concentración de nutrientes

(Yates & Peckol 1993, Hemmi et al. 2004), salinidad (Pedersen 1984) y emersión

(Martinez 1996) y de forma importante, por la presencia de herbívoros (Pavia & Toth

2000). Los contenidos totales de florotaninos solubles son conocidos por variar debido a

los factores medioambientales, también entre especies, genotipos algales y las

poblaciones (Honkanen & Jormalainen 2005).

16

2.4 El rol fotoprotector de los florotaninos ante U V: recientes evidencias

Estos compuestos están involucrados en los mecanismos de fotoprotección y son

particularmente eficientes en contrarrestar los efectos citotóxicos de la radiación UV

(Pavia 1997). En la presente tesis, el rol fotoprotector de los florotaninos es examinado

en función de su asignación a lo largo del talo en respuesta a diferentes tiempos de

exposición a tratamientos de radiación UV.

2.4.1 Los florotaninos en Laminariales: el factor morfo-funcional

En Phaophyceae los mayores niveles de florotaninos se encuentran en fucales y

dictiotales con 20 y 30 % del peso seco del alga respectivamente (Ragan & Glombitza

1986, Targett et al. 1995), sin embargo especies del orden Laminariales (“kelps” ) pueden

contener valores altos (Gómez & Huovinen 2010, Holzinger et al. 2011, Dubois & Iken

2012). En general, estas algas no solo se caracterizan por un gran tamaño sino también

por una gran complejidad morfológica. La separación de funciones metabólicas entre

frondas, estipe y rizoides (Küppers & Weidner 1980) sugiere que estos organismos

asignan diferentes niveles de florotaninos dependiendo de la actividad fisiológica. Por

otro lado una serie de factores endógenos de las algas pueden determinar cambios de

concentración: por ejemplo, diferencias entre individuos, en contenidos de fenoles de

algas pardas han sido demostrados (Tuomi et al. 1989). El tamaño del talo (Denton et al.

1990) y los estadios en el ciclo de vida (Van Alstyne et al. 2001) también juegan un rol en

la acumulación de florotaninos. En términos de su distribución dentro de un individuo,

varios factores parecen cobrar importancia. Por ejemplo el tipo de alga (Targett & Arnold

17

1998, Toth & Pavia 2002), la edad (Pedersen 1984) y el estadio reproductivo del tejido

(Ragan & Jensen 1978). Una especial característica de las algunas Laminariales es que

la actividad fotosintética y el crecimiento están desacoplados estacionalmente para poder

explotar mejor los recursos ambientales (ej, luz, nutrientes) (Hatcher et al. 1977,

Chapman & Craigie 1978) Por otro lado, el patrón de crecimiento y de asignación de

biomasa entre diferentes secciones del talo es muy diferente, por lo tanto, la

concentración de florotaninos (altamente asociada a la síntesis de componentes de pared

celular), será diferente. En términos de su rol morfo-funcional en respuesta a la

herbívoría, ha sido reportado que los florotaninos se localizan mayoritariamente en tejidos

más importantes para el fitness del alga (teoría de la óptima defensa) (Pansch 2009) .

Los florotaninos insolubles se concentran mayoritariamente en zonas que proveen

soporte estructural (estipes y rizoides), confiriendo mayor firmeza y resistencia al talo

(Lucas et al. 2000, Schoenwaelder & Wiencke 2000), Estudios recientes indican que

estadios reproductivos concentran una mayor proporción de florotaninos (Gruber 2011).

En este estudio, se utilizaran 2 especies de algas pardas (Clase Phaeophycea)

Lessonia nigrescenes (Bory, 1926) y Lessonia trabeculata Villouta & Santelices

correspondientes al orden Laminariales). Ya que ellas presentan diferentes

características fotobiológicas (L. nigrescens es una especie intermareal, mientras L.

trabeculata vive a profundidades mayores a 5 m), en la presente tesis se examina la

oportunidad de poder comparar la asignación y concentración de florotaninos en

respuesta a la radiación UV en dos organismos con similar morfología y patrones de

crecimiento. Por ejemplo, en L. nigrescens ha sido establecido claramente que estipes y

18

rizoides, que confieren resistencia al oleaje y sujeción al fondo, son más resistentes a la

radiación UV-B, mientras que las frondas, que actúan como estructuras fotosintéticas

transitorias, son altamente sensitivas (Gómez et al. 2005, 2007). Definitivamente esta

estrategia está enmarcada dentro de la serie de adaptación morfo-funcionales del alga

que le permiten sobrevivir en el ambiente intermareal. Por lo tanto la idea central de esta

tesis es poder definir si la concentración de florotaninos en diferentes partes del talo de

estas especies responde solo a la influencia de UV o si también factores tales como la

estacionalidad del crecimiento y actividad fotosintética son importantes para determinar

el componente morfo-funcional. Por ejemplo, debido a que la actividad de crecimiento

requiere síntesis de florotaninos (los cuales son polimerizados en la pared celular), estos

compuestos varían estacionalmente en respuesta a la actividad de crecimiento.

19

2.5 Hipótesis

� Los florotaninos son inducidos por la radiación UV en L. nigrescens, una especie

intermareal que está expuesta a la radiación UV en el ambiente natural pero no en L.

trabeculata, una especie submareal que raramente está sometida a este factor

� La concentración de florotaninos será mayor en verano y estará asociado a una

necesidad por mayor foto protección y además a un mayor crecimiento en esta

estación del año

� Las partes básales (estipes y rizoides) de Lessonia nigrescens son de importancia

central para la adhesión del alga al sustrato, concentran la mayor biomasa y además

sobrellevan el soporte mecánico para resistir el oleaje. Por lo tanto los florotaninos

estarán más concentrados en dichas estructuras comparados a las frondas.

2.6 Objetivo General

Determinar la concentración de florotaninos solubles e insolubles a lo largo del talo de

Lessonia nigrescens y Lessonia trabeculata, en relación con la estacionalidad, partes del

talo y exposición a diferentes condiciones de radiación UV en el laboratorio.

20

2.6.1 Objetivos específicos

� Determinar la variabilidad en la concentración de florotaninos en diferentes

estructuras del talo (frondas, estipes y rizoides) en L. nigrescens y L. trabeculata.

� Analizar la inducción de florotaninos solubles e insolubles en diferentes partes del

talo de L. nigrescens y L. trabeculata bajo diferentes series experimentales de

exposición con distintos tipos de tratamientos y dosis de radiación UV.

� Examinar si la estacionalidad y la incidencia en la radiación UV en el ambiente

natural, están relacionada con los contenidos relativos de las dos fracciones

funcionales de florotaninos.

21

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 Área de estudio y recolección de muestras

Para este estudio se obtuvieron muestras estaciónales, durante enero de 2007 y junio de

2008 de las macroalgas Lessonia nigrescens Bory y Lessonia trabeculata Villouta &

Santelices , en el sector intermareal y submareal de la costa valdiviana.

En el caso de Lessonia nigrescens las muestras se recolectaron en el sector

rocoso de Curiñanco (39º 49`S; 73º24`W) (XIV, Chile) y Calfuco (39º 46`S; 73º 24`W),

ambos sitios ubicados a 45 y 35 kms de la ciudad de Valdivia, respectivamente (Fig.6 ).

