Theorie der molekulargenetischen RH-Bestimmung · Theorie der molekulargenetischen RH-Bestimmung Molekulargenetische RH-Bestimmung in der Schwangerschaft 20. März 2007 in Kiel Tobias

T. Legler 20.03.07

Theorie der molekulargenetischen

RH-Bestimmung

Molekulargenetische RH-Bestimmung in der Schwangerschaft20. März 2007 in Kiel

Tobias J. LeglerAbteilung Transfusionsmedizin, Universitätsmedizin Göttingen

Zertifiziert nach DIN ISO 9001:2000

T. Legler 20.03.07

1. Molekulargenetik von RH, weak D, Partial D

2. RHD-Zygotie

3. Klinische Bedeutung der molekulargenetischen Blutgruppenbestimmung und Indikationsstellung

4. Keine Besprechung von Bandenmustern

5. Fetale RHD-Bestimmung aus mütterlichem Blut

T. Legler 20.03.07

Erythrozytäre Blutgruppensysteme

= Oligosaccharide = Peptidketten

ABOABO

Duffy

Kell

MN

Ss

Rh Kidd

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Meilensteine in der Molekulargenetik1990 Avent ND et al.: cDNA cloning of Rh CcEe

1992 Le Van Kim C, et al.: cDNA cloning of RhD

1993 Lo YM, et al. Prenatal determination of fetal RhD status byanalysis of peripheral blood of rhesus negative mothers (cells).

1994 Chérif-Zahar B et al.: Organization of the gene (RHCE)

1995 Rouillac C, et al.: Transcript analysis of D categoryphenotypes predicts hybrid Rh D-CE-D proteins

1996 Poulter M et al.: Reliable C/c typing method

1997 Gassner C et al.: RHD/CE typing by polymerase chainreaction using sequence-specific primers

T. Legler 20.03.07

1998 Faas BH et al. and Lo YM et al.: Detection of fetal RHD-specific sequences in maternal plasma.

1999 Wagner FF et al.: Molecular basis of weak D phenotypes

2000 Okuda H et al. Complete sequence RHD and RHCE

2000 Singleton BK et al.: Pseudogene RHDψ

2000 Wagner FF and Flegel WA: RHD gene deletion occurredin the Rhesus box.

2001 Wagner FF et al.: RHD positive haplotypes in D negative Europeans

2002 Shao CP et al.: Molecular basis of DEL and D-negative in Chinese

T. Legler 20.03.07

Rh-Blutgruppensystem

– RhD Protein, • wenn vorhanden, Individuum Rh-

positiv (D+), ca. 83% unserer Bevölkerung

• wenn nicht vorhanden, Individuum Rh-negativ (dd), ca. 17% unserer Bevölkerung

– RhCcEe Protein,• exprimiert die Antigene C oder c sowie

E oder e

T. Legler 20.03.07

Evolution der RH GenfamilieWagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occourred in the Rhesus box

Blood 95:3662-8 (2000)

Chromosom 1p34-p36RHCESMP1

vor 5-12 Mio Jahren

RHCESMP1RHD

T. Legler 20.03.07

Rh-System (CcD.ee bzw. CDe/cde)

Chromosom 1RHCERHD

D Ce CDe

cdeChromosom 1

d

RHCE

ce

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T. Legler 20.03.07

Schwache D-Phänotypen

D-Varianten

weak D (früher Du) Partial-D

D-Kategorie DFRDBTDHar

.....

DEL

„Partial DEL“

„weakDEL“

T. Legler 20.03.07

82,7

0,44 0,016

17,3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Häu

figke

it (%

)

D+ weak D D VI D- incl. DEL

Häufigkeit schwacher D-PhänotypenWagner et al. Infusionsther Transfusionsmed 1995;22:285

T. Legler 20.03.07

Weak D (Typ 1-53): Intrazelluläre AS

Avent und Reid: Blood 2000;95:375-387Legler TJ, Maas JH et al., Transfusion 1998;38:434-40Wagner FF, et al. Blood 1999;93:385-393, Wagner FF, et al. Blood 2000;95:2699-708

T. Legler 20.03.07

Punktmutationen bei Partial-D Phänotypen: Extrazelluläre AS

Avent and Reid: The Rh blood group system: a review. Blood 2000;95:375-387

Körmöczi GF, Legler TJ, et al. Molecular and serological Characterization of DWI,a novel "high grade" partial D. Transfusion 2004;44:575-580.

