ANTECEDENTES GENERALES

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UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN

FACULTAD DE AGRONOMA

PROPAGACIN Y DESCRIPCIN MORFO ANATMICA DE SPHACELE CHAMAEDRYOIDESPOR

JOS MANUEL RUBILAR OCAMPO

MEMORIA PRESENTADA A LA FACULTAD DE AGRONOMA DE LA UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO AGRNOMO.

CHILLN CHILE

2010

UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN

FACULTAD DE AGRONOMA

PROPAGACIN Y DESCRIPCIN MORFO ANATMICA DE SPHACELE CHAMAEDRYOIDESPOR

JOS MANUEL RUBILAR OCAMPO

MEMORIA PRESENTADA A LA FACULTAD DE AGRONOMA DE LA UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO AGRNOMO.

CHILLN CHILE

2010Aprobada por:

Profesor Asistente, Anglica Urbina P.

____________________

Licenciada en Biologa.

Gua

Profesor Asociado, Humberto Serri G.

____________________

Ing. Agrnomo, Mg, Sc.

Asesor

Profesor Asociado, Edgar Pastene N.

____________________

Qumico Farmacutico, Mg, Sc.

Asesor

Profesor Asociado, Ral Cerda G.

____________________

Ing. Agrnomo, Mg, Ad y Ec de Empresas. Decano

TABLA DE CONTENIDOS

Pgina

Resumen...................................................................................1

Summary.......1

Introduccin..........2

Materiales y Mtodos............................5

Resultados y Discusin............................9

Conclusiones.....................................26

Referencias..........26

INDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Pgina

Tabla 1Tabla 2Tabla 3Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6Tabla 7Tabla 8Tabla 9Figuras

Tabla 10

Tratamientos de ensayo I (A), estratificacin ms escarificacin con cido sulfrico (H2SO4)..

Tratamientos de ensayo II (B), lixiviacin de inhibidores ms aplicacin de giberelinas....

Tratamientos de ensayo III (C), escarificacin trmica con agua ms estratificacin..

Tratamientos de ensayo IV (D), aplicacin de giberelina..

Propagacin vegetativa (E), aplicacin de cido indolbutrico (IBA)....................................................

Porcentajes de germinacin en ensayo 1: escarificacin con cido sulfrico y estratificacin..Porcentajes de germinacin en ensayo 2: lixiviacin de inhibidores con agua a diferentes temperaturas y aplicacin de giberelina...Porcentajes de germinacin en ensayo 3: escarificacin trmica y estratificacin...Porcentajes de germinacin en ensayo 4: aplicacin de cido giberlico.Imgenes del proceso germinativo de Sphacele chamaedryoides mediante Microscopa Electrnica de Barrido

Resultados de propagacin vegetativa. Porcentajes de enraizamiento

56778

10

1112

1314

25

PROPAGACIN Y DESCRIPCIN MORFO ANATMICA DE SPHACELE CHAMAEDRYOIDES

PROPAGATION AND MORPHO-ANATOMICAL DESCRIPTION Of SPHACELE CHAMAEDRYOIDES

Palabras ndice adicionales: germinacin, dormancia, escarificacin, estratificacin.RESUMEN

Con el propsito de identificar un mtodo efectivo para obtener un alto porcentaje de germinacin y enraizamiento, en semillas y estacas de Sphacele chamaedryoides (Balbis) Briq. y observar los cambios morfolgicos que experimenta la semilla durante el proceso de germinacin, se realiz esta investigacin durante el ao 2009 y 2010 en la Facultad de Agronoma de la Universidad de Concepcin. Se efectuaron cuatro ensayos de germinacin: a) escarificacin con cido sulfrico y estratificacin, b) lixiviacin de inhibidores con agua a diferentes temperaturas ms concentraciones de cido giberlico, c) escarificacin trmica ms estratificacin y d) aplicacin de cido giberlico, en diferentes concentraciones. El mayor porcentaje de germinacin se obtuvo con el tratamiento de escarificacin trmica y estratificacin. Con respecto a la propagacin vegetativa, se realizaron ensayos con diferentes concentraciones de cido indolbutrico (IBA) aplicado a base de las estacas, los mayores porcentajes de enraizamiento se obtuvieron con aplicacin de 1.000 y 4.000 mg L-1 de IBA. Los cambios morfolgicos de la semilla durante el proceso de germinacin se observaron mediante Microscopio Electrnico de Barrido (MEB), estas observaciones permiten identificar caractersticas anatmicas y estructurales.SUMMARYThe aim of this work was to identify an effective method to improve the rate andpercentage of germination and the rooting of seeds and cuttings of Sphacele chamaedryoides (Balbis) briq. Morphological changes experienced by the seed during the germination process also were followed by microscopy. This research was conducted during 2009 and 2010 in the Faculty of Agronomy of the University of Concepcin. Four germination tests were assayed: a) sulfuric acid scarification and further stratification, b) leaching of inhibitors with different water temperatures plus different concentrations of gibberellic acid, c) thermal scarification plus stratification and d) gibberellic acid application at different concentrations. The highest percentage of germination was obtained with thermal scarification and stratification. Vegetative propagation test consisted of different concentrations of indole butyric acid (IBA) applied to the stem base. So, the highest percentage of rooting was obtained with the application of 1.000 and 4.000 mg L-1 IBA. The morphological changes of the seed during the germination process were observed by scanning electron microscope (SEM). These findings allowed identifying characteristics of highly lignified pericarp.INTRODUCCIN

La flora nativa de Chile destaca por su gran riqueza botnica con gneros y especies muy particulares, los que se desarrollaron durante la evolucin sin mucho intercambio de material gentico con sus parientes, debido al aislamiento geogrfico del pas (Vogel, 2000). Esta flora representa un recurso gentico importante, con un alto porcentaje de endemismo de especies y gneros (Massardo y Rozzi, 1996).