En el caso de la recolección de Lessonia trabeculata, los muestreos se realizaron

mediante buceo autónomo (Scuba) en el sector submareal de la Bahía de Corral, en el

sector de Morro Gonzalo ubicado a unos 12 kms del Puerto de Corral. Estas algas se

ubicaban entre 6 y 8 metros de profundidad. Una vez colectadas, las algas se colocaron

dentro de contenedores con agua de mar, a fin de conservar el alga en óptimas

condiciones hasta su llegada al laboratorio ubicado en el instituto de Biología Marina de

la universidad Austral de Chile.

22

Figura 6. Ubicación geográfica de los sitios de recolección de macroalgas

Valdivia (39°48'30” S, 73°14'30” O)

3.2 Diseño experimental de exposición a radiación U V

Las macroalgas Lessonia nigrescens y Lessonia trabeculata fueron transportadas a la

sala de acuarios del Instituto de Biología Marina y, mantenidas en estanques cilíndricos

de 20 L con agua de mar, a una temperatura de 13°C, salinidad de 30 PSU y aireación

constante (bomba de aire, Superpump Aquarius RS-610). Bajo estas condiciones las

algas fueron aclimatadas durante un período de 24 horas (Fig.7 ) antes de realizar las

respectivas mediciones fisiológicas.

23

Figura 7 . Diagrama proceso de aclimatación de algas recolectadas

Para los experimentos de exposición a la radiación UV, las algas fueron

seccionadas en sus diferentes partes estructurales de forma distinta según la estructura

que corresponda; en láminas la fronda, en hojuela el estipe y en cubos el rizoide (Fig.8).

Estos trozos de algas fueron luego colocados en recipientes de plástico transparente con

2L de agua de mar filtrada y aireación constante.

El sistema de exposición a radiación UV consistió de un set de 2 lámparas (Osram

L36w/640) de radiación PAR (Photosytheticatically Active Radiation), una lámpara Q-

Panel 313 (USA) que emite radiación centrada en UV-B y una lámpara Q-Panel 340

(USA) que emite radiación centrada en UV-A. Se definieron tres diferentes tratamientos

de radiación (Fig. 9 ) usando los siguientes filtros: a) PAR + UV-A + UV-B (PAB);

24

Ultraphan 295 que corta solo UV-C, b) PAR + UV-A (PA); Folex 320, que corta la radiación

bajo los 280 nmc) PAR (P), Ultraphan 400 que corta la radiación bajo de los

400 nm, excluyendo la radiación UV-B y UV-A. Agregar niveles de radiación

Cada recipiente conteniendo las algas y los filtros fueron colocados en un baño

termoregulado a una temperatura de 12-13°C en invierno y 15-16°C en verano. Las

lámparas fueron puestas a una distancia de 15 cm de los recipientes con las algas (Fig.

9). El material para análisis bioquímico y fotosíntesis fue tomado a diferentes tiempos

(inicial 2, 6, 24, 48 y 72 horas), con la finalidad de lograr dosis crecientes de exposición.

A B

Figura 8. Estructura morfológica y partes del talo de A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata.

25

3.3 Análisis Químico de Florotaninos

3.3.1 Extracción y preservación del material biológico

Después de cada intervalo de exposición el material biológico se introdujo dentro de

un termo con nitrógeno líquido (-169 ºC) durante un periodo mínimo de 2 horas, con

el objetivo de inhabilitar su metabolismo evitando cualquier sobreestimación en

nuestra medición.

Las muestran ya diseccionadas se someten a un secado con sílica Gel (mSiO2

nH2O) (Fig.10) (Fig.11 ). Para la mantención de estas muestras se utilizó sílica gel con

indicador azul. Esto significa que mientras la sílica este seca su color será azul, pero

conforme comience a absorber humedad de la muestra esta tonalidad cambiara hacia el

color rosado purpurino. Las muestras y la sílica gel fueron mantenidas en bolsas

herméticas. En el punto en que la sílica gel se encuentra saturada de agua, se cambia la

Figura 9. Esquema del sistema de incubación termorregulado, donde se indica la disposición de los tratamientos (lámparas y filtros) utilizados para la exposición del material biológico.

26

sílica gel de la muestra, esto se repite hasta que el color de la sílica no muestra cambio

indicando que la muestra se encuentra seca y lista para el proceso de molido.

La muestra ya secada en sílica gel (Fig.11), debe ser molida para su posterior

determinación de fenoles (florotaninos), para esto se utiliza el método de criofractura,

consistente en moler las muestras de alga seca con nitrógeno líquido, el cual congela la

muestra y posteriormente con un mortero se fractura, haciendo cada vez más pequeños

los trozos de muestra hasta tener la textura de granos de pimienta. El material es

A) B) C)

A B

Figura 10. Estado de humedad de la sílica gel. A) sílica de indicador azul seca. B) sílica ya saturada de agua.

Figura 11 . Cortes distintivos para cada parte del talo después del proceso de secado en sílica gel. a) Fronda, b) Estipe, c) Rizoide.

27

conservado en tubos de centrifuga (eppendorf 1,5 y 2 ml) y colocados dentro de bolsas

herméticas con sílica gel para su posterior análisis.

3.3.2 Determinación de Florotaninos

Los pocos métodos químicos disponibles para el análisis de florotaninos fueron revisados

hace dos décadas (Ragan & Glombitza 1986). Además, métodos químicos adicionales

para trabajar con florotaninos son raras veces reportados en la literatura. La mayoría

comúnmente, cuantifica los florotaninos en estudios ecológicos con métodos

colorimétricos intentando medir el contenido fenólico total (Amsler & Fairhead 2005). La

falta de métodos de análisis más sofisticados, está mayormente ligado a que los

florotaninos son de naturaleza polar, reactiva, son moléculas grandes o estructuralmente

relacionadas entre sí (Amsler & Fairhead 2005).

El reactivo Folin Denis fue mejorado por Otto Folin y Vintila Ciocalteu haciéndolo

más sensitivo a la reducción por fenoles y menos propenso a precipitar (Folin & Ciocalteu

1927). La primera de esas mejoras fue llevada a cabo incrementando la tasa de

molibdeno tungsteno azul en el reactivo fresco. El problema de la precipitación fue

resuelto por la adición de sulfato de litio (Folin & Ciocalteu 1927). Este análisis Folin-

Ciocalteu (FC) es también menos propenso a la interferencia por compuestos no

fenólicos, y por esas razones ha sido recomendado sobre el método de Folin-Denis

(Waterman & Mole 1994).

28

El método que se utilizó fue el colorimétrico de Folin-Ciocalteau de acuerdo a un

protocolo modificado por Koivikko (2005) y nuevamente modificado por Gómez &

Huovinen (2010). La tinción con el reactivo Folin-Ciocalteu es el método más

comúnmente usado para la medición de fenoles totales, está basado en la utilización del

compuesto fosfotungsteno- fosfomolibdeno como color reactante, el cual puede ser

usado en la determinación de tirosina en proteínas (Folin & Denis 1912a, Folin & Denis

1912b). Este compuesto arroja una coloración azul , cuya absorbancia es leída en un

espectrofotómetro (Scinco, Corea) en la longitud de 730 nm, a fin de obtener mediante

formula la cantidad total de florotaninos en miligramos de floroglucinol por gramos de

peso seco (PS), (mg Phl g-1 PS).