T. Legler 20.03.07

Genumlagerungenim RH System

Avent and Reid: The Rh blood group system: a review. Blood2000;95:375-387

Legler TJ, et al. DVa-category phenotype and genotype in Japanesefamilies. Vox Sang 2000;78:194-197.

T. Legler 20.03.07

D-negativer Phänotyp

D-negativ

RHD-Deletion RHD positivnicht exprimiert

RHD-RHCE-RHDHybridallele

Stopp-CodonFrame-ShiftSplice-SiteMissense

DEL

„Partial DEL“

„weakDEL“

T. Legler 20.03.07

RHD Allele bei D-negativen Individuen

Europäer1 1:1.536

Schwarze in Afrika2 82%

Chinesen3 24-40% (+DEL)6,4% (-DEL)

1 Wagner FF, et al.: BMC Genetics 2001;2:102Singleton BK et al.: Blood. 2000; 95: 12-8.3Shao Vox Sang 2002;83:156-161.

T. Legler 20.03.07

RHD ψSingleton BK et al.: Blood. 2000; 95: 12-8.

T. Legler 20.03.07

Ccdes

Faas et al. Transfusion 1997; 37:38-44

D-negativ, VS positiv (schwaches C, schwaches e)

RHD-Gen codiert C, Hybrid Exon 3 (RHD-CE(4-7)-RHD)

RHCE Gen codiert ce

Rh-Formel serologisch: dd (C)c ee

Molekulargenetisch: C-Reaktion von RHCE negativc-Reaktion von RHCE positivCdes-Reaktion positiv

T. Legler 20.03.07

DEL

RHD (IVS3+1G>A)

Wagner FF, Frohmajer A, Flegel WA: RHD positive haplotypes in D negative Europeans. BMC Genetics 2001;2:10

Shao CP, Maas JH, Su YQ, Köhler M, Legler TJ. Molecular background of Rh D-positive, D-negative, Del and weak D phenotypes in Chinese. Vox Sang 2002;83:156-161.

Wagner T, Körmöczi GF, Buchta C, Vadon M, Lanzer G, Mayr WR, Legler TJ. Anti-D immunization by DEL red blood cells. Transfusion 2005;45:520-526.

Körmöczi GF, Gassner C, Shao CP, Uchikawa M, Legler TJ. A comprehensive analysis of DEL types: Partial Del individuals are prone to anti-D alloimmunization. Transfusion 2005;45:1561-1567

RHD (K409K)(M295I)RHD

T. Legler 20.03.07

Häufige D negative RHD-Allele

RHD ψ

RHD-CE(3-7)-RHD

RHD (K409K)

RHD-CE(2-9)-D

T. Legler 20.03.07

Rhesus boxWagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occourred in the Rhesus box

Blood 95:3662-8 (2000)

RHCESMP1

hybrid Rhesus-box

upstream Rhesus-box downstream Rhesus-box

RHCESMP1RHD

T. Legler 20.03.07

Homologie und Nachweis der Hybrid Rhesus box

hybrid Rhesus box

downstream Rhesus box

upstream Rhesus box

identity region 1463 bp

TTTT

TTTT rnb31

rnb31

rez7

rez7

rez7

Pst

PCR-RFLP,Wagner und FlegelBlood 2000;95:3662-3668

hyb2-U

hyb2-U

hyb2-L

hyb2-L

PCR-SSP, Chiu et alClin. Chem. 2001;47:667-672

PCR-SSP + IPC, Perco et al.Transfusion 2003;43:335-359

u1-s

u1-s

T. Legler 20.03.07

Anwendungen der molekulargenetischen Rh-Bestimmung in der Schwangerschaft

Abklärung serologisch schwacher Reaktionen bei Schwangeren (und Neugeborenen)

Bestimmung der D-Zygotie bei Partnern von Anti-D immunisierten Frauen

D-Status des Feten bei Anti-D immunisierten Schwangeren

T. Legler 20.03.07

Molekulargenetik zur Entscheidung über Rh-Prophylaxe

Schwangere D-negativ: kann Anti-D bilden

D-positiv: bildet kein Anti-D

Fetus/Neugeborenes

D-negativ: ist nicht immunogen

D-positiv: ist immunogen

Rhesus-Immunisierungsregister: http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/RIR/Die Rhesus site http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/W. Flegel and F.F. Wagner

Serologisch schwacheoder unklare Reaktionen

Zygotiebestimmung

Pränataldiagnostikbei MHN

T. Legler 20.03.07

Molekulargenetik zur Entscheidung über Rh-Prophylaxe


Zygotiebestimmung


Schwangere mit serologisch schwachem D solltenbei weak D Typ 1-3 keine Rh-Prophylaxe erhalten, beianderen D-Varianten ist die Rh-Prophylaxe sinnvoll.