Sphacele chamaedryoides, conocida vulgarmente como salvia (Hoffmann et al., 1992), lahuen lahuen (Urbina et al., 1998) o como alhuelahun, pertenece a la familia de las Labiadas y al gnero Sphacele (Montenegro, 2002; Riedemann y Aldunate, 2004), es una familia amplia y cosmopolita (Hoffmann et al., 1992), constituida por hierbas, rara vez por arbustos o rboles (Niembro, 1989). Esta planta es endmica de Chile (Stark, 2009) crece en cerros asoleados de la zona costera entre la V y la X Regin, en suelos pedregosos, con buen drenaje pero con algo de humedad. Es un arbusto ramoso, perenne y redondeado, de crecimiento muy rpido, a partir de semillas, de hasta 2 m de alto por 1.80 m de dimetro. El follaje es bastante denso, las hojas tienen un tono verde-ceniciento (Riedemann y Aldunate, 2004) de 1.5 - 4 cm de largo por 0.5 - 1 cm de ancho (Pea et al., 2000), de forma oblongo-elpticas, pice redondeado y base atenuada, opuestas y decusadas, rugosas y pubescentes. Bordes suavemente crenados, nervadura reticulada y muy notoria (Stark, 2009). Las flores, de unos 2 cm de largo se disponen en verticilos como en todas las especies de la familia Labiadas, cada uno de los cuales presenta de 4 a 6 flores, stas aparecen durante la primavera y comienzos del verano y presentan un color celeste-grisceo (Montenegro, 2002; Riedemann y Aldunate, 2004). El cliz es tubular de 5 spalos y la corola es bilabiada (Montenegro, 2002) compuesta por 5 ptalos fusionados. El fruto es una ncula, madura a fines del verano y contiene una pequea semilla negra (Riedemann y Aldunate, 2004).

La planta, evidencia la presencia de tricomas glandulares, tanto en superficie superior como inferior, adems, en la superficie abaxial existen tricomas dendroides, los que contribuiran a evitar la prdida de agua y otros elementos en la especie (Urbina et al., 1998).

Esta planta chilena, es usada en la medicina popular para tratar enfermedades infecciosas, desrdenes menstruales, y enfermedades inflamatorias (Pastene et al., 2005). Tambin destaca, segn Hoffmann et al. (1992) y Seplveda et al. (1998) su uso como cicatrizantes, y en fricciones en caso de parlisis.

Qumicamente, la planta contiene 0.2 % de aceites esenciales en el cual se han caracterizado 65 substancias voltiles. Entre los compuestos no voltiles presentes, han sido identificados los triterpenos cido urslico y cido betulnico. Tambin se ha aislado la horminona, una diterpenquinona que se encuentra en varias especies de la familia Lamiaceae, su actividad citotxica y antibacteriana ha sido descrita en otros trabajos (Pastene et al., 2005). Segn Montes y Wilkomirsky (1985) los constituyentes basados en las hojas de la planta seran aceite esencial: 7.35 g/kg, con un 3 % de alfa pineno, 3.2 % de beta pineno, 15.2 % de falandreno, 32.4 % de limoneno-eucaliptol, 9.3 % de timol y en menos proporcin linalol, alcanfor, terpineol y borneol.

La germinacin de esta especie, comienza con la imbibicin de agua por parte de la semilla y culmina con la emergencia de la plntula a travs de las cubiertas (Azcon-Bieto y Taln, 1993; Bewley y Black, 1994), pero esto slo ocurre cuando las semillas han madurado y las condiciones ambientales son adecuadas, algunas no germinan hasta pasado un tiempo, incluso si disponen de condiciones ambientales favorables, ya que experimentan un perodo de dormancia (Meyer et al., 1960; Baldini, 1992). La dormancia en las semillas se puede deber a varios factores. Hartmann y Kester (1987), Hess (1980) y Meyer et al. (1960), sealan factores como: impermeabilidad de la cubierta seminal a los gases y agua, cubiertas de semillas duras y presencia de inhibidores de la germinacin. Hartmann y Kester (1987) sealan diversos tratamientos para superar el letargo de las semillas, como escarificacin mecnica con agua caliente y con cido, estratificacin de la semilla a bajas temperaturas, lixiviacin de inhibidores, o combinacin de los anteriores. Tambin sealan tratamientos para facilitar la germinacin, como lo son el uso de hormonas y otros estimulantes qumicos como giberelinas. Cualquiera de los tratamientos anteriores sirve para superar letargos mecnicos, por presencia de pericarpios lignificados. S. chamaedryoides, tambin se puede propagar, mediante reproduccin asexual o vegetativa. Segn Baldini (1992) y Felipe (1999), a partir de porciones de plantas, se obtienen descendencia homognea desde el punto de vista gentico e idnticas a la planta de la que se ha tomado el material de propagacin. La regeneracin por estacas es el medio ms utilizado e importante de propagacin de muchas especies agrcolas y ornamentales (Hartmann et al., 1990; Azcn-Bieto y Taln, 2008).

Existen distintos tratamientos a que se pueden someter las estacas de tallo, con el fin de aumentar la capacidad rizgena. Uno de los ms recomendados es el uso de reguladores de crecimiento para estimular la diferenciacin de races adventicias. Sin embargo, este tratamiento puede slo aumentar la capacidad rizgena, pero no puede crearla. Entre los reguladores de crecimiento el ms utilizado es el cido indolbutrico (IBA), ya que no es txico en un amplio rango de concentraciones para un gran nmero de especies (Baldini, 1992). Segn seala Muoz y Solanes (1983) las concentraciones ptimas de cido indolbutrico (IBA) para promover enraizamiento, varan entre 1.000 y 2.000 mg L-1. Los objetivos de esta investigacin, fueron determinar el tratamiento ms efectivo para promover la germinacin de semillas de S. chamaedryoides, evaluar el efecto de la aplicacin de cido indolbutrico en el enraizamiento de estacas y formacin de callos, y describir los cambios morfolgicos de la semilla en el transcurso del proceso de germinacin.MATERIALES Y MTODOS

El presente estudio se realiz en la Facultad de Agronoma de la Universidad de Concepcin, Campus Chilln, durante el ao 2009 - 2010.