3.3.3 Obtención del extracto

Para la extracción de fenoles, se procede a tomar el material antes almacenado (Fig. 11),

y pesarlo dentro de una gradilla de tubos de ensayo limpios (La cantidad de tubos es

relativa al número de réplicas, en este caso 3 réplicas para igual número de tratamiento

UV (UV-B, UV-A, PAR) y Dosis (inicial, 2, 6, 24, 48, 72 horas); dando un total de 48 tubos.

Para cada tubo se pesa una cantidad determinada de material biológico y se registra el

peso. El peso variará dependiendo la estructura del talo a analizar, ya que si es muy

concentrado (como el caso del rizoide), nos entregaran lecturas erróneas. Por tal razón

se utiliza alrededor de 100-120 mg material biológico para fronda, 50-40 mg para estipe,

40-30 mg en rizoide. La muestra posteriormente se incuba en acetona al 70% a 4 ºC de

29

temperatura durante 24 horas en un shaker refrigerado, luego mediante centrifugación a

3500 rpm por 2 minutos se separarán las dos fracciones supernadante y pellet (Fig.12).

El supernadante constituirá la fracción soluble asociada a los fisodes la cual será

sometida al análisis de florotaninos solubles.

3.3.4 Análisis de florotaninos solubles

El extracto se deja evaporar por alrededor de 2 h en una campana de extracción de gases

a fin de concentrar los florotaninos mediante la evaporación de la acetona. Del extracto

se toma una alícuota de muestra de 500 µl (Fig.13), se le agrega 1ml de reactivo Folin,

2.5 ml de agua destilada y 2 ml de Na2CO3 al 20% (Fig.13). La mezcla se deja reaccionar

en oscuridad durante 45 min hasta que adquiera un color azulado. Las muestras son

centrifugadas a 3000 rpm por 2 minutos a fin de obtener como supernandante la muestra

a medir separándola del pellet el carbonato de sodio, que no interesa en este análisis

(Fig.13 ).

Figura 12. Tubo con extracto listo para análisis

30

Posteriormente se leerá la absorbancia resultante en un espectrofotómetro

(Scinco, Corea) a una longitud de onda de 730 nm correspondiente al complejo folin-

floroglucinol. Para ello se toma una alícuota de la muestra y se introduce en una cubeta

de cuarzo de 10 mm, y se introduce en el espectrofotómetro. La concentración resultante

se expresara en mg Phl g-1 PS

Este análisis se realiza en un mínimo de 3 extracciones por muestra dependiendo

de la concentración de florotaninos que esta posea, siendo lo óptimo obtener en la tercera

extracción absorbancia con valores bajo los 0.100.

Figura 13. Proceso análisis de florotaninos mediante Folin-Ciocalteu. Protocolo modificado por Koivikko et al (2005).

31

3.3.5 Análisis de florotaninos insolubles

El pellet resultante de la centrifugación de los extractos constituye la fracción de

florotaninos insoluble asociados a la pared celular, debido a que la pared celular del alga

contiene varios compuestos que enmascaran a los florotaninos (alginatos, polisacáridos,

etc.) las muestras deben ser tratadas previamente antes de proceder con la

determinación de fenoles. Para ello se realiza una serie de lavados en un shaker durante

15 min a 200 rpm con una batería de alcoholes y diversos compuestos como se detalla a

continuación: lavado 1 vez con metanol, 2 veces con agua destilada, 5 veces nuevamente

con metanol, 2 veces con acetona al 100% y 2 veces con Di-etil-eter. Después de los

lavados, el pellet es secado durante 1 h a 60 ºC en una estufa para posteriormente dejar

incubar 17 horas con Hidroxido de Sodio (NaOH) a 80ºC en un shaker a temperatura

ambiente (Fig 14a). Terminado este tiempo se neutraliza la muestra con ácido fosfórico

y se procede a realizar el análisis de florotaninos según el protocolo de florotaninos

solubles (Fig. 14b).

A) B)

Figur a 14. Determinación de florotaninos mediante el método de modificado por Koivikko (2005) y Gómez & Huovinen (2010). A) Extracto florotaninos incubados en NaOH, B) extractos post método colorimétrico Folín-Ciocalteau

32

Cabe destacar que este análisis se realiza una vez terminado las extracciones que

servirán para la determinación de florotaninos solubles (Fig.14 )

Figura 15 . Instrumental de laboratorio para análisis de florotaninos. A) Termo para Nitrógeno líquido, B) Balanza analítica, C) Shaker refrigerado, D) Vortex,E) Centrifuga F) Espectrofotómetro (Scinco).

A) B) C) D) E) F)

33

3.3.6 Análisis de florotaninos mediante el método colorimétrico. A través de los métodos colorimétricos de Folin-Ciocalteu modificado por Koivikko (2005),

Gómez & Huovinen (2010) y su posterior lectura en el espectrofotómetro se obtuvieron

las absorbancias de los extractos de las distintas series (verano, invierno) de L.

trabeculata y L. nigrescens. La absorbancia a su vez es proporcional a la concentración

de la sustancia a la cual se le efectúa el análisis, en este caso corresponde a la

concentración parcial de fenoles. Para obtener la concentración en miligramos de

floroglucinol (fenoles) por gramos de alga seca, el valor de la absorbancia es introducido

a la fórmula de la ecuación de la curva (Fig. 16). Esta ecuación corresponde a la curva

de calibración realizada con floroglucinol. Las absorbancias son ingresadas junto con el

peso de la muestra en la fórmula de la curva de calibración (Tabla 1), que para este caso

es; y = 19,332x - 0,0416 R2 = 0,99.

Tabla 1 . Curva de calibración de Florotaninos. Expresado en miligramos de floroglucinol correspondientes a cada absorbancia según la dilución correspondiente.

Conc entración

Mg Phl (x)

Absorbancia

(y)

0,1 1,960 0,08 1,492 0,06 1,094 0,04 0,641 0,02 0,299 0,01 0,144 0,005 0,076 0,0025 0,064 0,00125 0,018

34

Figura 16 : Curva de calibración de floroglucinol obtenida mediante el

método colorimétrico de Folin-Ciocalteau modificado porKoivikko (2009).

y = 19,332x - 0,0416R2 = 0,9949

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

35

1.1 Análisis estadísticos

Los datos fueron transformados mediante logaritmo natural, a fin de normalizar los datos

y permitir la utilización del test de análisis de varianza (ANOVA) entre los 3 factores

medidos en el experimento; Estacionalidad, Tratamiento UV y Exposición respecto a la

concentración de florotaninos solubles e insolubles en cada una de las 3 réplicas

analizadas,. La normalidad de los datos se comprobó mediante el test de Kolmogorov-

Smirnov y la homocedasticidad a través del test de Levene. Para el análisis de varianza

se utilizó ANOVA a 2 vías para cada estructura del talo (fronda, estipe y rizoide), de

ambas macroalgas (Lessonia trabeculata y Lessonia nigrescens), para cada serie de

tiempo (Invierno Verano). Las interacciones intra-grupales se realizaron con la prueba

post hoc de Tuckey HSD. Para relacionar las concentraciones de florotaninos solubles e

insolubles, se realizó un análisis de correlación mediante el test de Pearson.