Bei Neugeborenen sollten serologische Methodenverwendet werden, die auch sehr schwache D-Variantenerfassen.

Ein molekulargenetisches RHD-Screening beiNeugeborenen müsste einfach und schnell sein, um rechtzeitig eine Aussage über die Rh-Prophylaxezu ermöglichen

T. Legler 20.03.07

Sequenzierung von RHDLegler TJ et al.: RHD sequencing: a new tool for decision making on

transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis

Ds1 Ds2 Ds3 Ds4 Ds5 Ds6 Ds7 Ds8 Ds9 Ds10

M D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D-M

100

300200

500

1000bp

bp

T. Legler 20.03.07

Bestimmung der RHD Zygotie bei Partnern von Anti-D Immunisierten


Zygotiebestimmung


Bei Paaren mit Kinderwunsch und Anti-DImmunisierung kann heute genauer bestimmt werden,ob ein D-positiver Mann hemi- (Dd) oder homozygoter(DD) Träger von RHD ist.

Beim hemizygoten Träger kann im Verlauf derSchwangerschaft der D-Status des Kindesbestimmt werden. Dieses ist zu 50% D-positivund zu 50% D-negativ.

Beim homozygoten Träger können Unter-suchungen zur Bestimmung des kindlichenD-Status vermieden werden.

T. Legler 20.03.07

Vorgehen bei Zygotiebestimmung

Test für hybrid-Rhesus Box

D-positiver Partner

1 D-negatives Allel

1 D-positives Allel

+ -

Test für nicht exprimiertes

RHD

1 D-negatives Allel

1 D-positives Allel

+

2 D-positive Allele

-

Perco P, et al. Transfusion 2003;43:335-339

RH-TypeRHD ψCdes

DEL

T. Legler 20.03.07

Molekulare Diagnostik bei Schwangeren mit Anti-D


Zygotiebestimmung


Beim hemizygoten Partner sollte ab der 11. SSWder fetale D-status aus mütterlichem Blut untersuchtwerden.

Nur bei RHD negativem Ergebnis für fetales RhDaus mütterlichem Blut und sonographischen Zeicheneiner Anämie sollte über Amniozentese der fetale RHD-Status untersucht werden.

Bei RHD positivem Ergebnis für fetales RhDaus mütterlichem Blut besteht bei invasivenEingriffen grundsätzlich eine hohe Gefahr derBoosterung des Immun-Anti-D.

T. Legler 20.03.07

ZusammenfassungBei Schwangeren mit unklarem D-Status sollte weak D Typ 1-3

berücksichtigt werden, um eine falsch positive D-Bestimmung und damit eine fehlerhafte Unterlassung der Rh-Prophylaxe zu vermeiden.

Die Beratung von Partnern mit Allo-Anti-D erfolgt nach Bestimmung der D-Zygotie des Mannes durch Bestimmung der Hybrid Rhesus Box.

Die fetale D-Bestimmung bei MHN sollte aus mütterlichem Blut erfolgen

D-Varianten mit Allo-anti-D Bildung sollten molekulargenetisch untersucht und ggfls. sequenziert werden.

Bei D-negativen Patientinnen mit Allo-Anti-D und Vortransfusionen sollte eine Look-back Untersuchung zeigen, ob unter den Blutspender evtl. DEL Spender die Immunisierung hervorgerufen haben.

T. Legler 20.03.07

The SSpecial Non-Invasive AAdvances in

FFetal and Neonatal EEvaluation Network

Network of excellence sponsored under the EU’s Framework programme 6 ‘Life Sciences, Genomics and Biotechnology for Health’

www.safenoe.org

Chair of steering committee Neil Avent ([email protected]) Scientific Director Sinuhe Hahn ([email protected])