Las nculas de Sphacele chamaedryoides se colectaron en la comuna de Hualqui, Provincia de Concepcin, Regin del Bo - Bo, la primera semana de abril del ao 2009, y la recoleccin del material vegetativo se realiz en el mismo sector, los primeros das de octubre del mismo ao.

GerminacinLas nculas recolectadas se guardaron en bolsas de papel para la posterior realizacin de los ensayos. Previo a esto, pasaron por un proceso de limpieza y desinfeccin con fungicida (Benlate 0.7 g + Captan 1.5 g en 1 litro de agua). Los tratamientos a los cuales fueron sometidas las nculas, para romper la dormancia de las semillas, se describen a continuacin:Ensayo I: Se tomaron 1.200 nculas y fueron sometidas a distintos tratamientos de escarificacin y estratificacin (Tabla 1).Tabla 1: Tratamientos de ensayo I (A), estratificacin ms escarificacin con cido sulfrico (H2SO4).Estratificacin (4oC)Escarificacin con H2SO4 (mg L -1)

0 min10 min20 min30 min

0 dasA 1A 2A 3A 4

15 dasA 5A 6A 7A 8

30 dasA 9 A 10 A 11 A 12

La escarificacin fue de tipo qumica y se realiz utilizando cido sulfrico al 24.2 % por perodos de 0, 10, 20 y 30 minutos. Para esto, se depositaron en un vaso de precipitado agregndoles el cido sulfrico a la concentracin antes mencionada, hasta cubrirlas totalmente. Luego de exponer las nculas al tiempo antes indicado, fueron lavadas con agua destilada durante un perodo de 24 horas para eliminar los posibles residuos.

Despus del lavado, fueron puestas a estratificar por un perodo de 0, 15 y 30 das en placas petri, cubiertas en su interior por papel absorbente hmedo y dentro de una cmara refrigerada a una temperatura de 4 oC en condiciones de oscuridad.Ensayo II: Se tomaron 1.200 nculas y fueron sometidas a tratamientos de lixiviacin de inhibidores con agua a diferentes temperaturas y luego se trataron con diferentes concentraciones de cido giberlico (Tabla 2). Las nculas fueron lavadas con agua a 25 oC y 50 oC, durante 5 minutos, ms un tratamiento sin lavado, para posteriormente ser sumergidas en tres diferentes concentraciones de giberelina. Para esto, las nculas fueron depositadas en tubos de ensayo con 2 ml de solucin de giberelina GA3 (Sigma), a concentraciones de 250, 500 y 1.000 mg L-1, por un perodo de tiempo aproximado de 24 horas, adems de un tratamiento testigo sin aplicacin de giberelinas.

Tabla 2: Tratamientos de ensayo II (B), lixiviacin de inhibidores ms aplicacin de giberelinas.

Lixiviacin de inhibidores (agua)Giberelinas (GA3 Sigma)

0 mg L-1250 mg L-1500 mg L-11.000 mg L-1

-B 1B 2B 3B 4

25 oCB 5B 6B 7B 8

50 oCB 9 B 10 B 11 B 12

Ensayo III: Se tomaron 1.200 nculas y fueron sometidas a diferentes tratamientos de escarificacin trmica con agua caliente y estratificacin a 0, 15 y 30 das (Tabla 3). Para la escarificacin, las semillas fueron inmersas en agua, dentro de un vaso de precipitado a 15, 30, 70 y 100 oC respectivamente. De inmediato, se retiraron de la fuente de calor y se dejaron durante un tiempo de 24 horas en el agua, que se fue enfriando gradualmente. Transcurridas las 24 horas, fueron puestas a estratificar por un perodo de 0, 15 y 30 das en placas petri, cubiertas en su interior por papel absorbente hmedo y dentro de una cmara refrigerada a una temperatura de 4 oC en condiciones de oscuridad.

Tabla 3: Tratamientos de ensayo III (C), escarificacin trmica con agua ms estratificacin.Estratificacin (4 oC)Escarificacin Trmica (agua)

15 oC30 oC70 oC100 oC

0 dasC 1C 2C 3C 4

15 dasC 5C 6C 7C 8

30 dasC 9 C 10 C 11 C 12

Ensayo IV: Se tomaron 1.200 nculas y fueron tratadas con cido giberlico, en concentraciones de 1.000, 2.500 y 5.000 mg L-1, ms un tratamiento testigo sin giberelinas (Tabla 4). Se mantuvo el mismo procedimiento que el ensayo II. Tabla 4: Tratamientos de ensayo IV (D), aplicacin de giberelinas.Giberelinas (GA3 Sigma)

0 mg L-11.000 mg L-12.500 mg L-15.000 mg L-1

D 1D 2D 3D 4

Para los 4 ensayos, una vez listos los tratamientos, las nculas fueron colocadas en placas petri de 10 cm de dimetro, con una lmina de papel filtro y en una cmara de germinacin a 24 oC, a humedad constante y 12 horas alternadas de luz y oscuridad para evaluar la germinacin de las semillas.Se consider la semilla germinada cuando la radcula emergida alcanz 1 mm de longitud.

Descripcin morfolgica de nculas, y cambios observados durante la germinacin de la semilla

Las observaciones morfolgicas de la semilla en el trascurso del proceso de germinacin, se realizaron con nculas maduras, fijadas en glutaraldehido y buffer cacodilato de sodio, por un mnimo de 24 horas, postfijadas en tetrxido de osmio y sometidas a secado de punto crtico. Este material, se mont en portas y se metaliz con oro-paladio y posteriormente se examin con Microscopio Electrnico de Barrido (MEB), en el Laboratorio de Microscopa Electrnica de la Universidad de Concepcin.Las evaluaciones y los registros se realizaron diariamente desde el da 0.Propagacin vegetativaSe utilizaron estacas de tallo leoso de S. chamaedrioydes recolectadas de plantas en ambiente natural. Se emple una cmara de proteccin de 2,4 m 1,6 m y 4 bandejas speedling. El agua fue suministrada de forma manual mediante un pulverizador, dependiendo de las condiciones observadas.