36

4. RESULTADOS

4.1 Concentración de Florotaninos solubles medida e n invierno y verano

4.1.1 Lessonia nigrescens:

4.1.1.1 Frondas

La concentración de florotaninos solubles en las frondas fluctuó entre 3,30 y 6,61 mg phl

g-1 PS, durante las mediciones efectuadas en verano e invierno respectivamente.,

comparativamente mostrando las mayores concentraciones en verano respecto a

invierno (Fig.17 ). La inducción de florotaninos fue baja en invierno y no se observó, en

general, cambios estadísticamente significativos en los distintos tratamientos de radiación

(P = 0,152; Tabla 2 , Fig. 17 A ).

Tabla 2. Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PA y P) y Tiempo de la exposición (0, 2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en extractos de frondas de Lessonia nigrescens medidos en invierno y verano. Los valores son promedio (n=3 ± E.E).

Variable Dependiente Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A) 2 0,43 2,00 0,152

Florotaninos Tiempo (B) 4 8,70 49,19 <0,001

Serie Invierno

A x B 8 1,24 5,74 <0,001

Residual 30 0,21

Total 44 1,18

Tratamiento UV (A) 2 615,85 575,33 <0,001


Serie Verano

A x B 8 96,93 90,55 <0,001 Residual 30 1,07

Total 44 58,83

37

Si se observó una interacción significativa entre el tratamiento UV y el tiempo de

exposición (p< 0,001). Por el contrario, durante verano, los valores fluctuaron fuertemente

entre horas. El análisis de ANOVA revelo que tanto los tratamientos de radiación como

el tiempo de exposición, así como su interacción mostraron un efecto significativo (P <

0,001; Tabla 2 ) (Fig. 17 B ).

Figura 17. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de fronda de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

38

4.1.1.2 Estipe

La concentración de fenoles totales en los estipes durante invierno fluctuó entre valores

máximos cercanos a 7 y mínimos de 11 mg phl g-1 PS (Fig. 18A ), encontrándose

diferencias significativas asociadas al tiempo de exposición y a su interacción con los

tratamientos UV (P<0,001; Tabla 3 ) (Fig. 18 A y 18 B ).

Durante verano, las concentraciones de florotaninos fueron mayores alcanzando

valores máximos cercanos a 20 mg phl g-1 PS (Fig. 18B ). En general los tratamientos de

radiación UV-B y UV-A, así como el tiempo de exposición a estas condiciones afectaron

la concentración de florotaninos solubles significativamente (P<003; Tabla 3).

Tabla 3 . Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamiento de radiación (PAB, PAR y P) y Tiempo de la exposición a radiación (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en estipe de Lessonia nigrescens medida en invierno y verano


Tratamiento UV (A) 2 0,03 7,06 0,003


Serie Invierno

A x B 8 0,09 22,69 <0,001

Residual 28 0,00 Total 42 0,07

Tratamiento UV (A)

2 39,38 58,99 <0,001


Serie Verano

A x B 8 5,06 7,58 <0,001 Residual 30 0,66

Total 44 13,04

39

4.1.1.3 Rizoide

A lo largo del estudio, el rizoide presentó los valores más altos de concentración de

florotaninos solubles, en relación a las otras estructuras analizadas en Lessonia

nigrescens, fluctuando entre 32 y 41 mg phl g-1 PS (Fig. 19 A ). En general, en la serie

invierno solo los efectos de los tratamientos de radiación fueron significativos (P<0,001;

Tabla 4 ).

Figura 19. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

Figura 18. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

40

En verano, al igual que las otras estructuras (fronda y estipe), el rizoide tuvo una

marcada inducción frente a los tratamientos de radiación, presentando una tendencia a

alcanzar sus valores máximos entre las 48 y 72 horas (alrededor de 62,21 mg Phl g-1 PS)

(Fig. 19 B ). En contraste con invierno, el efecto individual del tiempo de exposición y su

interacción con el tratamiento UV fueron significativos (P< 0,05; Tabla 4).

Tabla 4 . Análisis de ANOVA de 2 vías y Test de Tukey sobre los efectos de la estacionalidad tratamiento de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en rizoide de Lessonia nigrescens medidos en invierno y verano. Los valores son promedio n=3 ± E.E.

Durante la serie de verano, la concentración de florotaninos en rizoides aumenta

paulatinamente en el tratamiento PAR, mientras en los tratamientos con radiación UV no

hubo cambios significativos en el tiempo (Fig. 19 B ). Similarmente, la interacción entre

tratamiento UV y tiempo de exposición fue significativo (P <0,001; Tabla 4).


Tratamiento UV (A)

2 830,16 12,42 <0,001

Florotaninos Tiempo (B) 4 162,66 2,43 0,072

Serie Invierno

A x B 8 59,66 0,89 0,535

Residual 27 66,79 Total 41 124,00

Tratamiento UV (A)

2 0,05 3,56 0,041


Serie Verano

A x B 8 0,20 13,49 <0,001

Residual 29 0,01

Total 43 0,06

41

En general las concentraciones en Lessonia nigrescens exhibieron un gradiente a

través de sus estructuras especializadas (fronda < estipe < rizoide). Asimismo se observó

inducción de florotaninos en la mayoría de los tratamientos.

Figura 19. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (mayo de 2007) y B Verano (Enero de 2007.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

42

4.1.2 Lessonia trabeculata

4.1.2.1 Fronda

Los resultados obtenidos indican una alta concentración de florotaninos solubles,

variando entre 4 y 47 mg phl g-1 PS, lo cual es mucho mayor que los valores promedio

medidos en Lessonia nigrescens. En invierno, los cambios entre horas fueron muy

fluctuantes con las mayores concentraciones encontrándose en el tratamiento UV (Fig.

20 A). En este mismo sentido, hubo una interacción entre ambos factores (Tabla 5 ). En

verano, la variaciones entre horas fueron importantes pero en general los valores

máximos fueron menores que en invierno (máximos cercanos a 20 mg phl g-1 PS) (Fig.

20 B). Tanto los efectos de los factores individuales como su interacción fueron

estadísticamente significativos (P<0,001; Tabla 5 )

Tabla 5. Análisis de ANOVA de 2 vías y Test de Tukey en relación al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en extractos de frondas de Lessonia trabeculata medido en invierno y verano. Variable Dependiente Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A)

2 42,07 11,82 <0,001


Serie Invierno

A x B 8 193,42 54,36 <0,001

Residual 30 3,55

Total 44 46,39

Tratamiento UV (A)

2 2,45 1158,35 <0,001


Serie Verano

A x B 8 0,85 402,48 <0,001

Residual 27 0,00

Total 41 0,36

43

4.1.2.2 Estipe

Los florotaninos solubles en los estipes exhibieron una alta concentración en invierno,

con valores máximos cercanos a 42 mg phl g-1 PS pero con fuertes fluctuaciones entre

horas y algunas diferencias entre tratamientos (Fig. 21 A ). En general, la inducción de

florotaninos en los estipes fue afectada especialmente por la interacción entre tiempo de

incubación y tratamiento UV. (P<0,001; Tabla 6 ).