T. Legler 20.03.07

50 Partner in 19 Nationen

6. EU-Rahmenprogramm

T. Legler 20.03.07

Bis 1% Risiko einer Fehlgeburt

Kaum möglich vor der 11. SSW

Die derzeitige Pränataldiagnostik ist of invasiv

CVS

CORDOZENTESE

AMNIOZENTESE

ChromosomenanomalieMonogene ErkrankungenHämoglobinopathien

T. Legler 20.03.07

SAFE SAFE network: network: ZielZiel

Einführung eines kosteneffizienten, nicht-invasiven Pränatalscreenings

und Neugeborenenscreenings durch Schaffung von lang anhaltenden

Partnerschaften innerhalb und außerhalb der Europäischen

Gemeinschaft

März 2004 – Februar 2009

50 Partner aus 19 Staaten

12 Millionen EUR

T. Legler 20.03.07

Vorteil:• Komplettes fetales Genom

Probleme:• Sehr wenige! 12-20/ml mütterl. Blut

(Mergenthaler et al., JHC 2005, 53 (3): 319-322)

• Bis jetzt keine perfekten Marker• Persistenz über längere Zeit

(Bianchi et al., Med. Science, 1996; 93 (2), 705-708)

Intakte fetale Zellen im mütterlichen Blut

T. Legler 20.03.07

Quellen fetaler Marker immütterlichen Blut

Schwierig zu isolieren, möglicherweise viele Jahre persistent

FetaleFetale ZellenZellen imim mmüütterlichentterlichen BlutBlutErythroblastenThrophoblastenLeukozyten

ZellfreieZellfreie fetalefetale DNADNA imim mmüütterlichentterlichen KreislaufKreislauf

Ab der 5. SSW nachweisbarMetabolisierung innerhalb von 30 Minuten nach Entbindung3 – 6% der gesamten zirkulierenden freien DNA im Plasma

T. Legler 20.03.07

• Apoptose fetaler Zellen?• Plazenta! Keine starre Barriere

Trophoblasten(Guibert et al.,Hum.Repr.,2003;18 (8), 1733-36)

Ursprung fetaler DNA im Plasma

T. Legler 20.03.07

Abbau fetaler DNA nach Entbindung Rasche Clearance (Lo et al. Am J Hum Gen,1999; 64:218-24 ) :

T1/2 = 16 minutes (range 4-30)

T. Legler 20.03.07

SAFESAFE -- ErgebnisseErgebnisse

Bestimmung des fetalen RHD status ausmütterlichem Blut– Wird in mehreren Staaten Europas bei alloimmunisierten

Schwangeren angewendet. In Deutschland: UniversitätGöttingen, Abt. Transfusionsmedizin und DRK Oldenburg

– SAFE unterstützt Studien zur routinemäßigen Bestimmung des fetalen RhD Status aus mütterlichem Blut vor der antenatalenRh-Prophylaxe (indikationsbezogene Rh-Prophylaxe)

– Bestimmung von C, c, E, e, Kell, Duffy, HPA aus fetaler DNA in mütterlichem Blut.

– Etablierung von Kontrollmaterialien (Standards) und Standardisierung von Bestimmungsmethoden durchinternationale Ringversuche

T. Legler 20.03.07

Schwangerschaft ohne Rh-Prophylaxe

Schwangerschaft mit postnataler Rh-Prophylaxe

Schwangerschaft mit prä- und postnataler Rh-Prophylaxe

13.2% pro D+ Schwangersch.



Bowman J: Transfusion 2003;43:1661-1666

Rate der Anti-D Alloimmunisierung

T. Legler 20.03.07

Neuere Daten• Die antinatale Rh-Prophylaxe halbiert das Risiko einer Rh-Immunisierung und

eines schweren M. haemolyticus neonatorum (Koelewijn et al. DGTI 2006, 3 Jahre Studie, 600.000 Schwangerschaften in den Niederlanden:Neue Anti-D Immunisierungen im 1. Trimester von Schwangeren mit mind. einem D+ Kind)

Nurpostnatal

Ante + postnatal

Allo-Anti-D 58 (0,69%) 39 (0,31%)KeineImmunisierung 8687 12537

T. Legler 20.03.07

Anti-D Immunglobulin

• Blutprodukt• Freiwillige, hyperimmunisierte

Plasmaspender• Weltweiter Mangel• Kosten

T. Legler 20.03.07

Studien in GöttingenLegler TJ, Lynen, R, Maas JH, Pindur G, Kulenkampff D, Suren A, Osmers R, Köhler M. Prediction of fetal Rh D and Rh CcEephenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction. Transfusion Science 2002;27:217-223.

1. Studie: Vergleich der Genotypisierungsergebnisse aus Amnionpunktat und peripherem Blut 7.-21. SSW.

2. Studie: Vergleich der RHD Genotypisierungsergebnisse aus Blut von Rh-negativen Schwangeren in der 22.-34. SSW mit anamnestischen Angaben (Mutterpaß etc.) der Probandinnen nach Geburt (163 Einsender).