El sustrato utilizado consisti en 2/3 de arena, ms 1/3 de tierra de hoja, material proveniente de la Universidad de Concepcin, Campus Chilln. El sustrato fue esterilizado mediante autoclave a 121 oC por 1 hora, para eliminar semillas de malezas y patgenos. Tabla 5: Tratamientos propagacin vegetativa (E), aplicacin de cido indolbutrico (IBA).cido indolbutrico(mg L-1)

01252505007501.0002.0004.000

E 1E 2E 3E 4E 5E 6E 7E 8

Se confeccionaron 128 estacas de aproximadamente 8 centmetros de largo y 0,4 centmetros de dimetro, y se formaron 8 grupos de 16 estacas, elegidas al azar, estos grupos fueron desinfectados con una solucin acuosa al 0.75 % (v/v) de hipoclorito de sodio por 5 segundos. Una vez secas, fueron depositadas en frascos de vidrio, con cido indolbutrico en diferentes concentraciones, sumergiendo slo la base del material. De los 8 grupos, los tratamientos del 1 al 5 permanecieron en IBA durante las 12 siguientes horas, los otros grupos slo estuvieron en agua. El da del establecimiento, la base del material de los tratamientos 6 a 8, fue inmersa en las concentraciones de cido indolbutrico por 5 segundos para ser transferido en seguida al sustrato de enraizamiento (Tabla 5).

Con el propsito de mantener un control preventivo de enfermedades se realizaron pulverizaciones peridicas con una solucin acuosa de Benlate 0.7 g + Captan 1.5 g en 1 litro de agua. Los parmetros evaluados fueron: porcentaje de enraizamiento y formacin de callo.Diseo experimental y anlisis estadstico

Todos los ensayos de germinacin se realizaron con diseo completamente aleatorio. Los ensayos I, II y III con 12 tratamientos y 4 repeticiones. La unidad experimental fue de 25 semillas por repeticin. En el ensayo de propagacin vegetativa, el diseo experimental fue de bloques completos al azar, con 8 tratamientos y 4 repeticiones, la unidad experimental fue de 4 estacas.

Para determinar diferencias entre tratamientos, se realiz un anlisis de varianza no paramtrico propuesto por Kruskal Wallis (1952), y el procedimiento Conover (1999) (Balzarini et al., 2008).

RESULTADOS Y DISCUSIN

Germinacin Ensayo I: No se observ diferencias significativas en el porcentaje de germinacin entre los tratamientos, mediante el anlisis de varianza. El mayor porcentaje de germinacin obtenido (2 %), fue en el tratamiento con 15 das de estratificacin y sin escarificacin qumica con cido sulfrico (Tabla 6).

El efecto abrasivo del H2SO4 sobre la cubierta seminal de diferentes especies, mejora la aireacin e hidratacin de la semilla, lo que se traduce en una mayor eficiencia del proceso germinativo (Prez y Martnez-Laborde, 1994). Segn Hartman y Kester (1987) la duracin del tratamiento con cido sulfrico depende del tipo de semilla, pudiendo variar desde 10 minutos en algunas especies, hasta 6 horas o ms en otras, y al tratarse de semillas con tegumentos gruesos, los perodos de tratamientos en estos casos son largos. Para esta especie, los tratamientos son destinados a escarificar el pericarpio de las nculas. De acuerdo a los resultados podemos deducir que los tiempos destinados a la escarificacin, posiblemente no fueron los correctos, debido a que el pericarpio de los frutos de S. chamaedryoides est formado por una capa de clulas esclereidas dispuestas en empalizada, constituyendo un factor de latencia importante, dejando en evidencia la impermeabilidad de la semilla. Esto se concluye, ya que las semillas que fueron tratadas con acido sulfrico y el control, no presentaron diferencias de volumen, lo que indica que no embebieron agua. La imbibicin de agua es un fenmeno fsico y puede efectuarse an en semillas muertas (Hartmann y Kester, 1987; Sivori et al., 1980). Tambin es importante destacar, que la accin escarificante del cido sulfrico sobre nculas de la familia Labiatae, vara dependiendo de la especie, esto se fundamenta en estudios realizados por Cabello et al. (1998), en nculas de Lavandula stoechas, en donde obtuvo 83 % de germinacin utilizando cido sulfrico.

Tabla 6. Porcentajes de germinacin en ensayo 1: escarificacin con cido sulfrico y estratificacin. Estratificacin (4 oC)Escarificacin con H2SO4 (mg L-1)

0 min10 min20 min30 min

0 das0 0 0 0

15 das2 0 1 1

30 das0 0 0 0

No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de varianza (P < 0,05).Ensayo II: Al analizar los resultados, se determin que no existen diferencias significativas en el porcentaje de germinacin, segn las diferentes concentraciones de giberelina utilizada para estimular el proceso germinativo, y las distintas temperaturas del agua utilizadas para provocar un lavado de posibles inhibidores presentes en la semilla o en la superficie de la ncula. Los mayores porcentajes de germinacin (3 %) se obtuvieron para los tratamientos con agua a 15 oC ms 250, 500 y 1.000 mg L-1 de giberelina, sumado a estos, el tratamiento 7, en el cual se utiliz agua a 25 oC ms 500 mg L-1 de giberelina (Tabla 7).

En algunos casos, las semillas no germinan, aunque se den las condiciones adecuadas (Jensen-Salisbury, 1988; Prez y Martnez-Laborde, 1994). Segn seala Jensen-Salisbury (1988), una de las principales causas fisiolgicas que pueden determinar la dormancia de las semillas, es la presencia de sustancias inhibidoras en diferentes tejidos de la semilla. Los resultados de este ensayo, permiten deducir la ausencia de estos inhibidores en la semilla y pericarpio, ya que no hubo respuesta al tratamiento de lavado con agua a diferentes temperaturas.