Figura 20. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de fronda de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (Junio de 2008)y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

44

Tabla 6. Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en estipe de Lessonia trabeculata medidos en invierno y verano Variable Dependiente Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A) 2 224,86 18,00 <0,001


Serie Invierno

A x B 8 98,21 7,86 <0,001

Residual 30 12,49

Total 44 38,04

Tratamiento UV (A)

2 54,90 21,72 <0,001


Serie Verano

A x B 8 10,12 4,00 0,002

Residual 30 2,52

Total 44 9,33

Figura 21. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de estipes de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (Junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

45

4.1.2.3 Rizoide

Esta estructura durante la estación de verano presento una baja capacidad de inducción

en comparación a las demás estructuras. La concentración de florotaninos invierno para

tratamiento UV no mostró inducción (Fig. 22 A ) sin embargo las concentraciones fueron

afectadas por la interacción entre el tratamiento UV y el tiempo de exposición (P<0,001;

Tabla 7 ). En verano, se observaron pulsos de inducción, especialmente en el tratamiento

PAB, con valores máximos llegando a 27 mg phl g-1 PS (Fig. 22 B ). El efecto de los

tratamientos de radiación y el tiempo de exposición fue altamente significativo (P: < 0,001)

respecto a las concentración de florotaninos solubles (Tabla 7 ).

Tabla 7 . Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos solubles en rizoide de Lessonia trabeculata medidas en invierno y verano.


Tratamiento UV (A) 2 42,87 15,23 <0,001


Serie Invierno

A x B 8 21,17 7,52 <0,001

Residual 30 2,81

Total 44 12,61

Tratamiento UV (A)

2 43,42 44,47 <0,001


Serie Verano

A x B 8 30,87 31,61 <0,001

Residual 30 0,97

Total 44 17,86

46

4.2 Concentración de Florotaninos Insolubles medidos du rante invierno y verano

4.2.1 Lessonia nigrescens:

4.2.1.1 Fronda

Los resultados muestran que la concentración de florotaninos insolubles en las frondas

medidas en invierno variaron entre 7 y 12,5 mg phl g-1 PS (Fig. 23 A ). Hubo un efecto

conjunto de ambos factores (P < 0,001) mientras el impacto del tratamiento UV no fue

Figura 22. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

47

significativo (Tabla 8). Para la serie de verano, los valores de los florotaninos insolubles

incrementaron principalmente en los tratamientos con radiación UV (Fig. 23 B ). En este

caso, tanto los tratamientos UV como los tiempos de exposición tuvieron efectos

significativos sobre la variabilidad en la concentración de florotaninos insolubles.

Tabla 8 . Análisis de ANOVA de 2 vías respecto del efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de la exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en fronda de Lessonia trabeculata medidos en invierno y verano.


Tratamiento UV (A)

2 0,2 3,76 0,036

Florotaninos Tiempo (B) 4 7,79 145,47 <0,001 Serie Invierno A x B 8 0,86 16,18 <0,001 Residual 27 0,05 Total 41 0,92

2 0,77 136,65 <0,001 Tratamiento

UV (A) Florotaninos

Tiempo (B) 4 0,11 20,31 <0,001 Serie Verano A x B 8 0,04 7,86 <0,001 Residual 28 0,00 Total 42 0,06

48

4.2.1.2 Estipe

En invierno se detectó inducción moderada hacia las 24 y 48 h respecto a la

concentración inicial de florotaninos insolubles (máximo cercano a 6,98 mg phl g-1 PS)

(Fig. 24 A ). El efecto conjunto de los tratamientos de radiación UV y tiempos de

exposición fue significativo (P<0,05) (Tabla 9 ). En verano, los valores de florotaninos

insolubles fluctuaron poco con un promedio cercano a 6,698 mg phl g-1 PS (Fig. 24 B ).

Figura 23. Concentraciones de florotaninos solubles totales medidos en extractos de fronda de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

49

No se detectó un efecto significativo de los tratamientos de radiación ni del tiempo de

exposición durante verano (Tabla 9).

Tabla 9 . Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en estipes de Lessonia nigrescens medidos en invierno y verano.

Variable Dependiente

Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A) 2 0,33 7,32 0,003


Serie Invierno A x B 8 0,58 3,15 0,012 Residual 27 0,62 Total 41 2,78

2 0,04 0,05 0,951 Tratamiento UV

(A) Florotaninos

Tiempo (B) 4 8,66 4,43 0,006 Serie Verano A x B 8 8,26 2,11 0,066 Residual 30 15,65 Total 44 31,63

50

4.2.1.3 Rizoide

Los valores de florotaninos insolubles medidos en los rizoides de Lessonia nigrescens

durante invierno tendieron a disminuir desde 9 a 6 mg phl g-1 PS (Fig. 25 A ), sin embargo

no mostraron diferencias significativas asociadas con la exposición a radiación UV o

tiempo (P> 0,005; Tabla 10 ). En verano, las concentraciones de florotaninos mostraron

mayor variación entre distintas horas de incubación con valores máximos cercanos a 14

mg phl g-1 PS (Fig. 25 B ). En contraste a la situación en invierno, las concentraciones de

Figura 2 4. Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (Mayo de 2007 y B verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

51

florotaninos fueron significativamente afectadas por los dos factores individuales y su

interacción (Tabla 10 ).

Tabla 10. Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en rizoides de Lessonia nigrescens medida en invierno y verano.


Tratamiento UV (A)

2 0,38 0,28 0,753



2 9,02 11,12 <0,001 Tratamiento UV

(A) Florotaninos

Tiempo (B) 4 6,04 7,44 <0,001 Serie Verano A x B 8 8,69 10,72 <0,001 Residual 27 0,81 Total 41 3,65

52

4.2.2 Lessonia trabeculata:

4.2.2.1 Fronda

Las concentraciones de florotaninos en las frondas de Lessonia trabeculata durante

invierno tienden a aumentar en el transcurso de las exposiciones con valores que

incrementan entre 3 y 6 mg Phl g-1 PS (Fig. 26 A ). Durante este periodo, el tiempo de

exposición fue el único factor que afecto la variabilidad de los florotaninos (Tabla 11 ).

Figura 2 5. Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia nigrescens para ambas series estacionales; A invierno (Mayo de 2007) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

53

Tabla 11 . Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en fronda de Lessonia trabeculata medida en invierno y verano.


Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A)

2 0,38 0,59 0,557




(A) Florotaninos Tiempo (B) 4 1,57 4,50 0,006 Serie Verano A x B 8 0,52 1,50 0,197 Residual 27 0,35 Total 44 0,48

54

4.2.2.2 Estipe La concentración de florotaninos insolubles en los estipes no vario sustancialmente en

relación con el tratamiento UV y el tiempo de exposición con valores que varían en

invierno entre 4,5 y 7 mg Phl g-1 PS (Fig. 27 A ). El factor tratamiento UV y su interacción

con el tiempo de exposición fue significativo (P<0.05; Tabla 12 ). En verano, los valores

de florotaninos insolubles fluctuaron alrededor de la media (cerca de 5 mg Phl g-1 PS;

Figura 2 6. Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de fronda de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (Junio de 2008) y B verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

55

Fig. 27 B ). En general, se observó una interacción significativa entre tratamientos UV y

tiempo de exposición en los valores medidos durante este periodo (P<0,001; Tabla 12)

Tabla 12. Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en estipe de Lessonia trabeculata medida en invierno y verano.


Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A)

2 0,38 7,78 0,002

Florotaninos Dosis (B) 4 0,28 0,56 0,692

Serie Invierno

A x B 8 2,07 4,15 0,002

Residual 30 0,49

Total 44 0,92


(A) Florotaninos

Dosis (B) 4 2,42 7,26 <0,001 Serie Verano

A x B 8 1,83 5,5 <0,001

Residual 30 0,33

Total 44 0,85

56

4.2.2.3 Rizoide

Los valores de florotaninos insolubles medidos en rizoides para esta especie variaron en

invierno entre 4,5 y 7 mg Phl g-1 PS (Fig. 28 A ), y aquí los tratamientos de radiación y su

interacción con el tiempo afectaron significativamente la concentración de florotaninos

insolubles en ambas series estacionales (P < 0,001; Tabla 13 ). En el caso de muestras

Figura 2 7. Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de estipe de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.)

57

colectadas en verano, los valores fueron muy similares (entre 4 y 7 mg Phl g-1 PS; Fig.

28 B) y similarmente como en los experimentos de invierno, hubo una interacción

significativa entre ambos factores (Tabla 13 ).

Tabla 13 . Análisis de ANOVA de 2 vías respecto al efectos de los tratamientos de radiación (PAB, PAR y P) y tiempo de exposición (2, 6, 24, 48 y 72 h) sobre la concentración de florotaninos insolubles en rizoide de Lessonia trabeculata medida en invierno y verano.


Factor d.f. MS F P

Tratamiento UV (A) 2 0,06 10,79 <0,001

Florotaninos Dosis (B) 4 0,02 4,75 0,004

Serie Invierno

A x B 8 0,02 4,51 0,001

Residual 30 0

Total 44 0,01

2 2,27 8,65 0,001 Tratamiento

UV (A) Florotaninos

Dosis (B) 4 3,87 14,75 <0,001 Serie Verano

A x B 8 0,78 2,99 0,014

Residual 30 0,26

Total 44 0,77

58

Figura 28. Concentraciones de florotaninos insolubles totales medidos en extractos de rizoide de Lessonia trabeculata para ambas series estacionales; A invierno (junio de 2008) y B Verano (Enero de 2008.) Las determinaciones corresponden a exposición a tratamientos de radiación PAB (PAR+UVB+UVA), PA (UVA+PAR), P (PAR). Valores corresponden a promedio n= 3 ± E.E.).

59

4.3 Patrones longitudinales en la concentración de florotaninos

La asignación de florotaninos mostró variación a lo largo del talo. En el caso de Lessonia

nigrescens, los mayores valores cercanos a 33 y 26 mg Phl g-1 PS, para invierno y verano,

respectivamente, se concentraron en los rizoides (Fig. 29 A ). Hacia estipes y frondas los

valores disminuyen significativamente a valores menores a 10 y 5 mg Phl g-1 PS medidos

en ambas estaciones del año (Fig. 29 A ). Para Lessonia trabeculata, el patrón latitudinal

fue diferente comparado a L. nigrescens. En invierno, los valores mayores se

determinaron en las frondas con valores cercanos a 37 mg Phl g-1 PS, mientras en los

estipes y rizoides los valores fluctuaron entre 24 y 27 mg Phl g-1 PS (Fig. 29 B ). En

verano, el patrón no fue tan claro, ya que las frondas tuvieron muy bajos valores (3 mg

Phl g-1 PS) mientras que los mayores valores se midieron en los estipes (27 mg Phl g-1

PS; Fig. 29 B ). En el caso de los florotaninos insolubles, la variabilidad entre diferentes

partes del talo en ambas especies de Lessonia fue mucho menor que aquella observada

en los florotaninos solubles. En general los valores fueron inferiores a 8 mg Phl g-1 PS y

no se observó un claro patrón longitudinal. (Fig. 31 ).

60

Figura 29. Concentraciones de florotaninos solubles para 3 estructuras del talo (Fronda, Estipe, Rizoide), durante invierno y verano, donde: A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata. Valores corresponden a promedios ± error estándar (n = 3).

Figura 30. Concentraciones de florotaninos insolubles para 3 estructuras del talo (Fronda, Estipe, Rizoide), durante invierno y verano, donde: A) Lessonia nigrescens, B) Lessonia trabeculata. Valores corresponden a promedios ± error estándar (n = 3).

61

4.4 Correlación entre florotaninos solubles e insol ubles

Los florotaninos solubles se correlacionaron en diferente grado con los florotaninos

insolubles (Fig. 31 a 34). En Lessonia nigrescens, los valores de invierno fueron

significativamente correlacionados solo en el caso de los estipes (Fig. 32 ), mientras en

Figura 31. Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia nigrescens determinados en invierno para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

62

Verano, las fracciones de florotaninos medidos en las frondas fueron significativamente correlacionadas (Fig. 32).

Figura 32. Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia nigrescens determinados en verano para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

63

En el caso de Lessonia trabeculata, florotaninos solubles e insolubles no se correlacionaron para ninguna parte del talo ni estación del año (Figs. 33 y 34 ).

Figura 33. Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia trabeculata determinados en invierno para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

64

Figura 34. Correlación entre florotaninos solubles e insolubles de Lessonia trabeculata determinados en verano para distintas estructuras del talo: A) Fronda, B) Estipe, C) Rizoide.

65

5. DISCUSIÓN

5.1 Efecto de la radiación UV sobre la concentració n de florotaninos

El ambiente intermareal es caracterizado por una alta variabilidad en las condiciones

ambientales, lo que hace que los procesos de estrés impacten fuertemente en las

macroalgas. Los resultados de este estudio revelan respuestas frente uno de factores

que mayor daño ocasiona al alga que es el prolongado tiempo de exposición a la

radiación solar.

Para ambas especies el tiempo de exposición y tipo de tratamiento de radiación

tuvieron un efecto interactivo altamente significativo en cada una de las estructuras

(P<0,001). Dentro de los factores individuales, el tratamiento de radiación UV-B+UV-

A+PAR tuvo la mayor incidencia sobre las respuestas fotobiológicas en ambas algas,

pero en general, fueron las frondas de Lessonia nigrescens donde la concentración de

florotaninos solubles aumento significativamente en respuesta a este factor),

aproximadamente 9 veces de aumento en concentración respecto al valor inicial. Esta

tendencia es coincidente con resultados reportados en otros kelps, por ejemplo Alaria

esculenta (Swanson & Druehl 2002). Sin embargo, este nivel de inducción es diferente a

lo encontrado en otras especies tales como Ecklonia radiata y Ascophylum nodosum

(Steinberg 1995, Pavia et al. 1999).

La inducción ocurrió principalmente en la concentración de florotaninos solubles

presentes en frondas de L. nigrescens, lo cual sugiere una alta efectividad de los

66

compuestos al acoplarse perfectamente al periodo de mayor radiación. Durante estos

meses la radiación solar UV-B puede alcanzar valores cercano a 3 Wm-2 durante el

mediodía en Valdivia, mientras los niveles de radiación PAR pueden ser cercanos a 2.500

µmol m-2 s-1 (Huovinen et al. 2006) Por otra parte confirma que los niveles de radiación

usados en las lámparas (2,4 y 8,8 W m-2, para UV-B y UV-A, respectivamente) fueron

capaces de activar los mecanismos de síntesis de estas sustancias en la célula. En el

caso de Lessonia trabeculata, esta inducción no se produjo en ninguna época del año.

Esta especie en general mostró altos valores de florotaninos constitutivamente sugiriendo

que la inducción por la radiación UV-B estaría limitada por la concentración de

compuestos fenólicos presentes en el alga y su jerarquización a través de las distintas

estructuras de ella. Para los florotaninos insolubles en ambas algas no se observó una

tendencia clara sobre el efecto de los tratamientos de radiación, coincidente con los

resultados obtenidos en Lessonia nigrescens por Cruces et al. (2012).