T. Legler 20.03.07

Kosten-Nutzen Analyse: Niederlande• Szenarien:

(34.000 D-negative Frauen, pränatale Rh-Prophylaxe 1000 IU (= 48 EUR) in der 30. SSW

– Alle D-negativen Frauen erhalten eine generelle pränatale Rh-Prophylaxeund eine postnatale Rh-Prophylaxe nach D-Bestimmung ausNabelschnurblut

• 6.6 Mio Euro

– Alle D-negativen Frauen werden mit PCR gescreent und erhaltenentsprechend dem Ergebnis eine Rh-Prophylaxe. Die postnatale Rh-Prophlaxe erfolgt nach D-Bestimmung aus dem Nabelschnurblut.

• 3.9 Mio Euro

– Alle D-negativen Frauen werden mit PCR gescreent und erhaltenentsprechend dem Ergebnis eine prä- und postnatale Rh-Prophylaxe

• 3.5 Mio Euro

C. Ellen van der Schoot, 7. März 2007, SAFE Workshop in Göttingen

T. Legler 20.03.07

Fazit: Die pränatale Anti-D Prophylaxe ist oft nicht indiziert!

15-18 % aller Schwangerschaften betrifft D-negative Frauen

In 40% der Schwangerschaften bei D-negativen Frauen ist eine Anti-D Prophylaxe nicht indiziert, da der Fet D-negativ ist.

Im Falle eines D-positiven Feten würde nach Geburt eine sofortige Rh-Prophylaxe möglich werden, die Blutgruppenbestimmung aus Nabelschnurblut müßte nicht abgewartet werden.

Somit wäre die Rh-Prophylaxe effizienter und möglicherweise könnten hierdurch weitere Kosten durch eine verlängerte Liegedauer der Patientinnen vermieden werden.

T. Legler 20.03.07

SAFESAFE -- ErgebnisseErgebnisseBestimmung des fetalen Geschlechts aus

mütterlichem Blut• Indikation bei geschlechtschromosomal vererbten

Erkrankungen und bei Frauen mit angeboreneradrenaler Hyperplasie. Durch die Y-Chromosom-Testung konnten die invasiven Eingriffe um 50% reduziert werden.

• Standardisierung innerhalb Europas

• Labore in Tschechien, England, Frankreich, Israel, Italien, Niederlanden, Schottland, Spanien.

T. Legler 20.03.07

SAFESAFE -- ErgebnisseErgebnisse

Monogene Erkrankungen• Etablierung einer Biobank für Familien mit Chromosomenanomalien

und monogenen Erbkrankheiten für den Fall, dass neueTechnologien sich im Labor durchsetzen.

• Umfangreiche Untersuchungen bei Thalassaemie– Eine wachsende Zahl von Primer/Sonden für die häufigsten

Mutationen bei ß-Thalassämie wurden etabliert.

• Eine Diagnostik der Achrondroplasie aus mütterlichem Blut wurdeentwickelt.

T. Legler 20.03.07

SAFESAFE –– AusblickAusblick

In-house verfügbar• Screening für fetales RhD zur Einführung der indikationsbezogenen Rh-

Prophylaxe• Bestimmung des fetalen Geschlechts• Pränataldiagnostik für Paternale genetische Marker

Neue Forschungsansätze für andere Erkrankungen• Besseres Screening für Down Syndrom oder andere Aneuploidien durch

Proteomics oder Epigenetics• Bessere Diagnositik zur Vorhersage von Schwangerschaftskomplikationen

(Präeklamsie, IUGR, Frühgeburtlichkeit)• Diagnostik für X-chromosomal vererbte und rezessive Erkrankungen

T. Legler 20.03.07

DanksagungenDanksagungenMolekulargenetikJens-Holger MaasNadja BustamiVolker WiemannChao-Peng ShaoSerjey LukinElisabeth BinderPaul PercoGünther KörmöcziThomas WagnerHitoshi Ohto etc. etc.

Consensus EmpfehlungenFranz F. WagnerWilly A. FlegelChristoph GassnerHartmut Kroll

Mütterliches BlutSina MüllerSibylle DammeMichael KöhlerWolfgang EngelIris BartelsGünther EmonsEndokrinologikumKai Gutensohn163 Gynäkologen

Kit-EntwicklungMartina PragerNicolas Sachsenberg

SAFE PartnerC Ellen van der SchootGeoff DanielsKirstin Finning

T. Legler 20.03.07

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