Tabla 7. Porcentajes de germinacin en ensayo 2: lixiviacin de inhibidores con agua a diferentes temperaturas y aplicacin de giberelina.Lixiviacin de inhibidores (agua)Giberelinas (GA3 Sigma)

0 mg L-1250 mg L-1500 mg L-11.000 mg L-1

-0 3 3 3

25 oC0 2 3 0

50 oC1 1 1 1

No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de varianza. (P < 0,05).

Barcel et al. (2001), seala que los tejidos reproductores contienen mayores cantidades de giberelina, sin embargo, el contenido de la hormona vara en relacin con el crecimiento, edad de la planta, floracin, desarrollo del fruto, dormancia y germinacin. Aparentemente las giberelinas se producen cuando se necesitan, ya que en semillas en germinacin hay un aumento brusco al aumentar estas de tamao. Jensen-Salisbury (1988), indica que las concentraciones de giberelina aumentan durante la primavera en semillas latentes, y es posible que participen en condiciones normales para romper el estado de latencia. Barcel et al. (2001) y Sivori et al. (1980), seala que la aplicacin de giberelinas puede romper el perodo de dormancia en semillas, ya que puede sustituir tratamientos de estratificacin, que es donde aumenta el contenido de giberelinas.

Basndose en los resultados anteriores, se puede determinar que la giberelina no pudo penetrar en la semilla, debido a la dureza e impermeabilidad del pericarpio, an cuando se esperaba tener un efecto de escarificacin trmica sobre ste, al realizar lixiviacin de inhibidores con agua a 50 oC.Ensayo III: El anlisis de varianza detect diferencias (P 0,05) entre los tratamientos de este ensayo. El mayor porcentaje de germinacin (65 %), se obtuvo con escarificacin trmica a 100 oC y estratificacin por 30 das (Tabla 8). El efecto abrasivo de la escarificacin trmica, tiene como objetivo, al igual que el cido sulfrico, mejorar la permeabilidad de la semilla y de la ncula, en este caso por medio de lesiones fsicas provocadas por la temperatura del agua, y facilitar por medio de stas segn Prez y Martnez-Laborde (1994), el ingreso de agua y el intercambio gaseoso de la semilla, de modo que el embrin pueda iniciar su actividad metablica.Tabla 8. Porcentajes de germinacin en ensayo 3: escarificacin trmica y estratificacin.Estratificacin (4 oC)Escarificacin Trmica (agua)

15 oC30 oC70 oC100 oC

0 das0 a0 a0 a0 a

15 das0 a0 a0 a0 a

30 das 5 ab 10 b 61 b 65 b

Tratamientos con letras distintas indican diferencias significativas. Test de Conover (P < 0,05).

Los tratamientos 10, 11 y 12 que fueron sometidos a escarificacin trmica con temperaturas de 30, 70 y 100 oC y 30 das de estratificacin a 4 oC, en completa oscuridad, presentaron diferencias en el porcentaje de germinacin con respecto al resto de los tratamientos. Estos resultados fueron obtenidos al final del perodo de estratificacin, sin incidir las condiciones de la cmara de germinacin.

Los resultados anteriormente mencionados, concuerdan con los obtenidos por Berti et al. (2006), quien logr germinar semillas de Luma apiculata estratificando durante 30 das sobre arena estril hmeda a 2 oC, la germinacin comenz a los 28 das, durante el perodo de estratificacin, y al cabo de 30 das alcanz un 80 % de germinacin.

Estos resultados son coherentes con el hecho de que la testa seminal est cubierta por el pericarpio del fruto, fuertemente lignificado, lo que implica una mayor necesidad de que se favorezca la eliminacin de esta estructura para facilitar la germinacin.La luz promueve o inhibe la germinacin de semillas en algunas especies. La inhibicin de la germinacin por la luz se presenta, principalmente, en semillas de especies no domesticadas y de malezas. De este modo, de forma natural, las especies cuentan con un banco permanente de semillas en el suelo que tiende a garantizar su persistencia en condiciones adversas (Salisbury y Ross, 2000).

Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos, confirmando una posible fotoblastia negativa en semillas de S. chamaedrypiodes. Resultados similares obtuvo Cabello et al. (1998), en nculas de Lavandula stoechas, familia Labiatae, las cuales no presentaron germinacin en condiciones de luminosidad.La estratificacin tambin juega un papel importante en la germinacin, provocando un aumento transitorio del contenido de giberelinas y citocinina, con la consecuente disminucin del cido abscsico, estimulando la germinacin.

Todos estos factores en conjunto lograron anticipar el inicio del proceso germinativo.Ensayo IV: Los resultados obtenidos, no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos con 0, 1.000, 2.500 y 5.000 mg L-1 de cido giberlico (Tabla 9).Tabla 9. Porcentajes de germinacin en ensayo 4: aplicacin de cido giberlico.

Giberelinas (GA3 Sigma)

0 mg L-11.000 mg L-12.500 mg L-15.000 mg L-1

0 0 3 2

No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de varianza. (P< 0,Las giberelinas son los reguladores de crecimiento ms utilizados para romper la dormicin de semillas de numerosas especies vegetales (Prez y Martnez-Laborde, 1994). Segn Azcon-Bieto y Talon, (2008), cuando los niveles de giberelina (Gas) endgena son insuficientes, con el tratamiento de giberelina se puede romper la dormancia y promover la germinacin, ya que las Gas suplen los requerimientos de luz y fro que precisan muchas semillas para germinar. En el caso de aadir una giberelina especfica, sta a lo ms coincidir con una de las naturales que tiene la planta. Por tanto, si un proceso no responde a la adicin de giberelina exgena, no puede decirse que no es regulado por giberelinas, pues puede que no se haya aplicado la giberelina especfica que regula el proceso (Barcel et al., 2001).Los bajos porcentajes de germinacin, se deben a la no penetracin de la giberelina a la semilla, debido a la dureza del pericarpio.Descripcin morfolgica de nculas, y cambios observados durante la germinacin de la semilla

Da 0: Las nculas de S. chamaedryoides de forma oval redondeada, presentan tamaos variables, entre 2.5 mm de longitud y 1.2 mm de dimetro, (Figura 1 a), y la semilla de igual forma presenta 2.3 mm de longitud y 1.1 mm de dimetro aproximadamente (Figura 1 b), estos datos se basan en muestreo de 160 frutos.Figura 1. Sphacele chamaedryoides. a. Ncula (B: 500 m). b. Semilla (B: 500 m). c. Excrecencias (B: 100 m). d. Hilo (B: 100 m).

c: cubierta del fruto, d: dimetro, ex: excrecencias, h: hilo, l: longitud.