5.2 Efecto de la estacionalidad

En Lessonia, la estacionalidad afecta la fotosíntesis y el crecimiento, donde el

componente luz es el factor limitante regulando la expresión de tales procesos (Gómez

et al. 2005). Un ejemplo de ello es L. nigrescens que según nuestros datos presentarían

una capacidad de fotoprotección durante invierno y verano, pero es durante el verano

donde se gatilla la mayor concentración de compuestos fenólicos en todas sus

estructuras (Gómez & Huovinen 2010). Por ejemplo los resultados muestran un aumento

en verano de 1,5 veces para rizoide y casi 3 veces en su valor máximo de fronda, respecto

67

a sus valores iniciales encontrados en invierno. En contraste, la especie submareal L.

trabeculata, tiende a mostrar concentraciones de compuestos fenólicos que van

disminuyendo desde la época invernal hacia su punto de menor cantidad en verano. Este

comportamiento sugiere que la radiación solar no es el factor central en la dinámica de

los florotaninos en esta especie y por lo tanto, la acumulación de compuestos fenólicos

solubles e insolubles, responden a procesos distintos que los encontrados en L.

nigrescens. Por ejemplo en L. trabeculata se encontró que en los estipes existe una

mayor asignación de compuestos fenólicos durante verano (30,27 mg phl g-1 PS), caso

contrario de lo que ocurre en invierno donde es fronda la estructura con mayor

concentración de compuestos fenólicos (47 mg phl g-1 PS). Por otro lado, la

concentración de florotaninos insolubles presentes en estipe fue mayor durante todo el

año con un aumento no muy apreciable hacia la época estival, correspondiendo a una

alta concentración de compuestos fenólicos en estipe durante todo el año.

Otra característica que es modificada por la estacionalidad, es la rapidez en la

respuesta dado por el tiempo de exposición al estrés de RUV. Si se observa una

estructura representativa como es la fronda, esta estructura muestra diferencias

considerables en el tiempo de respuesta y su magnitud en ambas series de tiempo (Fig

35 A y Fig 35 B ). Por ejemplo, para Lessonia nigrescens medida en verano la mayor

concentración se florotaninos ocurre a las 2 horas (dosis de 17 KJ m-2 h-1) en el

tratamiento UV-B. A este tiempo de exposición a radiación UV-B, la inducción de

florotaninos fue cerca de 8 veces respecto a su valor inicial. Lo mismo ocurre en Lessonia

trabeculata a las 2 horas, aunque con valores de inducción mucho menores (2 veces

68

menor a la concentración de florotaninos de L. nigrescens). Esta dinámica cambia

durante la época de invierno, ya que las respuestas de ambas algas son más lentas y las

mayores concentraciones para el mismo tratamiento UV-B se registran después de 24

horas (dosis UV-B equivalente 207 KJ m-2 h-1), para L. trabeculata y 48 horas (dosis UV-

B de 414 KJ m-2 h-1), para L. nigrescens.

0

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100

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Inicial 2 6 24 48 72

PAB Invierno

PAB Verano

Dosis UV-B

Tiempos de exposición (horas)

Con

cent

raci

ón d

e flo

rota

nino

s (m

g ph

l g-1

PS

)

Dos

is d

e ra

diac

ión

UV

-B (

KJ

m-2

h-1

)

Figura 35 . Efecto de la estacionalidad sobre el tiempo de respuesta y concentración de florotaninos solubles medidos en extractos de fronda expuesta a tratamiento UV-B (PAR+UV-A+UV-B) para A) Lessonia trabeculata y B) Lessonia nigrescens

A B

69

Aunque no fue medido en este estudio, un factor que podría modificar la rapidez

de la respuesta, sería el tipo de composición química del compuesto fenólico medido. De

hecho quizás debido a la gran variedad de tipos de florotaninos, es posible que la

composición cambie estacionalmente y por ejemplo, en verano, puedan dominar formas

con una composición química de mayor reactividad comparada a formas que dominan en

invierno.

La respuesta de corto plazo en ambas algas estaría dentro del proceso de

aclimatación que poseen de manera intrínseca, donde una inducción generaría con

rapidez una alta cantidad de compuestos fenólicos, como una de las diversas respuestas

que poseen como mecanismo defensivo, esto referente a los valores encontrados frente

a la RUV durante la temporada de verano (Fig 17 A y Fig 20 A ). Las diferencias entre

ambas especies podrían estar asociadas al carácter intermareal de Lessonia nigrescens

comparado a L. trabeculata. En este sentido, los ciclos mareales a los cuales está

expuesta L. nigrescens, puede inducir síntesis de florotaninos en periodos más cortos

que los que normalmente ocurren en L. trabeculata, un alga que no está expuesta a esta

variabilidad ambiental. Esto sería similar a las diferencias encontradas entre L.

nigrescens y Durvillaea antarctica para la costa de Valdivia (Cruces et al. 2013). Pero en

ambas algas las respuestas de tiempo más extensos corresponderían a un proceso de

mayor complejidad ligado a una estrategia adaptativa de sobrevivencia frente a una

prolongada exposición a RUV, que incluye probablemente la acción de enzimas y

actividad antioxidante (Cruces et al. 2012). En este sentido, considerando solo el

tratamiento de radiación UV-B durante verano para ambas algas (Fig 36 A y Fig 36 B ),

70

se puede concluir que en Lessonia nigrescens existe una estimulación defensiva respecto

a la radiación solar. Debido a que en tiempos de exposición a RUV prolongados,

(equivalentes a 48 y 72 horas), las concentraciones de florotaninos se mantienen altas y

estables en el tiempo. Por el contrario, Lessonia trabeculata no mantuvo las mismas

respuestas en periodos mayores de exposición durante invierno (Fig 36 A) . Mostrando

concentraciones de florotaninos fluctuantes y sin tendencia para todos los tipos de

radiación (UV-B, UV-A y PAR).

5.3 Diferencias Morfo-funcionales

Las resultados obtenidos a través de la experimentación en ambas algas Lessonia

nigrescens y Lessonia trabeculata, indican que la asignación de florotaninos reflejan

diferentes adaptaciones morfo-funcionales a su respectivo hábitat. En general las

diferencias en contenidos de florotaninos entre diferentes partes del talo confirman

resultados obtenidos en otras especies de algas pardas tales como Laminaria digitata, L.

hyperborea, Sargassum muticum y Ascophyllum nodosum (Connan et al. 2006). Los

resultados obtenidos para L. trabeculata, entregan valores máximos de concentración

para fronda (47mg phl g-1 PS) y estipe (42 mg phl g-1 PS) mucho mayores respecto a

rizoide (22 mg phl g-1 PS) durante invierno y verano. Este comportamiento sugiere que

en esta especie la mayor asignación de compuestos fenólicos en frondas tiene que ver

con una mayor asignación de biomasa en estas estructuras y refleja el menor efecto del

oleaje en el submareal. Otro factor determinante en la priorización de estas estructuras

con altas concentraciones de compuestos fenólicos seria el constante ramoneo de

especies como Cheilodactylus varigeatus que habitan en bosques de L. trabeculata

71

(Vargas & Pequeño 2001) y al efecto mecánico de las corrientes al que está sometida.