Las nculas poseen una superficie lisa y muricada, provista de excrecencias ms o menos cilndricas, cortas y endurecidas, las cuales se disponen en forma perpendicular a la superficie de la semilla, sin presentar un patrn de distribucin definido, estas varan entre 10.4 m a 37.9 m de longitud y 8.35 m a 11.4 m de dimetro (Figura 1 c). En la superficie del pericarpio, ms especficamente en la zona polar basal, se observa la zona hilar (Figura 1 d) la cual posee una superficie lisa desprovista de excrecencias, y el hilo, el cual presenta forma lineal, con 270 m de largo y 40 m de ancho, que corresponde a la cicatriz dejada por el desprendimiento del funculo del vulo, al secarse la semilla (Figura 1 d) (Besnier, 1989).Figura 1. Sphacele chamaedryoides. e. (B: 50 m) y f. (B: 100 m). Corte transversal.

cs: cubierta seminal, em: embrin, pe: pericarpio.

En un corte transversal de la ncula, perpendicular al plano de los cotiledones, se distinguen claramente tres estructuras: pericarpio, correspondiente a la pared del fruto, cubierta seminal y embrin (Figura 1, e y f).

El pericarpio presenta 57.1 m de grosor, y est formado por esclereidas de 42.8 m de longitud, las cuales se disponen perpendicular a la superficie de la semilla (Figura 2 a). Dimitri y Orfila (1985), sealan que la testa de semillas que son liberadas por el fruto, y que deben afrontar las exigencias del medio, son gruesas y resistentes, entre las modificaciones que le otorgan dureza e impermeabilidad se encuentra la esclerificacin. En esta especie, las modificaciones antes mencionadas las adquiere el pericarpio, dando proteccin a la semilla. Lo anterior es sealado por Martn et al. (2005) en estudios en nculas de Lycopus L. (Lamiaceae), indicando que la capa en empalizada adquiere gran importancia, ya que confiere cierta dureza a la ncula constituyendo a la proteccin del embrin. Figura 2. Sphacele chamaedryoides. a. Esclereidas (B: 10 m). b. Embrin (B: 500 m). c. Detalle del embrin (B: 200 m). d. Grnulos de almidn (B: 100 m).

co: cotiledn, cs: cubierta seminal, es: esclereidas, em: embrin, g: grnulos de almidn, pe: pericarpio, r: radcula.

El epicarpio evidencia la presencia de mucilago, lo cual es frecuente en numerosas especies de la familia Lamiaceae (Martn et al., 2006), este carcter mucilaginoso queda en evidencia tras la hidratacin del fruto. Martin et al. (2004) y Martn et al. (2006) por su parte, indica que la excrecin de mucilago confiere a nculas de la familia Lamiaceae ventajas de dispersin, fijacin al suelo y germinacin.

La cubierta seminal presenta un grosor aproximado de 58 m, fusionndose con el pericarpio, esto ocurre generalmente con semillas del gnero Lamiaceae.

En un corte longitudinal de la semilla, se observa el embrin, el cual segn la clasificacin propuesta por Besnier (1989), corresponde al tipo folioso espatulado. ste alcanza un tamao de 1.911 m de longitud, donde la radcula mide aproximadamente 665 m y los cotiledones, ambos de igual tamao, rectos ovados, con el borde entero y el pice redondeado, presentan 1.622 m de longitud, mientras que de ancho se observan medidas de 622 m y 933 m de radcula y cotiledones respectivamente (Figura 2, b y c).

El grosor de cada uno de los cotiledones es de 460 m, y estn formados por tejidos parenquimaticos, esponjoso y en empalizada respectivamente. En la Figura 2 d, se distinguen los grnulos de almidn de forma esfrica y superficie regular, con dimetros promedios de 4.2 m. Besnier (1989), indica que los hidratos de carbono constituyen la reserva ms comn en las semillas y, de ellos, el almidn es la forma en que aparece con ms frecuencia, acumulndose en los cotiledones en forma de granos cuyo tamao y forma son bastante tpicos para cada especie.

Figura 2. Sphacele chamaedryoides. e. Detalle de radcula y micrpilo (B: 200 m). f. Corte longitudinal mostrando funculo y arilo (B: 50 m).

a: arilo, co: cotiledn, cs: cubierta seminal, f: funculo, mi: micrpilo, pe: pericarpio.

En la Figura 2 e, se puede apreciar la superficie lisa del dermatgeno y el micrpilo, sobre el pice de la radcula, mostrndose como una abertura que interrumpe la capa de esclereidas y los respectivos tejidos hacia el interior de la semilla.

En otro corte longitudinal se puede observar al funculo y el arilo. El primero de 196 m de longitud y 153 m de dimetro, y el arilo, que corresponde a una excrecencia del funculo, o del tegumento exterior, presenta 166 m de dimetro y 130 m de ancho aproximadamente (Figura 2 f).Da 1 10: La semilla incrementa su volumen, el embrin aumenta de tamao a 2.590 m, correspondiendo 2.295 m a la longitud de los cotiledones y 763 m a la longitud de la radcula, en el undcimo da. El ancho, tanto de los cotiledones como del eje hipoctilo radcula, aument a 1.113 m y 818 m respectivamente (Figura 3, a y b). Figura 3. Sphacele chamaedryoides. a. Embrin (B: 500 m). b. Detalle de radcula (B: 100 m). c. Ruptura de la cubierta seminal (B: 200 m). d. Detalle cotiledones (B: 200 m). co: cotiledn, cs: cubierta seminal, de: dermatgeno, em: embrin, gl: glndulas, pe: pericarpio, ps: parnquima esponjoso, pp: parnquima en empalizada, pg: pelos glandulares, r: radcula.

Hartmann y Kester (1987) y Dimitri y Orfila (1985), indican que el embrin y el tejido de reserva se hinchan por la imbibicin de agua, se diluye el protoplasma celular activndose las funciones que se traducen en el crecimiento de la plntula. Estos acontecimientos indican que la germinacin ha comenzado. Al duodcimo da la cubierta seminal y el pericarpio comienzan a romperse en el extremo polar basal de la semilla, y en forma paralela al plano de los cotiledones.

Da 11 20: La ruptura de la cubierta seminal y el pericarpio contina extendindose, debido al aumento de tamao del embrin, identificndose epicarpio, mesocarpio y endocarpio. De igual manera, se aprecia parte de la cubierta seminal (Figura 3 c).

Figura 3. Sphacele chamaedryoides. e. Cotiledones (B: 200 m). f. Radcula emergiendo de la semilla (B: 500 m). ps: parnquima esponjoso, pp: parnquima en empalizada, pg: pelos glandulares, r: radcula.

En un corte transversal, realizado el da 11 se observan los cotiledones, en stos se aprecia el parnquima en empalizada con tres capas de clulas alargadas perpendiculares a la superficie adaxial, y el parnquima esponjoso, situado hacia la superficie abaxial del cotiledn, este ltimo est conformado por clulas polidricas irregulares, las cuales no presenta disminucin en el material de reserva (Figura 3 d), en un mismo tipo de corte, realizado el da 19, se puede apreciar claramente la disminucin del material de reserva en clulas del parnquima esponjoso permitiendo medir dimetros de 13.7 m aproximadamente para este tipo de clulas (Figura 3 e). Es posible observar la superficie lisa con presencia de glndulas y pelos glandulares en la superficie abaxial y adaxial del cotiledn (Figuras 3, d y e). A partir del da 19, la cubierta seminal y el pericarpio se rompe completamente generando una fractura que se extiende desde el polo basal hacia el opuesto de ste, dejando visible la primera parte del embrin, el extremo de la radcula, la cual presenta un dimetro de 584.4 m. Es de forma redondeada sin presencia de excrecencias ni glndulas (Figura 3 f), la cual inicia su crecimiento para convertirse en la raz primaria y pone fin al proceso de germinacin (Bewley y Black, 1994 y Dimitri y Orfila, 1985).Figura 4. Sphacele chamaedryoides. a. Raz primaria (B: 1 mm). b. Hipoctilo (B: 200 m). c. Pelos radicales (B: 500 m). d. Embrin (B: 1 mm).

pg: pelos glandulares, pr: pelos radicales, rp: raz primaria, hp: hipoctilo.

Da 21 30: A partir del da 22, el embrin aumenta rpidamente de tamao, con una notoria diferencia entre la raz primaria y el hipoctilo, los cuales presentan 3.6 mm y 2.2 mm de longitud respectivamente (Figura 4 a). El hipoctilo contina aumentando su longitud y dimetro, provocando un aumento de la ruptura del pericarpio y cubierta seminal, por donde saldrn los cotiledones (Figura 4, b y c). Tambin es posible apreciar la superficie lisa con clulas alargadas y la presencia de pelos glandulares en el hipoctilo, y una gran cantidad de pelos radicales en la zona pilfera.

A partir del da 24, el embrin alcanza 9.8 mm, acentuando la diferencia entre la raz primaria y el hipoctilo, los cuales presentan 4.5 mm y 3.3 mm de longitud respectivamente (Figura 4 d). Los cotiledones y el eje hipoctilo radcula presentan un dimetro de 2 mm aproximadamente.Figura 4. Sphacele chamaedryoides. e. Zona pilfera y caliptra (B: 1 mm), f. Corte transversal de la raz (B: 100 m).ca: caliptra, ci: cilindro vascular, cx: crtex, er: epidermis, hp: hipoctilo, pr: pelos radicales, zp: zona pilfera.

En la radcula alargada que conforma la raz primaria, perfectamente diferenciada, se distingue la zona pilfera con abundantes pelos radicales y la caliptra (Figura 4 e). En un corte transversal de la raz, especficamente en la zona pilfera se distingue el cilindro vascular, el crtex y la epidermis, con detalle de los pelos radicales (Figura 4 f).

Los cotiledones presentan una superficie lisa, con clulas de forma regular y una notoria diferencia entre una y otra, presentando gran cantidad de glndulas en la superficie abaxial (Figura 5 a). A los 29 das aproximadamente, el embrin se desprende de la cubierta seminal (Figura 5 b), permitiendo distinguir claramente entre sta y el pericarpio (Figura 5 c). La fractura slo ocurre en el sector polar basal de la semilla, permitiendo salir cotiledones y dejando intacta el resto de la cubierta seminal, aprecindose la forma polidrica regular de sus clulas, comenzando de esta forma la etapa de plntula.Figura 5. Sphacele chamaedryoides. a. Cotiledones (B: 500 m). b. Cavidad dejada por la salida del embrin (B: 500 m). c. Detalle cubierta seminal y pericarpio (B: 100 m). d. Primordios foliares (B: 1 mm).

co: cotiledn, cs: cubierta seminal, cv: cavidad, gl: glndulas, pr: pelos radicales, pg: pelos glandulares, pe: pericarpio, tr: tricomas, pf: primordio foliar, ei: epictilo, hp: hipoctilo.