Un patrón completamente distinto se observó en L. nigrescens, en donde se muestra una

clara acumulación de florotaninos solubles en los rizoides (33 mg phl g-1 de peso), seguido

de los estipes (14 mg phl g-1 PS), mientras que las frondas llegan a valores cercanos a

3,30 mg phl g-1 PS. Estas concentraciones coincide con estudios anteriores donde se

encontró una mayor biomasa localizada en estipes y rizoide para poder resistir el gran

impacto de la ola y el estrés físico del intermareal rocoso donde habita (Westermeier &

Gómez 1996). Esto obedece claramente a una necesidad mayor del alga por mantenerse

en el sustrato, en donde las zonas basales requieren mayores precursores estructurales

(como lo son los florotaninos), lo que les confiere resistencia mecánica. Por otra parte se

ha reportado que las frondas de L. nigrescens son menos resistentes al estrés solar que

son estructuras transitorias exhibiendo una bajo tolerancia al estrés solar (Gómez et al.

2007).

La concentración de florotaninos insolubles para todas las estructuras presentó

una alta variabilidad en ambas algas, sin ninguna tendencia clara a través de las series

estacionales. Se destaca una mayor concentración presentes en L. nigrescens respecto

a Lessonia trabeculata, con una mayor concentración en fronda durante verano (13 mg

phl g-1 peso seco), que en el resto de las estructuras. Para L. trabeculata cabe resaltar

que es el estipe que muestra una mayor concentración respecto a las demás estructuras,

corroborando probablemente un la asignación de los florotaninos insolubles a la pared

celular (Strack et al. 1988; Peng et al. 1991).

72

La distribución de florotaninos podría ser un rasgo defensivo explicado por la teoría

de defensa óptima (TDO) (Pansch et al. 2009). Dicho modelo ha sido el más

explícitamente testeado en estudios de macroalgas desde hace muchas décadas atrás,

con enfoque en las defensas inducibles y la distribución intraindividual de defensas

(McKey 1979, Rhoades 1979). La TDO predice que las partes de la planta con mayor

valor de importancia para el “fitness” serán altamente defendidas, además de ser una vía

para optimizar el uso del costo defensivo químico, teniendo un incremento inducible en

la producción de estos compuestos como respuesta a la depredación (Tallamy & Raupp

1991, Karban & Baldwin 1997). Para el presente trabajo, por ejemplo, los resultados en

florotaninos solubles de L. nigrescens, apoyan este modelo defensivo, con el aumento de

concentración en las zonas basales, que le otorgan al alga la fijación al sustrato. En una

especie del intermareal rocoso expuesto, la capacidad de resistir el oleaje es fundamental

para el “fitness”, mientras que otras funciones, tales como la reproducción, son alojadas

en estructuras transitorias tales como las frondas. En el caso de la radiación solar, la

estrategia fotoprotectora (o defensiva) apunta a proteger estas estructuras durante la

época de mayor radiación solar, aumentando los florotaninos hasta 8 veces respecto al

valor inicial (Gómez & Huovinen 2010).

Para algas pardas los florotaninos forman parte de todo un conjunto de respuestas

defensivas que además del rol fotoprotector que se ha analizado en el presente estudio,

tienen características antioxidantes contra el estrés ambiental (Mittler 2002, Gómez et al.

2009, Pansch 2009). Por ejemplo el aumento de la radiación UV-B tiene el efecto de

inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (Aguilera et al. 2002), que tienen

un efecto severo en las algas debido a su alta reactividad, causando peroxidación de los

73

lípidos de las membranas biológicas (Fridovich 1986, Asada & Takahashi 1987). Esta

clase de agente oxidante se ha visto que es neutralizada de manera eficiente gracias a

las características antioxidantes de los florotaninos (Cruces et al. 2012).

Los florotaninos insolubles a su vez se podrían relacionar al mismo esquema de

fotoprotección, con un aumento en verano presentando niveles de inducción algo

menores en concentración que los compuestos solubles, pero que evidenciarían una

correlación para algunas estructuras durante ambas estaciones, reaccionando de la

misma manera frente al stress lumínico que los fenoles solubles. Aunque otra posible

respuesta a su alza en verano respecto a invierno, correspondería al complejo que forman

con la pared celular, correspondiendo el alza en su concentración a procesos de

crecimiento del talo esto en ambas algas (Gómez & Huovinen 2010).

En L. trabeculata por otro, lado la asignación de compuestos químicos defensivos

(florotaninos), corresponde el modelo TDO, pero no para radiación UV u oleaje, sino

probablemente para protegerse de la acción de los herbívoros. Esto en parte porque L.

trabeculata no está expuesta a RUV en su ambienta natural y por ende el mecanismo de

foto protección frente a este estrés no estaría desarrollado. Sin embargo, el impacto

asociado a los herbívoros podría explicar mejor la dinámica de los florotaninos en esta

especies (Pansch 2009).

74

6. CONCLUSIONES

� Las respuestas en ambas especies fueron diferentes frente al estrés lumínico.

Lessonia trabeculata mostró concentraciones de florotaninos solubles más altas que

L. nigrescens. Estas diferencias en general se mantuvieron en ambas estaciones

analizadas, sugiriendo que los altos niveles de L. trabeculata son constitutivos. Para

los florotaninos insolubles, aunque se observaron algunas diferencias entre especies,

estas fueron en general menores en comparación a los florotaninos solubles.

� A lo largo del talo, ambas especies mostraron patrones de asignación de florotaninos

diferentes. Mientras en Lessonia nigrescens, los florotaninos solubles disminuyen en

un sentido basal-distal (desde los rizoides hacia las frondas), en Lessonia

trabeculata, el sentido fue inverso, con las frondas acumulando las mayores

concentraciones de florotaninos. Los procesos morfo-funcionales en ambas especies

explican estos cambios: en L. nigrescens, una especie intermareal, rizoides y estipes

deben ser fuertes y resistentes, por lo tanto, la asignación de biomasa (y florotaninos)

es importante. Por el contrario, la naturaleza submareal de L. nigrescens, promueve

el desarrollo de la fronda para potenciar la absorción de luz y maximizar la

fotosíntesis, lo cual podría requerir también de florotaninos para el crecimiento de

esta estructura.

� Ambas especies de Lessonia mostraron diferente respuesta a los tratamientos de

radiación UV. En L. nigrescens las tasas de inducción son superiores y más rápidas

comparadas a L. trabeculata. Estos resultados reflejan también las diferencias en los

75

ecosistemas en que habitan (intermareal). En Lessonia. nigrescens, que habita la

zona intermareal se encuentra en constante interacción con altas dosis de radiación

UV. En L.trabeculata por el contrario concentraciones de florotaninos solubles e

insolubles fueron poco afectados por la radiación UV, lo cual es una respuesta

esperable en una especies que no está normalmente sometida a este factor en su

ambiente natural.

� A un nivel estacional, ambas especies mostraron algunas diferencias en las

concentraciones de florotaninos solubles, los cuales estuvieron relacionados con las

estructuras. Por ejemplo, los rizoides y frondas de ambas especies mostraron mayor

concentración de florotaninos en invierno comparado a verano. En los estipes, no

hubo diferencias importantes. Estos resultados apuntan probablemente a los

requerimientos para crecimiento y sostén de las estructuras, los cuales se intensifican

en invierno.

76

7. BIBLIOGRAFíA

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