Da 31 40: A los 33 das aproximadamente, el epictilo tiene una longitud de 0.73 mm y 0.3 mm de dimetro, en el brote se observan primordios foliares de 0.9 mm de longitud, los cuales presentan borde crenado, y nervadura reticulada, acompaados de tricomas y clulas glandulares bien desarrolladas, presentes slo en stos. Tricomas de longitud 0.03 mm se encuentran presentes tanto en los primordios como en el epictilo. En tanto el hipoctilo presenta pelos y tricomas glandulares en toda su superficie (Figura 5 d). Los cotiledones presentan pelos glandulares en la cara abaxial y adaxial (Figura 6 a), estomas slo en la superficie abaxial, estos poseen 29 m de largo por 25.5 m de ancho aproximadamente con clulas oclusivas muy notorias, presentando un complejo estomtico anomoctico (Figura 6 b).Figura 6. Sphacele chamaedryoides. a. Estomas y pelos glandulares (B: 50 m). b. Detalle de estomas (B: 10 m). c. Primordios foliares (B: 500 m). d. Tricomas dendroides y glandulares (B: 100 m). et: estoma, pg: pelo glandular, tr: tricoma, tg: tricoma glandular, td: tricoma dendroide.

A los 34 das aproximadamente, el primer par de hojas se extiende alcanzando 1.4 mm de longitud (Figura 6 c). Estas observaciones indican que la planta es fotosintticamente activa, y que ha iniciado su fase juvenil (Hartmann y Kester, 1987).

Segn Riedemann y Aldunate (2004), S. chamaedryoides alcanza 50 cm de crecimiento a partir de semillas el primer ao. En este estado, podramos observar la presencia de tricomas glandulares y dendroides. En las siguientes fotografas se pueden apreciar estas estructuras sobre el nervio central de la hoja (Figura 6, d, e y f).Figura 6. Sphacele chamaedryoides. e. Detalle de tricomas (B: 20 m) f. Ubicacin de estomas en la hoja (B: 10 m). et: estoma, tg: tricoma glandular, td: tricoma dendroide.

Propagacin vegetativaAl analizar la Tabla 10, se puede apreciar que no hubo efecto del cido indolbutrico aplicado, sobre el enraizamiento de estacas de S. chamaedryoides, ya que no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, segn anlisis de varianza. Los mejores resultados de enraizamiento (25 %) se obtuvieron con 1.000 y 4.000 mg L-1 de cido indolbutrico (IBA).

Se puede apreciar que existi una capacidad natural de enraizamiento de un 6,25 % en las estacas, sin aplicacin de hormona. Esto indica que el nivel endgeno de promotores de enraizamiento no sera un factor limitante en la rizognesis. Resultados similares apreci Cornejo (1997), en propagacin vegetativa en olivo, donde obtuvo un 5 % de capacidad natural de enraizamiento, sin la aplicacin de IBA.Estos resultados son similares a los informados por Palma (2001), quien realiz ensayos, para inducir enraizamiento de estacas de plantas femeninas de maqui, empleando cuatro concentraciones de AIB (0, 1.000, 2.000 y 4.000 mg L-1). Al analizar los resultados, concluy que el mayor porcentaje de enraizamiento (36.6 %) se obtuvo con aplicacin de 1.000 mg L-1 de IBA. De igual manera, Cornejo (1997) en propagacin vegetativa de olivo, obtuvo sus mejores resultados (70 % de germinacin) al someter las estacas a una concentracin de 4.000 mgL-1 de cido indolbutrico.Tabla 10. Resultados de propagacin vegetativa. Porcentajes de enraizamiento

(%).

cido indolbutrico (mg L-1)

01252505007501.0002.0004.000

6,256,2512,5002518,725

No se presentan diferencias significativas mediante anlisis de varianza. (P< Segn Hartmann y Kester (1987), los factores que afectan el enraizamiento de estacas son muy numerosos, ya que influyen caractersticas fisiolgicas, morfolgicas y genticas, junto a condiciones ambientales. El estado nutricional del material pudo haber influido directamente en el porcentaje de enraizamiento, ya que las estacas no fueron uniformes, variando los dimetros de estas entre 0.2 y 0.7 cm y por tanto obtenindose estacas con diferentes suministros de carbohidratos. Otro factor mencionado por Baldini (1992), corresponde a la poca de recoleccin del material, indicando que estacas colectadas en otoo enrazan mejor que aquellas recolectadas en invierno. Las estacas utilizadas en este trabajo, se recolectaron en primavera, siendo esta una posible razn de la obtencin de resultados insatisfactorios de enraizamiento, por lo cual se recomendara otra fecha de recoleccin.No fue posible evaluar la formacin de callos en las estacas, debido a que no hubo resultados. Con frecuencia, el proceso de rizognesis puede venir acompaado de la formacin de callo, pero la presencia de este, no tiene influencia sobre el proceso mencionado (Baldini, 1992; Hartmann y Kester, 1987). Muoz y Solanes (1983), sealan que las estacas tienen la capacidad de formar callo, siempre y cuando sean recolectadas en la poca oportuna. Por lo tanto la ausencia de callo podra deberse a la fecha no adecuada de recoleccin del material, reafirmando lo indicado por Baldini anteriormente.

CONCLUSIONESLos resultados de la presente investigacin permiten concluir que:1. Los tratamientos donde se utiliz escarificacin trmica entre 70 y 100 oC, y estratificacin a 4 oC, sin luz, por 30 das, fueron los ms efectivos para interrumpir la dormancia de semillas de S. chamaedryoides, ya que se logr un porcentaje de germinacin entre 61 y 65 %.

2. Los bajos porcentajes de germinacin en la mayora de los tratamientos son producto de un letargo mecnico, producto del pericarpio lignificado que presentan las nculas.

3. Mediante las observaciones realizadas en Microscopia Electrnica de Barrido, se pudo identificar caractersticas de clulas esclereidas, las que conforman el pericarpio lignificado.

4. En los tratamientos de propagacin vegetativa, la aplicacin de IBA no tuvo efecto en el enraizamiento de estacas, ni en la formacin de callos en S. chamaedryoides. REFERENCIAS1. Azcn-Bieto, J. y M. Taln. 1993. Fisiologa y bioqumica vegetal. Interamericana / McGraw-Hill. Madrid, Espaa.

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